Lotus Japonicus Gene Ljsbp è Altamente Conservato Tra Le Piante E Gli Animali E Codifica Un Omologo Per I Mammiferi Selenio-binding Proteins

Molecular Plant-microbe Interactions : MPMI. Apr, 2002  |  Pubmed ID: 12026169

Abbiamo isolato e caratterizzato un gene che Lotus japonicus (Ljsbp) codifica per un polipeptide putativo con sorprendente omologia per i mammiferi 56-kDa selenio-binding protein (SBP). cloni di cDNA omologhi a LjSBP sono stati anche isolati da soia, Medicago sativa e Arabidopsis thaliana. Studi di espressione comparativa in japonicus L e a. thaliana ha mostrato che le trascrizioni sbp sono presenti in vari tessuti e a diversi livelli. Soprattutto nei noduli japonicus L e seedpods e silique a. thaliana, sbp espressione sembra essere inerente allo sviluppo up-regolato. SBP Gene trascrizioni sono state localizzate tramite l'ibridazione in situ in cellule infettate e fasci vascolari del giovane noduli, mentre in noduli maturo, bassi livelli di espressione sono stati rilevati solo nelle cellule parenchimatico. Espressione delle trascrizioni sbp nel giovane seedpods e silique era chiaramente visibile in tessuti vascolari e gli embrioni, mentre negli embrioni, bassi livelli di espressione sono stati rilevati nell'epidermide la radice e i fasci vascolari. Gli anticorpi policlonali generati contro una proteina ricombinante LjSBP tronca riconosciuto un polipeptide di circa 60 kDa in nodulo estratti. Esperimenti di immunoistochimica hanno dimostrato che si è verificato accumulo di LjSBP nei peli radicali, nell'epidermide radice sopra i primordi del nodulo, nel floema del sistema vascolare e abbondantemente nelle cellule infette del giovane noduli. A prescindere dalla presenza di cyanobase, espressione di SBP è stata osservata anche nelle punte di radice, dove esso era confinata nelle cellule dell'epidermide e protophloem radice. Ipotizziamo che LjSBP può avere più di un ruolo fisiologico e può essere implicato nel controllare lo stato di ossidazione/riduzione di proteine bersaglio, nel trasporto vescicolare di Golgi, o entrambi.

Interazioni Pianta-microbo: Un Recettore Nel Dialogo Simbiotica

Nature. Jun, 2002  |  Pubmed ID: 12087390

Romanzo Lipochitin Strutture Oligosaccaride Prodotte Da Rhizobium Etli KIM5s

Carbohydrate Research. Jul, 2002  |  Pubmed ID: 12110194

Le strutture di oligosaccaride (LCOs) romanzo lipochitin prodotte da Rhizobium etli che kim5s sono stati caratterizzati utilizzando un sistema di inversione di fase nanoHPLC accoppiato ad un spettrometro di massa a trappola ionica. Questa tecnica ha dimostrata di essere più sensibile per la delucidazione strutturale di LCOs precedentemente usati metodi di spettrometrihe di massa. Le strutture dell'etli LCOs di R. KIM5s, la maggior parte contenente sei residui di monosaccaride, differiscono da quelli sintetizzati da tutte le altre cyanobase analizzati fino ad oggi. Inoltre, sono state trovate strutture romanzo in cui la spina dorsale di chitina è stata deacetilata presso uno o più GlcNAc moiety come composti minori. La differenza della gamma di questo ceppo rispetto a quella di altri noti fagiolo microsymbionts è discusso.

Analisi Genetica Di Un Operone PH Regolato Da Rhizobium Tropici Che Ciat899 Coinvolti Nella Competitività Acido Tolleranza E Nodulation

Molecular Plant-microbe Interactions : MPMI. Feb, 2003  |  Pubmed ID: 12575750

Rhizobium tropici CIAT899 è altamente acido tolleranti e un buon concorrente per Phaseolus vulgaris occupancy nodulo a basso pH. Mediante mutagenesi Tn5, abbiamo identificato un operone necessaria per la competitività di tolleranza e nodulation acido. L'inserimento è stato mappato l'estremità 5' del atvA, codifica un prodotto con identità di sequenza alta alla proteina batterica agro AcvB virulenza. Analisi di complementazione indicano che quello atvA è un ortholog di acvB, entrambi i geni essendo necessari per la tolleranza di acido. Una sostituzione Ser/Ala nel motivo LIPASE_SER di AtvA ha portato in un acido sensibili Fix + ma molto mal concorrente ceppo, dimostrando che Ser-313 è essenziale per la funzione AtvA. atvA è il secondo gene in un operone che è transcriptionally sovraregolati dallo shock acido. Il promotore acido-sensible a reagire è stato mappato in una regione intergenic 469-bp situata a monte del lpiA, il primo gene nell'operone. lpiA-come geni si trovano in diverse alfa, beta e gamma Proteobacteria che interagiscono con le cellule eucariote ospite, ed essi sono previsti per codificare le proteine di membrana, legate alla famiglia FmtC/MprF da basso G + C Firmicutes. Le proteine di quest'ultime sono coinvolti nella resistenza di peptidi antimicrobici cationici. Una cancellazione non polare in lpiA causava un calo sevenfold nodulation relativa competitività.

14-3-3 Isoforme E Modello Di Formazione Durante L'embriogenesi Microspora Orzo

Journal of Experimental Botany. Mar, 2003  |  Pubmed ID: 12598573

I membri della famiglia isoforma 14-3-3 hanno dimostrati di essere regolato inerente allo sviluppo durante l'embriogenesi animale, dove prendono parte a processi di differenziazione cellulare. i modelli di espressione specifica isoforma 14-3-3 sono stati studiati nei processi embryogenic pianta, utilizzando embriogenesi microspora di orzo (Hordeum vulgare L.) come sistema di modello. Dopo l'induzione di embriogenesi da stress, microspore con morfologia allargata ha mostrato maggiore redditività rispetto a quelli non allargata. A seguito di cultura microspora, divisione delle cellule è stata osservata solo tra le microspore allargate. Western blot e immunolocalization di orzo tre isoforme 14-3-3, 14-3-3A, 3B-14-3 e C 14-3-3 sono stati effettuati utilizzando anticorpi isoform specifico. Il livello della proteina 14-3-3 C era superiore in microspore allargate rispetto a quelli non allargata. Un modulo elaborato del 14-3-3A è stato associato con il pathway di morte delle microspore non allargata. Nella fase iniziale l'embriogenesi, 14-3-3 la localizzazione sottocellulare differiva tra microspore dividere e non per dividere e le strutture pluricellulari microspora-derivato ha mostrate un pattern di espressione polarizzata del 14-3-3 C e un segnale di 14-3-3A superiore in primordia dell'epidermide. Nella fase tardiva embriogenesi, C 14-3-3 è stato specificamente espresso sotto lo strato L(1) del meristema apicale di sparare e la Vespa di embrione-come le strutture (ELSs). C 14-3-3 è stata espressa anche nella Vespa e sotto lo strato L(1) del meristema apicale di sparare di 21 d dopo embrioni zygotic impollinazione (DAP). Questi risultati rivelano che le 14-3-3A elaborazione ed espressione tessuto-specifica isoforma C 14-3-3 sono strettamente correlati al destino delle cellule e l'iniziazione di differenziazione di tipo cellulare specifico, fornendo una nuova visione lo studio delle proteine 14-3-3 in embriogenesi della pianta.

Attivazione Specifica Delle Vie ERK Di Oligosaccaridi Di Chitina in Linee Cellulari Embrionali Zebrafish

Glycobiology. Oct, 2003  |  Pubmed ID: 12881410

Oligosaccaridi chitina (COs) giocano un ruolo nello sviluppo di pianta e si presumono che influenzano la formazione del piano corpo durante l'embriogenesi vertebrato. I meccanismi del COs i processi di riconoscimento e cellulari alla base dello sviluppo embrionale sono ancora non capito. Analizziamo il possibile collegamento con il percorso della chinasi di proteina mitogene-attivata che è conservato nell'evoluzione attraverso il Regno animale e vegetale ed è stato implicato in diversi processi cellulari, tra cui la crescita delle cellule, proliferazione, differenziazione, sopravvivenza e sviluppo vertebrato. Mostriamo che la stimolazione in vivo delle cellule embrionali zebrafish ZF13 e ZF29 con tetrasaccharides di chitina alla concentrazione di 10-9 M transitoriamente indotta da attivazione/fosforilazione della chinasi regolate extracellulare (ERKs), con un massimo dopo 15 min. Inoltre è stata esaminata la specificità biologica della chitina tetrasaccharides e vari derivati. La sostituzione di uno o due residui GlcNAc del backbone chitina di glucosio e fucosylation di chitina tetrasaccharides al capolinea riducendo ha causato una perdita completa della loro attività. Abbiamo testato anche un analogo tetrasaccharide chitina in cui gli atomi di ossigeno legami glicosidici sono stati sostituiti da atomi di zolfo. Questo analogico, che non poteva essere idrolizzata enzimaticamente, era potente come un induttore come chitina tetrasaccharide. Questi risultati suggeriscono che l'attivazione osservato di ERKs è chitina tetrasaccharide specifici e non richiedono ulteriore elaborazione enzimatica. Abbiamo esaminato le possibili vie di segnalazione che portano all'attivazione di ERK da COs mediante uso di anticorpi phosphospecific e inibitori. Possiamo concludere che non esiste un sistema di recettori ad alta affinità CO che collega per la Raf, MEK ed ERK pathway nelle cellule zebrafish.

Motivi Strutturali Nel RNA Codificato Dai Primi Nodulation Gene Enod40 Di Soia

Nucleic Acids Research. Sep, 2003  |  Pubmed ID: 12930950

La pianta gene enod40 è altamente conservato tra legumi e presente anche in varie specie di leguminose non. Si presume di svolgere un ruolo normativo centrale nell'interazione Rhizobium leguminosa, essendo espresso ben prima che l'iniziazione di divisioni delle cellule corticali con conseguente formazione di noduli. Due piccoli peptidi codificati dal mRNA di enod40, come pure la sua struttura secondaria hanno dimostrati di essere elementi chiave nei processi di segnalazione sottostante organogenesi nodulo. Qui vengono presentati i risultati riguardanti la struttura secondaria del mRNA di enod40 di soia. Questo studio combinato un approccio teorico, che coinvolgono la previsione della struttura e confronto, così come struttura di sondaggio. Il nostro studio indica cinque domini conservati in mRNA di enod40 tra le numerose specie di leguminose. Confronto della struttura suggerisce che alcuni domini sono anche conservati nelle specie non-leguminose e che non esiste un dominio aggiuntivo che è stato trovato solo nella specie leguminose sviluppare noduli indeterminati. La struttura di supporto dati sondaggio enzimatici e chimici per tre dei domini e parzialmente per le restanti due. Il resto della molecola sembra essere meno strutturato. Alcuni dei domini includono motivi, come U-contenenti loop interno e rigonfiamenti, che sembrano essere conservati. Pertanto, potrebbe essere coinvolti nel ruolo normativo del RNA enod40.

Distribuzione Di Auxina in Lotus Japonicus Durante Lo Sviluppo Del Nodulo Principale

Plant Molecular Biology. Aug, 2003  |  Pubmed ID: 14682616

Per questo lavoro, sono state costruite piante transgeniche Lotus japonicus esprimendo un gene reporter di fusione che consiste dei geni beta-glucuronidasi (gus) e proteina fluorescente verde (gfp) sotto il controllo del promotore auxina-sensible a reagire della soia GH3. Queste piante espresso GUS e GFP in fascio vascolare di germogli, radici e foglie. Sezioni di radice ha mostrato che in parti mature delle radici GUS è principalmente espressa in floema e vascolare parenchima del cilindro vascolare. Rilevando attività GUS, descriviamo il pattern di distribuzione auxina nella radice del determinato nodulating legume L. japonicus durante lo sviluppo del nodulation e anche dopo l'inoculazione con fattori di Nod purificati, acido N-naphthylphthalamic (NPA) e indoleacetic acid (IAA). Diversamente che il trifoglio bianco, che forma noduli indeterminati, L. japonicus ha presentato una forte attività di GUS presso la divisione delle cellule corticali esterni durante il prime nodulo cell divisioni. Questo suggerisce pattern di distribuzione diversi auxina tra i legumi nodulating determinato e indeterminato che può essere responsabile delle differenze nello sviluppo del nodulo fra questi gruppi. Misurando della GFP fluorescenza espresso 21 giorni dopo il trattamento con fattori di Nod o batteri siamo stati in grado di quantificare le differenze nei livelli di espressione GH3 nel singolo vivente radici. Per poter correlare questi dati con capacità di trasporto di auxina abbiamo misurato i livelli di auxina trasporto da un metodo radioattivo descritto in precedenza. A 48 h dopo l'inoculazione con fattori di Nod, trasporto auxina ha mostrato di essere aumentato nel segmento medio radice. I risultati ottenuti indicano che L. japonicus trasformato linee che esprimono la GFP e GUS giornalisti sotto il controllo del promotore GH3 sono adatti per lo studio della distribuzione di auxina in questo legume.

Analisi Dell'espressione Dei Recettori Toll-like E TIR Dominio Adattatore Famiglie Di Zebrafish

Molecular Immunology. Jan, 2004  |  Pubmed ID: 14687934

Il database di sequenza genomica di zebrafish è stato analizzato per la presenza di geni codifica membri dei recettori Toll-like (TLR) e recettori delle interleuchine (IL-R) e le relative proteine adattatore contenente un dominio TIR. Le previsioni risultanti mostrano la presenza di una o più controparti per il TLR1 umano, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR7, TLR8, TLR9, IL-1R e geni IL-18R e una copia dei geni adattatore MyD88, MAL, TRIF e SARM. In contrasto con i dati per il pesce palla Fugu rubripes, zebrafish ha due geni che sono molto simili a TLR4 umana. Inoltre, un gruppo di pesci specifica TLR può essere distinto che è strettamente correlato al gene della drosofila melanogaster Toll-9. La sequenza dei cDNAs clonati per TLR4, TLR2 e MyD88 mostrano la stessa organizzazione introne-esone come le controparti umane. Analisi di espressione mediante reverse transcriptase-PCR (RT-PCR) dimostra che 17 dei geni TLR zebrafish previsto e tutti i geni che codificano per le proteine adattatore sono espressi nella fase adulta. Un sottoinsieme dei geni TLR sono espressi a livelli più alti nei pesci infetti con l'agente patogeno Mycobacterium marinum. I geni indotti includono gli omologhi dei geni umani TLR1 e TLR2, le cui funzioni sono associate con infezioni micobatteriche, sottolineando l'idoneità di zebrafish come modello per l'analisi del sistema immunitario innato vertebrato.

