Summary
我们提出了在两种不同类型的生长培养基中生长几种螺菌株的程序。螺螺菌株 MSR-1 在液体和 O2浓度梯度半固态介质中生长, 而m magneticum应变 AMB-1 和m magnetotacticum应变 MS-1 在液体培养基中生长。
Abstract
趋磁细菌是革兰氏阴性、运动性的, 主要水生原核生物在淡水和海洋生境中无处不在。它们的特点是他们的能力 biomineralize magnetosomes, 这是磁性纳米晶体的磁铁矿 (fe3O4) 或硫铁矿 (fe3S4) 包围的脂质双层膜, 在其细胞质。对于大多数已知的趋磁细菌, magnetosomes 被组装在细胞质内的链中, 从而赋予细胞永久的磁偶极矩, 并使它们与外部磁场被动对齐。由于这些特殊特性, 趋磁细菌对商业和医疗应用具有很大的潜力。然而, 大多数物种都是微需氧的, 有特定的 O2浓度要求, 使它们比其他许多细菌 (如大肠杆菌) 更难生长。在这里, 我们提出了生长在趋磁细菌的三种最广泛研究的菌株的详细的协议, 所有属于螺属。这些方法可以精确控制对细菌可用的 O2浓度, 以确保它们正常生长并合成 magnetosomes。使用这些程序进行进一步研究的趋磁细菌生长不需要实验家成为微生物学专家。本文中介绍的一般方法也可用于分离和培养其他趋磁细菌, 虽然生长培养基的化学成分可能需要修改。
Introduction
趋磁细菌 (MTB) 代表了广泛的革兰氏阴性原核生物在淡水和海洋水生生境中无处不在1。这些细菌共有能力产生磁性晶体由磁铁矿 (fe3O4) 或硫铁矿 (fe3S4), 这是在大多数情况下组装成链内的细胞。这个特定的结构主题是由于存在的几个特定的蛋白质作用于细菌的细胞质和周围的每个晶体2的脂膜。每个单独的晶体及其周围的膜泡被称为构建, 大小从大约30到 50 nm 在螺物种3。由于 magnetosomes 的链排列, 这些细菌具有永久的磁偶极矩, 使其与外部应用的磁场被动对齐。因此, 这些细菌积极地沿着磁场线游动, 作为自推进的微罗盘可能更有效地找到最有利的条件 (e., O2浓度) 增长。
山地车的一个有趣的特性是它们能够调节构建晶体的化学和晶体学。大多数菌株产生相对高纯度的磁铁或硫铁矿的晶体, 虽然一些 biomineralize 两个矿物4。在所有情况下, 细菌都能够精确地控制其单个磁性域晶体的大小和形状。这就解释了为什么需要进行大量的研究来更好地了解山地车如何执行这个生物矿化过程。了解这一过程可能使研究人员能够为许多商业和医疗应用量身定制磁性纳米晶体。
对山地车进行广泛研究的一个重大障碍是在实验室中种植它们的困难。大多数物种, 包括在这项工作中使用的菌株, 是好气微需氧当生长与 O2作为一个终端电子受体。这就解释了为什么这些细菌最常在好氧和缺氧条件 (好氧-缺氧界面, OAI) 之间的过渡区发现。这清楚地表明, 山地车具有精确的 O2浓度要求, 在为这些生物体设计生长培养基时, 显然需要考虑这些需求。此外, 山地车的巨大现有多样性意味着不同菌株将需要不同类型的化学梯度和养分来实现最佳生长。
在这项工作中, 我们描述了生长三个最广泛研究的山地车的方法:螺 magneticum (应变 AMB-1), m magnetotacticum (MS-1) 和m 螺(MSR-1)。这些物种复数属于Proteobacteria门的Alphaproteobacteria类, 在形态学上是螺旋状的, 在细胞的每个末端都具有极鞭毛。我们提供了在液体和 O2浓度梯度半固态介质中生长应变 MSR-1 的协议, 基于以前发布的培养基配方5,6。我们还介绍了改良磁性幽门生长培养基 (MGSM)7中生长菌株 AMB-1 和 MS-1 的详细协议。
