Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Nükleer manyetik rezonans spektroskopisi (NMR) ve Microscale Thermophoresis (MST) tarafından küresel ve ipliksi protein etkileşimleri ölçme

Published: November 2, 2018 doi: 10.3791/58537
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Biochemistry, University of Alberta

Summary

Burada, üretim ve arıtma etiketlenir proteinlerin için bir protokol kararlı izotop ve protein-protein etkileşimleri nükleer manyetik rezonans (NMR) spektroskopisi ve MicroScale kullanarak sonraki karakterizasyonu ile mevcut Thermophoresis (MST) deneyler.

Abstract

Vimentin gibi ipliksi protein organizasyon proteinler plakin içeren siteleri ile yapısal bir iskele sağlayarak hücreleri içinde yinelenen denetim sağlar. Burada, tespit ve bu tür etkileşimler ölçüm için bir protokol envoplakin küresel plakin tekrar etki alanını ve vimentin sarmal bobin kullanılarak açıklanmıştır. Bu bir protein vimentin (veya benzer ipliksi protein) bağlar olup olmadığını belirlemek için ve etkileşim yakınlık ölçüm için bir temel sağlar. Faiz küresel protein 15ile N etiketli ve çözüm vimentin protein ile titre. Bir iki boyutlu NMR spektrumu tepe şekil veya kimyasal vardiya değişiklikleri gözlemleyerek etkileşimleri algılamak ve etkileri vimentin dördüncül yapı etkisi tuz düzeyleri de dahil olmak üzere çözüm koşullardan aydınlatmak için kazanılır. Faiz protein ipliksi ligand bağlar, bağlama etkileşim saf protein kullanarak MST tarafından sayılabilir. Bir protein ilgi bir filament bağlar olup olmadığını belirlemek için ve nasıl etkileşim değişikliği, mutasyonlar çözüm koşullar, gibi etkiler değerlendirmek için basit bir yol yaklaşımdır.

Introduction

Proteinler arasındaki etkileşimler hücreleri içinde sipariş oluşturmak Moleküler makineler oluşumunu sağlar. Bireysel etkileşimler genellikle zayıf ama genellikle kooperatif ve dinamik olarak düzenlenmiş olabilir multivalent kompleksleri için katkıda bulunmak. Atomik çözünürlük ve böyle karmaşık etkileşimleri hakkında kantitatif bilgi sağlayan hassas deneyleri mekanizmaları anlamak ve uyuşturucu gibi moleküller gibi müdahaleler tasarlamak için ihtiyaç vardır. NMR spektroskopisi protein etkileşimleri hakkında böyle bilgi elde etmek için etkili bir yöntemdir ve zayıf1bağlamak da dahil olmak üzere ligandlar için hızlı tarama için de kullanılır. NMR yöntemleri kullanılan çoğu protein gözlemlemek veya ligand gözlemek o kategorize edilebilir. Bu el yazması kararlı izotop (genellikle altında 20 kDa) nispeten küçük protein etiketli bir spektrum kazanılır ve etiketsiz ligand titre eski yaklaşım kullanır. Bu izin etiketli artıkları olumlu durumlarda eşlenmesi için etkileşim dahil. Bir kez karmaşık formlar, kimyasal ortamlarda kendilerini kimyasal Shift değişiklikler olarak tezahür etkileşen kalıntılarının ve NMR sinyalleri şeklinde bulunan değişiklikler vardır. Ölçüde bu tür değişiklikleri bu grupların etkileşim katılımı derecesi ile karşılıklı olarak ilişkilendirir. Kimyasal shift tedirginlikler (CSP) NMR spectra devamsızlık ve ligand değişen miktarlarda varlığı toplanan protein bir dizi karşılaştırarak ölçülebilir. Daha büyük ligandlar veya karmaşık etkileşimler için en yüksek şekli veya yoğunluğunu değişikliği etkileşimleri anlamak için ölçülebilir.

Ligand etkileşimleri algılamak için kullanılan en yaygın 2D deneme 15N-heteronuclear tek kuantum korelasyon (HSQC) deney2' dir. Bunun bir protein hangi genellikle benzeşme öğesini sürümleri E. coli bakteriyel kültürlerde 15' te N zenginleştirilmiş medya yetiştirilen olarak ifade ederek elde edilir ile 15N, liflerin düzenli bir biçimde etiketlenmesi gerekir. Titrasyon sırasında toplanan HSQC spectra üst üste zaman bağlama tepe değişiklikleri kalıntılarının karmaşık oluşumunda yer alan bir alt için açığa belirgindir. Etkileşim nerede Daralt özgür ve ligand doymuş durumu sinyallerini bir popülasyon ortalaması en yüksek hızlı Döviz rejimi meydana gelebilir. Alternatif olarak, devletler arasında yavaş Satım söz konusu olduğunda, her iki sinyali göreli tutarlarını gösteren integraller ile gözlenir. NMR lineshape analiz bazı durumlarda bağlama benzeşim tahmin etmek için kullanılan, MST gibi yöntemleri de uygun kanıtlamıştır ve hakiki etkileşimlerin çapraz doğrulama sağlar.

Desmosomes içinde bulunan iki proteinlerin sağlanan örnek verilebilir. Kavşak hücre yüzeyleri ve sitoiskeleti arasında aracılık ve hücre adezyon makineleri ve deri bütünlüğünü korumak için ara filamentler multivalent Hofstede aracılık ve kalp doku ve, dayanıklı kuvvetleri kesme. Hastalıkları desmosomal proteinler kardiomyopati veya vimentin gibi mutasyonlar ve otoantikorlar, hücre-hücre kavşaklar destabilization lider tarafından tehlikeye ve dolayısıyla onların etkileşim kritik öneme sahip3olduğunda neden olabilir. Etkileşimleri MST tarafından sayısal iken ligand bağlayıcı desmosomal proteinler tarafından yapısal temeli NMR spektroskopisi ile karakterize edilebilir. Burada yöntemleri genellikle temel oluklar teklif tandem kümeleri olarak var olmayan plakin tekrar etki alanları (PRDs) ve vimentin, helisel tarafından sunulan bir asidik yüzeyi ile etkileşim bir ara filaman arasındaki etkileşimler karakterize etmek için kullanılması paket4. Bu komplekslerin nerede böylece yapışkanlı tahvil bir doku yayılan bir ağ oluşturan bitişik hücrelere bağlamak desmosomes için hücre sitoiskeleti ara filamentler için çapa hücre zarı oluşur.

