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Biochemistry

परमाणु चुंबकीय अनुनाद स्पेक्ट्रोस्कोपी (एनएमआर) और अतिसूक्ष्म Thermophoresis (MST) द्वारा गोलाकार और रेशा प्रोटीन की बातचीत को मापने

Published: November 2, 2018 doi: 10.3791/58537
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Biochemistry, University of Alberta

Summary

यहां, हम उत्पादन और स्थिर आइसोटोप के साथ लेबल कर रहे हैं कि प्रोटीन के शुद्धिकरण के लिए एक प्रोटोकॉल मौजूद है, और प्रोटीन प्रोटीन बातचीत के बाद के लक्षण वर्णन परमाणु चुंबकीय अनुनाद (एनएमआर) स्पेक्ट्रोस्कोपी और अतिसूक्ष्म का उपयोग Thermophoresis (MST) उपाययोजना.

Abstract

vimentin जैसे रेशा प्रोटीन साइटों के साथ एक संरचनात्मक पाड़ प्रदान करके कोशिकाओं के भीतर संगठन प्रदान करते है कि बांध प्रोटीन युक्त plakin दोहराता है । यहां, का पता लगाने और इस तरह के बातचीत को मापने के लिए एक प्रोटोकॉल envoplakin के गोलाकार plakin दोहराने डोमेन और vimentin के पेचदार कुंडल का उपयोग कर वर्णन किया गया है । यह निर्धारित करने के लिए एक आधार प्रदान करता है कि क्या एक प्रोटीन बांधता vimentin (या समान रेशा प्रोटीन) और बातचीत के संबध की माप के लिए । ब्याज की गोलाकार प्रोटीन समाधान में vimentin प्रोटीन के साथ 15N और titrated के साथ लेबल है । एक दो आयामी एनएमआर स्पेक्ट्रम पीक आकार या रासायनिक बदलाव में परिवर्तन देख द्वारा बातचीत का पता लगाने के लिए अधिग्रहण कर लिया है, और नमक का स्तर, जो vimentin चतुर्धातुक संरचना प्रभाव सहित समाधान की स्थिति के प्रभाव स्पष्ट । यदि ब्याज का प्रोटीन रेशा ligand बाँधता है, तो बाध्यकारी संपर्क को शुद्ध प्रोटीन का प्रयोग करके MST से quantified जाता है. दृष्टिकोण का निर्धारण करने के लिए एक सीधा रास्ता है कि ब्याज की एक प्रोटीन एक रेशा बांध, और कैसे परिवर्तन, जैसे उत्परिवर्तनों या समाधान की स्थिति के रूप में, आकलन के लिए बातचीत को प्रभावित ।

Introduction

प्रोटीन के बीच बातचीत आणविक मशीनों है कि कोशिकाओं के भीतर आदेश बनाने के गठन की अनुमति देते हैं । व्यक्तिगत बातचीत अक्सर कमजोर हैं, लेकिन आमतौर पर multivalent परिसरों कि सहकारी और गतिशील विनियमित किया जा सकता है के लिए योगदान । संवेदनशील परख है कि परमाणु संकल्प और इस तरह के जटिल बातचीत के बारे में मात्रात्मक जानकारी प्रदान deduce तंत्र और डिजाइन हस्तक्षेप जैसे दवा के अणुओं की तरह की जरूरत है । एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी प्रोटीन बातचीत के बारे में इस तरह की जानकारी प्राप्त करने के लिए एक कुशल तरीका है, और भी उन है कि कमजोर1बांध सहित लाइगैंडों के लिए तेजी से स्क्रीनिंग के लिए प्रयोग किया जाता है । एनएमआर तरीकों का इस्तेमाल किया उन है कि प्रोटीन का पालन कर रहे है या ligand निरीक्षण में वर्गीकृत किया जा सकता है । इस पांडुलिपि पूर्व दृष्टिकोण का उपयोग करता है जिसमें एक स्पेक्ट्रम एक स्थिर-आइसोटोप लेबल प्रोटीन है कि अपेक्षाकृत छोटे है (आमतौर पर 20 केडीए के तहत) का अधिग्रहण किया है और unlabel titrated है । यह अनुकूल मामलों में मैप किया जा करने के लिए बातचीत में शामिल लेबल अवशेषों की अनुमति. एक बार जटिल रूपों, वहां के अवशेषों बातचीत के रासायनिक वातावरण में परिवर्तन कर रहे है कि खुद को रासायनिक बदलाव और उनके एनएमआर संकेतों के आकार में परिवर्तन के रूप में प्रकट । इस तरह के परिवर्तनों की सीमा बातचीत में इन समूहों की भागीदारी की डिग्री के साथ संबद्ध । रासायनिक बदलाव perturbations (CSPs) के अभाव और ligand की अलग मात्रा की उपस्थिति में एकत्र प्रोटीन की एनएमआर स्पेक्ट्रा की एक श्रृंखला की तुलना द्वारा मापा जा सकता है । बड़े लाइगैंडों या जटिल इंटरैक्शन के लिए, पीक आकार या तीव्रता में परिवर्तन को deduce इंटरैक्शन से मापा जा सकता है.

सबसे आम 2d प्रयोग ligand बातचीत का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया 15N-heteronuclear एकल क्वांटम सहसंबंध (HSQC) प्रयोग2है । यह आवश्यक है कि एक प्रोटीन समान रूप से 15n, जो आम तौर पर उंहें समानता के रूप में व्यक्त- ई. कोलाई बैक्टीरियल 15n-समृद्ध मीडिया में हो संस्कृतियों में संस्करणों टैग के साथ लेबल किया जाना चाहिए । बाध्यकारी जब HSQC स्पेक्ट्रा अनुमापन के दौरान एकत्र आरोपित रहे हैं स्पष्ट है, जटिल गठन में शामिल अवशेषों का एक सबसेट के लिए पीक परिवर्तन खुलासा. बातचीत तेजी से विनिमय शासन में हो सकता है जहां स्वतंत्र और ligand-संतृप्त राज्य संकेतों एक जनसंख्या औसत शिखर में गिर जाते हैं । वैकल्पिक रूप से, राज्यों के बीच धीमे विनिमय के मामले में, दोनों संकेतों को उनके सापेक्ष मात्रा का प्रतिनिधित्व करने वाले अभिंन के साथ मनाया जाता है । जबकि एनएमआर lineshape विश्लेषण कुछ मामलों में बाध्यकारी समानताएं अनुमान के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, MST के रूप में तरीके भी सुविधाजनक साबित कर दिया है और वास्तविक बातचीत के पार मांयता प्रदान करते हैं ।

प्रदान की उदाहरण दो desmosomes के भीतर पाया प्रोटीन की है । वे सेल सतहों और cytoskeleton और मध्यस्थता त्वचा और दिल के ऊतकों की अखंडता को बनाए रखने और कतरनी बलों के झेलने के लिए सेल आसंजन मशीनों और मध्यवर्ती तंतुओं के बीच multivalent बातचीत के बीच जंक्शनों मध्यस्थता । रोग परिणाम कर सकते हैं जब desmosomal प्रोटीन जैसे desmoplakin या vimentin उत्परिवर्तनों या एंटीबॉडी से समझौता कर रहे हैं, सेल के स्थिरीकरण के लिए अग्रणी-सेल जंक्शनों, और इसलिए उनकी बातचीत महत्वपूर्ण महत्व के हैं3. desmosomal प्रोटीन द्वारा बाध्यकारी ligand का संरचनात्मक आधार एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा विशेषता हो सकता है, जबकि बातचीत quantified द्वारा MST किया जा सकता है । तरीकों के साथ साथ plakin दोहराने डोमेन (PRDs) है जो अक्सर साथ मिलकर सेट है कि बुनियादी खांचे, और vimentin, एक मध्यवर्ती रेशा है कि एक अंलीय अपनी पेचदार द्वारा की पेशकश की सतह के माध्यम से सूचना का आदान प्रदान के रूप में मौजूद है के बीच बातचीत की विशेषताएं थे बंडल4. इन परिसरों कोशिका झिल्ली जहां वे सेल cytoskeleton के मध्यवर्ती तंतु के लिए desmosomes कि आसंन कोशिकाओं से कनेक्ट करने के लिए लंगर का गठन कर रहे हैं, इस प्रकार एक ऊतक भर में radiates कि चिपकने वाला बांड का एक नेटवर्क बनाने ।