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Protocol
1. 安装 N2工位
注: 选择管的内径, 使其可以连接到最小泄漏的油箱, 使1毫升塑料注射器的气缸紧紧地装在管子中。图 1提供了完整的 N2气站示意图。
- 安全地安装一个 n2油箱靠近一个长凳上有足够的空间来设置 n2站 (长度约50厘米)。
- 连接到水箱的一段足够长的管道, 以达到该站将建立的区域。如有必要, 在油箱的输出端应用聚四氟乙烯胶带, 以避免泄漏。
- 要建立一个能够同时冒泡五瓶介质的工作站, 可在长度约5厘米的情况下切割四件油管。
- 用三个三路 T 形塑料配件将油管组装成一条线。通过一个额外的 T 形接头将此行的一端连接到 N2油箱输出端的油管。在另一端添加90°弯头接头。
- 使用胶带将结构连接到位于工作台上方约30厘米的水平金属杆上。
- 将五件油管 (长度约20厘米) 连接至步骤1.4 中安装的配件的自由输出。
- 从五1.0 毫升塑料注射器中取出活塞, 然后将这些注射器的较大端部 (i. e, 与针头相反的一侧) 切除, 只保留已毕业的部分。用棉花填充这些注射器, 不要太紧。
- 将注射器插入20厘米长的垂直管道中, 并使用肥皂水确保 N2流动时没有泄漏。
- 取下五 25 G 针 (0.5 毫米 x 25 毫米) 的盖子, 然后将这些针头插入到10厘米厚的管子中。确保针头与油管紧密贴合。
注意: 在此步骤中有刺伤的风险。慢慢仔细地做。 - 将步骤1.9 中准备好的针头连接到 N2站的注射器。确保 N2流经所有五行, 并保持工作站待命。
2. 生长培养基制备
注意: 如步骤2.1.2、2.2.2 和2.3.8 中所述, 可以调整准备的培养基量。所用的水和化学品的用量需要按比例调整。在补充表 1中描述了所有介质组件的作用。
- MSR-1 液体生长培养基的制备
- 加入0.245 克柠檬酸铁至100毫升蒸馏水去离子水, 制备10毫米柠檬酸铁溶液。加热搅拌溶解, 直到得到一个黄色到橙色的透明溶液。使用标准周期 (至少15分钟曝光在121摄氏度) 热压罐解决方案, 然后将此库存解决方案存储在室温下的黑暗中。
注: 当沉淀变得明显时, 放弃柠檬酸铁溶液。 - 在含有蒸馏水的 1 L 的烧杯中, 在搅拌时添加以下顺序: 1.0 毫升微量矿物质补充液, 0.1 g 的 MgSO2PO4, 0.15 g 的 4. 7 H2O, 2.38 g HEPES, 0.34 g 纳米3 , 0.1 克酵母提取物, 3.0 克大豆蛋白胨, 4.35 毫升乳酸钾 (60% w/w 溶液) 和5毫升的10毫米 Fe (III) 柠檬酸盐库存解决方案。
注: 如果需要少量的生长培养基, 请按比例调整数量。对于能够同时冒泡五瓶的 N2站, 如本协议步骤1中的一个, 准备300毫升的培养基。
注意: 微量矿物质和 Fe (III) 柠檬酸盐库存解决方案需要保持无菌。为避免污染, 使用标准的无菌技术 (使用本生燃烧器的瓶子的火焰打开顶部), 并使用无菌移液头进行点胶。将矿物溶液储存在4摄氏度的冰箱中。 - 添加所有化学品后, 使用 1 M 氢氧化钠溶液调节 pH 值为7.0。将新鲜制备的培养基放入125毫升的血清瓶中。每瓶倒入60毫升培养基。
- 气泡 N2进入介质中30分钟, 以移除溶解的 O2, 使用连接到步骤1中描述的 N2站的小油管。将丁基橡胶塞放在每个瓶子的顶部, 留下一个小开口, 让多余的气体离开瓶子。
警告: 泡沫可能形成, 而冒泡与 N2。相应地调整气体流量以避免泡沫的产生。 - 压接密封每个瓶子与准备好的塞子和铝密封。铝密封确保瓶子在协议的其余部分保持密封。