Protocol

1. rekombinant Protein ifade

  1. Envoplakin PRD (E-PRD) ve Vimentin 99-249 (VimRod) ifadesi
    1. E. coli BL21(DE3) hücreleri istenilen gen içeren plazmid ile dönüşümü. Ağar kaplamalar 100 µg/mL ampisilin içeren hücrelerin yayıldı. Plakayı 37 ° C'de gecede kuluçkaya.
    2. Bir koloni almak ve müthiş suyu (TB) plazmid için seçmek için 100 µg/mL ampisilin içeren 20 mL aşılamak. Kültür 37 ° C'de (180 rpm) gecede sallayarak ile büyümek.
    3. Tüm 20 mL kültür için 1 L 50 µg/mL ampisilin içeren TB aktarın. 180 rpm kadar OD600 sallayarak ile kültür 37 ° C'de kuluçkaya 0,6-0,8 =.
    4. Sıcaklık 18 ° C-azaltmak ve protein ifade izopropil β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) ekleyerek 1 mM son bir konsantrasyon için ikna etmek. Kuluçka 18 ° C'de 160 protein ifade izin vermek için devir / dakikada gecede sallayarak ile devam edin.
    5. 15 dk. Decant 8000 x g de kültür centrifuging tarafından hücreleri hasat ve süpernatant atın.
    6. Yıkama hücre Pelet fosfat yaklaşık 40 mL resuspending tarafından hasat hücreleri tamponlu tuz çözüm (PBS: 20 mM fosfat tampon, pH 7.4, 120 mM NaCl). Resuspension 50 mL tüp aktarın. Santrifüj tekrar 8.000 x g de 15 dakika.
    7. Dikkatle boşaltmak ve süpernatant atın. Ya hemen arıtma Protokolü başlamak ya da hücre topakları ileride kullanmak için-20 ° C'de dondurmak.
  2. İfade Isotopically etiketli protein
    1. E. coli BL21(DE3) hücreleri dönüştürme ve 1.1.1-1.1.2 olduğu gibi 20 mL starter kültür hazırlamak.
    2. Tüm 20 mL kültür 1 litre zenginleştirilmiş TB bir ek 4.0 g tryptone, 5.0 g NaCl ve 100 µg/mL ampisilin içeren aktarın. 160 rpm'de kadar OD600 sallayarak ile kültür 37 ° C'de kuluçkaya 1,6-1,9 =.
    3. Santrifüjü 8000 x g 15 dk. Decant de tarafından 1 L kültür hasat ve süpernatant atın.
    4. Yavaşça PBS yaklaşık 40 mL resuspending tarafından hücre Pelet yıkama ve resuspension 50 mL tüp aktarmak.
    5. 8000 x g 15 dk. Decant için de yine santrifüj kapasitesi ve süpernatant atın.
    6. Hücre Pelet M9 en az medya (Tablo 1) ve transfer geri kalanına 100 µg/mL ampisilin içeren M9 en az medya 950 mL 20 ml resuspend.
    7. 50 mL steril filtre besin karışımı (Tablo 2 ve 3) ekleyin.
    8. 18 ° c 30 dk için kültür IPTG 1 mM son bir konsantrasyon için eklemeden önce parkenizin.
    9. Gecede 18 ° C'de 160 rpm'de sallayarak ile kuluçkaya.
    10. Bölüm 1.1.4-1.1.6 olduğu gibi hücre hasat.

2. Metal benzeşme Kromatografi (IMAC) arıtma VimRod ve E-PRD immobilize

  1. His6 öğesini VimRod arıtma
    1. Hücre Pelet 5 mL/g proteaz inhibitörü kokteyl eksik EDTA içeren PBS içinde resuspend. Aşağıdaki adımda hücre lizis geliştirmek için bir Dounce doku homogenizer 12 darbeleri ile homojenize.
    2. Buz üzerinde kapalı hücre süspansiyon 1 s/1 s bir darbede solüsyon içeren temizleyicide, % 80 genlik 1,5 dk. toplam süreleri, aşırı ısınmayı önlemek için çalıştırma arasında buzda yavaşça dönen iki ek sonication tekrar.
    3. 75.000 x g 45 dk. Decant için de örnek santrifüj kapasitesi ve bir şırınga filtre (0,45 µm) kullanarak süpernatant filtre.
    4. 5 mL IMAC sütun bağlama arabellek (20 mM HEPES, pH 7.5, 500 mM NaCl, 10 mM imidazole) 1 mL/dk hızlı protein sıvı kromatografi (FPLC) sistemi kullanarak akış hızında 5 sütun cilt (CV) ile equilibrate.
    5. Filtre uygulanmış süpernatant 0.5 mL/dk akış hızında sütuna yerleştirin.
    6. Sütun 5, CV yıkama arabellek (20 mM HEPES, pH 7.5, 500 mM NaCl, 50 mM imidazole) ile 1 mL/dk debi yıkayın.
    7. Protein 3 ile elute CV elüsyon arabelleği (20 mM HEPES, pH 7.5, 500 mM NaCl, 350 mM imidazole) 0.5 mL/dak toplamak 1.5 mL kesirler akış hızında. Varsa, eluted protein konsantrasyonu artırmak için yukarı akış elüsyon modunu seçin.
    8. Protein konsantrasyonu5ölçmek için standart yöntemleri kullanın ve SDS-sayfa tarafından ilgi protein içeren kesirleri FPLC kromatografik üzerinden tanımlayın.
    9. Havuz ve bir santrifüj ultrafiltrasyon (MWCO 3 kDa, 5 mL) 2 ml aygıtıyla protein yüksek miktarda içeren elüsyon kesirler konsantre. Herhangi bir çökelti kaldırmak ve 0,22 mikron filtre üzerinden geçmek 21.000 x g, santrifüj kapasitesi.
    10. 120 mL boyutu dışlama Kromatografi (S) sütun 1 mL/dak bir FPLC kullanarak akış hızında 2 S CV arabelleği (20 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7.5, 0,5 mM TCEP) ile equilibrate.
    11. 2.1.9 sütuna yoğun protein enjekte edip 1 S CV arabelleği akış hızı 0.5 mL/dk, 1 mL kesirleri toplama, ile elute.
    12. Önce ilgi protein içeren kesirleri tanımlayın.
    13. En yüksek miktarda protein içeren kesirleri havuz.
    14. Kısa süreli kullanım için 4 ° C'de depolayın veya % 20 ve mağaza içinde küçük aliquots-80 ° C'de gliserol ekleyin.
  2. E-PRD Protein kaldırıldı His6 etiketi ile saflaştırılması
    1. 2.1.1-2.1.8 His6 öğesini E-PRD protein arındırmak için adımları izleyin. Tepe kesirler havuz ve protein konsantrasyonu belirlemek.
    2. Tütün eklemek virüs (TEV) proteaz (1 mg/mL) 2 µL/mg havuza alınan protein etch. (6 kDa) boru diyalize aktarmak ve gecede 4 ° C'de S arabellekte diyaliz Bu adımı His6 etiketinin bölünme ve Ni-NTA reçine sonraki adımda bağlama çalışmasına engel imidazole kaldırılmasını sağlar.
    3. Ni-NTA reçine bir yerçekimi sütun 3 S CV arabelleği ile 5 mL equilibrate. Drenaj reçine aşırı arabelleğinden.
    4. Cleaved E-PRD protein reçine üzerine dökün ve 1 saat uncleaved His6 öğesini E-PRD ve cleaved His6 etiket bağlamak izin vermek için sallanan bir platform üzerinde kuluçkaya. TEV proteaz da His6 öğesini ve reçine bağlamak olacak. Aracılığıyla akış toplamak, hangi etiket Ücretsiz E-PRD içerir. Tüm E-PRD sağlamak için yıkama reçine ile 2 S CV arabellek kurtarılır.
    5. E-PRD ile akışı 2 ml (MWCO 3 kDa, 5 mL) bir santrifüj Ultrafiltrasyon aygıtı kullanarak konsantre. Herhangi bir çökelti kaldırmak ve 0,22 mikron filtre üzerinden geçmek için 21 000 x g, santrifüj kapasitesi.
    6. 120 mL S sütun 1 mL/dak bir FPLC kullanarak akış hızında 2 S CV arabelleği (20 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7.5, 0,5 mM TCEP MST veya 20 mM Tris-HCl, 1 mM DTT, pH 7 NMR için) ile equilibrate.
    7. 2.2.5 sütuna konsantre E-PRD protein enjekte edip 1 S CV arabelleği akış hızı 0.5 mL/dk, 1 mL kesirleri toplama, ile elute.
    8. Önce ilgi protein içeren kesirleri tanımlayın.
    9. En yüksek miktarda protein içeren kesirleri havuz.
    10. Kısa süreli kullanım için 4 ° C'de depolayın veya % 20 ve mağaza içinde küçük aliquots-80 ° C'de gliserol ekleyin.