Protocol

1. रिकॉमबिनेंट प्रोटीन एक्सप्रेशन

  1. Envoplakin PRD (E-PRD) और Vimentin 99-249 (VimRod) की अभिव्यक्ति
    1. वांछित जीन युक्त प्लाज्मिड के साथ ई. कोलाई BL21 (DE3) कोशिकाओं को बदलना. १०० µ जी/एमएल एम्पीसिलीन युक्त प्लेट्स आगर पर कोशिकाओं को फैलाएं । रात भर ३७ डिग्री सेल्सियस पर प्लेटें ।
    2. एक ही कॉलोनी उठाओ और inoculate के 20 मिलीलीटर भयानक शोरबा (टीबी) युक्त १०० µ जी/एमएल एम्पीसिलीन प्लाज्मिड के लिए चयन करने के लिए । (१८० rpm) रातोंरात मिलाते के साथ ३७ डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति हो जाना ।
    3. ५० µ g/एमएल एम्पीसिलीन युक्त टीबी के 1 एल के लिए पूरे 20 एमएल संस्कृति स्थानांतरण । ३७ डिग्री सेल्सियस पर १८० rpm पर मिलाते हुए के साथ संस्कृति मशीन के आयुध डिपो६०० = 0.6-0.8 ।
    4. 18 डिग्री सेल्सियस के तापमान को कम करने और 1 मिमी की एक अंतिम एकाग्रता के लिए isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) जोड़कर प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रेरित । प्रोटीन अभिव्यक्ति की अनुमति के लिए रातोंरात १६० rpm पर मिलाते के साथ 18 ° c पर गर्मी जारी रखें ।
    5. फसल के लिए 15 मिनट के लिए ८,००० x g पर संस्कृति केंद्रापसारक और supernatant त्याग द्वारा कोशिकाओं ।
    6. (पंजाब: 20 मिमी फॉस्फेट बफर, पीएच ७.४, १२० mm NaCl) फास्फेट के लगभग ४० मिलीलीटर में सेल गोली resuspend द्वारा काटा कोशिकाओं को धो लें । एक ५० एमएल ट्यूब करने के लिए निलंबन स्थानांतरण । 15 मिनट के लिए ८,००० x g पर फिर से केंद्रापसारक ।
    7. supernatant का त्याग कर दें । या तो तुरंत शुद्धि प्रोटोकॉल शुरू या भविष्य के उपयोग के लिए-20 डिग्री सेल्सियस पर सेल छर्रों फ्रीज ।
  2. अभिव्यक्ति Isotopically त्यसपछि प्रोटीन
    1. ई. कोलाई BL21 (DE3) कोशिकाओं को बदलने और 1.1.1-1.1.2 में के रूप में एक 20 मिलीलीटर स्टार्टर संस्कृति तैयार करते हैं ।
    2. एक अतिरिक्त ४.० g tryptone, ५.० g NaCl, और १०० µ g/ml एम्पीसिलीन युक्त एक समृद्ध टीबी के 1 एल के लिए पूरे 20 मिलीलीटर संस्कृति हस्तांतरण । ३७ डिग्री सेल्सियस पर १६० rpm पर मिलाते हुए के साथ संस्कृति मशीन के आयुध डिपो६०० = 1.6-1.9 ।
    3. 15 मिनट के लिए ८००० x g पर केंद्रापसारक द्वारा 1 एल संस्कृति फसल और supernatant त्यागें ।
    4. धीरे पंजाब के लगभग ४० मिलीलीटर में resuspend द्वारा सेल गोली धोने और एक ५० मिलीलीटर ट्यूब करने के लिए निलंबन हस्तांतरण ।
    5. 15 मिनट के लिए ८,००० x g पर फिर से केंद्रापसारक और supernatant त्यागें ।
    6. M9 ंयूनतम मीडिया (तालिका 1) के 20 मिलीलीटर में सेल गोली resuspend और M9 ंयूनतम १०० µ जी/एमएल एम्पीसिलीन युक्त मीडिया के ९५० मिलीलीटर के शेष करने के लिए स्थानांतरण ।
    7. फिल्टर निष्फल पोषक तत्व मिश्रण (2 टेबल और 3) के ५० मिलीलीटर जोड़ें ।
    8. 1 मिमी के अंतिम एकाग्रता के लिए IPTG जोड़ने से पहले 30 मिनट के लिए 18 डिग्री सेल्सियस के लिए संस्कृति Acclimatize ।
    9. १६० rpm पर मिलाते के साथ 18 डिग्री सेल्सियस पर रात भर मशीन ।
    10. फसल के रूप में खंड 1.1.4-1.1.6 कोशिकाओं ।

2. मैटीरियल मेटल संबधी क्रोमैटोग्राफी (IMAC) VimRod और ई-PRD का शुद्धिकरण

  1. His6 का शुद्धिकरण-tagged VimRod
    1. एक को छेड़ने वाला अवरोधक कॉकटेल कमी EDTA युक्त पंजाब के 5 मिलीलीटर/जी में सेल गोली resuspend । एक Dounce ऊतक homogenizer में 12 स्ट्रोक के साथ Homogenize निम्नलिखित कदम में सेल lysis में सुधार करने के लिए.
    2. बर्फ पर, 1 के एक पल्स पर सेल निलंबन sonicate/1 s पर बंद, ८०% आयाम की कुल के लिए १.५ min. sonication दो अतिरिक्त बार दोहराएँ, रन के बीच बर्फ पर धीरे घूमता overheating को रोकने के लिए.
    3. ४५ मिनट के लिए ७५,००० x g पर नमूना केंद्रापसारक और एक सिरिंज फिल्टर (०.४५ µm) का उपयोग कर supernatant फिल्टर ।
    4. Equilibrate एक फास्ट प्रोटीन तरल क्रोमैटोग्राफी (FPLC) प्रणाली का उपयोग कर 5 मिलीलीटर IMAC कॉलम (20 मिमी HEPES, पीएच ७.५, ५०० mm NaCl, 10 mm imidazole) 1 मिलीलीटर की एक प्रवाह दर पर () बाध्यकारी बफर की (CV)
    5. ०.५ मिलीलीटर की एक प्रवाह दर पर कॉलम पर फ़िल्टर्ड supernatant लोड/
    6. धोने बफर के 5 CV के साथ कॉलम धो (20 मिमी HEPES, पीएच ७.५, ५०० mm NaCl, ५० mm imidazole) 1 मिलीलीटर की एक प्रवाह दर/
    7. Elute में 3 सीवी के साथ प्रोटीन का रेफरेंस बफर (20 एमएम HEPES, पीएच ७.५, ५०० एमएम NaCl, ३५० एमएम imidazole) की प्रवाही दर पर ०.५ मिलीलीटर/लीजिए १.५ एमएल अंश । यदि उपलब्ध हो, eluted प्रोटीन की एकाग्रता बढ़ाने के लिए अप-फ्लो रेफरेंस मोड का चयन करें ।
    8. FPLC वर्णलेख कि एसडीएस द्वारा ब्याज के प्रोटीन होते पृष्ठ और मानक तरीकों का उपयोग करने के लिए प्रोटीन एकाग्रता5मापने से भिंन की पहचान करें ।
    9. पूल और एक केंद्रापसारक ultrafiltration उपकरण (MWCO 3 केडीए, 5 मिलीलीटर) के लिए 2 मिलीलीटर का उपयोग प्रोटीन की सबसे अधिक मात्रा युक्त रेफरेंस अंशों ध्यान केंद्रित । २१,००० x g पर केंद्रापसारक किसी भी वेग को हटाने के लिए और एक ०.२२ माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से गुजरती हैं ।
    10. Equilibrate एक TCEP का उपयोग कर 1 मिलीलीटर/मिनट की एक प्रवाह दर पर १२० मिलीलीटर आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी (एस) कॉलम के 2 CV के साथ एस बफर (20 मिमी HEPES, १५० मिमी NaCl, पीएच ७.५, ०.५ मिमी FPLC) ।
    11. स्तंभ पर 2.1.9 से केंद्रित प्रोटीन और elute के 1 CV के साथ एस बफर की एक प्रवाह दर पर इंजेक्शन ०.५ मिलीलीटर/मिनट, 1 एमएल अंशों का संग्रह ।
    12. पहले की तरह ही प् याज के प्रोटीन से युक्त अंशों को पहचानें ।
    13. पूल सबसे अधिक मात्रा में प्रोटीन युक्त अंशों ।
    14. लघु अवधि के उपयोग के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर या ग्लिसरॉल जोड़ने के लिए 20% और दुकान पर-८० ° c छोटे aliquots में ।
  2. His6 टैग के साथ ई-PRD प्रोटीन का शुद्धिकरण हटाया गया
    1. His6-टैग की गईं ई-PRD प्रोटीन को शुद्ध करने के लिए 2.1.1-2.1.8 में दिए गए चरणों का पालन करें । चोटी के अंशों पूल और प्रोटीन एकाग्रता का निर्धारण ।
    2. जोड़ें तंबाकू खोदना वायरस (टेव) की चिढ़ाना (1 मिलीग्राम/एमएल) 2 पर µ l/ डायलिसिस ट्यूबिंग (6 केडीए) और dialyze में एस बफर 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात स्थानांतरण । इस कदम की अनुमति देता है His6 टैग के दरार और imidazole कि अगले कदम में नी-ंत् राल के लिए बाध्यकारी के साथ हस्तक्षेप करेंगे हटाने ।
    3. Equilibrate S बफर के 3 CV के साथ एक गुरुत्वाकर्षण कॉलम में Ni-ंत् राल के 5 मिलीलीटर । राल से नाली अतिरिक्त बफर ।
    4. एक चट्टानी मंच पर राल और 1 घंटे के लिए मशीन पर सट ई PRD प्रोटीन डालो-uncleav His6-टैग ई-PRD और सट His6 टैग को बांधने की अनुमति । टेव को भी His6-tagged है और राल बाँधना होगा. के माध्यम से प्रवाह है, जो टैग मुक्त ई PRD शामिल लीजिए । एस बफर के 2 CV के साथ राल धो E-PRD के सभी सुनिश्चित करने के लिए बरामद किया है ।
    5. ध्यान ई-PRD के माध्यम से प्रवाह में 2 मिलीलीटर एक केंद्रापसारक ultrafiltration डिवाइस का उपयोग (MWCO 3 केडीए, 5 मिलीलीटर) । २१ ००० x g पर केंद्रापसारक किसी भी वेग को हटाने के लिए और एक ०.२२ माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से गुजरती हैं ।
    6. Equilibrate एक १२० एमएल एस कॉलम के 2 CV के साथ एस बफर (20 मिमी HEPES, १५० mm NaCl, पीएच ७.५, ०.५ मिमी TCEP के लिए MST या 20 मिमी Tris-एचसीएल, 1 मिमी डीटीटी, पीएच 7 एनएमआर के लिए) की एक प्रवाह दर पर 1 मिलीलीटर/
    7. 2.2.5 से कॉलम पर केंद्रित ई-PRD प्रोटीन इंजेक्षन और एस बफर के 1 CV के साथ elute ०.५ मिलीलीटर की एक प्रवाह दर/मिनट, 1 एमएल अंशों का संग्रह ।
    8. पहले की तरह ही प् याज के प्रोटीन से युक्त अंशों को पहचानें ।
    9. पूल सबसे अधिक मात्रा में प्रोटीन युक्त अंशों ।
    10. लघु अवधि के उपयोग के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर या ग्लिसरॉल जोड़ने के लिए 20% और दुकान पर-८० ° c छोटे aliquots में ।