Singola Molecola Imaging Dell'H-ras Membrana-ancoraggio Rivela Domini L'opuscolo Citoplasmatico Della Membrana Cellulare

Biophysical Journal. Jan, 2004  |  Pubmed ID: 14695305

Nell'ultima prova del decennio ha accumulato che piccoli domini di 50-700 nm di diametro si trovano nell'opuscolo exoplasmic della membrana del plasma. La maggior parte di questi domini presumibilmente consistere degli insiemi specifici di lipidi e proteine e si ritiene che a coordinare le cascate di trasduzione del segnale. Se domini simili sono presenti anche nel foglietto citoplasmatico della membrana del plasma è finora poco chiaro. Per indagare la presenza di domini citoplasmatici opuscolo, la sequenza di membrana-targeting H-Ras è stato fuso al C-terminale della proteina fluorescente gialla avanzata. Utilizzando la microscopia di fluorescenza di singola molecola, traiettorie di singole molecole diffondere l'opuscolo citoplasmatica della membrana del plasma sono state registrate. Da queste traiettorie, la diffusione delle molecole singole ancorata a membrana avanzata proteina fluorescente gialla è stata studiata in cellule vive su tempi da 5 a 200 MS, i risultati mostrano che la diffusione del 30-40% delle molecole è vincolata in domini con una dimensione tipica di 200 nm. Nessuna ripartizione di estrazione actina né colesterolo cambiato le caratteristiche di dominio significativamente, che indica che i domini osservati non possono essere correlati ai domini di membrana finora identificati.

Has2 è Necessaria a Monte Di Rac1 Governare Dorsale Migrazione Delle Cellule Laterali Durante La Gastrulazione Di Zebrafish

Development (Cambridge, England). Feb, 2004  |  Pubmed ID: 14729574

Il polisaccaride extracellulare grande acido ialuronico (HA) e il sintetizzazione degli enzimi (ha) sono stati implicati nella regolazione del potenziale migratorio delle cellule di cancro metastatico. Qui, vediamo di analizzare i ruoli di zebrafish Has2 nel normale sviluppo. Oligonucleotidi antisense oligonucleotides (MO)-mediata atterramento di zebrafish Has2 conduce alla perdita di HA, e gravi difetti migratori durante la gastrulazione, morfogenesi somite e germe primordiale cell migrazione. Durante la gastrulazione, cellule ventrolateral has2 morphant embrioni non riescono a sviluppare lamellipodia e per migrare dorsalmente, risultante in un blocco di convergenza dorsale, considerando che l'estensione dell'asse dorsale è normale. L'effetto è cellula autonoma, suggerendo che HA agisce come un segnale autocrino di stimolare la migrazione di cellule generatrici di HA. Su espressione ectopica nelle cellule assiali, has2 provoca la formazione di lamellipodia sovrannumerario e un blocco di estensione di asse. Analisi di epistasi con versioni costitutivamente attive e dominante-negativo del piccolo GTPase Rac1 suggeriscono che HA agisce tramite l'attivazione di Rac1, piuttosto che come una componente strutturale essenziale della matrice extracellulare. Insieme, i nostri dati forniscono prove che la convergenza e l'estensione sono distinti movimenti morfogenetici della gastrulazione. Inoltre, essi suggeriscono che lo stessi HA percorsi sono attivi auto-stimolare la migrazione cellulare durante l'embriogenesi di invasione e vertebrato del tumore.

Isoforma Specifica Differenze Nel Nucleo-citoplasmatici Rapida Spola Causano Distinte Distribuzioni Sottocellulare Di Sigma 14-3-3 E 14-3-3 Zeta

Journal of Cell Science. Mar, 2004  |  Pubmed ID: 14996909

Trasporto nucleo-citoplasmatici delle proteine svolge un ruolo importante nella regolazione di molti processi cellulari. Differenze nel nucleo-citoplasmatici spola possono fornire una base per le funzioni biologiche isoform specifico per i membri delle famiglie multigene, come la proteina 14-3-3. Molti organismi contengono molteplici isoforme 14-3-3, che svolgono un ruolo in numerosi processi, tra cui segnalamento, controllo del ciclo cellulare e apoptosi. Non è ancora chiaro se tali isoforme sono specializzati funzioni biologiche e se questa specializzazione si basa sull'associazione isoform specifico ligando, espressione regolamento o localizzazione specifica. Pertanto, abbiamo studiato la distribuzione sottocellulare di sigma 14-3-3 e 14-3-3 zeta in vivo in vari tipi di cellule di mammifero mediante fusioni proteina fluorescente gialla e anticorpi isoform specifico. 14-3-3 sigma era localizzato principalmente nel citoplasma e solo bassi livelli erano presenti nel nucleo, mentre zeta 14-3-3 è stato trovato a livelli relativamente elevati nel nucleo. Recupero di fluorescenza dopo esperimenti photobleaching (FRAP) indicato che le proteine 14-3-3 shuttle rapidamente dentro e fuori il nucleo tramite trasporto attivo e che le distinte distribuzioni sottocellulare di sigma 14-3-3 e 14-3-3 zeta sono causate da differenze di esportazione nucleare. 14-3-3 sigma aveva un 1.7 x superiore costante di velocità di esportazione nucleare rispetto a zeta 14-3-3, mentre le costanti di velocità di importazione erano uguali. Le proteine 14-3-3 vengono esportate dal nucleo almeno in parte da un Crm1-dipendente, leptomycin meccanismo B-sensibili. Le differenze nella distribuzione sottocellulare di 14-3-3 che abbiamo trovato in questo studio sono probabile che riflettono una base molecolare per isoforma specifica specializzazione biologica.

Il Riconoscimento Specifico Di Batteri Da Piantare Le Chinasi Del Recettore LysM Dominio

Trends in Microbiology. May, 2004  |  Pubmed ID: 15120137

DNA Computing Con Rilevazione Di Ibridazione a Singola Molecola

Nucleic Acids Research. 2004  |  Pubmed ID: 15388798

DNA computing mira a utilizzando acidi nucleici per il calcolo. Poiché micromolari soluzioni di DNA possono fungere da miliardi di nanoprocessors parallele, computer DNA può in teoria risolvere problemi di ottimizzazione che richiedono spazi di vasta ricerca. Tuttavia, il parallelismo reale attualmente raggiunto è almeno un centinaio million-fold inferiore rispetto al numero di molecole di DNA utilizzato. Ciò è dovuto la quantità di molecole di DNA di una specie che è necessaria per produrre un output rilevabile per i calcoli. Al fine di miniaturizzare il calcolo e ridurre notevolmente la quantità di DNA necessaria, abbiamo combinato DNA computing con rilevazione di singola molecola. Rilevamento affidabile ibridazione è stato raggiunto a livello di singole molecole di DNA con spettroscopia di fluorescenza cross-correlazione. Per illustrare l'utilizzo di questo approccio, abbiamo implementato un calcolo basato su DNA e risolto una variabile 4 4-clausola istanza della Soddisfacibilità computazionalmente difficile problema (SAT).

Proprietà Traffico Di KNOX E Diversa Localizzazione Sottocellulare Della Classe 1 Homeodomain Proteine Da Riso

Plant Molecular Biology. Aug, 2004  |  Pubmed ID: 15604716

Della KN1-come homeobox (KNOX) classe 1 i geni codificano per fattori di trascrizione coinvolti nel tiro meristema apicale sviluppo e manutenzione. Abbiamo studiato la localizzazione sottocellulare della proteina fluorescente verde-Tag riso KNOX proteine (Oskn1-3) dopo il bombardamento di particelle di cellule di cipolla e riso e dopo la trasformazione di Arabidopsis e riso con costrutti di espressione costitutiva e viscoelastico. In tutti i sistemi di test, tre riso proteine KNOX ha mostrate modelli di localizzazione nucleare e citoplasmatica. Tuttavia, Oskn1 inoltre mostrato in alcune cellule una distribuzione sopra punctae spostando casualmente nel citosol. Utilizzo di un sistema di espressione inducibile indicato una presenza nucleare di Oskn1 in cellule del meristema apicale di sparare e di espresione down-regulation in anticipo foglia primordia. Sistemi di test di Arabidopsis e riso sono stati utilizzati per studiare gli effetti di ormoni vegetali e auxina trasporto inibizione sulla localizzazione della proteina KNOX. Applicazione di GA3 o 1-NAA spostato completamente la localizzazione della proteina nel citoplasma e tradotto in perdita di punctae formata da Oskn1. Al contrario, applicazione NPA indotta da una completa localizzazione nucleare delle proteine KNOX. Per studiare il movimento intercellulare delle proteine KNOX abbiamo istituito un dosaggio co-bombardment romanzo nel quale traffico di KNOX senza tag proteine è stato visualizzato attraverso il co-trafficking delle proteine marker verde fluorescente o blu fluorescente. In esperimenti indipendenti multiple Oskn1 trafficate più estesamente a celle vicine di Oskn2 e Oskn3. Le differenze nelle proprietà di traffico di Oskn1, Oskn2 e Oskn3 e localizzazione correlano con le differenze nei modelli di localizzazione di mRNA e le differenze funzionali tra il riso KNOX geni e loro putativo orthologues da altre specie.

Morte Programmata Delle Cellule Durante La Transizione Da Strutture Pluricellulari Globulare Embrioni in Orzo Androgenesis

Planta. Jun, 2005  |  Pubmed ID: 15645302

Androgenesis rappresenta uno dei più affascinanti esempi di differenziazione delle cellule nelle piante. Orzo, la conversione delle microspore uninucleate stressati in embrione-come le strutture è altamente efficiente. Uno dei colli di bottiglia in questo processo è il rilascio di successo dell'embrione-come le strutture fuori dal muro di microspore esina. Nel presente lavoro, sono stati eseguiti studi morfologici e biochimici durante la transizione da strutture pluricellulari agli embrioni globulare. Esina parete rottura e la formazione dell'embrione globulare successive sono state osservate solo in microspore che divisi asimmetricamente. Divisioni indipendenti il generativo e i nuclei vegetativi ha dato luogo a strutture pluricellulari eterogenee, che erano composte da due domini diversi cellulari: cellule piccole con grandi cellule con struttura della cromatina normale e struttura della cromatina condensata. Durante la rottura del muro esina, le piccole cellule morirono e loro morte segnò il sito di rottura muro esina. Morte delle cellule nel dominio di piccole cellule ha mostrato caratteristiche tipiche della morte cellulare programmata impianto. Condensazione della cromatina e la degradazione del DNA preceduto distacco cellulare e citoplasma smantellamento, un processo che è stato caratterizzato dalla formazione di vescicole e vacuoli che contenevano materiale citoplasmatico. Questo morfotipo di morte cellulare programmata è stata accompagnata da un aumento nell'attività di caspase-3-come le proteasi. L'orchestrazione di un programma di morte culminò con l'eliminazione del piccolo dominio generativo, e ulteriormente l'embriogenesi è stata effettuata da grande dominio vegetativo. Ad oggi, questo è il primo rapporto per mostrare la prova che programmato delle cellule morte prende parte nello sviluppo degli embrioni microspora-derivato.

Transcriptome Profilatura Di Zebrafish Adulto Nella Fase Tardiva Della Tubercolosi Cronica a Causa Di Infezione Da Mycobacterium Marinum

Molecular Immunology. Jun, 2005  |  Pubmed ID: 15829308

Il modello infezione di Mycobacterium marinum-zebrafish è stato utilizzato in questo studio per l'analisi di una risposta transcriptome ospite all'infezione da mycobacterium a livello organismica. RNA isolato da zebrafish adulto che ha mostrato i segni tipici della tubercolosi del pesce a causa di un'infezione cronica progressiva con M. marinum è stato confrontato con RNA da pesci sani nelle analisi di microarray. Macchiato del oligonucleotide sets (progettato da Sigma-Compugen e MWG) e Affymetrix GeneChips sono stati usati, in totale comprendente 45.465 annotazioni di trascrizione di zebrafish. Basato su una dettagliata analisi comparativa e analisi di reverse transcriptase-PCR quantitativa, presentiamo una serie di riferimento convalidati di 159 geni cui regolamento è fortemente influenzata da infezione micobatterica in tre tipi di microarrays analizzati. Inoltre, abbiamo analizzato i set di dati separato di microarrays con particolare enfasi sui profili di espressione di geni correlati a immunitario. Sovraregolati geni includono molti componenti noti della risposta infiammatoria e diversi geni che in precedenza sono stati implicati nella risposta ad infezioni micobatteriche in colture di cellule di altri organismi. I diversi geni marcatori del lignaggio mieloide che sono stati caratterizzati in zebrafish ha anche mostrarono maggiore espressione. Inoltre, gli omologhi di zebrafish di molti geni di trasduzione di segnale con rapporto alla risposta immunitaria erano indotta da infezione da M. marinum. Future analisi funzionale di questi geni possono contribuire a comprendere i meccanismi della patogenesi micobatteriche. Dal momento che un folto gruppo di geni legati alla risposta immunitaria non ha mostrato espressione alterata negli animali infetti, questi risultati suggeriscono risposte specifiche in malattia indotta da mycobacterium.

Le Misure Di Diffusione Singola Molecola Di H-Ras Alla Membrana Del Plasma Delle Cellule Vive Rivelano Microdomain Localizzazione All'attivazione

Journal of Cell Science. May, 2005  |  Pubmed ID: 15860728

Studi recenti mostrano che il partizionamento di piccolo GTPase H-Ras in diversi tipi di membrane microdomains dipende guanosina 5'--trifosfato (GTP) carico di H-Ras. Conoscenza dettagliata circa le dinamiche in vivo di questo fenomeno è limitato. In questa relazione, è stato studiato l'effetto dell'attivazione di H-Ras sulla sua localizzazione microdomain da microscopia di fluorescenza di singola molecola. Singole molecole di H-Ras umani fusi per la proteina fluorescente gialla avanzata (eYFP) sono stati ripresi nella membrana del plasma dorsale delle cellule di topo in vivo ed è stato analizzato il loro comportamento di diffusione. La diffusione di un mutante costitutivamente attivo di (G12V) di H-Ras costitutivamente inattivo (S17N) è stata comparata. Dettagliate analisi hanno rivelato che per entrambi mutanti a major, popolazione diffusione veloce e una minore, lento-diffusione della popolazione erano presenti. La frazione lenta diffusione del mutante attivo è stata limitata a 200 domini nm, che non sono stati osservati per il mutante inattivo. In linea con questi risultati, abbiamo osservato che la frazione lenta diffusione del selvaggio-tipo H-Ras è diventato limitata a 200 domini nm su attivazione insulino-indotta del selvaggio-tipo H-Ras. Questa localizzazione di attivazione-dipendente di H-Ras a 200 domini nm, per la prima volta direttamente rilevata in cellule vive, sostiene la proposta relazione tra H-Ras microdomain localizzazione e attivazione.