3. NMR yöntemleri

  1. NMR numune hazırlama
    1. 15N etiketli vahşi-türü veya R1914E E-PRD protein 20 mM Tris-HCl, 1 mM DTT, pH 7 adım 2.2.6 S tampon olarak kullanarak daha önce açıklandığı gibi arındırmak. Protein hisse senedi çözümleri 0,3 yaklaşık 1 mL hacimleri ile 1 mM için genellikle aralığı.
      Not: Protein için konsantre olabilir > 100 µM numune hazırlama için konsantrasyon uygun bir aralığın içine getirmek için bir MWCO 3 kDa, 5 mL santrifüj Ultrafiltrasyon aygıt kullanarak.
    2. 20 mM Tris-HCl, 1 mM DTT, pH 7 adım 2.1.10 S tampon olarak kullanarak etiketsiz VimRod protein örneği arındırmak.
    3. 500 µL son hacmi içinde 100µM, döteryum oksit (D2O) % 10 (v/v) ve DSS (4,4-dimethyl-4-silapentane-1-sulfonic asit) son bir konsantrasyon 20 µM. son bir konsantrasyon için son bir konsantrasyon vahşi-türü veya mutant E-PRD protein eklemek Bring numune hacmi 500 µL kadar 20 mM Tris-HCl, 1 mM DTT, pH 7 kullanarak. Bir temsili numune hazırlama Tablo 4' te açıklanmıştır.
      Not: 0 ppm rezonans DSS 1H kimyasal vardiya kalibre için kullanılır hem de dolaylı 15N kimyasal başvurmak için protein6/ vardiya. D2O döteryum kilit sinyal için manyetik alan net bir sabit çalışma Spektrometre tutmak için kullanılır.
    4. E-PRD, D2ikinci bir örnek kadar önceki adımı olduğu gibi O ve DSS yapmak ve 50 µM 500 µL kadar ses getiren önce son bir konsantrasyon VimRod ekleyin.
    5. 500 µL örnekleri 5 mm geniş NMR tüpler deneme için transfer.
  2. NMR deneysel Kur
    1. Çıkarma komutu "ej"; hava akışına açmak Bu mıknatıs örnek getirecektir. Şimdi, örnek bir spinner mıknatıs üstüne içinde tarafından açılış ve komut "IJ" yerleştirin. Devam etmeden önce mıknatıs içinde örnek yerleşir kadar bekleyin.
    2. "Edc" komutunu kullanarak yeni bir veri kümesi oluşturun ve standart 1H NMR parametreleri deney seçerek "ZGPR" (Şekil 1) yükleyin. ADI, EXPNO (deney numarası) ve PROCNO (işlenen verileri dizin numarası) alanlarını doldurun. Çözücü "solvent ayarla" alanında seçin ve "üzerinde 'getprosol'" standart probehead ve solvent bağımlı (prosol) parametreleri okumak için tıklatınyürütmek.
    3. Deuterated solvent, Yani, D2O örneğe kilit, "kilit" komutunu kullanarak ve bu bitinceye kadar bekleyin süpürme ve kilit elde eder.
    4. Mıknatıs rezonans frekansı otomatik ayarlama komutu "atma" kullanarak örnek ayarlama tarafından düzeltin. Otomatik ayarlama işlemi tamamlanana sallantı eğrisi izlemek.
    5. TOPSHIM (komut "topshim") kullanarak manyetik alan dolgu. Titremeden manyetik alan örnek çevresinde bütünlük elde etmek için ayarlamalar süreçtir. "Wsh" komutu ile dolgu değerleri depolamak ve onları okumak için iyi bir yöntemdir "rsh" topshim önce aynı veya benzer örnekleri kullanıyorsanız kullanarak.
    6. Alıcı kazanç "rga" komutuyla en yüksek sinyal gürültü oranı elde etmek için ayarlayın.
    7. Spektrumunun merkezine su rezonans uzaklık (o1) yerleştirin ve "calibo1p1" kullanarak yüksek güçte 90 derece proton darbe (p1) ayarlayın.
    8. Toplamak proton spektrumu hazırlamalıyım sıfır kullanarak gitmek "zg" komutu ve oluşum "içeren üstel çarpma ("em"), ücretsiz indüksiyon çürüme (FID) hattı genişletmeyi birleşmeyle,"ft"e.f.P'yi" ile FID ve "pk" faz uygulamak için fourier dönüşümü Düzeltme.
    9. Otomatik Faz düzeltme "apk" ve "absn" polinom tümleştirme seçeneği olmadan kullanarak otomatik temel düzeltme uygulayın.
    10. Yeni bir veri kümesi (olduğu gibi 3.2.2) SOFAST HMBC deneme için deneyde "SFHMQC3GPPH" seçerek oluşturun.
    11. Kopya P1 ve O1 proton spektrum en iyi duruma getirilmiş ve P1 bağımlı bakliyat burada p1 en iyi duruma getirilmiş P1 değeri, plw1 güç düzeyi P1 için komut "getprosol 1 H p1 plw1", kullanarak doldurun.
    12. CNST54 sabiti Amid kimyasal shift kenardan uzaklığı ayarlamak için en iyi duruma getirmek ve CNST55 olmak alıcı kazanç sağlayan faiz spektral bölgelerin kapsayacak için bant genişliğini tanımlamak üzere optimize edilmiştir (Şekil 2). Bu parametreleri seçmek için ilk FID (ücretsiz indüksiyon decay) iki boyutlu spektrum ayıklamak ve onları tanımlamak gözlenen sinyal için bak. Buna ek olarak, gevşeme gecikme (D1), numarasını inceden inceye gözden geçirmek (NS) ve hangi olanaklı kılmak gidin ve veri kalitesi gerçek zamanlı olarak izlemek için tarama kukla taramaları (DS) komut "g", kabul edilebilir sinyal hassasiyet elde etmek için farklı.
    13. "Zg" mı kullanarak spectra kaydedin.
  3. NMR veri işleme
    1. İşleme parametreleri doğrudan F2 boyuta ayarlayın (1H) ve dolaylı F1 spektrum kullanımının (15N) Boyutlar "SI F2 = 2048, F1 512 =" dolaylı boyut (Şekil 3) isteğe bağlı doğrusal tahmin ile.
    2. "QSINE" pencere işlev seçin ve 2. iki boyutlu spektrum işlemek için bir sinüs çan kayma (SSB) girin.
    3. "Komut xfb pencere fonksiyonu ve fourier dönüşümü ile her iki yönde verileri işlemek için" girin.
    4. Her iki yönde otomatik faz düzeltme gerçekleştirmek için "apk2d" komutunu kullanın. Otomatik işlemi faz düzeltme tatmin edici bir düzeyde sağlamak değil, "rser" komutu ile FID'ler ayıklamak, 1 D işleme faz değerleri hesaplamak ve 2D veri uygulayabilirsiniz.
    5. Temel 2D verileri için otomatik temel düzeltme fonksiyonu "abs2" ile düzeltin. Bu işleme parametrelerinde tanımlanan ppm değerleri arasında polinom işlevi uygular ve daha fazla çözümleme için 2D bir spektrum üretecek.
    6. Eğer başka bir molekül ile etkileşim veri karşılaştırma için seri işlem gerçekleştirmek planlama, "wpar" komutu ile işleme parametreleri depolamak ve onları "rpar" geri. Tüm veri kümeleri aynı parametreleri ve çeşitleri ile işlenebilir bu şekilde farklılıklar işleme nedeniyle tanıtılacaktır değil.
  4. NMR veri analizi
    1. En yüksek malzeme çekme işlemine başlamak için "komut s" girin.
    2. Beklenen tepeler (Şekil 4) dayalı doruklarına ppm aralığı ve en düşük yoğunluk/maksimum sayı tanımlayın. Tamam'ı tıklatın ve sonuçları görsel denetim tarafından doğrulayın. Gerekli spectra kalitesine bağlı sonuçlar tatmin edici olana işlemi yeniden çalıştırın.
    3. "S" komutu ile bir peaklist oluşturur.
      Not: Bu peaklist varsayılan olarak veri yükseklik/en yüksek yoğunluk bilgileri içerir ve sonraki spektrumu için ihraç edilebilir ve diğer programlar tarafından okunabilir.
    4. En yüksek yoğunluklarda değişiklikleri veya başka bir molekül ile etkileşim göstermek protein HSQC spectra kimyasal nöbetleşe hareketinde gözlemlemek. Etkileşen molekül büyükse indirimleri bazı doruklarına ortadan kaybolması ile birlikte en yüksek yoğunluklarda bekliyoruz.
    5. Sonraki veri kümesi için en yüksek listesi doruklarına penceresinde bir sağ tıklama ile "tepeler" sekmesini tıklayarak ve "alma" seçerek alın.
    6. Tepeler üzerinde spektrum görselleştirmek ve onları yeni konumlara vardiya gerekirse. Tıkırtı üstünde "için tam bir tablo" "reset yoğunluklarda" bir peaklist yoğunluklarda (Şekil 5) ile spektrum için oluşturmak için. Bu zirve liste konum bilgileri saklı tepe listeden üzerinde taşıyacak.
    7. Tepe listeleri farklı DataSet'lerdeki bir elektronik tablo veya diğer matematiksel program analiz için "Export" fonksiyonunu seçerek dışa aktarın.
    8. En yüksek yoğunluklarda ile "zirve şiddeti karmaşık spektrum/en yüksek yoğunluk protein spektrumda" her zirve için görev değişikliği hesaplar. Değerleri yüzdesini değiştirmek için 100 çarpma tarafından dönüştürülebilir. En yüksek yoğunluklarda birbirine yakın konumlandırılmış tepeler için genellikle yüksek yoğunluklu proteinler için nispeten geniş zirvesinin olduğu gibi ölçmek daha kolay olmakla birlikte en yüksek birimler de yararlıdır unutmayın.