- 从 N2站断开针头和细管, 并用干净的针头 (1 英寸, ≤ 23G) 替换它们。调整 N2罐的阀门, 使气体的持续流动平稳, 排出油箱 (约50毫升/分钟)。
注: 大于23G 的针头可能会在塞子中留下永久性 unsealable 孔。 - 通过橡皮塞将连接到 N2罐中的针头插入一瓶介质中。立即将另一根干净的针头插入同一瓶中。对其他瓶子重复此步骤, 让 n2流动约30分钟, 以更换瓶中的空气 n2。
- 取下相应的针头, 从 N2站断开一个瓶子。等待几秒钟, 直到瓶中的压力降低到大气压, 并去除第二针。对所有剩余的瓶子重复此步骤。
注意: 为防止 O2在步骤2.1.4 后重新进入生长培养基瓶, 请快速连续执行 2.1.4 2.1.8 步骤。如果所有瓶子不能同时连接到 N2站, 请继续执行步骤 2.1. 4-2. 1.8 对于第一组瓶子, 然后对剩余的瓶子重复这些步骤。 - 将瓶子热压。让他们冷却到室温过夜, 然后储存在室温下。
- 加入0.245 克柠檬酸铁至100毫升蒸馏水去离子水, 制备10毫米柠檬酸铁溶液。加热搅拌溶解, 直到得到一个黄色到橙色的透明溶液。使用标准周期 (至少15分钟曝光在121摄氏度) 热压罐解决方案, 然后将此库存解决方案存储在室温下的黑暗中。
- AMB-1 和 MS-1 液体生长培养基的制备
- 准备10毫米铁奎尼酸 qutb 溶液。先将0.19 克奎宁酸溶于100毫升蒸馏水中, 再加入 0.27 g FeCl3. 6H2o. 搅拌溶解, 直到得到一个深红色, 明确的解决方案。使用标准周期 (至少15分钟暴露在121摄氏度), 热压罐解决方案。
注意: 在室温下将铁奎尼酸 qutb 溶液储存在黑暗中作为无菌库存解决方案。当沉淀变得明显时丢弃溶液。 - 在含有蒸馏水的 1 L 的烧杯中, 在搅拌时添加以下顺序: 10.0 毫升的维生素补充液, 5.0 毫升微量矿物质补充液, 0.68 g 的约2PO4, 0.848 克琥珀酸钠二元六水合物, 0.575 克酒石酸钠二水合物, 0.083g 醋酸钠, 0.45mL 的0.1% 水溶解, 0.17 g 纳米3, 0.04 g 抗坏血酸和3.0 毫升的10毫米 Fe (III) 奎尼酸 qutb 库存解决方案。
注: 如果需要少量的生长培养基, 请按比例调整数量。对于能够同时冒泡五瓶的 N2站, 如本协议步骤1中的一个, 准备300毫升的培养基。
注意: 维生素、微量矿物质和 Fe (III) 奎尼酸 qutb 库存解决方案需要保持无菌。为避免污染, 在配药时使用标准的无菌技术和无菌移液头。将矿物质和维生素溶液储存在4摄氏度的冰箱中。 - 添加所有化学品后, 使用 1 M 氢氧化钠溶液将 pH 值调整到6.75。
- 有关协议的其余部分, 请参阅步骤 2.1. 3-2. 1.9。
- 准备10毫米铁奎尼酸 qutb 溶液。先将0.19 克奎宁酸溶于100毫升蒸馏水中, 再加入 0.27 g FeCl3. 6H2o. 搅拌溶解, 直到得到一个深红色, 明确的解决方案。使用标准周期 (至少15分钟暴露在121摄氏度), 热压罐解决方案。
- MSR-1 半固态生长培养基的制备
- 通过溶解3.362 克 K2HPO4和 4.178 g 的约 2 PO4在100毫升蒸馏水去离子水中, 准备一个 0.5 M 磷酸盐缓冲液 pH 7.0。检查 ph 值是否为 7.0, 如果需要, 请将 ph 值稍微调整2PO4或氢氧化钠。将溶液储存在密封玻璃瓶中 (最好是塑料, 以避免氧交换)。
- 准备100毫升的0.02 米盐酸溶液。添加 0.2 g FeCl2. 4H2O 到此溶液, 搅拌溶解, 以获得10毫米的氯化铁溶液。将解决方案存储在一个密封玻璃瓶中的黑暗中。