Analisi Genomica Di Annotazione Ed Espressione Di Zebrafish Piccola Famiglia Di GTPasi Rho Durante Lo Sviluppo E Batterico Infezione

Genomics. Jul, 2005  |  Pubmed ID: 15894457

Il database di sequenza genomica di zebrafish è stato analizzato per la presenza di geni che codificano per i membri del Rho piccolo GTPases. L'analisi mostra la presenza di 32 zebrafish Rho geni che rappresentano uno o più omologhi della RHOA, RND3, RHOF, RHOG, RHOH, RHOJ, RHOU, RHOV, CDC42, RAC1, RAC2, RAC3, RND1, RHOBTB1, RHOBTB2, RHOBTB3 e RHOT1 geni umani. Dall'analisi di espressione mediante reverse transcriptase-PCR che ci mostrano che almeno 20 dei predetto zebrafish piccoli GTPasi geni sono espressi nella fase adulta. È interessante notare che, solo 5 di questi sono stati trovati per essere espressa a primi stadi embrionali, tra cui rhoab, rhoad, cdc42a, cdc42c e rac1a. Abbiamo osservato una forte upregulation dell'espressione rhogb zebrafish dopo infezione da Mycobacterium marinum di pesci adulti. Questo studio di annotazione completa fornisce una solida base per l'uso di zebrafish come modello per l'analisi della funzione di GTPasi Rho in sviluppo vertebrato e il sistema immunitario innato.

Profilo Di Espressione Genica Della Risposta Adattativa a Lungo Termine Di Ipossia Nelle Branchie Di Zebrafish Adulto

American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. Nov, 2005  |  Pubmed ID: 15994372

Bassi livelli di ossigeno (ipossia) giocano un ruolo in condizioni cliniche quali ictus, ischemia cronica e cancro. Per comprendere meglio queste malattie, è fondamentale studiare le risposte dei vertebrati all'ipossia. Tra i vertebrati, alcuni teleostei hanno sviluppato la capacità di adattarsi a livelli estremamente bassi di ossigeno. Abbiamo studiato a lungo termine risposte adattative all'ipossia in zebrafish adulto. Abbiamo usato zebrafish che sopravvisse gravi condizioni ipossiche per 3 sett e ha mostrato cambiamenti comportamentali e fenotipiche adattivi. Abbiamo usato i microarrays del cDNA di indagare l'ipossia-indotto cambiamenti nell'espressione dei 15.532 geni negli organi respiratori (branchie). Abbiamo identificato 367 geni differenzialmente espressi di cui 117 ha mostrato indotta da ipossia e 250 espressioni ipossia-ridotto. Depressione metabolica è stato indicato dalla repressione dei geni del ciclo TCA nella catena di trasporto degli elettroni e dei geni coinvolti nella biosintesi della proteina. Abbiamo osservato una maggiore espressione monocarboxylate transporter e la mioglobina di trasportatore di ossigeno. Il gruppo di ipossia-indotto incluso ulteriormente i geni per la malattia di Niemann-Pick C e per la malattia di Wolman [lipasi acida lisosomiale (LAL)]. Entrambe le malattie portano a un simile intra - ed extracellulare accumulo di colesterolo e glicolipidi. La proteina Niemann-Pick C è coinvolta nel traffico di colesterolo e si lega al colesterolo dall'interne delle membrane lisosomiali. LAL è responsabile della degradazione lisosomiale di colesterolo. I nostri dati suggeriscono un meccanismo adattivo romanzo all'ipossia, l'induzione di geni per traffico di lipidi lisosomiali e degrado. Studiando le risposte fisiologiche di ipossia nella specie tolleranti per ossigeno estremamente basso livelli possono aiutare a identificare nuovi geni regolatori, che possono avere importanti implicazioni cliniche.

Time-lapse Tracking Di Orzo Androgenesis Rivela La Morte Cellulare Determinata Posizione All'interno Di Pro-embrioni

Planta. Feb, 2005  |  Pubmed ID: 15449059

A seguito di stress abiotici per indurre l'orzo (Hordeum vulgare L.) androgenesis, lo sviluppo di 794 microspore allargate nella cultura è stato monitorato dal tracciamento time-lapse. In totale, 11% di microspore cingolate sviluppato in embrione-come le strutture (tipo-I pathway), 36% formano strutture pluricellulari (percorso tipo II) e il 53% delle microspore seguita gametophytic divisioni, accumulato amido e morì nei primi giorni di rilevamento (percorso tipo III). Nonostante il destino microspora, allargata microspore mostrati simili morfologie direttamente dopo il trattamento dello stress. L'analisi ultrastrutturale, tuttavia, ha rivelato due tipi di cellule morfologicamente distinte. Cellule con uno strato sottile intine e un citoplasma indifferenziato dopo trattamento di stress sono state associate con tipo-I percorsi di tipo II e considerando che la presenza di amiloplasti differenziati e uno strato di spessore intine sono stati associati con il percorso di tipo III. Rilevamento ha rivelato che il primo cambiamento morfologico associato potenziale embryogenic era una stella come morfologia, che era una fase transitoria tra uninucleate microspore vacuolate dopo lo stress e l'avvio della divisione cellulare. La differenza tra il tipo-I e II tipo di percorsi è stata osservata durante il tempo che hanno visualizzato la stella come morfologia. Durante la fase di transizione, embrione-come le strutture del tipo-ho percorso sempre sono stati rilasciati dalla parete esina al lato opposto del poro germe di polline, mentre nella via della tipo-II strutture pluricellulari furono in grado di rompere l'esina e rilasciare embrione-come le strutture. Inoltre, combinando gli studi di fattibilità con cella di rilevamento, mostriamo che rilascio di embrione-come le strutture è stato preceduto da una diminuzione della vitalità delle cellule posizionato presso il sito di rottura muro esina. Queste cellule sono state anche positivamente macchiate da Sytox arancione, un indicatore di morte delle cellule. Quindi, ci dimostrano, per la prima volta, che un processo di morte cellulare determinata posizione segna la transizione da una struttura multicellulare in una struttura simil-embrione durante androgenesis di orzo.

MyD88 Funzione Immunitaria Innata in Un Modello Di Infezione Dell'embrione Di Zebrafish

Infection and Immunity. Apr, 2006  |  Pubmed ID: 16552074

Meccanismi di segnalazione di immunità innata durante l'embriogenesi vertebrato sono in gran parte sconosciuti. Per lo studio del recettore Toll-like (TLR) funzione del modello di embrione di zebrafish di segnalazione, abbiamo progettato un setup sperimentale per atterramento di antisense oligonucleotides sotto condizioni di infezione batterica. Liquidazione dei batteri della Salmonella enterica sierotipo Typhimurium Ra era significativamente ridotta dopo atterramento di fattore di differenziazione mieloide 88 (MyD88), una proteina dell'adattatore comuni in TLR e interleuchina-1 receptor signaling. Quindi, noi dimostrare per la prima volta che la risposta immunitaria innata dell'embrione in via di sviluppo comporta la segnalazione MyD88-dipendente, che stabilisce ulteriormente l'embrione di zebrafish come modello per lo studio dei vertebrati dell'immunità innata.

La Produzione Di Specie-specifici Altamente Insaturi Grassi Contenenti Acil LCOs Da Rhizobium Leguminosarum Bv. Trifolii è Rigorosamente Regolata Da NodD E Coinvolge I Geni NodRL

Molecular Plant-microbe Interactions : MPMI. Mar, 2006  |  Pubmed ID: 16570652

Una proporzione dei fattori cenno di alcuni Rhizobium leguminosarum bv. trifolii ceppi è caratterizzata dalla presenza di catene acilico grassi altamente insaturi contenenti legami doppi trans nella coniugazione con il gruppo carbonilico del backbone glycan oligosaccaride. Queste catene dell'acilico grassi sono C18:3, C20:3, C18:4 o C20:4 e massimi di assorbimento UV a 303 e 330 nm. Questi fattori Nod si presume di essere importante per nodulation host specifico sulle specie di trifoglio. Tuttavia, nel wild-type r. leguminosarum bv. trifolii ANU843, fattori Nod con queste catene acil caratteristici non sono stati osservati utilizzando condizioni di crescita standard. Essi sono stati osservati solo quando nod geni erano presenti in copie multiple o quando la trascrizione è stata aumentata artificialmente a livelli più alti dall'introduzione delle copie supplementari del nodD gene regolatore trascrizionale. In uno schermo per i requisiti per la produzione dei fattori Nod con queste caratteristiche strutture genetici, si è constatato che la regione a valle del nodo e nodF è essenziale per la presenza di moiety acilico grassi altamente insaturi. MU-lacZ inserimento in questa regione ha prodotto un mutante che ha fatto non producono livelli rilevabili dei fattori di Nod acil-cuscinetto grassi altamente insaturi. L'inserimento di Mu-lacZ translationally è stato fuso a un nuovo gene putativo, designato nodR, nella regione intergenic nodo-nodL; Tuttavia, nessuna funzione prevista per la proteina putativa NodR è stata ottenuta dalle ricerche di omologia del database. In un set di 12 ceppi wild-type di r. leguminosarum da. trifolii provenienti da diverse regioni geografiche che sono stati analizzati per la presenza di un gene nodR-come si è constatato che sette ceppi portano un omologo NodR open reading frame. Presi insieme, i nostri risultati suggeriscono un regolamento strettamente controllato di geni nod, in cui proponiamo che è l'equilibrio di transcriptional livelli di nodFE e i geni di nodRL che è fondamentale per determinare la presenza di moiety acilico grassi altamente insaturi nei fattori Nod prodotto da r. leguminosarum bv. trifolii.

Clonazione, Espressione Funzionale E Caratterizzazione Di Mesorhizobium Loti Arilammina N-acetiltransferasi: Simbiosi Organismo Fornisce Piante Leguminose Con Il Sentiero N-acetilazione Xenobiotico

Molecular Microbiology. Apr, 2006  |  Pubmed ID: 16573698

Arilammina N-acetiltransferasi (NAT) sono metabolizzare xenobiotici enzimi coinvolti nella detossificazione di numerose sostanze chimiche aromatiche. Il percorso N-acetilazione NAT-dipendente non è stato precedentemente rilevato in piante. Qui mostriamo l'occorrenza del percorso in piante leguminose, grazie alla simbiosi con Mesorhizobium loti NAT-dipendente. Abbiamo clonato due enzimi NAT da loti M. e ha dimostrato che questi due enzimi ricombinanti catalizzato il N-acetilazione di diversi noti substrati NAT, compresi i residui di pesticidi derivati di anilina. Abbiamo anche dimostrare l'esistenza di una funzionale via acetilazione NAT-dipendente in noduli di Lotus japonicus inoculati con loti M. radice. Loti M. è il primo organismo eucariotico-non indicato per esprimere due isoforme NAT cataliticamente attive. Questo lavoro fornisce anche la prima prova per l'acquisizione di una via di detossificazione di xenobiotici da una pianta attraverso la simbiosi con un microbo di terreno.

Pattern Di Espressione E Caratterizzazione Della Famiglia MAPK Nello Zebrafish

Gene Expression Patterns : GEP. Oct, 2006  |  Pubmed ID: 16774848

La famiglia via chinasi (MAPK) proteina attivata mitogene è conservata nell'evoluzione attraverso il regni animale e vegetale. Queste proteine sono state implicate in diversi processi cellulari, tra cui sviluppo, proliferazione, differenziazione, sopravvivenza e crescita delle cellule. In questo studio abbiamo annotato e clonato membri della famiglia-zebrafish MAPK gene, contenente le sottofamiglie ERK, JNK e p38. Loro sequenze sono stati confrontati a orthologs di altri vertebrati (umano, del mouse e ratto) e sono stati determinati i livelli di espressione temporale e spaziale dei geni mapk zebrafish durante lo sviluppo iniziale di zebrafish. Reverse transcriptase-PCR semiquantitativa analisi hanno rivelato che la maggior parte dei geni di mapk sono espressi durante lo sviluppo dello zebrafish. Erk2, 3 e p38a sono state espresse a livello costante durante l'embriogenesi di zebrafish, considerando che erk1, 4, 5, 6, 7 e p38b ha mostrato i modelli di espressione temporale specifico. I modelli di espressione spaziale sono stati ottenuti da montare tutto in situ hybridization alla fecondazione post di 24 h (hpf) e 48 embrioni hpf. I modelli di espressione erano localizzati in regioni specifiche in entrambe le fasi e furono strettamente regolati durante l'embriogenesi. Per p38b, nessuna colorazione è stata rilevata a 24 e 48 hpf. Tuttavia, l'espressione è stata dimostrata blastula-fase. Insieme, abbiamo individuato il orthologs di zebrafish della famiglia genica zebrafish MAPK e determinato la loro espressione spaziale e temporale specifica e modelli di distribuzione durante l'embriogenesi zebrafish.

Microscopia a Risonanza Magnetica Di the Zebrafish Adulto

Zebrafish. 2006  |  Pubmed ID: 18377223

Microscopia a risonanza magnetica (MRM) è una modalità di imaging che permette di acquisizione non invasiva di immagini ad alta risoluzione in animali opachi intatti. Il Danio zebrato (Danio rerio) è un importante organismo modello per lo studio della biologia vertebrato. Tuttavia, ottici studi in vivo in zebrafish sono limitati ai primissimi stadi dello sviluppo a causa opacità degli stadi giovanili e adulti. Applicazione di alta risoluzione MRM non è ancora stata esplorata in zebrafish adulto. In questo studio abbiamo applicato e ottimizzato metodi MRM ad alta risoluzione per esaminare le strutture anatomiche in modo non invasivo in zebrafish adulto. Immagini protone chiaro morfologici sono stati ottenuti da T (2)-ponderata spin-eco e rapida acquisizione con rapida acquisizione con sequenze di valorizzazione (RARE) di rilassamento che ha rivelato molti dettagli anatomici nell'intero zebrafish intatto in un campo magnetico di 9,4 T. Inoltre, imaging in vivo di zebrafish adulto ha rivelato dettagli anatomici sufficienti. A nostra conoscenza questo è il primo rapporto dell'applicazione di gestione record di messaggistica ad alta risoluzione per studiare le strutture anatomiche dettagliate nello zebrafish adulto.