4. MicroScale Thermophoresis (MST)

  1. Ligand Protein E-PRD hazırlanması
    1. Ligand protein 1 litre 20 mM HEPES, pH 7.5, 10 mM NaCl, gecede 4 ° C'de yavaşça karıştırarak askıya 3,5 kDa mini diyaliz ünitesinde 800 μL kadar dialyzing tarafından bir MST uyumlu arabelleğe değişimi.
    2. Santrifüj Ultrafiltrasyon ünitesi (3 kDa MWCO) kullanarak ligand 14 000 x g 10 dk. temiz bir tüp yoğun protein aktarmak için de centrifuging konsantre ol.
    3. Ligand 21.000 x g 10 dk de santrifüj kapasitesi ve dikkatle süpernatant zarlarını protein var kaldırmak için yeni bir tüp için transfer. 280 absorbans kullanarak ligand konsantrasyonu belirlemek nm ve ligand tükenme katsayısı. % 10 Ekle %0,015 son bir konsantrasyon vermek için ara-20. Ara-20 adsorpsiyon için kılcal damarlar önlemek için tahlil tampon eklenir. MST deneyler için kullanılan son tahlil arabellek 20 mM HEPES, pH 7.5, 10 mM NaCl, %0,015 olan ara-20.
  2. Hedef boya etiketli Protein VimRod hazırlanması
    1. Kırmızı-tris-NTA boya PBS-T kırmızı-tris-5 mikron bir konsantrasyon vermek NTA ile sağlanan 1 x 50 μL ekleyerek yeniden oluşturma. 2 μL aliquots 200 μL tüpler içine dağıtmak ve -20 ° C'de depolayın
    2. Hedef protein 0,34 mikron ile tahlil arabellek için sulandırmak. Hedef 58 μL kırmızı-tris-NTA boya için bir 2 μL aliquot ekleyin ve oda sıcaklığında 30 dk için kuluçkaya. Nihai hedef boya etiketli 0,33 mikron bölgedir. 21.000 x g 10 min için etiketli hedefe santrifüj kapasitesi ve dikkatle süpernatant herhangi bir çökelti kaldırmak için yeni bir tüp için transfer. Kırmızı-tris-NTA boya proteinler His6 etiketi ile bağlar ve sub-nanomolar aralığında bir bağlama ayrışma sabiti (KD) vardır. % 100 etkili olduğunu daha fazla hiçbir arıtma gereklidir hedef protein bağlı.
    3. MST araç üzerinde açmak ve kontrol yazılımı açın. Kırmızı-tris-NTA boya için kırmızı ayarı seçin. 25 ° c sıcaklık kontrolü açmak
    4. Hedefi etiketleme doğrulamak için öntest seçin ve toplama veya cuvettes adsorpsiyon için. Bu parametreler bir değerlendirmesini otomatik olarak sağlanır.
    5. Mix 17 μL tahlil arabellek ve hedef protein ve pipetting tarafından mix 3 μL. Onları seyreltilmiş hedef daldırma ve kılcal ortasına kadar sıvı çizim tarafından iki standart kılcal doldurun. Kılcal damarlar içinde belgili tanımlık tepsi ve aletleri içine yerleştirin. Ölçüm başlatın.
    6. Floresans yeterli bir düzeyde ve adsorpsiyon (kılcal çizgi şeklinde bozulma) belirtisi yok arıyorum sonuçları gözden geçirin ya da yazılım analizde işaretlenir toplama (distorsiyonları MST izleme). Eğer sonuçları olumlu hareket üstünde-e doğru ligand adımları olmasa bile farklı bir arabellek güvenilir gerekir ya da % 0.05 veya daha fazla ara-20 miktarı artırılabilir.
  3. E-PRD Ligand iki kat seyreltme serisi hazırlanması
    1. Seyreltme serisi 16, etiketleme tarafından hazırlayın 200 μL Tüpler 1-16.
    2. Ligand 17 μL 1.17 Tube1 için istenen en fazla ligand konsantrasyonu daha daha büyük konsantrasyon x ekleyin. Bir aliquot sonra serideki sonraki tüp transfer edileceği gibi bu iki kez gerekli miktar (8,5 μL) birimdir. Testin son hacim 10 μL ligand 1.17 x konsantrasyon 8,5 μL için 1 x 1.5 μL hedef protein, VimRod eklenmesi ile seyreltilmiş yüzden. Bu maksimum konsantrasyon seçilmiş en az 20 kez tahmini KD değeri olmalıdır.
    3. Tahlil arabellek 8,5 μL Tubes2-16 her aliquot için yeni bir pipet ucu kullanarak ekleyin. Pipet ipuçları yeniden kullanma (için doğru pipetting bkz: üreticinin talimatlarına tavsiyeler) doğruluğu etkiler. Yavaş yavaş çözüm kabarcıkları oluşmadan tahlil ara belleğe serbest Tube2 ligand Tube1 üzerinden 8,5 μL aktarın. Ligand ve tampon yukarı ve aşağı en az 6 kez, tekrar kabarcıkları oluşmadan pipetting tarafından karıştırın. En yoğun tüp E-PRD 1.5 mM ve etiketli VimRod mevcut bir son konsantrasyonu 50 nM.
    4. Ligand 8,5 μL Tube3 için Tube2 aktarım ve tahlil arabellek ile karıştırın. Tüm tüpler ligand eklendi oldu kadar seri seyreltme yineleyin. Böylece tüm tüpler 8,5 μL ligand iki kat dilutions bir dizi içeren Tube16 üzerinden 8,5 μL atmak.
  4. Bağlama tepki ve MST deneme hazırlanması
    1. Etiketli hedef protein 1.5 μL her tüplerinin ekleyin ve karışımı yavaşça kabarcıklar önlemek için dikkatli olmak yukarı ve aşağı pipetting. 15 dakikadır kuluçkaya.
    2. Bağlama tahlil için uzman modu seçin ve seri seyreltme serisi için parametreleri girin. Sıcaklık kontrolü ayarlandığından emin olun için 25 ° C, % 40 ve orta MST iktidara uyarma güç ayarlanır. Bu parametreler okudu diğer bağlama ortakları için optimize edilmiş olması gerekir.
    3. Kılcal bağlama reaksiyonlar ile doldurun ve kapiller tepsisine yerleştirin. Alet belgili tanımlık tepsi yük, sıcaklık 25 ° C yeniden elde etmek ve ölçüm başlatmak bekleyin.
  5. Veri Analizi
    1. Benzeşme analiz yazılımı içinde bağlama tahlil dosyasını açın. Kapiller taramaları gözden geçirin; Floresans düzeyleri ortalama üzerinden % 10'den fazla farklılık değil, hiçbir toplama veya adsorpsiyon 3.6 bölümünde açıklandığı gibi tespit edilmelidir.
    2. MST analiz sağ panosunda seçin ve tahlil veri çözümlemesi kümesi sürükleyin. Aynı koşullar altında aynı hedef-ligand bağlayıcı testin birden çok çalıştırma varsa aynı kümesinde bırakarak birleştirilebilir. Alternatif olarak, her çalışma çözümleme bağımsız olarak kesilmesine.
    3. Verileri grafik için doz yanıt uygun sekmeye taşıyın. Bir tek bağlama site bekleniyor KD modeli seçin. Hill modeli aynı zamanda kooperatif davranışı ile birden çok bağlayıcı siteleri için bir seçenektir. Kalite kontrol geçemedi aykırı puan uygun-ebilmek var olmak çıkarmak bu aşamada. Birden çok deneyleri ile birleştirme ayarlar ortalama ve standart sapma hataları hesaplanan.
    4. Açık belgili tanımlık son etiket ve tek bir grafikte tüm araziler arasında karşılaştırılması. Her eğrinin için uygun sonuçlar oluşturulur tablosundan al. Veri veya monte eğrileri diğer sunu veya analiz yazılımı için istenirse verin.