3. एनएमआर तरीके

  1. एनएमआर नमुना तयारी
    1. शुद्धि 15N-लेबल जंगली प्रकार या R1914E ई-PRD प्रोटीन के रूप में पहले 20 मिमी Tris-एचसीएल, 1 मिमी डीटीटी, पीएच 7 एस के रूप में प्रयोग वर्णित कदम 2.2.6 के लिए बफर । प्रोटीन स्टॉक समाधान आमतौर पर के बारे में 1 मिलीलीटर की मात्रा के साथ ०.३ से 1 मिमी रेंज ।
      नोट: प्रोटीन के लिए ध्यान केंद्रित किया जा सकता है > 100 µ एक MWCO 3 केडीए, 5 एमएल केंद्रापसारक ultrafiltration डिवाइस का उपयोग कर नमूना तैयारी के लिए एक उपयुक्त श्रेणी में एकाग्रता लाने के लिए एम ।
    2. 20 मिमी Tris-एचसीएल, 1 मिमी डीटीटी, चरण 2.1.10 के लिए एस बफर के रूप में पीएच 7 का उपयोग कर unlabel्ड VimRod प्रोटीन का एक नमूना शुद्ध ।
    3. ५०० µ एल के एक अंतिम मात्रा में, जंगली प्रकार या उत्परिवर्ती ई-PRD प्रोटीन १०० µ एम के एक अंतिम एकाग्रता के लिए जोड़ें, ड्यूटेरियम ऑक्साइड (डी2ओ) को अंतिम एकाग्रता के लिए 10% (v/v), और DSS (4, 4-dimethyl-4-silapentane-1-sulfonic एसिड) को अंतिम एकाग्रता के लिए 20 µ एम. लाओ नमूना मात्रा अप करने के लिए ५०० µ एल का उपयोग कर 20 मिमी Tris-एचसीएल, 1 मिमी डीटीटी, पीएच 7. एक प्रतिनिधि नमूना तैयारी तालिका 4में वर्णित है ।
      नोट: DSS के 0 पीपीएम अनुनाद के लिए 1एच रासायनिक बदलाव जांच के रूप में अच्छी तरह के रूप में 15एन प्रोटीन6के रासायनिक बदलाव के अप्रत्यक्ष संदर्भित करने के लिए प्रयोग किया जाता है । डी2ओ एक निरंतर शुद्ध चुंबकीय क्षेत्र में स्पेक्ट्रोमीटर ऑपरेटिंग रखने के लिए ड्यूटेरियम ताला संकेत के लिए प्रयोग किया जाता है ।
    4. पिछले चरण में के रूप में ई-PRD, डी2ओ और DSS का एक दूसरा नमूना बनाने और ५०० µ एल करने के लिए मात्रा लाने से पहले ५० µ मीटर की एक अंतिम एकाग्रता के लिए VimRod जोड़ने
    5. प्रयोग के लिए एक 5 मिमी चौड़ा एनएमआर ट्यूबों के लिए ५०० µ एल नमूने स्थानांतरण ।
  2. एनएमआर प्रायोगिक सेटअप
    1. निकालें आदेश "ej" के साथ हवा का प्रवाह चालू करें; यह नमूना चुंबक से ऊपर लाएगा । अब, आदेश "ij" के साथ खोलने और डालने के द्वारा चुंबक के शीर्ष पर एक स्पिनर के भीतर नमूना जगह है । रुको जब तक नमूना आगे बढ़ने से पहले चुंबक के अंदर बसा ।
    2. "edc" आदेश का उपयोग करके एक नया dataset बनाएं और प्रयोग "ZGPR" (चित्रा 1) का चयन करके मानक 1H एनएमआर पैरामीटर्स को लोड करें । नाम, EXPNO (प्रयोग संख्या) और PROCNO (संसाधित डेटा फ़ोल्डर संख्या) फ़ील्ड भरें । "सेट विलायक" क्षेत्र में विलायक का चयन करें और मानक probehead और विलायक निर्भर (prosol) मापदंडों को पढ़ने के लिए "निष्पादित ' getprosol ' पर क्लिक करते हैं ।
    3. deuterated विलायक, यानी, डी2ओ, आदेश का उपयोग "ताला" के लिए नमूना ताला और यह व्यापक और ताला प्राप्त है जब तक इंतजार ।
    4. स्वचालित ट्यूनिंग कमान "आत्मा" का उपयोग नमूना ट्यूनिंग द्वारा चुंबक की प्रतिध्वनि आवृत्ति को सही. स्वत: ट्यूनिंग पूरा हो गया है जब तक लड़खड़ा वक्र मॉनिटर ।
    5. चुंबकीय क्षेत्र TOPSHIM का उपयोग कर परत (कमान "TOPSHIM") । Shimming नमूना चारों ओर एकरूपता को प्राप्त करने के लिए चुंबकीय क्षेत्र के समायोजन की प्रक्रिया है । यह अच्छा अभ्यास के लिए कमांड "wsh" के साथ परत की दुकान और उंहें पढ़ने के प्रयोग "rsh" topshim से पहले, यदि एक ही है या इसी तरह के नमूनों का उपयोग कर ।
    6. शोर अनुपात करने के लिए अधिकतम संकेत प्राप्त करने के लिए आदेश "्गा" के साथ रिसीवर लाभ को समायोजित करें ।
    7. पानी अनुनाद ऑफसेट (o1) पर स्पेक्ट्रम के केंद्र प्लेस और "calibo1p1" का उपयोग उच्च शक्ति पर ९० डिग्री प्रोटॉन पल्स (p1) निर्धारित किया है ।
    8. "zg" आदेश और प्रक्रिया "efp" जो घातीय गुणा ("em"), मुक्त प्रेरण क्षय (फिड) शामिल लाइन का विस्तार, "फुट" रूपान्तर परिवर्तन फिड और "पीके" के चरण लागू करने के साथ "के साथ शून्य जाओ" का उपयोग कर प्रोटॉन स्पेक्ट्रम लीजिए सुधार.
    9. स्वचालित चरण सुधार "apk" और स्वत: आधारभूत सुधार "absn" बहुपद बिना एकीकरण विकल्प का उपयोग कर लागू होते हैं ।
    10. प्रयोग में "SFHMQC3GPPH" का चयन करके SOFAST HMBC प्रयोग के लिए एक नया डेटासेट (as in 3.2.2) बनाएं ।
    11. प्रतिलिपि अनुकूलित p1 और O1 प्रोटॉन स्पेक्ट्रम से और आदेश का उपयोग करके p1 निर्भर दालों आबाद "getprosol एक ज p1 plw1", जहां p1 है अनुकूलित p1 मान और plw1 p1 के लिए शक्ति स्तर है ।