- 通过溶解6.72 克 NaHCO3在100毫升蒸馏水去离子水中, 制备0.8 米碳酸氢钠溶液。将溶液储存在密封玻璃瓶中。
- 热压罐采用标准循环 (至少15分钟曝光121摄氏度) 的步骤 2.2.1-2.2.3 中准备的解决方案。在黑暗中将它们存储为无菌库存解决方案。
- 在含有1公升蒸馏水的烧杯中, 在搅拌时添加以下顺序: 5 毫升微量矿物质补充液, 0.2 毫升1% 水溶解溶液, 0.4 克氯化钠, 0.3 g NH4Cl, 0.1 g MgSO4. 7H2O, 0.05 克 CaCl2. 2H2O, 1 克琥珀酸钠, 0.5 克醋酸钠, 0.2 克酵母萃取物和 1.6 g 琼脂。
- 用铝箔和热压罐盖住烧杯, 在步骤2.3.5 中制备的溶液。
- 就在热压罐循环结束前, 准备一个新鲜的 4% l-cysteine·HClH2O 溶解0.8 克 l-cysteine·溶液HClH2O 20 毫升蒸馏水中的去离子水。用 5 M 氢氧化钠溶液中和 pH 7.0 的溶液。
注意: 重要的是要准备新鲜的半胱氨酸溶液, 以避免半胱氨酸的氧化。将矿物溶液储存在4摄氏度的冰箱中。 - 高压灭菌后, 让介质冷却至50–60°c, 并将烧杯置于本生燃烧器的火焰下。除去铝箔, 并迅速添加以下顺序, 而轻轻搅拌: 0.5 毫升的维生素溶液, 2.8 毫升无菌磷酸盐缓冲液库存解决方案, 3 毫升无菌氯化铁库存解决方案, 1.8 毫升无菌碳酸氢钠库存溶液和10毫升的过滤灭菌半胱氨酸溶液。
注: 如果需要少量的生长培养基, 请按比例调整数量。它通常是方便准备一批120毫升的培养基。
注意: 所有解决方案必须保持无菌, 以便将来使用。在配药时使用标准的无菌技术和无菌移液器提示执行步骤2.3.8。 - 加入所有化学物质后, 将温热培养基转移到16毫升无菌螺帽亨盖特管中。将12毫升的培养基输送到每个管子中并密封管子。
注意: 为了避免污染, 在本生燃烧器的火焰下执行步骤2.3.9。在琼脂凝固前执行, 培养基为40摄氏度或以上。 - 使管子不受干扰几个小时, 直到琼脂凝固和 OAI 变得明显, 具体化为粉红色到无色界面, 大约1到3厘米的表面下方的介质。
注: 介质应在管子中慢慢变无色。此转换所需的时间量是可变的, 取决于最初在介质中溶解的 O2的量。
3. 山地车接种
注: AMB-1、MS-1 和 MSR-1 菌株的培养可以在商业上获得 (材料表)。
注意: 在本生燃烧器的火焰下, 在无菌条件下执行以下所有步骤。
- 液体培养基中菌株 MSR-1、AMB-1 和 MS-1 的接种
- 密封一个空的125毫升血清瓶与丁基橡胶塞和铝压接密封。通过塞子在瓶子中插入两根针头, 并将在步骤1.7 中准备好的注射器连接到其中一个。将注射器连接到 O2的气缸, 通过与用于 N2站的相同类型的油管。
- 让 o2流经瓶子约30分钟, 以确保瓶子中的所有空气被 o2取代。取出两个针头, 允许在瓶子中的轻微超压, 然后热压罐。使用前, 允许瓶子冷却至室温。
注意: 为节省时间, 请在介质制备过程中执行步骤3.1.1 和 3.1.2, 并将瓶子与介质或库存解决方案一起热压。 - 将新鲜中瓶和 O2瓶的瓶塞顶部消毒, 在上面涂上70% 乙醇溶液的几滴, 并通过本生燃烧器的火焰传递。
- 使用无菌注射器和针头, 从 o2瓶中提取1毫升 o2 , 并将其转移到新鲜的培养基瓶中。在这一步骤中, 确保针头紧紧贴合注射器, 以避免注射器中的任何空气。
- 如果使用在玻璃瓶中生长的另一种文化中的接种剂, 通过在上面涂上几滴70% 乙醇溶液并通过本生燃烧器的火焰来消毒新鲜培养基瓶和旧文化瓶的瓶塞。如果使用从冷冻培养管的接种剂, 只是让它温暖到室温与管密封在火焰下的本生燃烧器。