Representative Results

(Artıkları 1822-2014 klonlanmış pProEX-HTC) E-PRD etki VimRod etki alanı (artıkları 99-249 pET21a klonlanmış) ve insan envoplakin gen insan vimentin4 His6 etiketleri ile ifade ve saf. Şekil 6 ve Şekil 7 göstermek VimRod saflık düzeyleri (18,8 kDa) ve E-PRD (21,8 kDa) elde edilen protein saflaştırma bu yöntem. E-PRD yapı VimRod protein His6 etiket bağlama boya kullanılarak etiketlenir ve herhangi bir E-PRD onun His6 etiketi istinat boya bağlama için rekabet edebilir MST deneyler için gerekli etikettir His6 kaldırılması. TEV proteaz etiketiyle bölünme sonra ikinci IMAC sütun TEV proteaz, cleaved etiket ve herhangi bir uncleaved His6-E-kalan PRD kaldırır. Son parlatma arıtma boyutu dışlama Kromatografi adımdır. E-PRD elüsyon tepe 72 nerede bu büyüklükte bir protein monomer beklenir mL ortalanır iken her ikisi proteinler de benzer bir boyutu rağmen 51 mL adresindeki sütun üzerinden VimRod elutes. VimRod boyutunu belirgin artış nedeniyle muhtemeldir karakteristiklerini ipliksi uzun çubuk olarak şeklinde protein analitik ultracentrifuge deneyler VimRod monomeric4olduğunu gösterdi. Protein düşük verimleri bu zengin suyu en az medyada üretilen hücreler daha düşük bir miktarı nedeniyle from M9 içinde yetiştirilen kültür elde edilir. TB M9 hazırlıkları için daha büyük starter kültürlerin ilk büyüme hücre sayıları 15N NMR deneyler için gerekli etiketleme ölçüde korurken geliştirilmesi sağlar.

15N -1H HSQCs alınan E-PRD R1914E mutant ve vahşi türü için varlığı ya da yokluğu VimRod (Şekil 8A-8 D) içinde. E-PRD Şekil 8A yelpazesi de çözümlenmiş tepeler, düzgün katlanmış bir protein gösterge beklenen sayısını gösterir. VimRod (resim 8B) huzurunda geniş hattı genişletmeyi ve tepe kaybolması, E-PRD ile VimRod arasındaki karşılık gelen spektrum gösterir. Bu bağlama tarafından R1914E mutasyon kıyasla kanıtladığı Şekil 8 c ve 8 Dolarak kaybolur. Küçük değişiklik VimRod ek olarak bu mutant E-PRD ve VimRod arasında bağ eksikliği gösteren R1914E mutant üzerine spektrumda görülmektedir. E-PRD en yüksek yoğunluklarda yokluğunda varlığı/VimRod karşılaştırmak ve en yüksek E-PRD tesisin genişletilmesi aralığı gösteren rakam 8E, göreli en yüksek yoğunluklarda olarak çizilen. E-PRD (gösterilmez) R1914E mutant doruklarına % 20 veya daha yüksek en yüksek yoğunluklarda yaklaşık % 97'si vahşi türü (rakam 8E) için yaklaşık % 20 ile karşılaştırıldığında VimRod varlığı içinde korunur. Bu kaybı temsil eder, ek mutantlar da ara etkilere sahip ile işlev noktası mutant okudu4yapılmış olması.

Doğrulamak ve VimRod ve E-PRD MST Analizi His6 VimRod floresan kırmızı-tris-NTA boya hedef olarak etiketlenmiş kullanarak bağlama quantitate için karışık 39.1 için 1.28 mm E-PRD ligand konsantrasyonları azaltılarak nM gerçekleştirilen. Üç bağlama titrations yapılmıştır ve sonuçları Ortalama ve Şekil 9' da gösterilen. Verileri bir site ligand bağlayıcı standart bir model ile uygun ve bir KD 25.7 ± 2.1 mikron verdi. VimRod ve E-PRD arasında bağ yüzey plasmon rezonans tarafından değerlendirilmesi 19,1 ± 1.3 mikron4benzer KD değeri verdi.