    12. अनुकूलन CNST54 लगातार रासायनिक बदलाव और CNST55 के लिए ऑफसेट निर्धारित करने के लिए बैंडविड्थ को परिभाषित करने के लिए ब्याज की वर्णक्रमीय क्षेत्रों जो रिसीवर लाभ (चित्रा 2) अनुकूलित किया जा करने की अनुमति देता है शामिल करने के लिए । इन मापदंडों का चयन करने के लिए, दो आयामी स्पेक्ट्रम से पहले फिड (मुक्त प्रेरण क्षय) निकालने और मनाया संकेत के लिए उन्हें परिभाषित करने के लिए देखो. इसके अलावा, छूट देरी (D1), स्कैन की संख्या (NS), और डमी स्कैन (डी एस) आदेश के साथ स्वीकार्य संकेत संवेदनशीलता को प्राप्त करने के लिए बदलती हैं "जी एस", जो जाने के लिए सक्षम बनाता है और वास्तविक समय में डेटा की गुणवत्ता की निगरानी स्कैन.
    13. स्पेक्ट्रा शूंय जाओ "zg" का उपयोग कर रिकॉर्ड ।
  3. एनएमआर डाटा प्रोसेसिंग
    1. संसाधन पैरामीटर प्रत्यक्ष f2 (1ज) और अप्रत्यक्ष (चित्रा 3) में वैकल्पिक रेखीय पूर्वानुमान के साथ "SI f2 = 2048, f1 = 512" का उपयोग कर स्पेक्ट्रम की परोक्ष f1 (15N) आयाम के आकार के लिए सेट करें ।
    2. विंडो फंक्शन के रूप में "QSINE" का चयन करें और दो आयामी स्पेक्ट्रम को प्रोसेस करने के लिए 2 में से एक साइन बेल शिफ्ट (एसएसबी) डालें ।
    3. आदेश "xfb" खिड़की समारोह और रूपान्तर परिवर्तन के साथ दोनों दिशाओं में डेटा को संसाधित करने के लिए दर्ज करें ।
    4. दोनों दिशाओं में स्वत: चरण सुधार लाने के लिए कमांड "apk2d" का प्रयोग करें । स्वचालित प्रक्रिया चरण सुधार के एक संतोषजनक स्तर को प्राप्त नहीं करता है, तो "rser" आदेश के साथ FIDs निकालने, 1 डी प्रसंस्करण से चरण मूल्यों की गणना, और 2d डेटा के लिए उन्हें लागू होते हैं ।
    5. 2 डी डेटा के लिए स्वत: आधारभूत सुधार फ़ंक्शन "abs2" के साथ आधार रेखा सुधारें । यह पीपीएम प्रसंस्करण मापदंडों में परिभाषित मूल्यों के बीच एक बहुपद समारोह पर लागू होता है और आगे विश्लेषण के लिए एक 2d स्पेक्ट्रम का उत्पादन होगा ।
    6. यदि एक और अणु के साथ बातचीत डेटा की तुलना के लिए धारावाहिक प्रसंस्करण प्रदर्शन की योजना बना, कमांड "wpar" के साथ प्रसंस्करण मापदंडों की दुकान और उंहें "rpar" के साथ याद करते हैं । इस तरह सभी datasets एक ही पैरामीटर के साथ संसाधित किया जाएगा और भिन्नता संसाधन अंतर के कारण पेश नहीं किया जाएगा ।
  4. एनएमआर डेटा विश्लेषण
    1. आदेश दर्ज करें "पीपी" चोटी उठा की प्रक्रिया शुरू करने के लिए ।
    2. पीपीएम रेंज परिभाषित और न्यूनतम तीव्रता/चोटियों की अधिकतम संख्या उम्मीद चोटियों पर आधारित (चित्रा 4). ठीक पर क्लिक करें और दृश्य निरीक्षण के द्वारा परिणामों की पुष्टि । यदि आवश्यक हो, तो प्रक्रिया को पुन: चलाएं जब तक कि परिणाम संतोषजनक गुणवत्ता पर आधारित हैं ।
    3. "पीपी" आदेश के साथ एक peaklist उत्पन्न करें ।
      नोट: इस peaklist डिफ़ॉल्ट रूप से डेटा ऊंचाई/पीक तीव्रता जानकारी शामिल है और बाद के स्पेक्ट्रम के लिए निर्यात किया जा सकता है और अंय कार्यक्रमों द्वारा पढ़ा जा सकता है ।
    4. एक और अणु के साथ बातचीत का संकेत है कि प्रोटीन HSQC स्पेक्ट्रा में रासायनिक बदलाव में पीक तीव्रता या आंदोलन में परिवर्तन पर गौर । यदि बातचीत अणु बड़ी है, कुछ चोटियों के गायब होने के साथ साथ चोटी तीव्रता में कटौती की उंमीद है ।
    5. "चोटियों" टैब पर क्लिक करें और चोटियों खिड़की में एक सही क्लिक के साथ "आयात" का चयन करके अगले डेटा सेट करने के लिए चोटी की सूची आयात करें ।
    6. स्पेक्ट्रम पर चोटियों कल्पना और अगर जरूरत उन्हें नए पदों के लिए बदलाव । "पूरी तालिका" के लिए "रीसेट तीव्रता" पर क्लिक करें तीव्रता के साथ स्पेक्ट्रम के लिए एक peaklist उत्पन्न करने के लिए (चित्रा 5). इस पीक सूची संग्रहीत पीक सूची से स्थिति जानकारी पर ले जाएगा ।
    7. "निर्यात" फ़ंक्शन का चयन करके विश्लेषण के लिए विभिन्न डेटासेट से एक स्प्रेडशीट या अन्य गणितीय प्रोग्राम के लिए पीक सूचियों का निर्यात करें.
    8. प्रत्येक चोटी के लिए समारोह "प्रोटीन स्पेक्ट्रम में पीक तीव्रता में पीक तीव्रता" के साथ शिखर गहनता में परिवर्तन की गणना । मान १०० का गुणा करके प्रतिशत परिवर्तन में परिवर्तित किया जा सकता है । ध्यान दें कि चोटी की मात्रा भी उपयोगी है हालांकि पीक तीव्रता को मापने के लिए चोटियों कि एक दूसरे के करीब तैनात है आसान कर रहे हैं, के रूप में आमतौर पर अपेक्षाकृत व्यापक चोटियों के एक उच्च घनत्व के साथ प्रोटीन के लिए मामला है ।