Caratterizzazione Genetica E Transcriptome Di Linee Cellulari Di Modello Zebrafish

Zebrafish. 2006  |  Pubmed ID: 18377224

Confrontato con l'uso crescente di zebrafish come organismo modello in molti laboratori, linee di cellule zebrafish sono ancora non sfruttate e limitata applicazione, parzialmente a causa delle loro proprietà genetiche e fisiologiche sconosciuto. Ci caratterizzano due zebrafish fibroblasti embrionali linee cellulari, ZF4 e PAC2. Noi dimostrare la stabilità genetica di queste due linee di cellule zebrafish e raggiunto la manipolazione genetica dalla transfezione mediata da lipidi o un metodo nucleofection elettroporazione-basato. Dati dall'analisi di chip di zebrafish (Affymetrix) dimostrano caratteristiche uniche di queste linee di due cellulari nei livelli di espressione genica, mostrando che zebrafish diverse linee cellulari possono essere classificate dal loro profilo transcriptome. Loro risposte transcriptional all'esposizione di fattore di crescita di siero suggeriscono che linee di cellule di fibroblasti zebrafish possono essere utilizzati per studiare i processi correlati alla guarigione delle ferite o cancro.

Danio Rerio: Fluorescente in Situ Ibridazione Protocollo E Imaging Tridimensionale Dei Pattern Di Espressione Genica

Zebrafish. 2006  |  Pubmed ID: 18377226

Vi presentiamo un metodo e un protocollo per l'ibridazione in situ fluorescente (FISH) in embrioni di zebrafish per abilitare imaging tridimensionale dei pattern di espressione genica mediante scansione microscopia confocal del laser. Descriviamo lo sviluppo del nostro protocollo e il flusso di lavoro di elaborazione delle immagini tridimensionali da microscopio confocale. Ci riferiamo a questo protocollo come zebraFISH. PESCE si basa sull'uso di amplificazione del segnale tyramide (TSA), che si traduce in colorazione fluorescente altamente sensibile e molto localizzata. Il protocollo di zebraFISH è stato ampiamente testato e qui di seguito presentiamo un pannello di cinque sonde per geni espressi in diversi tessuti o cellule singole. PESCE in combinazione con microscopia di scansione laser confocale fornisce un ottimo strumento per generare immagini tridimensionali dei pattern di espressione genica. Proponiamo che tali immagini tridimensionali sono adatti per la costruzione di un repository di modelli di espressione genica, complementari alla nostra precedentemente pubblicato atlante anatomico tridimensionale dello sviluppo dello zebrafish (bio-imaging.liacs.nl/). La nostra metodologia per l'elaborazione di immagini di immagini tridimensionale confocale permette un approccio analitico per la definizione del gene domini di espressione basate sull'atlante anatomico tridimensionale.

Singola Molecola Diffusione Rivela Mobilità Simile Per La Lck, H-ras E K-ras Ancore Di Membrana

Biophysical Journal. Aug, 2006  |  Pubmed ID: 16920696

Recenti prove sull'occorrenza di piccole dimensioni (diametro di 5-700 nm) microdomains lipido l'opuscolo della exoplasmic della membrana del plasma ha suscitato interesse nella possibilità che domini simili possono essere presenti anche nel foglietto illustrativo citoplasmatica della membrana del plasma. Tuttavia, le conoscenze attuali su queste "zattere lipidiche", in cellule vive sono limitata. Un modo per ottenere comprensione in ricorrenza e la dimensione delle zattere lipidiche è l'uso della microscopia di singola molecola, che permette di studiare il movimento diffusivo di singole molecole con elevata accuratezza posizionale e temporale. Utilizzando questa tecnica, abbiamo confrontato il comportamento di diffusione dell'ancoraggio Lck membrana, che ha un'alta affinità per le zattere lipidiche, il comportamento di diffusione dell'ancoraggio di membrana del K-Ras, che ha affinità trascurabile per zattere e confrontato i risultati con quelli dell'ancoraggio della membrana del H-Ras. Sorprendentemente, abbiamo trovato solo lievi differenze nel comportamento di diffusione delle varie ancore lipidiche, che indica che le zattere lipidiche putativo foglietto citoplasmatico avrebbe dovuto essere piccolo (< 137 diametro nm) e non influenzano la mobilità delle molecole di membrana ancorate molto su scadenze fino a 60 ms.

Funzioni Della Famiglia MAPK in Sviluppo Vertebrato

FEBS Letters. Sep, 2006  |  Pubmed ID: 16949582

Il mitogene attivata proteina chinasi (MAPK) famiglia, consistente della chinasi di proteina extracellulare segnale regolato, c-Jun ammino terminale MAPK e p38 sottofamiglie, è conservata nell'evoluzione in tutta la pianta e regni animale. Queste proteine sono state implicate in diversi processi cellulari, tra cui sviluppo, migrazione, proliferazione, differenziazione, sopravvivenza e crescita delle cellule. Approcci gene-targeting in zebrafish, polli, rane e topi hanno rivelato ruoli cruciali di MAPK in sviluppo vertebrato. Rottura del gene o - silenziamento spesso portano ad effetti letali, quindi zebrafish ex utero sviluppo fornisce un eccellente modello in vivo per studiare la funzione di MAPK nella embriogenesi precoce. In questa recensione, abbiamo riassumere l'attuale comprensione della funzione sviluppo vertebrato famiglia MAPK e mettere questo nella prospettiva di possibilità per future ricerche.

Caratterizzazione Dei Cloni Genomici E Analisi Di Espressione Dei Tre Tipi Di Dismutasi Superossido Durante Lo Sviluppo Del Nodulo in Lotus Japonicus

Molecular Plant-microbe Interactions : MPMI. Mar, 2007  |  Pubmed ID: 17378429

Dismutasi (SOD) di superossido sono metalloenzymes che gioca un ruolo primario nella protezione contro lo stress ossidativo in piante e altri organismi. Ci hanno caratterizzato quattro geni SOD in Lotus japonicus e hanno analizzato la loro espressione nelle radici e quattro stadi di sviluppo dei noduli. L'espressione di CuZnSOD citosolico, al mRNA, proteina e livelli di attività enzimatica, diminuisce con l'età del nodulo e la proteina è localizzata nel dividendo celle e thread infezione dei noduli emergente e in cellule infette del giovane noduli. Il MnSOD mitocondriale era downregolata, mentre il MnSOD bacteroidal visualizzato massimali livelli di attività di proteine ed enzimi nei noduli più anziani. Due altri geni, codifica plastidic (FeSOD1) e isoforme citosoliche di FeSOD (FeSOD2), sono stati identificati e mappati. I geni si trovano nei cromosomi differenti e mostrano espressione differenziale. Il livello di mRNA FeSOD1 non cambia durante lo sviluppo del nodulo, mentre FeSOD2 era sovraregolato. I modelli distinti di espressione dei geni SOD possono riflettere diversi meccanismi di regolamentazione delle attività enzimatica durante l'ontogenesi del nodulo. In particolare, a livello di mRNA e attività, la perdita virtuale di CuZnSOD citosolico in noduli maturi e vecchi, concomitante con l'induzione di FeSOD2, suggerisce che i due enzimi possono funzionalmente compensano nel citosol alle ultime fasi dello sviluppo del nodulo.

Modelli Di Sistemi Per Malattie Infettive E Il Cancro in Zebrafish: Una Relazione Su Un Laboratorio Di EMBO Tenuto Presso Il Centro Di Lorentz, Leida, I Paesi Bassi, 16-18 Luglio 2007

Zebrafish. 2007  |  Pubmed ID: 18284335

DNA Computing Di Soluzioni Ai Problemi Dello Zaino

Bio Systems. Mar, 2007  |  Pubmed ID: 16860927

Una linea di ricerca informatica del DNA si concentra su algoritmi di ricerca parallela, che possono essere usati per risolvere molti problemi di ottimizzazione. DNA in soluzione è in grado di fornire un'enorme libreria molecolare, che può essere ricercata mediante tecniche molecolari biologiche. Abbiamo implementato tale parallela ricerca di soluzioni ai problemi dello zaino, che chiedono il modo migliore confezionare un zaino di volume limitato. Diversi casi di problemi dello zaino sono stati risolti utilizzando il DNA. Dimostreremo come i calcoli possono essere estesa dalla traduzione in vivo della libreria del DNA in proteina. Questa combinazione di DNA e proteine consente di ottimizzazione multicriterio. I calcoli dello zaino eseguiti quindi possono essere visto come le ottimizzazioni della proteina, uno dei più complessi calcoli eseguiti da sistemi naturali.

ERK1 Ed ERK2 MAPK Sono Regolatori Chiave Di Distinti Gene Sets in Zebrafish Embriogenesi

BMC Genomics. 2008  |  Pubmed ID: 18442396

Le proteine di segnalazione MAPK sono coinvolti in molti processi cellulari eucariotici e reti di segnalazione. Funzioni specifiche della maggior parte di queste proteine in sviluppo vertebrato rimangono tuttavia inafferrabile a causa di potenziali esuberi. Per esempio, i percorsi di attivazione a monte per ERK1 ed ERK2 sono molto simili, e anche molti dei loro obiettivi noti a valle sono comuni. In contrasto, topi e zebrafish studi indicano i ruoli distinti per entrambi ERKs nella proliferazione cellulare, trasformazione oncogenica e sviluppo. Un grande collo di bottiglia per ulteriori studi è che si sa relativamente poco di in vivo downstream segnalazione specifici per queste chinasi.

Un Aumento Spazialmente Limitato Mobilità Del Recettore è Coinvolto Nella Rilevazione Direzionale Durante Dictyostelium Discoideum Chemiotassi

Journal of Cell Science. May, 2008  |  Pubmed ID: 18469015

La migrazione cellulare diretto verso una fonte chemiotattica, chemiotassi, coinvolge tre processi complessi e interrelati: rilevamento direzionale, polarizzazione cellulare e motilità. Direzionale di rilevamento consente la migrazione negli eucarioti cellule di chemiotassi in estremamente superficiale gradienti (< 2% attraverso il corpo della cella) della chemoattractant. Sebbene rilevamento direzionale è stata osservata come risposte spazialmente limitate lungo la membrana del plasma, la nostra comprensione della; bussola della cella che controlla la traslocazione indotta dal gradiente di proteine durante i movimenti chemiotattici è ancora largamente carente. Fino ad ora, il comportamento dinamico e la mobilità della molecola recettore chemoattractant è stata trascurata in modelli che descrivono i meccanismi di rilevamento direzionale. Qui, vi mostriamo da microscopia di singola molecola un aumento agonista-indotta nella frazione mobile di cAMP-recettore all'avanguardia del chemotacting Dictyostelium discoideum cellule. L'insorgenza della mobilità del recettore è stata correlata a disgiungere e attivazione della proteina-Galpha2. Una simulazione di elementi finiti ha mostrato che l'aumento della frazione cellulare del recettore attivato attivato la generazione amplificata di attivato Gbetagamma-dimeri all'avanguardia della cellula, che ne rappresenta fedelmente un passo di amplificazione lineare primario nel rilevamento direzionale. Vi proponiamo qui che modulazione della mobilità del recettore è direttamente coinvolto nella rilevazione direzionale e fornisce una nuova base meccanicistica per il passo di amplificazione primaria nelle attuali modelli teorici che descrivono rilevamento direzionale.

Funzioni Distinte Per ERK1 Ed ERK2 Nei Processi Di Migrazione Delle Cellule Durante La Gastrulazione Di Zebrafish

Developmental Biology. Jul, 2008  |  Pubmed ID: 18514184

Il MAPKs sono molecole di segnalazione regolatori chiave in molti processi cellulari. Qui definiamo differenziale funzioni per ERK1 ed ERK2 MAPKs in zebrafish embriogenesi. Oligonucleotides atterramento di ERK1 ed ERK2 provocato difetti di migrazione delle cellule durante la gastrulazione, che potrebbe essere salvato da co-iniezione di mRNA corrispondente. Sorprendentemente, Erk2 mRNA cross-salvato ERK1 atterramento, ma erk1 che mRNA è stato in grado di compensare per atterramento di ERK2. Cella-tracing esperimenti ha rivelato un difetto di convergenza per ERK1 morphants senza un grave difetto posteriore-estensione, mentre ERK2 morphants ha mostrato una riduzione più grave in estensione antero-posteriore. Questi difetti sono state apportate modifiche primarie nella gastrulazione movimenti delle cellule e non causato dalla specifica di destino delle cellule alterate. Saturando condizioni atterramento mostrò che l'assenza di FGF-mediata ERK2 dual-fosforilata dal margine blastula bloccato l'avvio di processi di riorganizzazione del citoscheletro epiboly, actina e tubulina e ulteriormente arrestato l'embriogenesi, mentre ERK1 atterramento aveva solo un lieve effetto sulla progressione epiboly. Insieme, i nostri dati definiscono ruoli distinti per ERK1 ed ERK2 nei processi di migrazione cellulare dello sviluppo durante l'embriogenesi zebrafish.

Candidati Per Recettori Di Membrana Progestinico - Passato Gli Approcci E Le Sfide Future

Comparative Biochemistry and Physiology. Toxicology & Pharmacology : CBP. Nov, 2008  |  Pubmed ID: 18602498

Progestinici hanno una vasta gamma di funzioni in biologia riproduttiva. Molte azioni di rapido nongenomic di progestinici sono state identificate, tra cui l'induzione della maturazione ovocitaria, modulazione di segnalazione riproduttiva nel cervello, attivazione rapida della mammella Cancro cell signaling, induzione della reazione acrosomale e ipermotilità nello sperma dei mammiferi. Attualmente, ci sono tre candidati del recettore per mediare le azioni rapide progestinico: recettori di membrana (1) progestinico (mPRs); (2) componenti della membrana del recettore progestinico (PGRMCs); e (3) recettori nucleari progestinico (nPRs). La famiglia recentemente descritto mPR delle proteine ha sette domini transmembrana integrale e da intermediario segnalazione tramite vie di proteine G accoppiate. I PGRMCs hanno una singola transmembrana con domini di omologia Src putativi per l'attivazione del potenziale dei messaggeri secondo. Il nPRs classico, oltre ad avere ben definite attività trascrizionale, può anche mediare rapida attivazione delle vie di segnalazione intracellulare. Tuttavia, i dettagli dei meccanismi con cui queste tre classi di recettori progestinici mediano rapida segnalazione intracellulare e la loro localizzazione sottocellulare rimangono poco chiari. Inoltre, mPRs, nPRs e PGRMCs presentano sovrapposte espressione e funzioni nei tessuti multipli, implicando potenziali interazioni durante la maturazione degli ovociti, parto e il cancro al seno di segnalazione in singole celle. Tuttavia, la stragrande maggioranza degli studi fino ad oggi si è concentrati sulle funzioni di uno di questi gruppi di recettori in isolamento. Questa recensione riassumerà le recenti scoperte sui tre candidati del recettore progestinico principali, sottolineando i diversi approcci utilizzati, alcuni trabocchetti sperimentale e le controversie attuali. Inoltre esamineremo prove del coinvolgimento di mPRs e nPRs in una delle azioni più ben caratterizzate nongenomic steroidi nei vertebrati basali, maturazione degli ovociti e concludere suggerendo alcune future aree di ricerca. Chiarimento delle polemiche che circondano l'identità e la localizzazione dei recettori di membrana progestinico può aiutare diretta ricerca futura che potrebbe avanzare la nostra comprensione delle azioni rapide di steroidi.

Anguille D'argento Maschile Maturo a Nuoto

BMC Physiology. 2008  |  Pubmed ID: 18616800

Se anguille argento europee sono impedite di migrazione riproduttiva, rimangono in una fase prepuberale da dopaminergico inibizione dell'attività ipofisaria. Perché questa inibizione è probabilmente un requisito per una fase di crescita femminile estesa, abbiamo testato se è sesso-specifici da sottoporre entrambi i sessi a stimolazione di GnRHa (GnRH agonista) - iniezione o 3 mesi di nuoto in acqua di mare.

Fototermica Rilevamento Delle Singole Nanoparticelle D'oro: Prospettive Per High-throughput Screening

Chemphyschem : a European Journal of Chemical Physics and Physical Chemistry. Aug, 2008  |  Pubmed ID: 18666264

Usiamo fototermica microscopia per rilevare e immagini singole nanoparticelle d'oro che sono incorporate in un film polimerico o immobilizzate in un ambiente acquoso. Riducendo l'apertura numerica dell'ottica rilevazione ci permette di raggiungere un volume di rilevamento allargata a 200 volte mantenendo comunque detectivity sufficiente. Ci caratterizzano le funzionalità di questo approccio per l'individuazione dei colloidi d'oro con un diametro di 20 nm, con enfasi sugli aspetti pratici che sono importanti per le applicazioni high-throughput screening. Il volume di rilevamento estesa in combinazione con la stabilità del segnale fototermica sono vantaggi principali rispetto ad approcci basati sulla fluorescenza, che sono limitati dal photoblinking e photobleaching. Attenta considerazione è il compromesso tra il massimo aumento della temperatura locale che può essere tollerata da un biologico esemplare e tempo di integrazione minima necessaria per determinare in modo affidabile se un determinato volume contiene una specie bersaglio. Troviamo che il nostro approccio ha il potenziale per aumentare la portata di rilevazione limitata (cioè il limite dato dal volume rilevazione diviso per il tempo di rilevamento minimo) da due a tre ordini di grandezza.

Analisi Delle Interazioni Delle Proteine Con Ligandi Dei Fagi-visualizzato Di Segnalazione Di Spettroscopia Di Correlazione Di Fluorescenza

Journal of Biomolecular Screening. Sep, 2008  |  Pubmed ID: 18753688

Spettroscopia di correlazione di fluorescenza (FCS) era utilizzata per misurare l'affinità di legame dei ligands ai ligates che vengono espresse da tecnologia phage display. Utilizzando questo metodo noi abbiamo quantificato l'associazione della proteina 14-3-3 segnalazione ad ligando artificiale del peptide. Come un ligando abbiamo usato il peptide artificiale R18 espresso come una fusione della proteina del cappotto di cpIII che è presente in 3 a 5 copie in un fago M13. Confronti di affinità di associazione sono stati realizzati con liberi R18 ligandi utilizzando FCS. Il risultato ha mostrato un'affinità di legame relativamente alto per fagi-visualizzato R18 peptide confrontato con l'associazione gratuita R18 fluorescente contrassegnati. Quantificazione è stato supportato dalla titolazione dei numeri dei fagi mediante microscopia a forza atomica (AFM). AFM ha dimostrato di determinare con precisione i numeri dei fagi in soluzione come una buona alternativa per la microscopia elettronica. È stato dimostrato di fornire dati affidabili che correlato perfettamente con quelli dei numeri dei fagi vitali determinati dagli studi classici di infezione batterica. In conclusione, un metodo molto sensibile e veloce per la selezione di nuovi ligandi peptidici o ligates basato su un dosaggio quantitativo in soluzione è stato sviluppato.

Identificazione E L'imaging in Tempo Reale Di Una Popolazione Del Neutrofilo Che Esprimono Myc Coinvolta Nell'infiammazione E Formazione Di Granuloma Micobatterica in Zebrafish

Developmental and Comparative Immunology. 2008  |  Pubmed ID: 17553562

Da trap rinforzatore di screening abbiamo identificato una linea transgenica di zebrafish mostrando espressione YFP specifici dei leucociti durante la fine dell'embrione e precoce sviluppo larvale. Vicino romanzo membro della famiglia proto-oncogene myc codifica fattori di trascrizione, noti per essere importante per la regolazione myelopoiesis umano è stato mappato il suo inserimento di rilevamento enhancer. Caratterizzazione della famiglia zebrafish myc ha mostrato che solo questo gene myc particolare è fortemente espresso nei leucociti. Per identificare il tipo di cella myc/YFP-esprimendo, abbiamo riesaminato specificità dei marcatori mieloidi descritti da multiplex ibridazione in situ fluorescente, mostrando che lcp1 può essere considerato come un indicatore generale del leucocita, csf1r come un marcatore specifico del macrofago e mpx e lyz come marcatori specifici di neutrofili. Analisi successive presenza definite cellule YFP-positivo come un sottoinsieme della popolazione dei neutrofili. Utilizzo in tempo reale immagini confocal dimostreremo che queste cellule migrano verso siti di infiammazione e sono coinvolte nella risposta immunitaria innata verso infezioni, compresa la formazione di granuloma indotto marinum Mycobacterium.

Scoperta Di Un Glucocorticoide Funzionale Del Recettore Beta-isoforma Nello Zebrafish

Endocrinology. Apr, 2008  |  Pubmed ID: 18096659

Negli esseri umani, esistono due varianti di giuntura di recettore (GR) di glucocorticoidi: GRalpha e GRbeta, che sono identici tra aminoacidi 1-727 e poi diverge. Considerando che GRalpha (il canonico GR) agisce come un fattore di trascrizione attivato dal ligando, GRbeta non associare agonisti glucocorticoidi tradizionale, priva di attività transactivational di GRalpha e agisce come un inibitore dominante negativo di GRalpha. Si è ipotizzato che questa isoforma del recettore è coinvolto nell'induzione della resistenza ai glucocorticoidi in pazienti asmatici. Purtroppo, un'isoforma beta GR è stato rilevato nel solo gli esseri umani, e pertanto, un modello animale per gli studi su questo isoform è carente. Nel presente studio, ci dimostrano che nello zebrafish un GR isoforma esiste che diverge dal canonico zebrafish GR nella stessa posizione come umano GRbeta da GRalpha umano. Il Danio rerio GR beta-isoforma agisce come un inibitore dominante-negativo in dosaggi di reporter, e nella misura di inibizione e il rapporto GRalpha/GRbeta efficacia è simile a studi effettuati con l'umano isoforme GR. Inoltre, la localizzazione sottocellulare di zebrafish GRbeta è simile al suo equivalente umano. Infine, i livelli di espressione di GRalpha e GRbeta sono stati determinati in tessuti di zebrafish adulto e a diversi stadi di sviluppo. Due isoforme del recettore sono stati rilevati in tutto il corpo, e livelli di mRNA di GRbeta erano relativamente bassi rispetto ai livelli di mRNA di GRalpha, come gli esseri umani. Così, per la prima volta, un'isoforma GR beta è stata identificata in una specie animale nonhuman, nuova luce sulla rilevanza di questa variante di splice GR e fornendo un versatile modello animale per gli studi sul sistema di GR.

Malattia Di Modellazione in Zebrafish: Cancro E Risposte Immunitarie - Una Relazione Su Un Seminario Tenuto a Spoleto, Italia, 20-22 Luglio 2009

Zebrafish. Dec, 2009  |  Pubmed ID: 20047471

Il crescente interesse utilizzando zebrafish per dissezione genetica e funzionale di malignità e l'infezione è stato evidenziato con il secondo workshop internazionale su modelli di Zebrafish di cancro e la risposta immunitaria a Spoleto, Italia (20-22 luglio 2009). Il tema dei rapporti stato-of-the-art presenti l'unica idoneità di zebrafish per monitoraggio in vivo dei fondamentali processi biologici e patologici. Per esempio, imaging in vivo è stato impiegato per la prima dimostrazione dello sviluppo diretto di cellule staminali ematopoietiche da epitelio hemogenic e per la visualizzazione di homing delle cellule T e interazione con le cellule epiteliali del timo. Inoltre, monitoraggio in vivo è stato determinante per lo sviluppo di modelli di malattia dei tumori solidi, leucemie e delle condizioni infiammatorie e per valutare l'efficacia di farmaci piccola molecola in condizioni fisiologiche e patologiche. Il successo di schermi di piccole molecole di zebrafish è stato sottolineato dall'identificazione della prostaglandina E2 (PGE2) come un'efficiente induttore di espansione di cellule staminali che hanno causato l'avvio della prima sperimentazione umana sull'efficacia della PGE2 nel trapianto di midollo osseo. Ulteriormente, sono stati stabiliti zebrafish modelli di malattie infettive come la tubercolosi che ora sono suscettibili di alto-rendimento in vivo droga schermi, uno sviluppo tanto necessaria nella lotta contro microrganismi farmaco-resistenti. Il successo di questo workshop e rapidamente nel settore del cancro e la risposta immunitaria in zebrafish hanno generato incontri follow-up a Boston (giugno 2010) ed Edimburgo (2011).

Transcriptome Analisi Funzionale E Profilatura Di Zebrafish Embrionale Innato Risposta Immunitaria All'infezione Da Salmonella

Journal of Immunology (Baltimore, Md. : 1950). May, 2009  |  Pubmed ID: 19380811

A causa della netta separazione dell'immunità innata da risposte adattative, l'embrione di zebrafish esternamente in via di sviluppo rappresenta un modello in vivo utile per l'identificazione dei determinanti host innata della risposta all'infezione batterica. Qui abbiamo effettuato un corso di tempo transcriptome analisi studio e gene analisi di ontologia della risposta immunitaria innata embrionale all'infezione con due ceppi di Salmonella modello che suscitano un'infezione letale o una risposta attenuata. La risposta trascrizionale all'infezione con il ceppo letale sia il ceppo mutante di LPS O-Ag avirulente ha mostrato chiare conservazione con risposte host rilevate in altri modelli vertebrati e cellule umane, compresa l'induzione di geni che codificano per i recettori superficie cellulare, signaling intermediates, fattori di trascrizione e mediatori infiammatori. Inoltre, il nostro studio ha portato all'identificazione di un grande insieme di infezione e risposta immunitaria romanzo geni marcatori, la futura Caratterizzazione funzionale di cui sosterrà annotazione genoma vertebrati. Le serie temporali e i confronti ceppo batterico, geni di matrix metalloproteinase, compreso mmp9, erano tra i geni di infezioni-sensibli a reagire più coerenti. Purificato flagellina Salmonella indotta anche fortemente mmp9 espressione. Utilizzando analisi di atterramento, abbiamo dimostrato che questo gene era a valle del Danio rerio omologhi del recettore della flagellina TLR5 e l'adattatore MyD88. Inoltre, mediata da flagellina induzione di altri marcatori di infiammazione, tra cui il1b, il8 e cxcl-C1c, è stato ridotto su Tlr5 atterramento, nonché espressione di irak3, un putativo regolatore negativo di pathway TLR. Infine, abbiamo dimostrato che l'induzione di il1b, mmp9 e irak3 richiede Myd88-dipendente di segnalazione, mentre erano ifn1 e il8 indotta Myd88 indipendentemente durante l'infezione da Salmonella.

Specificità Della Risposta Dell'ospite Transcriptome Zebrafish Infezione Micobatterica Acuta E Cronica E Il Ruolo Dei Componenti Di Sistema Immunitario Innati E Adattivi

Molecular Immunology. Jul, 2009  |  Pubmed ID: 19409617

Micobatteri patogeni hanno la capacità di sopravvivere all'interno dei macrofagi e persistono all'interno dei granulomi. Contrassegnato alterazioni del profilo di espressione del gene host come risultato delle interazioni ospite-patogeno complesse che determinano l'esito di un processo di infezione micobatterica. Qui abbiamo usato il modello zebrafish per studiare la specificità della risposta dell'ospite alle infezioni con due ceppi di mycobacterium che danno risultati distinti malattia: una malattia acuta con mortalità precoce o una malattia cronica con formazione di granuloma, causate da ceppi di Mycobacterium marinum Mma20 ed E11, rispettivamente. Abbiamo effettuato uno studio microarray di diversi stadi di progressione della malattia in zebrafish adulto e ha trovato che l'acuta e croniche ceppi evocato parzialmente sovrapposti firme transcriptome host, nonostante che inducono fenotipi malattia profondamente diverse. Entrambi i ceppi colpite molte cascate di segnalazione, tra cui percorsi WNT e TLR. È interessante notare le differenze più forti sono state osservate nella fase iniziale della malattia. La risposta immediata al ceppo acuta è caratterizzata da maggiore espressione dei geni codifica MHC classe I proteine, matrix metalloproteinases, fattori di trascrizione, citochine e altre proteine comuni la risposta immunitaria. Al contrario, piccola GTPasi e istone gene gruppi hanno mostrato maggiore espressione in risposta al ceppo cronico. Abbiamo anche trovato che quasi il 1000 mycobacterium-reattiva geni sovrappongono tra le firme di espressione degli adulti infetti zebrafish ed embrioni nelle diverse fasi della formazione di granuloma. Poiché zebrafish adulto possiedono un sistema immunitario adattativo simile a mammiferi ed embrioni di zebrafish si basano esclusivamente sull'immunità innata, questa sovrapposizione indica un importante contributo della componente innata del sistema immunitario in risposta alle infezioni micobatteriche. Presi insieme, il nostro confronto delle risposte transcriptome coinvolte in acuto versus infezioni croniche e in embrionali versus adulti situazione fornisce importanti nuovi cavi per indagare il meccanismo di patogenesi micobatteriche.

Zebrafish Sviluppo E Rigenerazione: Nuovi Strumenti Per La Ricerca Biomedica

The International Journal of Developmental Biology. 2009  |  Pubmed ID: 19557689

Ricerca di base nella formazione del modello riguarda la generazione di fenotipi e tessuti. Può quindi portare a nuovi strumenti per la ricerca medica. Questi includono le analisi fenotipica screening, applicazioni in tissue engineering, nonché generale i progressi nelle conoscenze biomediche. Il nostro obiettivo è quello di discutere questo campo emergente, con particolare riferimento a strumenti basati sulla biologia dello sviluppo dello zebrafish. Descriviamo screening fenotipica dosaggi in fase di sviluppo nel nostro e in altri laboratori. Nostri saggi riguardano: (i) amministrazione locale o sistemica di un composto in esame o farmaco di zebrafish in vivo; (ii) la successiva rilevazione o "lettura" di un cambiamento fenotipico definito. Una lettura positiva può provocare dal legame del composto in esame ad un target molecolare coinvolto in un percorso di sviluppo. Vi presentiamo i dati preliminari sui dosaggi per composti che modulano la creazione dello scheletro, turnover osseo, risposte immunitarie, infiammazione e stress primi anni di vita. I dosaggi utilizzano live zebrafish embrioni e larve, nonché pesce adulto in fase di rigenerazione della pinna caudale. Descriviamo il proof-of-concept studi sul targeting dei composti localizzati in blastemas di rigenerazione utilizzando microcarriers. Zebrafish sono meno costosi da mantenere di roditori, produrre un gran numero di uova trasparenti, e alcuni saggi di zebrafish potevano essere scalato fino in schermi di media ed alta velocità di trasmissione. Tuttavia, gli avanzamenti in automazione e imaging sono richiesti. Zebrafish non può sostituire i modelli dei mammiferi nella pipeline di sviluppo della droga. Tuttavia, possono fornire un ponte conveniente tra cell-based assays e modelli intero organismo dei mammiferi.

Deep Sequencing Di Zebrafish Transcriptome Risposta All'infezione Da Mycobacterium

Molecular Immunology. Sep, 2009  |  Pubmed ID: 19631987

Tecnologia romanzo high-throughput deep sequencing ha cambiato radicalmente il modo che la complessità funzionale del transcriptomes può essere studiata. Riportiamo sul primo uso di questa tecnologia per ottenere la visione della vasta gamma di risposte di transcriptional che sono associati con un processo di malattia infettiva. Utilizzando il sistema di espressione (DGE) di Solexa/Illumina gene digitale, un metodo di sequenziamento del transcriptome basato su tag, abbiamo studiato modifiche transcriptome mycobacterium-indotta in una specie di vertebrati di modello, il Danio rerio. Abbiamo ottenuto una profondità di sequenziamento di oltre 5 milioni di tag per esempio con forte correlazione tra repliche. Mapping di tag indicato quello espresso di zebrafish adulto sano e infetti oltre il 70% di tutti i geni rappresentati nel database di trascrizione. Confronto dei dati con una precedente analisi multi-piattaforma microarray hanno mostrato che entrambi i tipi di tecnologie identificato regolamento di simili gruppi funzionali di geni. Tuttavia, la natura imparziale di analisi DGE fornito approfondimenti che non potevano ottenere analisi di microarray. In particolare, vi mostriamo che DGE set di dati strumentali per la verifica dei modelli di gene previsto e ci ha permesso di rilevare mycobacterium-regolato il passaggio tra trascrizione diverse isoforme. Inoltre, mappatura genomica del DGE indotta da infezione tag form rivelata trascrizione romanzo per il quale mancava qualsiasi precedente prove basate su EST dell'espressione. In conclusione, la nostra analisi di sequenziamento profondo rivelato in profondità l'elevato grado di complessità transcriptional della risposta dell'ospite all'infezione micobatterica e risultò nella scoperta e validazione di nuovi prodotti genici con espressione indotta in soggetti infetti.

Mutanti Di Zebrafish Ricompensa Rivelano Romanzo Trascrizioni Mediando Gli Effetti Comportamentali Dell'anfetamina

Genome Biology. 2009  |  Pubmed ID: 19646228

La dipendenza è una disregolazione dei sistemi di ricompensa del cervello, determinato da diversi complessi percorsi genetici patologici. Il test di preferenza di posto condizionata fornisce una valutazione degli effetti delle droghe in modelli animali, permettendo la ricerca di sostanze biologicamente rilevanti a livello rispetto alla ricompensa. Il nostro laboratorio ha precedentemente segnalato lo sviluppo di un paradigma di preferenza di posto condizionata affidabile per zebrafish. Qui, questo test è stato utilizzato per isolare un dominante N-etil-N-nitrosourea (ENU)-indotta mutante, nessuna dipendenza (nad(dne3256)), che non riesce a rispondere alle anfetamine, e che abbiamo usato come punto di ingresso verso identificare la risposta comportamentale pertinente transcriptional di anfetamine.

Singola Molecola Microscopia Rivela Organizzazione Microdomain Membrana Delle Cellule in Un Vertebrato Vivente

Biophysical Journal. Aug, 2009  |  Pubmed ID: 19686669

È stato possibile per molti anni a studiare la dinamica delle proteine fluorescente contrassegnate da microscopia di singola molecola, ma fino ad ora questa tecnologia è stata applicata solo alle singole cellule in coltura. In questo studio, è stato esteso a cellule staminali e gli organismi vertebrati viventi. Come una molecola di interesse che abbiamo usato giallo fuso proteina fluorescente per l'ancoraggio di membrana H-Ras umana, che ha dimostrato di costituire un modello per le proteine ancorate nella membrana del plasma. Abbiamo usato un setup di microscopia di fluorescenza grandangolari per visualizzare singole molecole in una linea cellulare di zebrafish (ZF4) e nelle cellule staminali embrionali primarie. Un setup di riflessione interna totale microscopia è stato utilizzato per l'imaging negli organismi viventi, in particolare nelle cellule epidermiche della pelle di embrioni di zebrafish di 2 giorni di età. I nostri risultati dimostrano la presenza di membrane microdomains in cui si limita la diffusione delle proteine di membrana in un organismo vivente. Questa organizzazione di membrana differiva notevolmente da quella osservata in cellule coltivate, illustrando la pertinenza dell'esecuzione singola molecola microscopia negli organismi viventi.

Espressione Temporale Del Recettore Estrogeno Epatica 1, Vitellogenin1 E Vitellogenin2 in Anguille Argento Europee

General and Comparative Endocrinology. Mar, 2010  |  Pubmed ID: 19766647

Perché anguille argento europee mai sono state catturate durante o dopo la loro migrazione riproduttiva 6000 km al Mar dei Sargassi, tutte le conoscenze esistenti sulla loro maturazione sessuale deriva dalla stimolazione ormonale. Anguille d'argento che iniziano la loro migrazione oceanica sono ancora immature con ovociti pre-vitellogenic. Quindi abbiamo ipotizzato che vitellogenesi dovrebbero iniziare con l'espressione del recettore degli estrogeni nel fegato prima che il circolante 17beta-estradiolo (E2) può avere alcun effetto. In questo studio abbiamo seguito la vitellogenesi epatica su 4 iniezioni settimanali con estratti ipofisari carpa (CPE). Nuovo molecolare primers per l'espressione del recettore dell'estrogeno 1 (esr1), vitellogenin1 (vtg1) e vitellogenin2 (vtg2) nel fegato sono stati sviluppati. Sequenze di vtg2 ed esr1 non sono stati descritti in precedenza in Anguilla anguilla. Tutte le anguille hanno mostrato un aumento settimana di lunghezza occhio dimensioni e delle pinne pettorali, che sono segni di precoce maturazione. Lo stesso si è verificato con l'indice di gonadosomatic, l'ovocita stadio e diametro e numero di goccioline di Grasse depositate. Primi vitellogenesi apparvero come un processo in 3 fasi (1) livelli di E2 ed esr1 espressione sono stati aumentati in modo significativo già dopo una sola iniezione, espressione (2) vtg1 e vtg2 erano significativamente aumentati rispettivamente dopo uno e due iniezioni, e (3) vtg1 e vtg2 espressione aumentata ulteriormente dopo iniezioni di tre e quattro. Poi anche aumentata di calcio al plasma (corrisponde con plasma vitellogenin) e tuorlo globuli è comparso negli ovociti. Questi risultati mostrano che esr1 è il primo dei tre geni esaminati che è espressa durante l'insorgenza di vitellogenesi epatica. Inoltre, vitellogenesi ovarica (comparsa di tuorlo globuli in ovociti) si verifica 1-2 settimane dopo l'insorgenza di vitellogenesi epatica.

Identificazione Dei Geni a Valle Hoxb1b: Hoxb1b Come Un Fattore Regolatore Controllo Trascrizionale Reti E Movimento Delle Cellule Durante La Gastrulazione Di Zebrafish

The International Journal of Developmental Biology. 2010  |  Pubmed ID: 19876844

Le proteine Hox sono homeobox contenente i fattori di trascrizione che giocano un ruolo importante nella creazione di serie presuntivo del sistema nervoso centrale e il mesoderma assiale nell'embrione precoce di vertebrati. I geni Hox sono espressi in primo luogo durante le fasi di gastrula e studi recenti suggeriscono che la loro funzione va oltre il loro ruolo come creazione di serie di fattori determinanti. Per migliorare la nostra comprensione del ruolo delle proteine Hox durante lo sviluppo iniziale di vertebrati, abbiamo progettato una strategia per identificare i geni bersaglio dell'hoxb1b di zebrafish tramite sovraespressione e analisi microarray intero genoma. Abbiamo confrontato direttamente i dati di microarray hoxb1b con quelli risultanti dalla sovraespressione eterologa del gene Xenopus XhoxD1 in embrioni di zebrafish. Entrambi i geni sono i geni hox espresso primi nei loro rispettivi embrioni nativi e visualizzare l'espressione spaziale simile pattern. Il trascrittoma di zebrafish è stato analizzato prima dell'inizio dell'espressione del gene endogeno hoxb1b e abbiamo osservato ampia sovrapposizione tra la hoxb1b e la XhoxD1 putativi geni a valle suggerendo conservazione evolutiva funzionale tra questi geni hox. Inoltre, geni che codificano per fattori di trascrizione e le proteine che sono noto per essere coinvolto nel movimento e adesione delle cellule erano sovrarappresentati tra i geni candidati a valle, che indica il coinvolgimento dei geni evolutivamente più antica espressa hox in cella movimento processi e reti di transcriptional.

Metodo Di Isolamento Di RNA Per Singolo Embrione Transcriptome Analisi Nello Zebrafish

BMC Research Notes. 2010  |  Pubmed ID: 20233395

Transcriptome analisi durante l'embriogenesi di solito richiede pool di embrioni per ottenere sufficiente RNA. Quindi, i livelli misurati di espressione del gene rappresentano i livelli di mRNA media dei campioni in pool e la variazione biologica fra gli individui è confuso. Questo può ridurre irreversibilmente la robustezza, la risoluzione o l'espressività dell'esperimento. Pertanto, abbiamo sviluppato un metodo affidabile per isolare abbondante RNA di alta qualità da embrioni individuali per singolo embrione transcriptome analisi utilizzando zebrafish come organismo modello. Metodi disponibili per l'isolamento di RNA embrionale di Danio rerio utilizzano minimamente dieci embrioni. Ulteriore downscaling di questi metodi a un embrione non è praticamente fattibile.

Nuoto Sopprime Vitellogenesi Epatica Nell'europee Femminile Anguille D'argento, Come Indicato Dall'espressione Dell'estrogeno Recettore 1, Vitellogenin1 E Vitellogenin2 Nel Fegato

Reproductive Biology and Endocrinology : RB&E. 2010  |  Pubmed ID: 20302623

Quando europee d'argento anguille (Anguilla anguilla) avventurano nell'Oceano Atlantico per loro 6.000 km semelparous deposizione run al Mar dei Sargassi, sono ancora in una fase prepuberale. Ulteriormente lo sviluppo sessuale sembra essere bloccato da dopaminergico inibizione dell'attività dell'ipofisi e dell'ipotalamo. Recentemente, abbiamo trovato che nuoto per diverse settimane in acqua dolce stimolato l'incorporazione di goccioline di Grasse negli ovociti. Così, è stato ipotizzato che lungo termine nuoto in acqua di mare avrebbe comunicato l'inibizione ulteriormente e sarebbe anche stimolare la produzione di vitellogenin dal fegato.

Funzioni Del Gene Specifico Dei Macrofagi Nell'immunità Innata Spi1 Diretto

Blood. Jul, 2010  |  Pubmed ID: 20424185

Il fattore di trascrizione Spi1/Pu.1 gioca un ruolo cruciale nello sviluppo delle cellule mieloidi nei vertebrati. Nonostante studi approfonditi di Spi1, il gruppo controllato gene rimane in gran parte sconosciuto. Per identificare i geni dipendono Spi1, abbiamo utilizzato una strategia di microarray utilizzando un approccio atterramento in embrioni di zebrafish combinati con ordinamento fluorescenza-attivato delle cellule delle cellule mieloidi da embrioni transgenici. Questo approccio di utilizzo di atterramento con verde fluorescente contrassegnato proteina tipi cellulari specifici era successo nell'identificare geni macrophagespecific nell'immunità innata Spi1 diretto. Abbiamo trovato un gene gruppo downregolata su spi1 atterramento, che è anche arricchito in fluorescenza-attivato ordinati di cellule mieloidi cellule embrionali di una linea transgenica di spi1:GFP. Questo gruppo di gene, che rappresentano i geni bersaglio putativo myeloidspecific Spi1, conteneva tutti i geni precedentemente identificati Spi1-dipendente zebrafish 5 così come un grande insieme di nuovi geni correlati a immunitario. Studi di presenza con marcatori di neutrofili e macrofagi ha rivelato che mfap4, mpeg1, ptpn6 e cxcr3.2 geni erano espressi specificamente in macrofagi embrionale precoce. In un approccio funzionale, abbiamo dimostrato che cxcr3.2 gene, che codifica per il recettore delle chemochine 3.2, è coinvolta nella migrazione di macrofagi nel sito di infezione batterica. Quindi, basato sulla nostra analisi combinata transcriptome, abbiamo scoperto nuovi geni di macrofago-specifico marker precoce, compreso un trasduttore di segnale fondamentale per la migrazione di macrofagi nella risposta immunitaria innata.

In Vivo Imaging a Risonanza Magnetica Per Individuare Il Melanoma Maligno in Zebrafish Adulto

Zebrafish. Jun, 2010  |  Pubmed ID: 20515295

I modelli di cancro zebrafish sono veloci guadagnando terreno nella ricerca sul cancro. La maggior parte dei tumori nello zebrafish sviluppano tardi nella vita, quando i pesci non sono più trasparenti, limitando i metodi di imaging ottici in vivo. Così, di imaging non invasivo per tenere traccia di tumore nello zebrafish adulto rimane impegnativo. In questo studio, abbiamo applicato la risonanza magnetica microimaging (microMRI) per tenere traccia di melanomi spontanei nei modelli stabile zebrafish transgenici che esprimono un'oncoproteina dei tipo RAS e privo di P53 (mitf:Ras::mitf:GFP X p53(-/-)). I tumori in live zebrafish adulto sono stati osservati in varie località utilizzando un T (2)-ponderata fast spin echo sequenza a 9,4 T. Ulteriore, live imaging dei tumori presso campo ultraelevato (17,6 T) ha rivelato eterogeneità significativa del tumore. Questa eterogeneità è stato confermato anche da significative differenze nel tempo di rilassamento trasversa, T(2) misurato in varie regioni del tumore. A nostra conoscenza, questo è il primo rapporto che dimostrano l'applicazione di microMRI per rilevare le posizioni, lo status di invasione, e caratteristiche dei melanomi interne in zebrafish e suggerendo che microMRI non invasiva possono essere applicate per gli studi longitudinali monitorare lo sviluppo del tumore e in tempo reale valutazione degli effetti terapeutici in modelli tumorali zebrafish.

Integrazione Di Informazioni Eterogenee Sequenza Per Microarray Transcriptome-wide Design; Un Esempio Di Zebrafish

BMC Research Notes. 2010  |  Pubmed ID: 20626891

Un microarray completa espressione genica preferibilmente dovrebbe rilevare tutte le sequenze genomiche che possono essere espresso come RNA in un organismo, cioè il trascrittoma. Tuttavia, la nostra conoscenza di un transcriptome di qualsiasi organismo è ancora incompleto e transcriptome informazioni viene continuamente aggiornati. Presentiamo qui, una strategia per integrare le informazioni di sequenza eterogenea che possono essere utilizzati come input per un design aggiornato microarray.

Transcriptome Analisi Della Funzione Traf6 Nella Risposta Immunitaria Innata Di Embrioni Di Zebrafish

Molecular Immunology. Nov-Dec, 2010  |  Pubmed ID: 20851470

TRAF6 è un giocatore chiave presso l'incrocio tra lo sviluppo e l'immunità. L'analisi della sua funzione molecolare in vivo è una grande sfida da gravi difetti di sviluppo e mortalità precoce causata dalla carenza di Traf6 nei topi knock-out di interferire con l'analisi della risposta immunitaria. In questo studio abbiamo utilizzato una nuova strategia per analizzare la funzione di Traf6 in un modello di malattia infettiva Danio rerio-Salmonella. Nel nostro approccio, l'effetto di un Traf6 oligonucleotides traduzione di blocco è stato titolato giù per evitare difetti di sviluppo e la risposta all'infezione in queste condizioni è stato studiato utilizzando la combinazione di analisi di microarray e intero trascrittoma deep sequencing. Transcriptome analisi il knock-down traf6 ha permesso l'identificazione di un set di gene cui reattività durante l'infezione è altamente dipendente Traf6. Analisi di trend di espressione basata sul DataSet risultante identificato nove cluster di geni con profili di risposta caratteristici trascrizione, dimostrando che traf6 ha un ruolo dinamico come un regolatore positivo e negativo. Tra i geni Traf6-dipendente è stato un grande insieme di ben noti geni infiammatori e anti-microbici. Inoltre, abbiamo identificato diversi geni che non erano precedentemente legate ad una risposta all'infezione microbica, come ad esempio il gnrh2 di gene ormone della fertilità e il danno al DNA-regolato autophagy modulatore 1 gene dram1. Con l'utilizzo del modello di embrione di zebrafish ora abbiamo analizzato la funzione in vivo di Traf6 nella risposta immunitaria innata senza interferenza dell'immunità adattativa.

Creazione Di Zebrafish Come Modello Di Esercizio Romanzo: Nuoto Economia, Nuoto-enhanced Crescita Ed Espressione Di Gene Marcatore Di Crescita Del Muscolo

PloS One. 2010  |  Pubmed ID: 21217817

Zebrafish è stata largamente accettato come un modello multidisciplinare di vertebrati, ma la sua utilità come un modello per la fisiologia dell'esercizio è stato ostacolato dalla scarsa conoscenza sulla sua economia di nuoto, nuoto di velocità e costi di trasporto ottima. Pertanto, abbiamo eseguito individuale e numero nuoto esperimenti per quantificare nuoto economia e dimostrare l'esercizio effetti sulla crescita di zebrafish adulto.

Il Regolatore Epigenetico Istone Deacetylase 1 Promuove La Trascrizione Di Un Programma Di Core Neurogena in Embrioni Di Zebrafish

BMC Genomics. 2011  |  Pubmed ID: 21226904

Il regolatore epigenetico istone Deacetylase 1 (Hdac1) è necessario per la specifica e creare una serie di neuroni e glia myelinating durante lo sviluppo del vertebrato sistema nervoso centrale (CNS). Questa funzione di coordinamento per Hdac1 è evolutivamente conservata in zebrafish e mouse, ma non è ben capito il meccanismo di azione del Hdac1 nel SNC in via di sviluppo.

Interazioni Ospite-patogeno Rese Trasparente Con Il Modello Zebrafish

Current Drug Targets. Jun, 2011  |  Pubmed ID: 21366518

Il Danio rerio molto promettente come una droga di high-throughput screening modello per malattie legate all'immunitario, tra cui il cancro e le malattie infiammatorie e infettive. Ciò è dovuto le eccellenti possibilità di imaging in vivo in combinazione con strumenti avanzati per l'analisi di mutanti su scala genomica e grandi. Il contesto del sistema immunitario in via di sviluppo dell'embrione permette di studiare il contributo dei tipi differenti delle cellule immuni alla progressione della malattia. Inoltre, a causa della separazione temporale dell'immunità innata da risposte adattative, zebrafish embrioni e le larve sono particolarmente utili per dissezionare i fattori innati host coinvolti nella patologia. Recenti studi hanno sottolineato la notevole somiglianza del Danio rerio e sistema immunitario umano, che è importante per applicazioni biomediche. Questa recensione è focalizzata sull'uso di zebrafish come modello per le malattie infettive, con enfasi su agenti patogeni batterici. A seguito una breve panoramica del sistema immunitario zebrafish e strumenti e metodi utilizzati per lo studio delle interazioni ospite-patogeno in zebrafish, discutiamo le conoscenze attuali su recettori e componenti di segnalazione a valle che sono coinvolti nella risposta immunitaria innata dell'embrione zebrafish. Riassumiamo recenti intuizioni maturate con l'uso di modelli di infezione batterica, soprattutto il modello Mycobacterium marinum che illustrano le potenzialità del modello zebrafish per lo screening high-throughput farmaco antimicrobico.

Uno Schermo High-throughput Per La Progressione Di Tubercolosi

PloS One. 2011  |  Pubmed ID: 21390204

Un terzo della popolazione mondiale è stato infettato da Mycobacterium tuberculosis e ceppi multifarmacoresistenti stanno rapidamente evolvendo. L'evidente assenza di un sistema di high-throughput screening di tutto l'organismo per studiare la progressione della tubercolosi sta rapidamente diventando il collo di bottiglia nella ricerca di tubercolosi. Abbiamo sviluppato con successo tale sistema utilizzando zebrafish Mycobacterium marinum infezione modello, che è un modello ben caratterizzato per la progressione di tubercolosi con rilevanza biomedica, mimando i tratti distintivi della patologia tubercolosi umana. Soprattutto, ci dimostrano l'adeguatezza del nostro sistema direttamente lo studio di M. tuberculosis, mostrando per la prima volta che l'agente patogeno umano può propagare in questo modello di vertebrati, con conseguente sintomi di malattia precoce simili a quelle osservate dopo infezione da M. marinum. Il nostro sistema è in grado di screening per la progressione della malattia mediante iniezione di tuorlo robotici degli embrioni di e lo screening di flusso visivo di larve di stadio avanzato. Mostriamo anche che questo sistema affidabile può riassumere il metodo di iniezione vena caudale standard con un livello di throughput di 2.000 embrioni all'ora. Abbiamo inoltre dimostrare la possibilità di studiare la trasduzione del segnale che porta alla progressione della malattia utilizzando genetica inversa a livelli di alto-rendimento. Soprattutto, usiamo composti di riferimento per convalidare il nostro sistema in sperimentazione delle molecole che impediscono la progressione di tubercolosi, che lo rende estremamente adatto per indagare nuovi composti anti-tubercolosi in vivo.

Primo Ibrido Artificiale Della Specie Anguilla Anguilla Australis E Anguilla Anguilla

BMC Developmental Biology. 2011  |  Pubmed ID: 21396126

Studi sull'ibridazione artificiale dell'Anguilla diversa specie sono state condotte recentemente, cioè femmina a. australis con dieffenbachii a. maschio e femmina a. japonica con maschio a. anguilla. L'esistenza di questi ibridi artificiali non è stato tuttavia dimostrato dai metodi genetici indipendenti. Due specie - a. anguilla e a. australis - che sono filogeneticamente vicino ma hanno tempi di maturazione sessuale diversa (12-25 settimane e 6-8 settimane, rispettivamente), erano tenuti a produrre ibridi favorevoli per gli studi di riproduzione.

Quantificazione Di Interiorizzazione GPCR Da Microscopia Di Singola Molecola in Cellule Viventi

Integrative Biology : Quantitative Biosciences from Nano to Macro. Jun, 2011  |  Pubmed ID: 21541374

Internalizzazione del recettore dopo stimolazione con ligando è un componente chiave della risposta di una cellula e consente di selezionare una cella senso correttamente il suo ambiente. Nuovi metodi fluorescenti hanno permesso la visualizzazione diretta dei stimolato agonista G-protein-coupled recettori (GPCR) traffico di cellule viventi. Tuttavia, è difficile da osservare in vivo a causa della intrinseca autofluorescenza e citosolici segnali di GPCR fluorescente contrassegnati interiorizzazione dei GPCR. Questo studio utilizza la superiore precisione posizionale di microscopia di fluorescenza di singola molecola di visualizzare in tempo reale l'interiorizzazione di Dictyostelium discoideum campi recettori cAR1, geneticamente codificati con eYFP. Questa tecnica ha permesso di seguire il numero di recettori nel tempo rivelando che la frazione di recettori citosolici aumenta dopo stimolazione persistente agonista e che la maggior parte dei recettori sono stata degradata dopo interiorizzazione. Il processo di interiorizzazione osservata era fosforilazione dipendente, come dimostrato con l'uso di un mutante cAR1 carenti di fosforilazione, cm1234-eYFP o stimolazione con un antagonista, Rp-accampamenti che non inducono la fosforilazione del recettore. Inoltre, esperimenti fatti nelle cellule tumulo-fase suggeriscono che intrinseco, fosforilazione indotta interiorizzazione di cAR1 è necessario per le celle di tipo selvatico Dictyostelium progredire correttamente attraverso sviluppo pluricellulare. A nostra conoscenza, questa osservazione illustra per l'interiorizzazione di fosforilazione-dipendente tempo prima di cAR1 singole molecole nelle cellule viventi e il suo coinvolgimento nello sviluppo pluricellulare. Questo imaging molto sensibile di internalizzazione del recettore può essere un approccio utile e universale per la caratterizzazione farmacologica di GPCR in altri tipi di cellule.

Zebrafish Embrioni E Larve: Una Nuova Generazione Di Modelli Di Malattia E Schermi Di Droga

Birth Defects Research. Part C, Embryo Today : Reviews. Jun, 2011  |  Pubmed ID: 21671352

L'innovazione tecnologica ha aiutato l'embrione di zebrafish guadagnare terreno come un modello di malattia e un sistema di test per lo screening di stupefacenti. Qui, passiamo in rassegna l'uso di embrioni di zebrafish e larve prime nella ricerca biomedica applicata, utilizzando casi selezionati. Guardiamo l'utilizzo di embrioni di zebrafish come modelli di malattia, prendendo la sindrome alcolica fetale e la tubercolosi come esempi. Discutiamo advances in imaging, in tecniche di coltura (tra cui microfluidica) e nella consegna della droga (tra cui nuove tecniche per l'iniezione robotico di composti nell'uovo). L'uso di embrioni di zebrafish nelle fasi iniziali di droga sicurezza-screening è discusso. Così sono anche le nuove analisi comportamentale che sono essere adattati da roditore ricerca per uso in embrioni di zebrafish, e che possono diventare rilevanti nel convalidare gli effetti di composti neuroattive come ansiolitici e antidepressivi. Letture, quali lo screening morfologico e funzione cardiaca, sono esaminate. Ci sono diversi inconvenienti nel modello zebrafish. Uno è il suo sviluppo molto rapido, che significa che lo screening con zebrafish è analogo alla "proiezione su un treno Run-Away". Pertanto, ci sostengono che zebrafish embrioni devono essere precisamente in scena quando viene utilizzato in dosaggi acute, in modo da garantire una coerenza finestra di esposizione dello sviluppo. Noi crediamo che gli schermi di embrione di zebrafish possono essere utilizzati nelle fasi pre-regulatory di sviluppo di farmaci, anche se sono necessari ulteriori studi di convalida per superare lo scetticismo dell'industria. Infine, il Danio rerio non pone nessuna sfida per la posizione dei modelli di roditori: è complementare a loro, soprattutto nelle fasi iniziali della ricerca di droga.

Screening Rapido Di Espressione Genica Immunitaria Innata Nello Zebrafish Tramite Trascrizione D'inversione - Amplificazione Multiplex Legatura-dipendente Dalla Sonda

BMC Research Notes. 2011  |  Pubmed ID: 21676242

Con il Danio rerio sempre più utilizzato in immunologia e ricerca delle malattie infettive, c'è bisogno di efficienti strumenti molecolari valutare l'espressione di gene immune in questa specie di modello. RT-MLPA (trascrizione d'inversione - amplificazione multiplex legatura-dipendente sonda) fornisce un metodo sensibile e riproducibile, in cui amplificazione fluorescente coniugati di lunghezze uniche sono prodotti per un insieme definito di trascrizioni di destinazione. Il metodo impiega sonde del oligonucleotide che tempri siti adiacenti su una sequenza di destinazione e quindi sono unite da una ligasi termostabili. Successivamente, multiplex PCR con primer universale dà luogo a sequenze amplificate che possono essere analizzati con attrezzature standard di sequenziamento e relativa quantificazione software. Consentendo la quantificazione simultanea di circa 40 indicatori selezionati in un dosaggio di un tubo, RT-MLPA è estremamente utile per le applicazioni high-throughput screening.

Un Modello Di Cella ΔRaf1-ER-inducible Oncogenica Zebrafish Fegato Identifica Le Firme Di Carcinoma Epatocellulare

The Journal of Pathology. Sep, 2011  |  Pubmed ID: 21744342

Anche se il sottostante meccanismo molecolare del carcinoma epatocellulare rimane poco chiaro, segnalazione vie essenziali per la crescita e la sopravvivenza delle cellule sono alterate, tra cui il pathway Raf-MEK-MAPK. Questo percorso può essere attivato da epatite B o C le infezioni da virus e l'espressione ectopica dell'oncogene Raf-1 è spesso visto in carcinoma epatocellulare. Inoltre, il pathway Raf-MEK-MAPK è stato anche dimostrato di essere liberalizzato nei tumori del fegato di zebrafish. Basato sulla conservazione genetica tra zebrafish e tumori di fegato umani, il Danio rerio è stato usato come un modello animale per meglio comprendere le basi molecolari del carcinoma epatocellulare. Qui noi stabilire un modello di cella zebrafish oncogenica viscoelastico, in cui Raf-1(ΔRaf1) umano oncogenico post-transcriptionally attivabile nelle cellule del fegato di zebrafish con la somministrazione di 4-hydroxytamoxifen (4HT). L'attivazione di ΔRaf1 ha provocato la hyperactivation della cascata di zebrafish MEK-ERK, crescita cellulare promosso e proliferazione e apoptosi inibito. La trasformazione delle cellule ZFL-ΔRaf1-ER mitogeni è stata confermata allo-trapianto in vivo e in silico analisi microarray. Profilo di espressione genica delle cellule trattate con 4HT e un inibitore di MEK identificato un set di firme Raf-MEK-dipendente. Questa risposta transcriptome è stata confrontata con zebrafish e cancro del fegato umano transcriptomes. Abbiamo identificato e validato mediante PCR quantitativa, un set di geni transcriptionally regolata da iperattivo di segnalazione MAPK in cellule ZFL-ΔRaf1-ER, zebrafish fegato tumori e tumori di fegato umani, suggerendo che il modello di Danio rerio in vitro delle cellule del fegato può essere utilizzato per ulteriore studio delle basi molecolari del carcinoma epatocellulare umano. Il targeting molecolare dei geni di carcinoma epatocellulare comunemente regolamentati utilizzando il modello di cellulare ZFL-ΔRaf1-ER può essere applicato per individuazione di alto-rendimento preclinici destinazione.

Identificazione Del Comune Carpa Geni Immunitarie Innate Con Il Sequenziamento Del Genoma Intero E Dati RNA-Seq

Journal of Integrative Bioinformatics. 2011  |  Pubmed ID: 21908900

La carpa comune è un sistema di modello candidato per la ricerca di immunologia. Utilizzando la tecnologia di sequenziamento di nuova generazione, abbiamo generato un'enorme quantità di letture di sequenza del genoma di carpa e transcriptome. Attualmente, il nostro obiettivo è di identificare carpa geni coinvolti nello sviluppo della risposta immunitaria innata, particolarmente TIR dominio contenenti geni, da un montaggio preliminare del genoma. Per raggiungere questo obiettivo, abbiamo sviluppato una pipeline di identificazione completa del gene. Questa analisi ci ha permesso di stimare che la carpa ha 39 TIR contenenti dominio trascrizione isoforme e geni.

Modellazione Di Malattie Infettive E Funzione Immunitaria Innata Negli Embrioni Di Zebrafish

Methods in Cell Biology. 2011  |  Pubmed ID: 21951535

I tipi principali delle cellule del sistema immunitario innato, macrofagi e neutrofili, si sviluppano durante i primi due giorni dell'embriogenesi zebrafish. L'interazione di queste cellule immunitarie con microbi patogeni può essere ricondotte eccellentemente in embrioni di zebrafish otticamente trasparente. Vari strumenti e metodi sono stati sviluppati recentemente per la visualizzazione e isolando le cellule immunitarie innate embrionale zebrafish, per stabilire le infezioni da diverse tecniche di micro-iniezione e per analizzare la risposta immunitaria innata host successivo riconoscimento microbica. Qui forniamo orientamenti pratici per l'applicazione di queste metodologie e rivedere l'attuale stato dell'arte nella ricerca di malattie infettive di zebrafish.

Confronto Di Immersione Statica E Sistemi Di Iniezione Endovenosa Per L'esposizione Di Zebrafish Embrioni Per La Tarda Di Edwardsiella Naturale Agente Patogeno

BMC Immunology. 2011  |  Pubmed ID: 22003892

L'embrione di zebrafish è un importante modello in vivo per studiare la risposta immunitaria innata ospite verso l'infezione microbica. Nella maggior parte dei modelli di malattia infettiva di zebrafish, infezione avviene tramite micro-iniezione di batteri in embrione. In alternativa, Edwardsiella tarda, un agente patogeno di pesce naturale, è stato utilizzato per trattare gli embrioni di immersione statica. In questo studio abbiamo utilizzato transcriptome profilatura e RT-PCR quantitativa per analizzare la risposta immunitaria indotta dall'iniezione e tarda E. immersione.

Deep Sequencing Della Risposta Transcrittomica Immunitaria Innata Di Embrioni Di Zebrafish Di Infezione Da Salmonella

Fish & Shellfish Immunology. Nov, 2011  |  Pubmed ID: 20816807

Batteri della Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. typhimurium) causano un'infezione infiammatoria e letale in embrioni di zebrafish. Per caratterizzare la risposta dell'ospite innata embrionale a livello transcriptome, abbiamo esteso e convalidato precedenti dati di microarray di analisi di sequenziamento di nuova generazione Illumina. Abbiamo ottenuto 10 milioni sequenza letture dal controllo e infetti da Salmonella zebrafish embrioni utilizzando un metodo basato su tag sequenziamento (DGE o Tag-Seq) e 15 milioni letture mediante sequenziamento intera trascrizione (RNA-Seq), che rispettivamente mappato a circa il 65% e 85% di note Ensembl 28.716 trascrizioni. Entrambi metodi di sequenziamento hanno mostrato che una forte correlazione di sequenza leggere conteggi per trascrizione e una sovrapposizione di 241 trascritti differenzialmente espressi in risposta all'infezione. Una bassa sovrapposizione delle 165 trascrizioni è stata osservata con i precedenti dati di microarray. Sulla base dei dati combinati basati su microarray e sequenziamento transcriptome abbiamo compilato un set di riferimento con annotazioni di infezione-reattive geni negli embrioni di zebrafish, codifica di fattori di trascrizione, proteine di trasduzione del segnale, citochine e chemochine, fattori del complemento, proteine coinvolte nell'apoptosi e proteolisi, proteine con attività anti-microbica, come pure molte proteine conosciute o romanzo non precedentemente legate alla risposta immunitaria. Inoltre, tramite il confronto dei dati deep sequencing di infezione da S. typhimurium negli embrioni di zebrafish con dati precedenti deep sequencing di infezione da Mycobacterium marinum nello zebrafish adulto abbiamo derivato un set comune di geni infezione-sensibli a reagire. Questo set di gene è costituito da geni di difesa noti e putativo host innata che sono espressi sia in assenza che in presenza di un sistema immunitario adattativo pienamente sviluppato e che forniscono un riferimento prezioso per gli studi futuri delle interazioni ospite-patogeno utilizzando modelli di infezione di zebrafish.

Un Modello Di Danio Rerio Osteosarcoma Implica La Mmp-19 Ed Ets-1 Così Come Riduce La Risposta Immunitaria Nella Angiogenesi E Migrazione

The Journal of Pathology. Feb, 2012  |  Pubmed ID: 22297719

Circa il 40% dei pazienti osteosarcoma die di metastasi. Nuove strategie per migliorare il trattamento dei pazienti metastatici richiedono una migliore comprensione dei processi coinvolti, come l'angiogenesi, la migrazione e la risposta immunitaria. Tuttavia la rarità di osteosarcoma e la sua eterogeneità rende difficile studiare questa neoplasia. Recentemente abbiamo segnalato la trasformazione maligna del mouse cellule staminali mesenchimali (MSCs) che formavano l'osteosarcoma al trapianto in topi. Qui abbiamo studiato queste cellule negli embrioni di zebrafish e trovato che MSCs trasformato indotta angiogenesi e migrarono attraverso i corpi degli embrioni, ma questo è stato mai osservato con MSCs normale non trasformati (progenitori delle MSCs trasformato). Analisi genomica intera espressione sia le cellule e l'host ha mostrato che l'angiogenesi e migrazione relativi geni matrix metalloproteinase 19 (Mmp-19) ed eritroblastosi virus E26 omologo del oncogene 1 (Ets-1) sono stati sovraespresso in trasformate MSCs rispetto al normale MSCs. indagare la risposta dell'ospite, gli embrioni iniettati con MSCs trasformato ha mostrato diminuita espressione di geni correlati immune, soprattutto major classe complesso di istocompatibilità 1 (mhc1ze), rispetto agli embrioni iniettati con MSCs normale. Queste scoperte contribuiscono all'identificazione di eventi genetici coinvolti nell'angiogenesi, la migrazione e la risposta ospite, fornendo obiettivi, nonché un modello adatto per schermi di droga di alto-rendimento. Copyright © 2012 società patologica della Gran Bretagna e Irlanda. Pubblicato da John Wiley & Sons, Ltd.

Automatizzato Dosaggio Intero Animale Bio-imaging Per La Diffusione Del Cancro Umano

PloS One. 2012  |  Pubmed ID: 22347456

Una piattaforma di bio-imaging quantitativa è stata sviluppata per l'analisi della diffusione del cancro umano in un dosaggio di xenotrapianto vertebrati a breve termine. Sei giorni dopo l'impianto di cellule tumorali in embrioni di zebrafish, imaging automatici in 96 piatti ben accoppiato ad algoritmi di analisi di immagine quantifica la diffusione in tutta l'host. Conclusioni in questo modello in correlazione con il comportamento nel lungo termine modelli xenoinnesto roditore per pannelli di mal - contro linee cellulari altamente maligno derivano da cancro della mammella, della prostata e del colon-retto. Inoltre, le cellule tumorali con caratteristiche sparse mesenchimali mostrano maggiore capacità di diffusione più tipi di cellule con aspetto epiteliale. Inoltre, interferenza del RNA stabilisce il ruolo di metastasi-soppressore per E-caderina, in questo modello. Questo automatizzato dosaggio quantitativo di bio-imaging intero animale può servire come una proiezione in vivo prima linea passo nella pipeline anticancerogeno destinazione scoperta.

Metastasi Sperimentale Mediata Da Neutrofili Sono Valorizzata Dall'inibizione VEGFR in Un Modello Di Xenoinnesto Zebrafish

The Journal of Pathology. Feb, 2012  |  Pubmed ID: 22374800

Inibizione di VEGF segnalazione efficacemente sopprime la crescita del tumore localizzato ma accelera invasività tumorale e micrometastasi da meccanismi sconosciuti. Per studiare le interazioni dinamiche e reciproche tra le cellule tumorali e loro microambiente durante questi processi, abbiamo stabilito un modello xenoinnesto iniettando cellule tumorali nella circolazione sanguigna di embrioni di zebrafish trasparente. Il risultato è riproducibile in rapida formazione simultanea di un tumore localizzato e micrometastasi sperimentale, consentendo tempo risolto imaging di entrambi i processi a cella singola risoluzione entro una settimana. La vascolarizzazione tumorale è stato avviato de novo di rimodellamento delle primitive cellule endoteliali in una rete funzionale. Ruoli di cellule mieloidi nei passaggi critici tumorigenesi come la vascolarizzazione e l'invasione sono stati rivelati da approcci genetici e farmaceutici. Abbiamo scoperto che la fisiologica migrazione dei neutrofili controllato invasione tumorale di condizionamento della matrice di collagene e formando la nicchia metastatica, come rilevato da microscopia confocal del due-fotone e generazione di seconda armonica. Somministrazione di inibitori della VEGFR bloccato vascolarizzazione tumorale e una crescita del tumore localizzato ma migliorato la migrazione dei neutrofili, che a sua volta promosso invasione del tumore e la formazione di micrometastasi. Questo dimostra la cooperazione in vivo tra la segnalazione di VEGF e cellule mieloidi in metastasi e fornisce un nuovo meccanismo sottostante i risultati recenti che VEGFR targeting può promuovere invasività tumorale. Copyright © 2012 società patologica della Gran Bretagna e Irlanda. Pubblicato da John Wiley & Sons, Ltd.

Primitivo Cluster Hox Duplicato Nel Genoma Di Anguilla Europea

PloS One. 2012  |  Pubmed ID: 22384188

Ciclo vita enigmatica e corpo allungato di anguilla europea (Anguilla anguilla L., 1758) sono molto motivati indagine scientifica. Recentemente, ricerca di anguilla ha guadagnato in urgenza, mentre la popolazione è diminuita fino al punto di rischio critico. Abbiamo montato un genoma di progetto al fine di facilitare i progressi in tutte le province della biologia di anguilla. Qui, usiamo il genoma di indagare complemento di anguilla la Hox dello sviluppo fattori di trascrizione. Dimostriamo che a differenza di altri pesci teleostei, l'anguilla mantiene completamente popolato, duplicate cluster Hox, originatasi presso la duplicazione del genoma teleosteo-specifici. Utilizzando ibridazioni mRNA-sequencing e in situ, dimostreremo che tutte le copie sono espressi in embrioni in anticipo. Teorie dell'evoluzione vertebrati prevedono che il mantenimento dei geni Hox funzionali, duplicati può dar luogo a ulteriori complessità dello sviluppo, che non è immediatamente evidente nell'adulto. Tuttavia, l'innovazione chiave morfologica altrove nella storia della vita di anguilla coincide con l'origine evolutiva del suo repertorio Hox.