Figure 1
Şekil 1: ekran yakalama NMR deney kurulumunun. Pencerenin gösterildiği bir HSQC veri toplamak için standart bir deneme oluşturmak için kullanılır. Deney parametreleri içinde okumak deney bitişik. Gösterilen ZGPR deney ilk bir deney olarak bağımlı proton standart ve Çözücü parametreleri yüklemek için seçilir. Başlık pencere kayıt tutma amaçları için deneysel ayrıntıları girmek için kullanılır. HSQC spektrum toplamak için ZGPR deneme SFHMQC3GPPH ile değiştirilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2: NMR deneysel parametrelerini ayarlama. Gösterilen penceresi NMR titreşim sıra temel parametrelerini girmek için sinyal en iyi duruma getirmek için kullanılır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: NMR veri işleme. Her iki boyut NMR spektrumu sayısını işlemek için kullanılan parametreler, bu da tipik olarak ayarlanır gösteren oklarla gösterilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4: NMR en yüksek malzeme çekme parametrelerini. NMR doruklarına işlenmiş NMR spektrumu aldığın için kullanılan parametreler ile tipik değerler gösterilir. Ppm aralığı, yoğunluk ve spectra optimize etmek için zirveleri sayısını ayarlayın. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 5
Şekil 5: yoğunluklarda ile temsilcisi Peaklist. Bir numara ve onun 1H NMR spektrumu aldı her tepe verilir ve 15N kimyasal vardiya ve sinyal şiddeti görüntülenir. Bu peaklist daha sonra etkileşen bir ortak varlığı/olmaması durumunda elde edilen spectra karşılaştırmak için kullanılabilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 6
Şekil 6: His6 öğesini VimRod IMAC ve S. A. arıtma Kromatografik elüsyon IMAC sütun için bir büyük en yüksek VimRod gösterir. B. kromatografik elüsyon S sütun için bir büyük pik gösterir. C. SDS-sayfa kesirler arıtma boyunca toplanan: MW standartları MW ile havuza alınmış kDa soldaki jel (M), hücre lysate (1), IMAC akışı ile (2), yıkama (3), havuza alınan elüsyon (E1), S elüsyon (E2) gösterilir. Bantları daha yüksek moleküler ağırlık Lanes E1 ve E2 görünür Batı leke (veri gösterilmez) tarafından onaylanmış olarak saf VimRod reaksiyonlar vardır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 7
Şekil 7: E-PRD IMAC ve S. A. arıtma SDS-sayfa MW molekül ağırlığı standartlara gösterilen IMAC arınma ilk IMAC sütunundan (E1), TEV bölünme ürünleri (+ TEV), jel (M) ve eluate soluna kDa içinde belirtilen ve aracılığıyla akış ikinci IMAC sütundaki (FT). B. Kromatograf S sütundan bir büyük pik gösterir. C. SDS-sayfa molekül ağırlığı standartları (M) ve kesirler S tepe üzerinden. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 8
Şekil 8: HSQC Spectra vahşi-tipi ve R1914E Mutant, E-PRD varlığı ve yokluğu VimRod. HSQC spectra vahşi-türü E-PRD göster (100 µM) 20 mm Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1 mM DTT, Devamsızlık (A) veya 50 µM varlığı pH 7 VimRod (B). C ve D panelleridir R1914E mutant (100µM) HSQC spectra yokluğu veya 50 µM varlığı VimRod, anılan sıraya göre. Masası'nda E göreli 1H -15N en yüksek yoğunluklarda E PRD veya VimRod bağlama olmadan keyfi olarak atanan ve sıra konumuna göre değil en sayısı bir fonksiyonu olarak gösterilir. Bu değerler bir önemi kesim en yüksek yoğunluk azaltma üzerine bir ligand eklenmesi için tanımlamak için kullanılabilir. Atamaları yoksa, önemli değerleri kez harita için bir bağlayıcı alanı görülebilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 9
Şekil 9: E-PRD VimRod için bağlama. E-PRD seyreltilmiş 1.28 mm iki kat dilutions 39.1 için bir dizi nM ve MST çözümlemeyi gerçekleştirmeden önce etiketli VimRod ile inkübe. Veri üç bağımsız deneyleri kombine edilmiştir. Verileri bir KD 25.7 mikron ile ± 2.1 μm kalınlığında bir KD güven veren bir KD modeline uygun. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Reaktif Miktar
Sodyum fosfat, dibasic (susuz) 6.0 g
Potasyum fosfat, Yem mono (susuz) 3.0 g
Sodyum klorür 0,5 g
H2O 950 mL

Tablo 1. M9 medya izotopik etiketleme için.

Reaktif Miktar
15 NH4Cl 1.0 g
Glukoz (veya 13C-glikoz) 2.0 g
1 M MgSO4 2 mL
50 mM CaCl2 4 mL
20 mg/mL tiamin 1.0 mL
3 mM FeCl3 400 ΜL
Mix (Tablo 3) metal 500 ΜL
H2O 50 mL

Tablo 2. M9 takviyesi medya için besin karışımı.

Reaktif Miktar
4 mM ZnSO4 323 mg
1 mM MnSO4 75,5 mg
4.7 mM H3BO3 145 mg
0.7 mM CuSO4 55,9 mg
H2O İlâ 500 mL

Tablo 3. MT besin karışımı zenginleştirmek için metal karışımı ek.

Örnek 1 mM E-PRD tampon A1 (µL) 1mM VimRod tampon A (µL) Arabellek (µL) 200 µM DSS (µL) D2O Tampon B2 (µL) Toplam hacim (µL)
E-PRD yalnız 50 0 50 50 350 500
E-PRD + VimRod 50 50 0 50 350 500
1 Arabellek A: 20 mM Tris-HCl, 1 mM DTT, pH 7
2 Arabellek B: 23 mM Tris-HCl, 1.14 mM DTT, pH 7

Tablo 4. NMR numune hazırlama.

Discussion

2D 15N çözüldü NMR deney en çok kullanılan biridir yöntemleri nasıl iki molekül göstermek için etkileşim. Çözüm devlet titrasyon deneyde boyunca sürekli olarak izlenmesi için her iki ortaklarına sinyalleri sağlar en bilgi zengini yöntemidir. Genellikle nitel rağmen büyük kompleksler söz konusu olduğunda, yöntem da olumlu durumlarda bağlama benzeşim ölçmek için nerede NMR sinyalleri-ebilmek var olmak izci yüksek çözünürlüklü spectra kullanılabilir. Boyutu 20 kDa altında birçok protein durumunda bağlayıcı siteleri da eşlenebilir gibi nerede atamaları elverişli bir konuma sahip, yapılabilir. MST gibi tamamlayıcı deneyleri çözüm etkileşimleri hakkında kantitatif bilgi sağlar ve daha az protein etiketlenmemiş Birleşik Devletleri gerektirir. Mutant bağlama veri karşılaştırma genişletmektedir NMR satırı ile kanıtlanan etkileşimleri orijinal olduğundan emin olmak için denetim ve değil eserleri, örneğin, toplama veya viskozite değişiklikleri sağlamak için kullanışlıdır.