4. अतिसूक्ष्म Thermophoresis (MST)

  1. Ligand प्रोटीन ई-PRD की तैयारी
    1. एक MST संगत बफर में ligand एक्सचेंज एक ३.५ केडीए मिनी डायलिसिस यूनिट में ८०० μL प्रोटीन की dialyzing अप करने के लिए 20 मिमी HEPES, पीएच ७.५, 10 मिमी NaCl के 1 एल में निलंबित कर दिया, 4 डिग्री सेल्सियस पर धीरे से सरगर्मी रात भर ।
    2. ध्यान ligand एक केंद्रापसारक ultrafiltration इकाई का उपयोग कर (3 केडीए MWCO) 10 मिनट के लिए १४ ००० x g पर केंद्रापसारक द्वारा । एक स्वच्छ ट्यूब के लिए केंद्रित प्रोटीन हस्तांतरण ।
    3. 10 मिनट के लिए २१,००० x g पर ligand केंद्रापसारक और ध्यान से एक नई ट्यूब के लिए supernatant हस्तांतरण के लिए किसी भी उपजी प्रोटीन को दूर । २८० एनएम और ligand विलुप्त गुणांक पर अवशोषक का उपयोग कर ligand की एकाग्रता का निर्धारण । जोड़ें 10% के बीच-20 ०.०१५% की एक अंतिम एकाग्रता देने के लिए । बीच-20 परख बफर को जोड़ा है केशिकाओं को सोखना को रोकने के लिए । अंतिम परख बफर कि MST प्रयोगों के लिए प्रयोग किया जाता है 20 मिमी HEPES, पीएच ७.५, 10 मिमी NaCl, ०.०१५% के बीच-20 है ।
  2. डाई-लेबल लक्ष्य प्रोटीन VimRod की तैयारी
    1. 5 माइक्रोन की एकाग्रता देने के लिए लाल-tris-ंत् के साथ आपूर्ति की गई 1x पंजाब-टी के ५० μL को जोड़कर लाल-tris-ंत् डाई का पुनर्गठन करें । 2 μL aliquots में २०० μL ट्यूबों और स्टोर में-20 डिग्री सेल्सियस वितरण ।
    2. परख बफर के साथ ०.३४ माइक्रोन के लिए लक्ष्य प्रोटीन पतला । एक 2 μL aliquot के लिए लक्ष्य के ५८ μL जोड़ें लाल-tris-ंत् डाई और कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए मशीन । डाई-लेबल लक्ष्य की अंतिम एकाग्रता ०.३३ माइक्रोन है । 10 मिनट के लिए २१,००० x g पर लेबल लक्ष्य केंद्रापसारक और ध्यान से एक नई ट्यूब के लिए supernatant हस्तांतरण किसी भी वेग को दूर करने के लिए । लाल-tris-ंत् डाई को His6 टैग के माध्यम से प्रोटीन से बांधता है और उप-nanomolar रेंज में एक बाध्यकारी पृथक्करण स्थिरांक (KD) होता है । यह प्रभावी ढंग से १००% लक्ष्य प्रोटीन के लिए बाध्य है तो कोई आगे शोधन की आवश्यकता है ।
    3. MST साधन चालू करें और नियंत्रण सॉफ्टवेयर खोलें । लाल-tris-ंत् डाई के लिए लाल सेटिंग का चयन करें । 25 डिग्री सेल्सियस के तापमान नियंत्रण को चालू करें ।
    4. लक्ष्य के लेबल को प्रमाणित करने और cuvettes में एकत्रीकरण या सोखना के लिए जांचने के लिए पुनर्परीक्षण का चयन करें । इन मापदंडों का एक आकलन स्वचालित रूप से प्रदान की जाती है ।
    5. मिश्रण 17 परख बफर के μL और लक्ष्य प्रोटीन और मिश्रण के 3 μL pipetting द्वारा । उन्हें पतला लक्ष्य में सूई और केशिका के केंद्र में तरल ड्राइंग द्वारा दो मानक केशिकाओं भरें । । केशिकाओं ट्रे में और उपकरणों में जगह है । माप प्रारंभ करें ।
    6. प्रतिदीप्ति के एक पर्याप्त स्तर की तलाश में परिणाम की समीक्षा करें और सोखना (केशिका लाइन आकार में विकृति) या एकत्रीकरण (विकृतियों MST ट्रेस) जो सॉफ्टवेयर विश्लेषण में ध्वजांकित हो जाएगा के कोई संकेत नहीं । यदि परिणाम सकारात्मक कदम पर ligand कदम है, नहीं तो एक अलग बफर का प्रयास किया जाना चाहिए या के बीच-20 की राशि ०.०५% या अधिक करने के लिए बढ़ सकता है ।
  3. ई-PRD Ligand दो गुना कमजोर पड़ने की श्रृंखला की तैयारी
    1. 1-16 से 16, २०० μL ट्यूबों लेबलिंग द्वारा एक कमजोर पड़ने श्रृंखला तैयार करते हैं ।
    2. Tube1 करने के लिए वांछित अधिकतम ligand एकाग्रता की तुलना में 1.17 x अधिक एकाग्रता पर ligand के 17 μL जोड़ें । यह मात्रा एक aliquot के रूप में दो बार (८.५ μL) की जरूरत राशि है तो श्रृंखला में अगले ट्यूब को हस्तांतरित किया जाएगा । परख के अंतिम मात्रा 10 μL तो ८.५ ligand के 1.17 x एकाग्रता की μL लक्ष्य प्रोटीन, VimRod के १.५ μL के अलावा द्वारा 1x को पतला किया जाएगा । यह अधिकतम चुना एकाग्रता का अनुमान KD मान से कम 20 बार होना चाहिए ।
    3. Tubes2-16 के लिए परख बफर के ८.५ μL जोड़ें प्रत्येक aliquot के लिए एक नया पिपेट टिप का उपयोग कर । पिपेट युक्तियों का फिर से उपयोग करना सटीकता को प्रभावित कर सकता है (सटीक pipetting पर सलाह के लिए निर्माता के निर्देश देखें). स्थानांतरण ८.५ Tube1 से ligand के μL Tube2 धीरे से बुलबुले पैदा किए बिना परख बफर में समाधान जारी । मिश्रण ligand और बफर ऊपर और नीचे pipetting से 6 बार, फिर बुलबुले पैदा करने के बिना । सबसे केंद्रित ट्यूब में ई-PRD १.५ मिमी था और लेबल VimRod ५० एनएम के अंतिम एकाग्रता पर मौजूद था ।
    4. स्थानांतरण ८.५ Tube2 से Tube3 के लिए ligand के μL और परख बफर के साथ मिश्रण । दोहराने धारावाहिक कमजोर पड़ने तक सभी ट्यूबों पड़ा है ligand जोड़ा । Tube16 से ८.५ μL को छोड़ें ताकि सभी ट्यूबों में ligand के ८.५ μL दो-गुना कमजोर पड़ने की एक श्रृंखला में हों ।
  4. बाइंडिंग प्रतिक्रिया और MST प्रयोग की तैयारी
    1. प्रत्येक ट्यूबों के लिए लेबल लक्ष्य प्रोटीन के १.५ μL जोड़ें और धीरे ऊपर और नीचे pipetting बुलबुले से बचने के लिए सावधान किया जा रहा द्वारा मिश्रण । 15 मिनट के लिए मशीन ।
    2. बाध्यकारी परख के लिए विशेषज्ञ मोड का चयन करें और एक धारावाहिक कमजोर पड़ने श्रृंखला के लिए मापदंडों में दर्ज करें । सुनिश्चित करें कि तापमान नियंत्रण करने के लिए सेट है 25 ° c, उत्तेजना पावर ४०% करने के लिए सेट है, और मध्यम करने के लिए MST शक्ति । इन मापदंडों का अध्ययन किया जा रहा अंय बाध्यकारी भागीदारों के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए ।
    3. केशिकाओं के साथ बाध्यकारी प्रतिक्रियाओं के साथ भरें और । साधन में ट्रे लोड, 25 डिग्री सेल्सियस पाने और माप शुरू करने के लिए तापमान के लिए प्रतीक्षा करें ।
  5. डेटा विश्लेषण
    1. संबद्धता विश्लेषण सॉफ़्टवेयर में बाइंडिंग परख फ़ाइल खोलें । केशिका स्कैन की समीक्षा करें; प्रतिदीप्ति स्तर औसत से 10% से अधिक भिंन नहीं होना चाहिए, कोई एग्रीगेट या सोखना खंड ३.६ में वर्णित के रूप में पता लगाया जाना चाहिए ।
    2. सही पैनल पर MST विश्लेषण का चयन करें और विश्लेषण सेट में परख डेटा खींचें । यदि एक ही लक्ष्य के कई रन हैं-समान शर्तों के तहत ligand बाध्यकारी परख वे एक ही सेट में छोड़ने के द्वारा विलय किया जा सकता है । वैकल्पिक रूप से, प्रत्येक रन विश्लेषण में स्वतंत्र रूप से गिरा दिया जा सकता है ।
    3. डेटा ग्राफ करने के लिए खुराक प्रतिक्रिया फिट टैब पर ले जाएँ. यदि कोई एकल बाइंडिंग साइट अपेक्षित है तो KD मॉडल चुनें. पहाड़ी मॉडल भी सहकारी व्यवहार के साथ कई बाध्यकारी साइटों के लिए एक विकल्प है । गुणवत्ता नियंत्रण पास नहीं था ग़ैर अंक इस स्तर पर फिट से हटाया जा सकता है । कई परख के साथ सेट मर्ज औसत और मानक विचलन के रूप में गणना की त्रुटियों जाएगा ।
    4. अंतिम टैब खोलें और एकल ग्राफ़ पर सभी प्लॉट के बीच परिणामों की तुलना करें. जनरेट किया गया है जो तालिका से प्रत्येक वक्र के लिए फिटिंग परिणाम प्राप्त करें । डेटा या फिट घटता अंय प्रस्तुति या विश्लेषण सॉफ्टवेयर को निर्यात अगर वांछित ।

Representative Results

ई PRD डोमेन (अवशेषों pProEX में क्लोन 1822-2014-HTC) मानव envoplakin जीन और VimRod डोमेन (अवशेषों 99-249 pET21a में क्लोन) मानव vimentin4 के His6 टैग और शुद्ध के साथ व्यक्त किया गया । चित्रा 6 और चित्रा 7 VimRod की शुद्धता के स्तर को प्रदर्शित (१८.८ केडीए) और ई-PRD (२१.८ केडीए) प्रोटीन शोधन की इस विधि से प्राप्त की. ई PRD निर्माण से His6 टैग के हटाने VimRod प्रोटीन के रूप में MST प्रयोगों के लिए आवश्यक है एक His6 टैग बाध्यकारी डाई और किसी भी ई PRD अपने His6 टैग को बनाए रखने का उपयोग लेबल है डाई के बंधन के लिए प्रतिस्पर्धा कर सकते हैं । टेव के साथ टैग के क्लीवेज के बाद दूसरा IMAC कॉलम टेव को चिढ़ाने, सट टैग और किसी भी अनसट His6-ए-PRD कि बनी को हटा देता है । शुद्धि के अंतिम चमकाने कदम आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी है । दोनों प्रोटीन एक समान आकार के होने के बावजूद, VimRod elutes कॉलम से एक ५१ मिलीलीटर जबकि ई PRD रेफरेंस पीक ७२ मिलीलीटर पर केंद्रित है, जहां इस आकार के एक प्रोटीन मोनोमर की उंमीद होगी । VimRod के आकार में स्पष्ट वृद्धि की संभावना एक रेशा लंबी रॉड के रूप में अपनी विशेषताओं के कारण है विश्लेषणात्मक ultracentrifuge प्रयोगों के रूप में प्रोटीन के आकार का प्रदर्शन किया है कि VimRod4monomeric था । प्रोटीन की कम पैदावार समृद्ध कोशिकाओं की कम राशि की वजह से उन अमीर शोरबा से उन से M9 में उगाई संस्कृतियों से प्राप्त कर रहे है ंयूनतम मीडिया में उत्पादन किया जा रहा है । टीबी में M9 तैयारी के लिए बड़ी स्टार्टर संस्कृतियों की प्रारंभिक वृद्धि की अनुमति देता है सेल पैदावार में सुधार, जबकि 15N एनएमआर प्रयोगों के लिए आवश्यक लेबल की सीमा को बनाए रखने ।

15एन-1एच HSQCs जंगली प्रकार और ई के R1914E उत्परिवर्ती के लिए अधिग्रहीत किए गए थे PRD उपस्थिति या VimRod की अनुपस्थिति में (चित्रा 8A-8D) । ई के स्पेक्ट्रम चित्रा 8A में PRD अच्छी तरह से हल चोटियों, एक ठीक से जोड़ प्रोटीन का संकेत की उंमीद की संख्या से पता चलता है । VimRod की उपस्थिति में (चित्रा 8B) स्पेक्ट्रम व्यापक लाइन व्यापक और पीक गायब, ई-PRD और VimRod के बीच बाध्यकारी करने के लिए इसी से पता चलता है । इस बाध्यकारी R1914E के उत्परिवर्तन के रूप में चित्रा 8C और 8Dकी तुलना द्वारा सबूत खो दिया है । थोड़ा परिवर्तन R1914E उत्परिवर्ती को VimRod के अतिरिक्त पर स्पेक्ट्रम में मनाया इस उत्परिवर्ती ई-PRD और VimRod के बीच बाध्यकारी की कमी का संकेत है । e-PRD पीक उपस्थिति में तीव्रता/VimRod की तुलना में और चित्रा 8Eमें सापेक्ष चोटी तीव्रता के रूप में रची गई, जो चोटी की सीमा को इंगित करता है ई PRD परिसर में विस्तार । ई के R1914E उत्परिवर्ती-PRD (दिखाया नहीं) 20% या उच्च चोटी VimRod की उपस्थिति में लगभग 20% की तुलना में जंगली प्रकार (चित्रा 8E) के लिए चोटियों के बारे में ९७% बनाए रखा । इस समारोह बिंदु उत्परिवर्ती के एक नुकसान का प्रतिनिधित्व करता है, अतिरिक्त म्यूटेंट होने मध्यवर्ती प्रभाव भी4अध्ययन किया गया है के साथ ।

के लिए मांय और quantitate VimRod और ई PRD MST विश्लेषण का उपयोग His6-फ्लोरोसेंट लाल-VimRod-tris डाई ंत् के कम सांद्रता के साथ मिश्रित लक्ष्य के रूप में लेबल ligand-PRD १.२८ mM से ३९.१ एनएम प्रदर्शन किया गया । तीन बाइंडिंग titrations किए गए थे और परिणाम औसत और चित्र 9में दिखाए गए हैं । डेटा एक साइट ligand बाध्यकारी के एक मानक मॉडल के साथ फिट थे और २५.७ ± २.१ माइक्रोन के एक KD दिया । सतह plasmon अनुनाद द्वारा VimRod और ई-PRD के बीच बंधन का मूल्यांकन १९.१ ± १.३ माइक्रोन4के एक समान कश्मीरडी मूल्य दिया था ।

Figure 1
चित्र 1: एनएमआर प्रयोग के सेटअप का स्क्रीन कैप्चर । दिखाई गई विंडो का उपयोग किसी HSQC डेटासेट को एकत्रित करने के लिए एक मानक प्रयोग सेट करने के लिए किया जाता है. प्रयोग पैरामीटर से सटे प्रयोग में पढ़ रहे हैं । ZGPR प्रयोग दिखाया मानक और विलायक निर्भर प्रोटॉन मापदंडों लोड करने के लिए एक प्रारंभिक प्रयोग के रूप में चुना जाता है । शीर्षक विंडो रिकॉर्ड रखने के प्रयोजनों के लिए प्रयोगात्मक विवरण इनपुट करने के लिए उपयोग किया जाता है । HSQC स्पेक्ट्रम ZGPR प्रयोग SFHMQC3GPPH के साथ बदल दिया है इकट्ठा करने के लिए । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: एनएमआर प्रयोगात्मक मापदंडों का समायोजन. दिखाया खिड़की एनएमआर पल्स अनुक्रम के लिए बुनियादी मापदंडों में प्रवेश करने के लिए संकेत का अनुकूलन करने के लिए प्रयोग किया जाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: एनएमआर डेटा प्रोसेसिंग । एनएमआर स्पेक्ट्रम के दो आयामों में से प्रत्येक को संसाधित करने के लिए उपयोग किए गए पैरामीटर्स दिखाए जाते हैं, जिनमें आमतौर पर समायोजित किए गए तीरों का संकेत होता है. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: एनएमआर चोटी उठा के लिए पैरामीटर्स । एनएमआर चोटियों संसाधित एनएमआर स्पेक्ट्रम में चुनने के लिए उपयोग किए गए पैरामीटर्स विशिष्ट मानों के साथ दिखाए जाते हैं । पीपीएम रेंज, तीव्रता, और स्पेक्ट्रा को अनुकूलित करने चोटियों की संख्या को समायोजित करें । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: तीव्रता के साथ प्रतिनिधि Peaklist । एनएमआर स्पेक्ट्रम में उठाया गया है कि प्रत्येक चोटी एक नंबर दिया जाता है, और उसके 1एच और 15एन रासायनिक बदलाव और संकेत तीव्रता प्रदर्शित कर रहे हैं । इस peaklist तो स्पेक्ट्रा उपस्थिति में प्राप्त की तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता/ कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्रा 6: His6 की शुद्धि-IMAC द्वारा VimRod टैग और एस. ए. IMAC कॉलम से रेफरेंस के लिए वर्णलेख VimRod की एक प्रमुख चोटी दिखाती है । B. एस कॉलम से रेफरेंस के लिए वर्णलेख एक बड़ी चोटी दिखाती है । C. एसडीएस-शुद्धि के पाठ्यक्रम पर एकत्र अंशों का पृष्ठ: जेल (एम), सेल lysate (1), IMAC फ्लो-थ्रू (2), वॉश (3), पूलिंग रेफरेंस (E1), परित एस रेफरेंस (E2) के लिए केडीए में संकेत मेगावॉट के साथ मेगावॉट के मानक हैं. गलियों में उच्च आणविक भार पर दिखाई बैंड E1 और E2 पश्चिमी दाग (डेटा नहीं दिखाया गया है) की पुष्टि के रूप में शुद्ध VimRod के oligomers हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 7
चित्रा 7: IMAC द्वारा ई-PRD का शुद्धिकरण और एस. ए. एसडीएस-imac शोधन के पृष्ठ मेगावाट के साथ आणविक भार मानकों दिखा जेल के बाईं ओर केडीए में संकेत (एम) और पहले IMAC कॉलम (E1) से eluate, टेव क्लीवेज उत्पादों (+ टेव), और दूसरी IMAC कॉलम (फुट) से प्रवाह के माध्यम से । B. एस स्तंभ से chromatograph एक प्रमुख चोटी से पता चलता है । C. एसडीएस-आणविक भार मानक (एम) के पृष्ठ और एस पीक से भिन्न. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 8
चित्रा 8: HSQC स्पेक्ट्रा ऑफ वाइल्ड-टाइप और R1914E उत्परिवर्ती ई-PRD की उपस्थिति और अनुपस्थिति में VimRod । HSQC स्पेक्ट्रा शो वाइल्ड-टाइप ई-PRD (१०० µ मी.) में 20 एमएम Tris-एचसीएल, १५० एमएम NaCl, 1 एमएम डीटीटी, पीएच 7 में अनुपस्थिति (ए) या उपस्थिति ५० µ एम VimRod (बी) की है । पैनलों सी और डी R1914E उत्परिवर्ती (१०० µ मीटर) के अभाव या ५० µ एम VimRod, क्रमशः की उपस्थिति में HSQC स्पेक्ट्रा हैं । पैनल में ई रिश्तेदार 1एच-15एन चोटी के साथ या VimRod बंधन के बिना PRD के शिखर संख्या, जो मनमाने ढंग से सौंपा और अनुक्रम की स्थिति पर आधारित नहीं है की एक समारोह के रूप में दिखाए जाते हैं । इन मूल्यों के लिए एक ligand के अलावा पर पीक तीव्रता में कमी के लिए एक महत्व कटऑफ को परिभाषित किया जा सकता है । यदि असाइनमेंट उपलब्ध हैं, तो महत्वपूर्ण मानों को अक्सर किसी बाइंडिंग क्षेत्र में मैप करने के लिए देखा जा सकता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 9
चित्र 9: VimRod के लिए ई-PRD की बाइंडिंग । ई-PRD दो गुना की एक श्रृंखला में पतला था १.२८ mM से ३९.१ एनएम के लिए और MST विश्लेषण प्रदर्शन से पहले लेबल VimRod के साथ मशीन । तीन स्वतंत्र परख से डेटा संयुक्त थे । डेटा एक k d मॉडल के लिए फिट थे ± २.१ माइक्रोन के एक kd विश्वास के साथ २५.७ माइक्रोन के एक kडी दे रही है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

अभिकर्मक मात्रा
सोडियम फॉस्फेट, dibasic (निर्जल) ६.० छ
पोटेशियम फॉस्फेट, monobasic (निर्जल) ३.० छ
सोडियम क्लोराइड ०.५ छ
एच२ओ ९५० मिलीलीटर तक

तालिका 1. Isotopic लेबलिंग के लिए M9 मीडिया ।

अभिकर्मक मात्रा
15 एनएच4सीएल १.० छ
ग्लूकोज (या 13सी-ग्लूकोज) २.० छ
1 M MgSO4 2 मिलीलीटर
५० मिमी CaCl2 4 मिलीलीटर
20 मिलीग्राम/एमएल Thiamine १.० एमएल
3 मिमी FeCl3 ४०० µ l
धातु मिश्रण (तालिका 3) ५०० µ l
एच२ओ ५० मिलीलीटर तक

तालिका 2. M9 मीडिया की पूरकता के लिए पोषक तत्व मिश्रण.

अभिकर्मक मात्रा
4 मिमी ZnSO4 ३२३ मिलीग्राम
1 मिमी MnSO4 ७५.५ मिलीग्राम
४.७ मिमी एच3बो3 १४५ मिलीग्राम
०.७ मिमी CuSO4 ५५.९ मिलीग्राम
एच२ओ ५०० मिलीलीटर तक

तालिका 3. मीट्रिक टन पोषक तत्व मिश्रण को समृद्ध बनाने के लिए धातु मिश्रण पूरक ।

नमूना 1 मिमी ई-PRD बफर में1 (µ एल) 1mM VimRod बफर A (µ l) बफर A (µ l) २०० µ m DSS डी2ओ (µ एल) बफर बी2 (µ एल) कुल मात्रा (µ l)
ई-PRD अकेले ५० 0 ५० ५० ३५० ५००
ई-PRD + VimRod ५० ५० 0 ५० ३५० ५००
1 एक बफर: 20 मिमी Tris-एचसीएल, 1 मिमी डीटीटी, पीएच 7
2 बफर बी: 23 मिमी Tris-एचसीएल, १.१४ मिमी डीटीटी, पीएच 7

तालिका 4. एनएमआर नमुना तयारी.

Discussion

2d 15N-हल एनएमआर प्रयोग सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया तरीकों में से एक को दिखाने के कैसे दो अणुओं बातचीत है । यह सबसे अधिक जानकारी संपंन तरीका है कि दोनों भागीदारों के संकेतों को लगातार समाधान राज्य में एक अनुमापन प्रयोग भर में निगरानी की अनुमति देता है । हालांकि आम तौर पर गुणात्मक बड़े परिसरों के मामले में, विधि भी अनुकूल मामलों में इस्तेमाल किया जा सकता है बाध्यकारी समानताएं जहां एनएमआर संकेत उच्च संकल्प स्पेक्ट्रा में ट्रैक किया जा सकता है मापने के लिए । जहां असाइनमेंट सुविधाजनक रूप से किए जा सकते हैं, जैसे कई प्रोटीन के मामले में 20 केडीए के तहत आकार में, बाध्यकारी साइटों को भी मैप किया जा सकता है. पूरक परख जैसे MST समाधान में बातचीत के बारे में मात्रात्मक जानकारी प्रदान करते हैं, और unlabel्ड राज्यों में कम प्रोटीन की आवश्यकता होती है । उत्परिवर्ती बाध्यकारी डेटा की तुलना नियंत्रण प्रदान करने के लिए यह सुनिश्चित करने के लिए उपयोगी है कि बातचीत एनएमआर लाइन को विस्तृत करने का सबूत वास्तविक और नहीं कलाकृतियों, उदाहरण के लिए, एकत्रीकरण या चिपचिपापन परिवर्तन कर रहे हैं ।

प्रोटीन एक्सप्रेशन

अभिव्यक्ति प्रक्रिया को कारगर बनाने के श्रम गहन प्रोटीन उत्पादन की मात्रा कम कर देता है । इस अनुकूलन प्रक्रिया का हिस्सा प्रोटीन की रिकॉमबिनेंट अभिव्यक्ति के लिए ई. कोलाई का एक उचित तनाव की पहचान शामिल है । तनाव वरीयता उपयोग में वेक्टर की प्रकृति सहित तत्वों पर निर्भर करता है और, अधिक विशेष रूप से, रिकॉमबिनेंट प्रोटीन की अंतिम स्थिरता7व्यक्त की जा रही है । अंतर्जात ई. कोलाई द्वारा heterologous प्रोटीन के क्षरण के जोखिम को छेड़ने की कमी ई. कोलाई जैसे BL21 तनाव के उपयोग से कम किया जा सकता है । दुर्लभ codons युक्त जीन के लिए, BL21-CodonPlus (DE3) RIPL जैसे एक तनाव पसंद किया जा सकता है । इस तनाव arginine, isoleucine, के लिए दुर्लभ codon tRNAs की अतिरिक्त अंतर्जात प्रतियां के साथ BL21 तनाव की तंग कमी प्रकृति को जोड़ती है, रेखा, और leucine । वैकल्पिक रूप से, दुर्लभ codons कि स्पष्ट समझौता कर सकते हैं एक codon अनुकूलित एक वाणिज्यिक स्रोत से निर्माण के आदेश से बचा जा सकता है । ई. कोलाई के कई उपभेदों रिकॉमबिनेंट जीन अभिव्यक्ति के लिए उपलब्ध हैं, प्रत्येक7अभिव्यक्ति के दौरान एक विशेष समस्या के दरकिनार के लिए अनुकूलित । इस अध्ययन के मामले में, मानक की कमी तनाव BL21 (DE3) बाद की शुद्धि और विश्लेषण के लिए घुलनशील प्रोटीन की पर्याप्त मात्रा में उत्पादन किया ।

प्रोटीन शुद्धि

एक दिया प्रोटीन के लिए शुद्धि प्रोटोकॉल अक्सर अर्थ में अद्वितीय है कि प्रत्येक प्रोटीन स्थिर और घुलनशील जैसे तापमान, नमक एकाग्रता, या पीएच के रूप में विभिंन स्थितियों के अंतर्गत रहता है । अपनत्व क्रोमैटोग्राफी के माध्यम से शुद्धिकरण का समग्र प्रभाव शुद्धिकरण प्रक्रिया के दौरान विभिन्ना कदमों पर imidazole जैसे eluting प्रजातियों की एकाग्रता के प्रति भी संवेदनशील होता है. इस काम में, IMAC के लिए महत्वपूर्ण बफर शर्तों ई के लिए पीएच थे PRD, और VimRod के लिए imidazole एकाग्रता । ७.५ का एक पीएच IMAC कॉलम से ई-PRD निंनलिखित प्रारंभिक रेफरेंस के वर्षण से बचने के लिए आवश्यक था । VimRod के IMAC शुद्धि के लिए, स्तंभ वॉश कदम के दौरान 30 से ५० mM से imidazole की एकाग्रता में वृद्धि अंतिम रेफरेंस अंशों की शुद्धता में पर्याप्त सुधार करने के लिए पाया गया था । रेफरेंस स्टेप के लिए २५० से imidazole की एकाग्रता बढ़ाने से ३५० एमएम भी फाइनल रेफरेंस की उपज में सुधार पाया गया । elute २५० mM imidazole का उपयोग कर प्रोटीन के लिए प्रारंभिक प्रयास VimRod के अधूरा रेफरेंस के लिए नेतृत्व के रूप में कॉलम की एक अंतिम 1 मीटर imidazole पट्टी से पता चला (डेटा नहीं दिखाया गया है) । imidazole एकाग्रता को बढ़ाने के लिए ३५० mM के रेफरेंस के लिए पर्याप्त मात्रा में प्रोटीन से बंधे कॉलम को ठीक किया गया. एस एक दोहरे उद्देश्य की सेवा कर सकते है क्योंकि यह प्रोटीन शुद्धि के लिए एक चमकाने कदम के रूप में कार्य करता है जबकि एक साथ बफर एक्सचेंज प्रदर्शन । बफर एक्सचेंज बाद बाध्यकारी विश्लेषण के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है क्योंकि यह elute His6-टैग प्रोटीन के लिए इस्तेमाल imidazole हटा । यह भी एक ऐसी नमक एकाग्रता या पीएच, जो कुछ बहाव तकनीकों या परख की प्रभावकारिता को प्रभावित कर सकते है के रूप में शर्तों को बदलने का अवसर के रूप में कार्य करता है । प्रोटीन थर्मल शिफ्ट (अंक), विशेष रूप से कमरे के तापमान8,9पर समय की लंबी अवधि के लिए स्थिर प्रोटीन की आवश्यकता होती है उन लोगों के लिए बहाव परख के लिए इष्टतम बफ़र्स की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

बाइंडिंग विश्लेषण

प्रोटीन है कि हौसले से तैयार है सही बाध्यकारी परख के लिए महत्वपूर्ण है, हालांकि जमे हुए प्रोटीन भी जब तक परिणाम की तुलना कर रहे है के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है । एक नमक और पीएच निर्भर फैशन में vimentin multimerize जैसे रेशा प्रोटीन, और इसलिए समाधान हालत को अनुकूलित किया जा करने की आवश्यकता है और इस तरह धारा10,11, गतिशील प्रकाश बिखरने के रूप में एक विधि द्वारा अनुमानित oligomeric राज्य 12 या विश्लेषणात्मक ultracentrifugation13,14,15. एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी परमाणु संकल्प पर छोटे प्रोटीन की ligand बातचीत को मापने के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है । हालांकि, जब एक प्रोटीन बड़ा अणु के साथ सूचना का आदान प्रदान, धीमी tumbling मग्न, और संकेतों की हानि में यह परिणाम है, जो बाध्यकारी पुष्टि कर सकते है हालांकि यह जरूरी बंधन साइटों, जो भी काम की आवश्यकता होगी के मानचित्रण की अनुमति नहीं है कम रीढ़ की अनुनादों. इस परिदृश्य में, एनएमआर प्रयोग सहभागिता साइट की पहचान की अनुमति नहीं देते । अतएव साइट निर्देशित mutagenesis को बाध्यकारी के लिए आवश्यक अवशेषों की पहचान करने के लिए लागू किया जाता है । इस तरह के म्यूटेंट इसलिए संकेत हानि प्रदर्शित नहीं करते । इस प्रोटोकॉल में, १९१४ की स्थिति पर एक प्रतिस्थापन के साथ एक उत्परिवर्ती फार्म VimRod की उपस्थिति में चोटी तीव्रता बरकरार रखती है और इसलिए ई की बातचीत के विघटन की पुष्टि PRD और VimRod । रीढ़ और sidechain अनुनादों के असाइनमेंट इस दृष्टिकोण के लिए मूल्य जोड़ना होगा, विशेष रूप से मुक्त ई के लिए संरचना के रूप में PRD एक्स द्वारा हल किया गया है-रे क्रि4। एनएमआर के भविष्य के अनुप्रयोगों के बड़े अणुओं के बीच जटिल बातचीत का लक्षण वर्णन शामिल है और अल्ट्रा उच्च क्षेत्र मैग्नेट और अन्य चौकस समूहों के उपयोग से इस तरह के रूप में 13ग लेबल और trifluoro मिथाइल समूहों के पत्रकारों के रूप में लाभ होगा ।

MST16बंधन बातचीत का अध्ययन करने के लिए लाभ के एक नंबर है । बाध्यकारी साझेदार समाधान में स्वतंत्र हैं और मैटीरियल नहीं है । नमूनों की गुणवत्ता का विश्लेषण, एकत्रीकरण की गुणवत्ता नियंत्रण रिपोर्टिंग, केशिकाओं के लिए सोखना या लक्ष्य अणु के अपर्याप्त फ्लोरोसेंट लेबलिंग के साथ सॉफ्टवेयर में बनाया गया है । लक्ष्य की छोटी मात्रा में आम तौर पर इस्तेमाल कर रहे हैं, लेबल लक्ष्य की एकाग्रता एक 10-20 μL मात्रा में 20-50 एनएम के बीच आम तौर पर है/ इस प्रोटोकॉल बहुत छोटे प्रतिक्रिया संस्करणों का उपयोग करता है (10 μL) ligand की एकाग्रता को अधिकतम करने के लिए कि कमजोर बाध्यकारी बातचीत की अनुमति titrations में प्राप्त किया जा सकता है विशेषता है । यह आवश्यक सटीक pipetting और देखभाल बुलबुले शुरू करने से बचने के लिए लिया जा रहा है, जबकि अभी भी अच्छी तरह से मिश्रण । पर्याप्त मिश्रण धारावाहिक कमजोर पड़ने के सेट के साथ सटीक, लगातार प्रतिदीप्ति माप के लिए महत्वपूर्ण है । MST प्रयोगों में 20 के बीच की राशि एक मानक ०.०५% से ०.०१५% करने के लिए बुलबुले बनाने और मिश्रण में सुधार की प्रवृत्ति को कम किया गया था ।

लाल-Tris-ंत् डाई एक त्वरित, आसान और सुविधाजनक तरीका है फ्लोरोसेंट किसी भी प्रोटीन है कि एक अपने टैग है लेबल । लेबलिंग प्रभावी ढंग से केवल 30 मिनट में पूरा हो गया है और बहुत तंग है ताकि कोई डाई हटाने की प्रक्रिया आवश्यक है । कोई संशोधन प्रोटीन है कि ligand बाध्यकारी गुणों को बदल सकता है में एमिनो एसिड अवशेषों के लिए किए गए हैं । एक चेतावनी है कि केवल प्रोटीन एक His6 टैग होना चाहिए लेबल होना चाहिए । यह ligand प्रोटीन से टैग की दरार की आवश्यकता, e-PRD, और टैग को हटाने और एक दूसरे IMAC कॉलम कदम के साथ ई-PRD uncleav । यदि संभव हो, ligand प्रोटीन एक अपने टैग के उपयोग के बिना तैयार किया जाना चाहिए । वैकल्पिक रूप से, प्रोटीन covalently lysine अवशेषों या thiol युग्मन के लिए cysteine अवशेषों को अमीन युग्मन के माध्यम से एक fluorophore के साथ लेबल किया जा सकता है । हालांकि, देखभाल जब एक fluorophore के आबंध लगाव के बाद से ऐसी प्रणालियों का उपयोग कर लिया जाना चाहिए इलेक्ट्रोस्टैटिक या ध्रुवीय बाध्यकारी lysine या cysteine अवशेषों पर निर्भर बातचीत को प्रभावित कर सकते हैं । MST द्वारा VimRod और ई-PRD के बीच बाध्यकारी संबधों की ठहराव को असामान्य रूप से नमक एकाग्रता के प्रति संवेदनशील किया गया । इस समस्या को शुरू में dialyzing द्वारा दोनों लक्ष्य और ligand परख बफर के एक ही बैच में कम किया गया था । बहरहाल, MST बाध्यकारी वक्र के संतृप्ति प्राप्त नहीं किया जा सकता है जब १५० mM VimRod के जटिल व्यवहार के कारण NaCl की उपस्थिति में MST परख प्रदर्शन । विश्वसनीय, पूरा डेटा प्राप्त किया गया था एक बार NaCl की एकाग्रता के लिए कम किया गया था 10 मिमी सही गणना की अनुमति KD. इसलिए, समाधान की स्थिति और पूरक परख के साथ तुलना के सावधान अनुकूलन मजबूत परिणाम प्राप्त करने के लिए सिफारिश कर रहे हैं । इसके अलावा, MST के लिए एक दिया बातचीत के लिए नमक निर्भरता यों तो इस्तेमाल किया जा सकता है, प्रोटीन बातचीत के stoichiometric गुण यों तो, प्रोटीन तह की निगरानी, और एंजाइम कैनेटीक्स में जांच17।

Disclosures

लेखकों के हितों का कोई संघर्ष का खुलासा ।

Acknowledgments

इस परियोजना NSERC RGPIN द्वारा समर्थित किया गया है-2018-04994, परिसर अलबर्टा नवाचार कार्यक्रम (आरसीपी-12-002C) और अलबर्टा Prion अनुसंधान संस्थान/अलबर्टा नवाचारों जैव समाधान (२०१६०००१८), एम ओ और जीनोम कनाडा और कनाडा फाउंडेशन के लिए संमानित किया Metabolomics इनोवेशन सेंटर (TMIC) तथा NANUC को नवाचार अनुदान प्रदान किया गया ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Monolith NT.115, includes control and analysis software NanoTemper Technologies MO-G008 Instrument for microscal thermophoresis
His-Tag Labeling Kit RED-Tris-NTA NanoTemper Technologies MO-L008 RED-tris-NTA dye for MST
Standard capillaries NanoTemper Technologies MO-K022 capillaries for MST
HisTrap HP, 5 mL GE Healthcare 17524801 IMAC column
HisPur Ni-NTA resin, 100 mL Thermo Fisher Scientific 88222 IMAC resin
HiLoad 16/600 Superdex 75 pg GE Healthcare 28989333 SEC column
TEV protease Sigma Aldrich T4455 cleavage of his tag from E-PRD
BL21(DE3) Competent E. coli New England Biolabs C2527H cells for protein expression
cOmplete Protease Inhibitor Cocktail Tablets EDTA-Free Sigma Aldrich 11873580001 protease inhibitors for protein purification by IMAC
TCEP, Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride Sigma Aldrich C4706 reducing agent for protein purification
Reagents (HEPES, NaCl, etc) Sigma Aldrich various Preparation of media and buffers
Ammonium chloride (15N, 99%) Cambridge Isotope Laboratories NLM-467 isotope labelling for NMR
D2O, Deuterium Oxide (D, 99.8%) Cambridge Isotope Laboratories DLM-2259 NMR sample preparation
DSS, Sodium 2,2-dimethyl-2-silapentane-5-sulfonate-D6 (D,98%) Cambridge Isotope Laboratories DLM-8206 reference for NMR
Precision 5 mm NMR Tubes, 7” long SJM/Deuterotubes BOROECO-5-7 NMR tubes
NMR spectrometer (14.1 Tesla) Bruker acquisition of NMR data
TCI 5mm z-PFG cryogenic probe Bruker acquisition of NMR data
Name Company Catalog Number Comments
Software
Bruker TopSpin 4.0.1 Bruker processing of NMR data
MO.Control NanoTemper Technologies included with Monlith NT.115
MO.Affinity Analysis NanoTemper Technologies included with Monlith NT.115

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References

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जैव रसायन अंक १४१ कोशिका adhesiondesmosome desmoplakin रेशा प्रोटीन मध्यवर्ती रेशा अतिसूक्ष्म thermophoresis नाभिकीय चुंबकीय अनुनाद स्पेक्ट्रोस्कोपी प्रोटीन इंटरेक्शन vimentin
परमाणु चुंबकीय अनुनाद स्पेक्ट्रोस्कोपी (एनएमआर) और अतिसूक्ष्म Thermophoresis (MST) द्वारा गोलाकार और रेशा प्रोटीन की बातचीत को मापने
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Winkelaar, G., Trieber, C., Kumar,… More

Winkelaar, G., Trieber, C., Kumar, J., Overduin, M. Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (NMR) and Microscale Thermophoresis (MST). J. Vis. Exp. (141), e58537, doi:10.3791/58537 (2018).

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