- 如果使用在玻璃瓶中生长的另一种文化中的接种剂, 将1毫升的旧文化接种到新鲜培养基中。如果使用冷冻储存的疫苗接种, 仅接种0.1 毫升稀释在冷冻过程中使用的甘油或二甲基亚砜 (DMSO)。在这两种情况下, 使用无菌针头和无菌注射器。
- 孵育培养在32摄氏度, 并接种到新鲜培养基后4到7天。
- O2梯度半固态介质中 MSR-1 的孕育
- 验证新鲜培养基的试管是否显示一个定义良好的 OAI, 由粉红色到无色界面具体化。
- 如果接种者来自另一 O2浓度梯度半固态培养, 通过移液50µL 的培养物来收获细菌, 并将无菌移液头放置在由细菌形成的带上。在新鲜培养基 (粉红色/无色界面) 中缓慢接种这些细菌, 避免干扰界面 OAI。如果接种剂是来自冰冻的文化, 以同样的方式进行100µL 的接种剂代替。
- 密封管, 让细菌在25摄氏度和30摄氏度之间生长。在细菌带到达培养基表面之前, 使用相同的程序转移到新鲜培养基中。
4. 细菌的观察
- 将70% 乙醇溶液放在上面并通过本生燃烧器的火焰, 消毒培养瓶的瓶塞。对于半固态介质, 在本生燃烧器的火焰下打开管。使用无菌针头和无菌注射器提取细菌。
- 使用吊滴方法8确保细菌是磁性和能动的。
注意: 相位对比显微镜提供了很好的结果, 但不是强制性的。放大倍率范围从10X 到60X 是合适的。 - 使用透射电镜 (TEM) 观察细胞结构和 magnetosomes 的详细信息8。
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Representative Results
成功制备培养基可按以下方式进行评估。在过程结束时, 应获得明确的解决方案 (不含任何沉淀) (这对于液体介质和 O2梯度半固态介质都是如此)。在接种前显示 MSR-1 液体培养基的预期方面的图片见图 2a。一个成功的 O2浓度梯度半固体介质是通过形成一个 OAI 后几个小时的信号, 表明由粉红色的介质在管的顶部的存在 (图 3, 管 a)。介质的其余部分应为无色。接种前的全粉红色培养基是溶解完全氧化的标志, 因此不成功制备 O2浓度梯度。
在接种 (或几天后, 如果接种者是从冰冻的文化), 简单地通过使用光源或分光光度计检查的浊度的培养液培养基的成功增长可以检查大约48小时。通过浊度证明细菌实际上生长 (图 2b) 证实了成功的增长。如果培养基在48小时后保持清晰, 细菌就不会生长。在正常生长的液体培养基培养基中, 通过将瓶中的介质放在磁性搅拌板上并用手电筒照明, 可以在48小时后检查细菌合成 magnetosomes 的存在。在低搅拌速度下, 介质应 "闪光", 根据搅拌磁体在实验家位置上的方向交替变暗和亮。对于非磁性培养, 由细胞向实验家散射的光强度将保持不变。
在半固态培养基中的成功生长表明, 在粉红色/无色界面形成微需氧带细菌。由于 o2的消耗量由细菌和 o2梯度的变化, 带将慢慢迁移到跟随 OAI (图 3, 管 B)。
吊滴法使观察者能够检查细菌是否是磁性和能动的。几分钟后, 山地车应该集中在悬挂下降的边缘, 证明他们积极地沿着磁场线游动 (图 4a)。为了确保细胞是磁性的, 翻转磁铁的方向坐在下降的旁边。细菌应该开始向相反的边缘游动 (图 4b)。最后, magnetosomes 的形状可以用 TEM 检查。在直径约第30-45 nm 的 Cuboctahedral 晶体应观察9。这些晶体通常排列在一个长链或多个短链在这里研究的物种 (图 5)。
图 1: N2的插图毒气站(a) 示意图表示。(b) 设置的图片。一个成功的站将有适当长度的大型和细管, 以便在该协议的步骤1.9 中描述的细管的末端仍然沉浸在介质中的气体冒泡步骤。气体流量也应随时调节, 以确保所有 O2被移除, 介质不会泄漏。请点击这里查看这个数字的更大版本.
图 2: 接种前后液体生长培养基瓶.(a) 接种前清除 MSR-1 培养基。(b) 经过3天的成功生长后, 浑浊的 MSR-1 培养基。请点击这里查看这个数字的更大版本.
图 3: O2管梯度半固体培养基前 (管 A) 和10天后 (B 管) 接种.B 管中的细菌带用红色箭头表示。
图 4: 使用相位对比显微镜进行20X 放大时悬挂跌落实验的典型结果.(a) 山地车游向磁铁的南极, 在液体/空气界面积聚。(b) 翻转磁铁1分钟后, 大多数细胞都离开了视野。
图 5: AMB-1 细胞的 TEM 观察.构建链用红色箭头表示。两个鞭毛用黑色箭头表示。
补充表 1.请点击这里下载此表格.
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Discussion
山地车的特定 O2浓度要求使它们在实验室中生长不平凡。液体介质协议的一个关键步骤是从培养基中初始去除所有 o2 , 以通过在接种前添加一定体积的 o2来控制最终浓度。结果表明, MSR-1 生长在几乎完全有氧条件下, 然而, 细胞的磁性大大降低。同一研究结果表明, AMB-1 和 MS-1 在完全有氧条件下不生长6。对于 MSR-1 半固态培养, 所有 O2首先通过半胱氨酸溶液减少, 然后出现 o2浓度梯度, 导致 OAI 的形成。如果一个文化不生长良好或不是磁性的, O2浓度应该是第一件事检查。
半固态生长培养基是分离未知山地车或生长对 O2和氧化还原梯度高度敏感的物种的一个有趣的选择, 因为它可以确保稳定梯度的存在, 并允许细菌定位在提供最佳生长条件的位置。当需要更高的体积 (例如, 用于 DNA 提取) 时, 或者当需要对细胞进行进一步分析 (构建研究) 时, 液体培养基更方便使用, 因为它允许更容易地分离细胞生长培养基。半固态培养基中的琼脂可能确实会干扰细胞的采集技术。
在某些文化中, 细胞有时变得非能动, 可能由于自发突变。非运动细胞在生长培养基中存活和生长, 因为它们不需要游泳来寻找生存所需的养分。标准的赛道方法10可以用来恢复运动的文化, 因为只有能动的细胞可以沿着赛道游泳。磁性表型的损失也可能发生在文化中, 即使 O2浓度是最佳的, 再次由于自发突变11。在这种情况下, 最好的解决办法是通过将野生型细菌的冷冻种群接种到新鲜培养基中来开始一种新的文化。或者, 赛道技术也可以允许恢复磁性文化。
必须避免其他生物体对文化的污染, 因此大多数的协议都要使用无菌技术进行。在本生燃烧器的火焰下操作通常会给保持无菌条件带来令人满意的结果。然而, 如果培养在易受污染的环境中生长, 应采取额外的预防措施, 例如在准备培养基和接种细菌时在层流罩中工作。应注意的是, 半固态介质中的污染风险较高, 因为每次去除细胞时都需要打开管。
这些协议可以使足够的细菌生长, 以执行许多不同类型的实验, 如基于光学显微学12、13、电子显微成像14、15的物理研究,x 射线同步辐射分析16, 基因组和蛋白质研究17,18。如有必要, 离心可实现悬浮液中较高浓度的细菌。此外, magnetosomes 可以提取和纯化, 用于进一步应用离心19获得的细胞颗粒或致密细胞悬浮液。
增长媒介配方通常基于相同的管理原则 (参见补充表 1 , 以了解在这里描述的生长介质中每个组分的作用列表的摘要)。通过有机酸 (g., 琥珀酸, 醋酸盐, 酒石酸, 乳酸) 或碳酸氢盐等无机化合物, 必须向细菌提供碳源。选择合适的碳源取决于细菌的新陈代谢。dna 和蛋白质中的氮和磷 (dna, 膜) 也需要和提供的纳米3, NH4Cl 和2PO4在这里描述的食谱。缓冲液 (HEPES、磷酸盐缓冲液) 是抵抗 pH 变化所必需的。微量矿物质补充液含有酶的辅助因子, 而维生素可以被细菌用作辅酶或某些酶的功能基团。酵母提取物和大豆蛋白胨提供了用于蛋白质生产的氨基酸和盐的来源。由于山地车是氧化还原敏感的, 一个或几个还原剂必须经常添加到培养基 (例如, 半胱氨酸, 抗坏血酸, 乳酸)。在生物矿化的培养基中,需要铁的主要来源 (例如, 柠檬酸铁, 铁奎尼酸 qutb, 氯化物)。最后, 微需氧细菌作为末端电子受体需要少量的 O2 。强制厌氧山地车使用其他化合物, 如硝酸盐或一氧化二氮代替。
这些协议的主要限制是不能保证它们将适用于其他种类的山地车。菌株 AMB-1, MS-1 和 MSR-1 是所有淡水山地车, 因此本文描述的食谱不能用于种植海洋 magnetospirilla, 如Magnetospira thiophila应变 MMS-1, Magnetospira应变 QH-2, 或其他海洋山地车,需要较高的盐浓度。然而, 为了增加山地车的其他菌株, 并为新菌株的分离, 本文提出的用于液体和半固态介质的一般方法可用于制备不同配方的培养基。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢理查德 b. 弗兰克尔对山地车文化的帮助, 亚当. 希区柯克和朱慧在在麦克马斯特大学建立山地车文化, 以及为训练和访问电子显微设备 (麦克马斯特大学) 而进行的培训和使用。健康科学学院)。这项工作得到了加拿大自然科学和工程研究理事会 (NSERC) 和美国国家科学基金会的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AMB-1 | American Type Culture Collection (ATCC) | ATCC 700264 | |
| MS-1 | ATCC | ATCC 31632 | |
| MSR-1 | Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) | DSM 6361 | |
| Ferric citrate | Sigma-Aldrich | F3388-250G | |
| Trace mineral supplement | ATCC | MD-TMS | |
| KH2PO4 | EMD | PX1565-1 | |
| MgSO4.7 H2O | EMD | MX0070-1 | |
| HEPES | BioShop Canada Inc | HEP001.250 | |
| NaNO3 | Sigma-Aldrich | S5506-250G | |
| Yeast extract | Fischer scientific | DF210929 | |
| Peptone | Fischer scientific | DF0436-17-5 | |
| Potassium L-lactate solution (60%) | Sigma-Aldrich | 60389-250ML-F | |
| D-(-)-Quinic acid | Sigma-Aldrich | 138622 | |
| FeCl3.6H2O | Fischer scientific | I88-100 | |
| Vitamin supplement | ATCC | MD-VS | |
| Sodium succinate hexahydrate | Fischer scientific | S413-500 | |
| Sodium L-tartrate dibasic dihydrate | Sigma-Aldrich | 228729-100G | |
| Sodium acetate trihydrate | EMD | SX0255-1 | |
| Resazurin | Difco | 0704-13 | |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544-25G | |
| K2HPO4 | Caledon | 6620-1-65 | |
| FeCl2 .4H2O | Sigma-Aldrich | 44939-250G | |
| Sodium bicarbonate | EMD | SX0320-1 | |
| NaCl | Caledon | 7560-1 | |
| NH4Cl | EMD | 1011450500 | |
| CaCl2.2 H2O | EMD | 1023820500 | |
| Agar A | Bio Basic Canada Inc | FB0010 | |
| L-cysteine.HCl.H2O | Sigma-Aldrich | C7880-100G | |
| 1.0 mL syringes | Fischer scientific | B309659 | |
| 25G x 1 needles | BD | 305125 | |
| 125 mL serum bottles | Wheaton | 223748 | |
| 20 mm aluminum seals | Wheaton | 224223-01 | |
| 20mm E-Z Crimper | Wheaton | W225303 | |
| Butyl-rubber stoppers | Bellco Glass, Inc. | 2048-11800 | |
| Hungate tubes | Chemglass (VWR) | CLS-4208-01 | |
| Septum stopper, 13mm, Hungate | Bellco Glass, Inc. | 2047-11600 | |
| Glass culture Tubes | Corning (VWR) | 9826-16X | |
| Hydrochloric acid 36.5-38%, BioReagent | Sigma-Aldrich | H1758-100ML | 11.6 - 12 N |
References
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