Protein ifade

İfade işleminin verimliğini emek yoğun protein üretim miktarını azaltır. Bu en iyi duruma getirme işlemi kimlik E. coli uygun bir baskı protein rekombinant ifade içerir. Strain tercih öğeleri vektör doğa kullanımda dahil bağlıdır ve daha ayrıntılı olarak, Rekombinant protein olmanın son istikrar7dile getirdi. Risk endojen E. coli tarafından Contegra protein bozulması proteaz proteaz kullanımıyla azaltılabilir eksik E. coli BL21 zorlanma gibi. Nadir kodon içeren genler için bir yük gibi BL21-CodonPlus (DE3) RIPL tercih edilebilir. Bu zorlanma proteaz eksik doğa BL21 baskı nadir kodon tRNA arginin, isoleucine, prolin ve lösin için ek endojen kopyaları ile birleştirir. Alternatif olarak, overexpression olumsuz etkileyebilir nadir kodon kodon optimize edilmiş bir yapı ticari bir kaynaktan gelen sipariş ederek kalmayabilir. Birçok E. coli suşları rekombinant gen ekspresyonu için kullanılabilir, her bir problem tuzağa sırasında ifade7için optimize edilmiş. Bu çalışmada söz konusu olduğunda, standart proteaz eksik soy BL21(DE3) çözünür protein sonraki ve analiz için yeterli miktarda üretilen.

Protein Saflaştırma

Belirli bir protein için arıtma Protokolü kez her protein istikrarlı ve çözünür sıcaklık, tuz konsantrasyonu veya pH gibi farklı koşullar altında kalır anlamda eşsizdir. Benzeşme kromatografi ile arınma genel etkinliği de konsantrasyon eluting imidazole çeşitli adımlar gibi arıtma işlemi sırasında duyarlıdır. Bu çalışmada, kritik arabellek koşullar IMAC için E-PRD için pH ve VimRod imidazole konsantrasyona vardı. 7,5 pH yağış IMAC sütundan ilk elüsyon takip E-PRD önlemek için gerekli oldu. VimRod IMAC arıtma için 50 mM için 30 imidazole konsantrasyon sütun yıkama adım sırasında artan önemli bir gelişme son elüsyon kesirler saflık için bulundu. Elüsyon adım için 350 mm 250 imidazole konsantrasyonu artan da son elüsyon verimini artırmak için bulundu. 250 mM imidazole kullanarak protein elute ilk girişimleri bir son 1 M imidazole şerit sütun (veri gösterilmez) tarafından ortaya VimRod eksik elüsyon için yol açtı. İmidazole konsantrasyon elüsyon için 350 mm artan tüm sütuna bağlı protein kurtarmak için yeterli idi. Aynı anda arabellek Satım gerçekleştirirken protein arıtma parlatma bir adım olarak görür çünkü S çift bir amaca hizmet edebilir. Beri protein His6 öğesini elute eskiden imidazole kaldırır arabellek Satım sonraki bağlama analiz için kritik bir adımdır. Ayrıca tuz konsantrasyonu veya belirli aşağı akım teknikleri veya deneyleri etkinliğini etkileyebilir pH gibi koşulları değiştirmek için bir fırsat olarak hizmet vermektedir. Protein termal kayması (puan) için kararlı protein arayanlar için özellikle aşağı akım deneyleri, en uygun arabelleklerini tanımlamak için kullanılan oda sıcaklığında8,9bir süre uzun.

Bağlama Analizi

Taze hazırlanmış protein doğru bağlama deneyleri için kritik olsa da sonuçları karşılaştırılır sürece donmuş protein de kullanılabilir. Vimentin multimerize tuz ve pH bağımlı bir şekilde, örneğin ipliksi protein ve dolayısıyla çözüm en iyi duruma getirilmiş gerek ve sn10,11, ışık saçılma dinamik gibi bir yöntem tarafından tahmini oligomeric durumu durumu 12 ya da analitik ultrasantrifüj13,14,15. NMR spektroskopisi ligand etkileşimleri atomik çözünürlükte küçük proteinlerin ölçmek için uygundur. Ancak, bir protein daha büyük molekül ile etkileşim, yavaş tumbling ensues ve bu sinyallerin ille öyle olmasına rağmen hangi bağlama doğrulayabilirim kaybolmasına neden eşleme de atama, en az gerektirecektir siteleri Binding izin omurga rezonanslar. Bu senaryoda, NMR deneyler etkileşim site tanımlaması izin vermez. Bu nedenle site mutagenesis bağlama için gerekli kritik artıkları tanımlamak için uygulanan yönetti. Bu tür mutantlar bu nedenle sinyal kaybı gösteren değil. Bu iletişim kuralı, bir ikame pozisyonda 1914 mutant bir formla en yüksek yoğunluklarda VimRod huzurunda korur ve bu nedenle E-PRD ve VimRod arasındaki etkileşimin bozulma onaylar. Özellikle ücretsiz E-PRD yapısını x-ışını kristalografisi4tarafından çözüldü gibi omurga ve sidechain rezonanslar tayini bu yaklaşım, değer ekleyebilirsiniz. NMR gelecekteki uygulamalar büyük moleküllerin arasındaki karmaşık etkileşimler karakterizasyonu içerir ve ultra yüksek alan mıknatıslar ve gözlemlenebilir diğer grup 13gibi kullanılması yararlanacaktır C harfiyle ve trifluoro metil grubu olarak gazetecilere.

MST bağlama etkileşimleri16eğitim için avantajları vardır. Bağlama ortağız çözümde serbest ve immobilize değil. Analiz örnekleri kalite kalite kontrol toplama raporlama, adsorpsiyon kılcal veya yetersiz floresan hedef molekülünün etiketleme yazılımıyla içine inşa edilmiştir. Hedef az miktarda genellikle kullanılan, etiketli hedef konsantrasyonu genellikle 10-20 μL birim/tepki olarak 20-50 nM arasında. Zayıf bağlama etkileşimleri karakterize edilebilir izin titrations elde edilebilir ligand konsantrasyonu en üst düzeye çıkarmak için çok küçük tepki birimleri (10 μL) bu protokolünü kullanır. Bu doğru pipetting ve hala iyice karıştırma sırasında kabarcıklar tanıtımı önlemek için alınan bakım gerektirir. Yeterli karıştırma seri dilutions kümesi boyunca doğru tutarlı floresans ölçümler için önemlidir. Ara-20 tutar MST deneylerde bir standart 0,05 0,015 kabarcıklar oluşturmak ve geliştirmek karıştırma eğilimi düşük % düşürüldü.

Kırmızı-Tris-NTA boya fluorescently bir His vardır herhangi bir protein etiketlemek için hızlı, kolay ve kullanışlı bir yol sağlar etiket. Etiketleme sadece 30 dakika içinde etkili bir şekilde tamamlandı ve hiçbir boya kaldırma yordamını gerekli olması çok sıkı. Hiçbir değişiklik ligand bağlayıcı özellikleri değiştirebilir protein amino asit kalıntılarında için yapılır. Bir ihtar etiketlenir sadece protein His6 etiketi olması gereken olmasıdır. Bu ligand protein, E-PRD ve etiket ve uncleaved E-PRD ile ikinci bir IMAC sütun adım etiketinden bölünme gerekli. Mümkünse, bir onun kullanımı olmadan ligand protein hazırlanmalıdır etiket. Alternatif olarak, proteinler kovalent lizin tortular veya sistein kalıntıları kaplin thiol için kaplin amin aracılığıyla bir fluorophore ile etiketlenmiş. Ne zaman bir fluorophore kovalent eki beri gibi sistemleri kullanarak lizin veya sistein kalıntıları üzerinde güvenerek elektrostatik veya polar bağlama etkileşimleri etkileyebilir ancak, özen göstermelidir. VimRod ve E-PRD MST tarafından arasındaki affinity bağlama miktar tuz konsantrasyonu çok hassastı. Bu sorunu başlangıçta hedef ve ligand tahlil arabellek aynı toplu işe dialyzing hafifletilmiş. Yine de, doygunluk MST bağlama eğrinin MST tahlil VimRod karmaşık davranış nedeniyle 150 mM NaCl varlığında işlemi sırasında elde edilebilir değil. NaCl konsantrasyonu 10 KDdoğru hesaplama sağlayan mM den indirdi bir kez güvenilir, tam veri elde edildi. Dolayısıyla, çözüm koşulları ve tamamlayıcı deneyleri ile karşılaştırma dikkatli optimizasyon sağlam sonuçlar elde etmek için önerilir. Ayrıca, MST verilen etkileşimi için tuz bağımlılığı ölçmek, enzim kinetiği17protein etkileşimleri, monitör protein katlanması ve sonda stokiometrik özelliklerini ölçmek için kullanılabilir.

Disclosures

Yazarlar hiçbir çıkar çatışmaları ifşa.

Acknowledgments

Bu proje NSERC RGPIN-2018-04994, kampüs Alberta yenilik programı (RCP-12-002 C) ve Alberta Prion Araştırma Enstitüsü tarafından desteklenen / Alberta yeniliklerin Bio çözümleri (201600018), layık M.O ve genom Kanada ve Kanada Vakfı Metabolomics yenilik Merkezi (TMIC) ve NANUC layık yenilik hibe.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Monolith NT.115, includes control and analysis software NanoTemper Technologies MO-G008 Instrument for microscal thermophoresis
His-Tag Labeling Kit RED-Tris-NTA NanoTemper Technologies MO-L008 RED-tris-NTA dye for MST
Standard capillaries NanoTemper Technologies MO-K022 capillaries for MST
HisTrap HP, 5 mL GE Healthcare 17524801 IMAC column
HisPur Ni-NTA resin, 100 mL Thermo Fisher Scientific 88222 IMAC resin
HiLoad 16/600 Superdex 75 pg GE Healthcare 28989333 SEC column
TEV protease Sigma Aldrich T4455 cleavage of his tag from E-PRD
BL21(DE3) Competent E. coli New England Biolabs C2527H cells for protein expression
cOmplete Protease Inhibitor Cocktail Tablets EDTA-Free Sigma Aldrich 11873580001 protease inhibitors for protein purification by IMAC
TCEP, Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride Sigma Aldrich C4706 reducing agent for protein purification
Reagents (HEPES, NaCl, etc) Sigma Aldrich various Preparation of media and buffers
Ammonium chloride (15N, 99%) Cambridge Isotope Laboratories NLM-467 isotope labelling for NMR
D2O, Deuterium Oxide (D, 99.8%) Cambridge Isotope Laboratories DLM-2259 NMR sample preparation
DSS, Sodium 2,2-dimethyl-2-silapentane-5-sulfonate-D6 (D,98%) Cambridge Isotope Laboratories DLM-8206 reference for NMR
Precision 5 mm NMR Tubes, 7” long SJM/Deuterotubes BOROECO-5-7 NMR tubes
NMR spectrometer (14.1 Tesla) Bruker acquisition of NMR data
TCI 5mm z-PFG cryogenic probe Bruker acquisition of NMR data
Name Company Catalog Number Comments
Software
Bruker TopSpin 4.0.1 Bruker processing of NMR data
MO.Control NanoTemper Technologies included with Monlith NT.115
MO.Affinity Analysis NanoTemper Technologies included with Monlith NT.115

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vinogradova, O., Qin, J. NMR as a unique tool in assessment and complex determination of weak protein-protein interactions. Topics in Current Chemistry. 326, 35-45 (2012).
  2. McKercher, M. A., Wuttke, D. S. NMR Chemical Shift Mapping of SH2 Peptide Interactions. Methods in Molecular Biology. 1555, Clifton, N.J. 269-290 (2017).
  3. Al-Jassar, C., Bikker, H., Overduin, M., Chidgey, M. Mechanistic Basis of Desmosome-Targeted Diseases. Journal of Molecular Biology. 425 (21), 4006-4022 (2013).
  4. Fogl, C., et al. Mechanism of intermediate filament recognition by plakin repeat domains revealed by envoplakin targeting of vimentin. Nature Communications. 7, (2016).
  5. The Protein Protocols Handbook. Walker, J. M. , 2nd ed, Humana Press. (2002).
  6. Wishart, D. S., et al. 1H, 13C and 15N chemical shift referencing in biomolecular NMR. J. Biomol. NMR. 6, 135-140 (1995).
  7. Casali, N. Escherichia coli Host Strains. E. coli Plasmid Vectors. , Humana Press. 27-48 (2003).
  8. Ericsson, U. B., Hallberg, B. M., DeTitta, G. T., Dekker, N., Nordlund, P. Thermofluor-based high-throughput stability optimization of proteins for structural studies. Analytical Biochemistry. 357 (2), 289-298 (2006).
  9. Kozak, S., et al. Optimization of protein samples for NMR using thermal shift assays. Journal of Biomolecular Nmr. 64, 281-289 (2016).
  10. Burgess, R. R. A brief practical review of size exclusion chromatography: Rules of thumb, limitations, and troubleshooting. Protein Expression and Purification. , In Press (2018).
  11. Kunji, E. R. S., Harding, M., Butler, P. J. G., Akamine, P. Determination of the molecular mass and dimensions of membrane proteins by size exclusion chromatography. Methods. 46 (2), 62-72 (2008).
  12. Stetefeld, J., McKenna, S. A., Patel, T. R. Dynamic light scattering: a practical guide and applications in biomedical sciences. Biophysical Reviews. 8 (4), 409-427 (2016).
  13. Patel, T. R., Winzor, D. J., Scott, D. J. Analytical ultracentrifugation: A versatile tool for the characterisation of macromolecular complexes in solution. Methods. 95, 55-61 (2016).
  14. Pearson, J. Z., et al. Chapter One - Next-Generation AUC Adds a Spectral Dimension: Development of Multiwavelength Detectors for the Analytical Ultracentrifuge. Methods in Enzymology. Cole, J. L. 562, Academic Press. 1-26 (2015).
  15. Gorbet, G. E., Pearson, J. Z., Demeler, A. K., Cölfen, H., Demeler, B. Chapter Two - Next-Generation AUC: Analysis of Multiwavelength Analytical Ultracentrifugation Data. Methods in Enzymology. Cole, J. L. 562, Academic Press. 27-47 (2015).
  16. Wienken, C. J., Baaske, P., Rothbauer, U., Braun, D., Duhr, S. Protein-binding assays in biological liquids using microscale thermophoresis. Nature Communications. 1, 100 (2010).
  17. Jerabek-Willemsen, M., et al. MicroScale Thermophoresis: Interaction analysis and beyond. Journal of Molecular Structure. 1077, 101-113 (2014).

Tags

Biyokimya sayı: 141 hücre adhesiondesmosome kardiomyopati ipliksi protein ara filaman microscale thermophoresis nükleer manyetik rezonans spektroskopisi protein etkileşim vimentin
Nükleer manyetik rezonans spektroskopisi (NMR) ve Microscale Thermophoresis (MST) tarafından küresel ve ipliksi protein etkileşimleri ölçme
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Winkelaar, G., Trieber, C., Kumar,… More

Winkelaar, G., Trieber, C., Kumar, J., Overduin, M. Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (NMR) and Microscale Thermophoresis (MST). J. Vis. Exp. (141), e58537, doi:10.3791/58537 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter