Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Meten van interacties van bolvormige en filamenteuze eiwitten door nucleaire magnetische resonantie spectroscopie (NMR) en Microscale Thermophoresis (MST)

Published: November 2, 2018 doi: 10.3791/58537
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Biochemistry, University of Alberta

Summary

Hier presenteren we een protocol voor de productie en zuivering van eiwitten die zijn gemarkeerd met stabiele isotopen, en verdere karakterisering van eiwit-eiwitinteractie met behulp nucleaire magnetische resonantie (NMR) spectroscopie en MicroScale Thermophoresis (MST) experimenten.

Abstract

Filamenteuze eiwitten zoals vimentin bieden organisatie binnen cellen door een structurele steiger voorzien van sites die eiwitten met plakin te binden wordt herhaald. Een protocol voor het opsporen en het meten van dergelijke interacties wordt hier beschreven met behulp van het bolvormige plakin herhalen domein van envoplakin en de spiraalvormige spoel van vimentin. Dit vormt de basis voor het bepalen of een proteïne bindt vimentin (of soortgelijke filamenteuze eiwitten) en voor meting van de affiniteit van de interactie. De bolvormige proteïne van belang is gelabeld met 15N en getitreerd met vimentin eiwit in oplossing. Een tweedimensionale NMR-spectrum is verkregen te detecteren interacties door het observeren van veranderingen in de vorm van de piek of chemische shifts, en te verhelderen effecten van oplossing voorwaarden met inbegrip van zout niveaus, die van invloed zijn vimentin quaternaire structuur. Als de proteïne van belang de draadvormige ligand bindt, wordt de bindende interactie gekwantificeerd door MST met behulp van de gezuiverde eiwitten. De benadering is een eenvoudige manier om te bepalen of een proteïne van belang een gloeidraad bindt, en voor de beoordeling van de invloed van wijzigingen, zoals mutaties of oplossing omstandigheden, op de interactie.

Introduction

Interacties tussen eiwitten toestaan de vorming van moleculaire machines die order binnen cellen maken. De afzonderlijke interacties zijn vaak zwak maar meestal bijdragen aan multivalent complexen die coöperatieve en dynamisch geregeld kunnen worden. Gevoelige testen waarmee atomaire resolutie en kwantitatieve informatie over dergelijke complexe interacties zijn nodig om afleiden van mechanismen en interventies zoals drugs-achtige moleculen ontwerpen. NMR-spectroscopie is een efficiënte methode voor het verkrijgen van dergelijke informatie over eiwitinteractie, en ook wordt gebruikt voor snelle screening voor liganden met inbegrip van degenen die zwak1binden. De NMR-methoden gebruikt kunnen worden onderverdeeld in die zijn eiwitten observeren of ligand observeren. Dit manuscript maakt gebruik van de voormalige aanpak waarin een spectrum van een testing-isotoop label eiwit dat is relatief klein (meestal onder 20 kDa) wordt verworven en de labelloze ligand wordt getitreerd. Hierdoor de gelabelde residuen betrokken bij de interactie worden toegewezen in gunstige gevallen. Eenmaal de complexe vormen, zijn er veranderingen in de chemische omgevingen van interagerende residuen die zich als veranderingen in de chemische verschuiving manifesteren en vorm van hun NMR-signalen. De omvang van dergelijke wijzigingen correleert met de mate van betrokkenheid van deze groepen in de interactie. Chemische verschuiving verstoringen (CSP's) kunnen worden gemeten door het vergelijken van een reeks van NMR spectra van het eiwit verzameld in de afwezigheid en aanwezigheid van wisselende hoeveelheden van het ligand. Voor grotere liganden of complexe interacties, kan de verandering in de vorm van de piek of intensiteit worden gemeten om afleiden van interacties.

De meest voorkomende 2D experiment gebruikte voor het opsporen van ligand interacties is de 15N-heteronucleaire één quantum correlatie (HSQC) experiment2. Dit vereist dat een eiwit gelijkmatig worden gelabeld met 15N, die meestal wordt bereikt door het uiten van hen als affiniteit-tagged versies in E. coli bacteriele gegroeid in 15N verrijkte media. Bindende is duidelijk wanneer de spectra van de HSQC tijdens de titratie verzameld, zijn erover, piek wijzigingen voor een subset van residuen die betrokken zijn bij de complexvorming onthullen. De interactie kan optreden in het regime van de snelle uitwisseling waar de signalen van de vrije en ligand-verzadigd staat in een bevolking die gemiddeld piek samenvouwen. U kunt ook in het geval van langzame uitwisseling tussen de Staten, worden beide signalen waargenomen met integralen die hun relatieve bedragen vertegenwoordigen. Terwijl NMR lineshape analyse kan worden gebruikt om te schatten de bindende affiniteiten in sommige gevallen, zoals MST gebleken ook handige methodenen Kruis-validatie van echte interactie bieden.

Het voorbeeld is van twee eiwitten binnen desmosomes gevonden. Zij bemiddelen kruispunten tussen cel oppervlakken en het cytoskelet en bemiddelen multivalent interacties tussen cel adhesie machines en intermediaire filamenten te handhaven van de integriteit van de huid en hart weefsels en het weerstaan van schuintrekken krachten. Ziekten kunnen leiden tot wanneer desmosomal eiwitten zoals desmoplakin of vimentin zijn aangetast door mutaties of autoantilichamen, wat leidt tot destabilization van cel-cel kruispunten, en vandaar hun interacties van cruciaal belang3 zijn. De structurele basis van ligand binding door desmosomal eiwitten kan worden gekarakteriseerd door NMR spectroscopie, terwijl de interacties kunnen worden gekwantificeerd door MST. Hierin methoden werden gebruikt om het karakteriseren van de interacties tussen de plakin herhalen domeinen (PRDs), die vaak aanwezig als tandem verzamelingen die het aanbieden van fundamentele groeven en vimentin, een tussenliggende gloeidraad die via een zure oppervlak aangeboden door de spiraalvormige communiceert bundel4. Deze complexen worden gevormd op het celmembraan waar ze anker voor intermediaire filamenten van het cytoskelet van de cel te desmosomes die verbinding met de aangrenzende cellen maken, en vormt aldus een netwerk van zelfklevende obligaties die in een weefsel uitstraalt.

Protocol

1. recombinant eiwit expressie

  1. Uitdrukking van Envoplakin PRD (E-PRD) en Vimentin 99-249 (VimRod)
    1. Tover E. coli BL21(DE3) cellen met de plasmide met het gewenste gen. Verspreid de cellen op agar platen met 100 µg/mL ampicilline. Incubeer de platen bij 37 ° C's nachts.
    2. Kies een één kolonie en geweldig Bouillon (TB) 20 mL met 100 µg/mL ampicilline te selecteren voor het plasmide beënten. Het groeien van de cultuur bij 37 ° C met schudden (180 rpm) 's nachts.
    3. De hele 20 mL cultuur overbrengen in 1 L van TB met 50 µg Mo/mL ampicilline. Incubeer de cultuur bij 37 ° C met schudden bij 180 t/min tot de OD600 = 0,6-0,8.
    4. Verlaag de temperatuur tot 18 ° C en eiwit expressie veroorzaken door isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) toe te voegen aan een eindconcentratie van 1 mM. Incubatie op 18 ° C met schudden bij 160 rpm's nachts eiwit expressie mogelijk te blijven.
    5. Oogst van de cellen door centrifugeren van de cultuur bij 8.000 x g gedurende 15 min. Decant en verwijder het supernatant.
    6. Wassen de geoogste cellen door het resuspending van de cel pellet in ongeveer 40 mL fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS: 20 mM fosfaatbuffer, pH 7.4, 120 mM NaCl). De resuspensie overbrengen in een tube van 50 mL. Centrifuge weer bij 8.000 x g gedurende 15 minuten.
    7. Decanteren en verwijder het supernatant. Onmiddellijk beginnen met het protocol van de zuivering of de cel pellets bij-20 ° C voor toekomstig gebruik te bevriezen.
  2. Expressie ionenpaar gelabelde eiwit
    1. Transformeren van E. coli BL21(DE3) cellen en bereiden een 20 mL starter cultuur zoals in 1.1.1-1.1.2.
    2. De hele 20 mL cultuur overbrengen in 1 L van verrijkte TB met een extra 4.0 g trypton, 5,0 g NaCl en 100 µg/mL ampicilline. Incubeer de cultuur bij 37 ° C met schudden bij 160 rpm tot de OD600 = 1.6-1.9.
    3. Oogst de 1 L cultuur door middel van centrifugeren bij 8000 x g gedurende 15 min. Decant en verwijder het supernatant.
    4. Wassen van de cel pellet door zachtjes resuspending in ongeveer 40 mL PBS en de resuspensie overbrengen in een tube van 50 mL.
    5. Centrifugeer nogmaals bij 8.000 x g gedurende 15 min. Decant en verwijder het supernatant.
    6. Resuspendeer de pellet cel in 20 mL van de M9 minimale media (tabel 1) en transfer naar de rest van de 950 mL van minimale media M9 met 100 µg/mL ampicilline.
    7. Voeg 50 mL van de nutriënten mix filter gesteriliseerde (tabellen 2 en 3).
    8. De cultuur tot 18 ° C gedurende 30 minuten acclimatiseren voordat u IPTG toevoegt aan een eindconcentratie van 1 mM.
    9. Na een nacht bebroeden bij 18 ° C met schudden bij 160 t/min.
    10. Het oogsten van de cellen in de sectie 1.1.4-1.1.6.

2. geïmmobiliseerd Metal Affinity chromatografie (IMAC) zuivering van VimRod en E-PRD

  1. Zuivering van His6-gelabeld VimRod
    1. Resuspendeer de pellet cel in 5 mL/g van PBS met een protease inhibitor cocktail ontbreekt EDTA. Meng met 12 lijnen in een Dounce weefsel homogenizer ter verbetering van de lysis van de cel in de volgende stap.
    2. Op het ijs, bewerk ultrasone trillingen ten de celsuspensie op een puls van 1 s op/1 s uit, 80% amplitude voor een totaal van 1,5 min. herhaalt het ultrasoonapparaat twee meer tijden, wervelende zachtjes op ijs tussen runs om oververhitting te voorkomen.
    3. Centrifugeer het monster bij 75.000 x g gedurende 45 min. Decant en filteren van het supernatans dat met behulp van een injectiespuit filter (0,45 µm).
    4. Equilibreer een 5 mL IMAC-kolom met 5 kolom volumes (CV) van bindende buffer (20 mM HEPES, pH 7.5, 500 mM NaCl, 10 mM imidazol) op een debiet van 1 mL/min met behulp van een systeem van snelle proteïne vloeistofchromatografie (FPLC).
    5. Het laden van het gefilterde supernatant op de kolom op een debiet van 0,5 mL/min.
    6. Was de kolom met 5 CV van wassen buffer (20 mM HEPES, pH 7.5, 500 mM NaCl, 50 mM imidazol) met een debiet van 1 mL/min.
    7. Elueer de proteïne met 3 CV van elutie buffer (20 mM HEPES, pH 7.5, 500 mM NaCl, 350 mM imidazol) op een debiet van 0,5 mL/min. verzamelen 1,5 mL breuken. Indien beschikbaar, selecteer de up-flow elutie-modus te verhogen de concentratie eiwit geëlueerd.
    8. Het identificeren van de breuken van het chromatogram FPLC die bevatten de proteïne van belang door SDS-PAGE en standaardmethoden voor het meten van de concentratie eiwit5gebruiken.
    9. Bundelen en het concentreren van de elutie breuken met de hoogste hoeveelheid eiwit een centrifugaal ultrafiltratie-apparaat (MWCO 3 kDa, 5 mL) tot 2 mL gebruikt. Centrifugeer bij 21.000 x g te verwijderen van een eventueel neerslag en passeren een 0,22 μm-filter.
    10. Equilibreer een uitsluiting voor 120 mL grootte met de kolom-chromatografie (S) met 2 CV van S buffer (20 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7.5, 0.5 mM TCEP) op een debiet van 1 mL/min met behulp van een FPLC.
    11. Injecteer de geconcentreerde eiwit uit 2.1.9 op de kolom en elueer met 1 CV van S buffer op een debiet van 0,5 mL/min, verzamelen van 1 mL breuken.
    12. Het identificeren van de breuken met de proteïne van belang als vóór.
    13. Het zwembad van de fracties die de hoogste hoeveelheden eiwitten bevatten.
    14. Bewaren bij 4 ° C voor korte termijn gebruik of glycerol toevoegen aan 20% en winkel bij-80 ° C in kleine porties.
  2. Zuivering van E-PRD eiwit met de His6 Tag verwijderd
    1. Volg de stappen in de 2.1.1-2.1.8 voor het zuiveren van His6-gelabeld E-PRD eiwit. Bundelen van de piek fracties en bepalen de eiwitconcentratie.
    2. Toevoegen van tabak etch virus (TEV) protease (1 mg/mL) 2 µL/mg van gebundelde eiwit. Overbrengen van dialyse buizen (6 kDa) en dialyze in S buffer's nachts bij 4 ° C. Deze stap kunt splitsing van de His6-tag en verwijdering van de imidazool die met de binding aan de Ni-NTA hars in de volgende stap interfereren zal.
    3. Equilibreer 5 mL Ni-NTA hars in een gravity kolom met 3 CV van S buffer. Afvoer overtollige buffer van de hars.
    4. Giet het gekloofd E-PRD-eiwit op de hars en incubeer gedurende 1 uur op een rockende platform de uncleaved His6-gelabeld E-PRD en de gekloofd His6 tag te binden. De TEV protease is ook His6-gelabeld en zal binden de hars. Verzamel de stroom door, waarin de tag-vrije E-PRD. Wassen van de hars met 2 CV van S buffer om ervoor te zorgen dat alle van de E-PRD wordt teruggewonnen.
    5. E-PRD concentreren in de stroom door tot 2 mL met behulp van een apparaat van de centrifugaal ultrafiltratie (MWCO 3 kDa, 5 mL). Centrifugeer bij 21 000 x g te verwijderen van een eventueel neerslag en passeren een 0,22 μm-filter.
    6. Equilibreer een 120 mL S-kolom met 2 CV van S buffer (20 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7.5, 0.5 mM TCEP voor MST of 20 mM Tris-HCl, 1 mM DTT, pH 7 voor NMR) op een debiet van 1 mL/min met behulp van een FPLC.
    7. Injecteer de geconcentreerde E-PRD-eiwit uit 2.2.5 op de kolom en elueer met 1 CV van S buffer op een debiet van 0,5 mL/min, verzamelen van 1 mL breuken.
    8. Het identificeren van de breuken met de proteïne van belang als vóór.
    9. Het zwembad van de fracties die de hoogste hoeveelheden eiwitten bevatten.
    10. Bewaren bij 4 ° C voor korte termijn gebruik of glycerol toevoegen aan 20% en winkel bij-80 ° C in kleine porties.

3. NMR methoden

  1. NMR monstervoorbereiding
    1. Zuiveren van 15N-geëtiketteerden wild-type of R1914E E-PRD eiwitten zoals eerder is beschreven met behulp van 20 mM Tris-HCl, 1 mM DTT, pH 7 als de S-buffer voor stap 2.2.6. Eiwit stamoplossingen variëren meestal van 0,3 tot 1 mM met volumes van ongeveer 1 mL.
      Opmerking: Eiwit kan worden geconcentreerd > 100 µM met behulp van een MWCO 3 kDa, 5 mL centrifugaal ultrafiltratie apparaat om de concentratie in een geschikt bereik voor de bereiding van de monsters.
    2. Zuiveren van een steekproef van labelloze VimRod eiwit met 20 mM Tris-HCl, 1 mM DTT, pH 7 als de S-buffer voor stap 2.1.10.
    3. In een eindvolume van 500 µL, wild-type of mutant E-PRD eiwit toevoegen om een eindconcentratie van 100µM, deuteriumoxide (D2van O) om een eindconcentratie van 10% (v/v) en DSS (4,4-dimethyl-4-silapentane-1-sulfonic zuur) tot een uiteindelijke concentratie van 20 µM. Bring Het monstervolume tot 500 µL met behulp van 20 mM Tris-HCl, 1 mM DTT, pH 7. De voorbereiding van een representatieve steekproef wordt beschreven in tabel 4.
      Opmerking: De 0 ppm resonantie van DSS wordt gebruikt voor het kalibreren van de chemische shifts van 1H, alsmede voor indirecte référencement van de 15N chemische verschuivingen van de eiwit-6. D2O wordt gebruikt voor het deuterium lock signaal om te houden van de spectrometer die op een constante netto magnetisch veld.
    4. Make-up een tweede monster van E-PRD, D2O en DSS zoals in de vorige stap en voeg VimRod aan een eindconcentratie van 50 µM alvorens het volume tot 500 µL.
    5. De 500 µL monsters overbrengen in een 5 mm breed-NMR buizen voor het experiment.
  2. NMR experimentele opstelling
    1. Inschakelen van de luchtstroom met de eject opdracht "ej"; Dit zal het monster van de magneet. Nu, leg het monster binnen een spinner op de top van de magneet door de opening en invoegen met de opdracht "ij". Wacht totdat het monster afwikkelt binnen de magneet voordat u verdergaat.
    2. Maak een nieuwe dataset met behulp van de opdracht "edc" en laden norm 1H NMR parameters door het selecteren van experiment "ZGPR" (Figuur 1). De naam, de EXPNO (experiment nummer) en de PROCNO (verwerkte gegevens mapnummer) velden invullen. Selecteer het oplosmiddel in het veld "Set oplosmiddel" en klik op "Uitvoeren 'getprosol'" om te lezen van de standaard probehead en oplosmiddelen afhankelijke (prosol) parameters.
    3. Het monster, tot de Halfzwaar solvabel is, dat wil zeggen, D2O vergrendelen, opdracht "vergrendelen" en wacht totdat het is voltooid vegen en behaalt vergrendelen.
    4. De resonantiefrequentie van de magneet corrigeren door het monster met behulp van de automatische tuning opdracht "atma" tuning. Volgen de wobble curve totdat de automatische afstemming voltooid is.
    5. Shim het magnetisch veld met behulp van TOPSHIM (opdracht "topshim"). Shimming is een proces van aanpassingen van magnetisch veld om uniformiteit rond het monster. Het is raadzaam de shim-waarden met de opdracht "wsh" opslaan en lezen van hen gebruikend "rsh" voor topshim, als het dezelfde of soortgelijke monsters.
    6. Pas de receiver gain met "rga" commando om het maximale signaal / ruisverhouding.
    7. Plaats het midden van het spectrum op de verschuiving van de resonantie water (o1) en stel de 90 graden proton pols (p1) op hoog vermogen met behulp van de "calibo1p1".
    8. Verzamel de proton-spectrum met behulp van de nul gaan "zg" commando en proces met "efp" inclusief exponentiële vermenigvuldiging ("em"), het gratis inductie verval (FID) houdende uitbreiding van de lijn "ft" fourier transformatie van de FID en "pk" toe te passen fase correctie.
    9. De automatische fase correctie "apk" en de correctie van de basislijn van automatische "absn" met behulp van de polynoom zonder integratie optie toepassen.
    10. Maak een nieuwe dataset (zoals in 3.2.2) voor het SOFAST HMBC experiment door het selecteren van "SFHMQC3GPPH" in de experiment.
    11. Kopie geoptimaliseerd P1 en O1 van proton spectrum en vullen van P1 afhankelijke pulsen met behulp van de opdracht "getprosol 1H p1 plw1", waar p1 is de geoptimaliseerde waarde P1 en plw1 is het energieniveau voor P1.
    12. Optimaliseren van de constante CNST54 als u wilt instellen van de verschuiving voor amide chemische verschuiving en CNST55 om te bepalen de bandbreedte omvatten de spectrale regio's van belang waardoor de winst van de ontvanger te worden geoptimaliseerd (Figuur 2). Schakel deze parameters, de eerste FID (free induction decay) uittreksel uit het twee-dimensionale spectrum en zoekt het waargenomen signaal ze kunnen worden gedefinieerd. Bovendien variëren de ontspanning vertraging (D1), aantal scans (NS), en dummy scans (DS) te verkrijgen van acceptabel signaal gevoeligheid met opdracht "gs", die kunnen gaan en scannen om te controleren de kwaliteit van de gegevens in real-time.
    13. Het opnemen van de spectra met nul Go "zg".
  3. Verwerking van de gegevens van de NMR
    1. De verwerkingsparameters instelt op het formaat van de directe F2 (1H) en indirecte F1 (15N) afmetingen van het gebruik van het spectrum "SI F2 = 2048, F1 = 512" met optionele lineaire voorspelling in indirecte dimensie (Figuur 3).
    2. Selecteer "QSINE" als de functie van het venster en voer een sinus bell verschuiving (SSB) van 2 voor het verwerken van de tweedimensionale spectrum.
    3. Voer de opdracht "xfb" om de gegevens in beide richtingen met venster functie en de fourier transformatie te verwerken.
    4. Gebruik de opdracht "apk2d" voor het uitvoeren van de automatisch fasecorrectie in beide richtingen. Als het automatische proces niet een bevredigend niveau van fasecorrectie tot, FID's uitpakken met het commando "rser" fase waarden van 1D verwerking berekenen en toepassen op de 2D gegevens.
    5. Corrigeer de basislijn met de automatische basislijn-correctiefunctie "abs2" voor 2D gegevens. Dit geldt een polynomiale functie tussen de ppm waarden omschreven in de verwerkingsparameters en zal produceren een 2D spectrum voor verdere analyse.
    6. Als het plan voor het uitvoeren van seriële verwerking voor vergelijking van gegevens van de interactie met een ander molecuul, slaan de verwerkingsparameters met de opdracht "wpar" en herinneren ze met "rpar". Op deze manier die alle de datasets worden verwerkt met dezelfde parameters en variaties zullen niet worden ingevoerd als gevolg van verwerking van verschillen.
  4. NMR Data-analyse
    1. Voer de opdracht "pp" om te beginnen met het proces van het plukken van de piek.
    2. Definieer de ppm bereik en minimum intensiteit/maximaal aantal pieken gebaseerd op verwachte pieken (Figuur 4). Klik op OK en bevestig de resultaten door visuele inspectie. Indien nodig, opnieuw uitvoeren het proces totdat de resultaten bevredigend zijn gebaseerd op spectra-kwaliteit.
    3. Het genereren van een peaklist met het commando "pp".
      Opmerking: Deze peaklist bevat gegevens hoogte/piek intensiteit informatie standaard en kan worden geëxporteerd naar latere Spectra en kan worden gelezen door andere programma's.
    4. Houd rekening met wijzigingen in de piek intensiteit of beweging in chemische shifts in het eiwit HSQC spectra die interactie met een ander molecuul aangeven. Als de interactie molecule groot is, verwachten reducties in piek intensiteit samen met de verdwijning van sommige toppen.
    5. De piek-lijst naar de volgende gegevensset importeren door te klikken op het tabblad "pieken" en "importeren" met een klik met de rechtermuisknop in het venster van de pieken.
    6. Visualiseren van de pieken in het spectrum en indien nodig ze te verschuiven naar een nieuwe positie. Klik op "reset intensiteiten" voor "complete table" voor het genereren van een peaklist voor het spectrum met intensiteiten (Figuur 5). Deze piek-lijst zal over de positiegegevens van opgeslagen piek lijst dragen.
    7. De piek-lijsten uit verschillende datasets exporteren naar een werkblad of een ander wiskundig programma voor analyse door de "Export"-functie te selecteren.
    8. Bereken de verandering in de piek intensiteit met de functie "piek intensiteit in complexe spectrum/piek intensiteit in eiwit spectrum" voor elke piek. Waarden kunnen worden geconverteerd naar procentuele verandering door vermenigvuldiging van 100. Merk op dat piekvolumes ook nuttig, zijn hoewel de piek intensiteit zijn gemakkelijker te meten voor bergtoppen die dicht bij elkaar liggen, zoals meestal het geval voor eiwitten met een hoge varkensdichtheid relatief brede pieken.

4. MicroScale Thermophoresis (MST)

  1. Voorbereiding van de Ligand eiwit E-PRD
    1. Wisselen de ligand in een MST compatibel buffer door dialyzing tot 800 μL van eiwit in een 3,5 kDa mini dialyse eenheid geschorst in 1 L van 20 mM HEPES, pH 7.5, 10 mM NaCl, roeren langzaam bij 4 ° C's nachts.
    2. Concentreren de ligand met behulp van een centrifugaal ultrafiltratie eenheid (3 kDa MWCO) door centrifugatie bij 14 000 x g gedurende 10 min. overdracht de geconcentreerde eiwit tot een schone koker.
    3. Centrifugeer het ligand bij 21.000 x g gedurende 10 minuten en het supernatant zorgvuldig overbrengen in een nieuwe buis te verwijderen elke neergeslagen eiwitten. Bepaal de concentratie van het ligand met behulp van de extinctie op 280 nm en de ligand uitsterven coëfficiënt. Voeg 10% Tween-20 te geven een eindconcentratie van 0,015%. Tween-20 is toegevoegd aan de buffer assay ter voorkoming van adsorptie aan de haarvaten. De definitieve test buffer die wordt gebruikt voor de MST experimenten is 20 mM HEPES, pH 7.5, 10 mM NaCl, 0,015% Tween-20.
  2. Bereiding van de kleurstof-geëtiketteerden Target eiwit VimRod
    1. Het reconstrueren van de rood-tris-NTA kleurstof door toevoeging van 50 μl van 1 x PBS-T is voorzien van de rood-tris-NTA tot een concentratie van 5 μM. 2 μL aliquots afzien in 200 μl buizen en opgeslagen bij-20 ° C.
    2. Verdun de eiwitten van de doelgroep naar 0,34 μM met assay buffer. 58 μL van doel toevoegen aan een hoeveelheid van 2 μL van RED-tris-NTA kleurstof en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. De uiteindelijke concentratie van kleurstof-geëtiketteerden doel is 0,33 μM. Centrifugeer de gelabelde doelgroep op 21.000 x g gedurende 10 minuten en het supernatant zorgvuldig overbrengen in een nieuwe buis te verwijderen van een eventueel neerslag. De RED-tris-NTA kleurstof bindt aan eiwitten door middel van het His6-label en heeft een bindende dissociatieconstante (KD) in het bereik van de sub-nanomolar. Het is in feite 100% gebonden aan het doel-eiwit dus geen verdere zuivering vereist is.
    3. Zet het MST-instrument en de controle-Software niet openen. Selecteer de rode instelling voor de rood-tris-NTA kleurstof. Zet de thermostaat op 25 ° C.
    4. Selecteer het dit om te valideren dat de etikettering van het doel en controleer voor aggregatie of adsorptie aan de cuvettes. Een evaluatie van deze parameters wordt automatisch verstrekt.
    5. Mix-17 μL van assay buffer en 3 μL van doel eiwit en meng door pipetteren. Vul twee standaard haarvaten door dompelen hen in het verdunde doel en het opstellen van vloeistof in het midden van het capillair. Plaats de haarvaten in de lade en de instrumenten. Start de meting.
    6. Bekijk de resultaten op zoek naar een voldoende niveau van fluorescentie en geen tekenen van adsorptie (vervorming in de shape capillaire lijn) of aggregatie (verstoringen in de MST trace), die zal worden gemarkeerd in de analyse van de software. Indien resultaten positief zijn op de ligand stappen, zo niet een andere buffer moet worden geprobeerd of het bedrag van de Tween-20 kan worden verhoogd tot 0.05% of hoger.
  3. Voorbereiding van de E-PRD Ligand tweevoudige verdunningsreeks
    1. Bereiden van een verdunningsreeks door labeling 16, 200 μl buizen van 1-16.
    2. 17 μL van de ligand op 1.17 x sterkere concentratie dan de concentratie van de maximale ligand Tube1 wilde toevoegen. Dit volume is tweemaal het bedrag dat nodig is (8,5 μl) een aliquoot gedeelte wordt vervolgens overgebracht naar de volgende buis in serie. Het uiteindelijke volume van de bepaling is 10 μL dus 8,5 μl van 1,17 x concentratie van ligand zullen worden verdund tot 1 x door toevoeging van 1,5 μL van de doel-eiwit, VimRod. Deze maximale concentratie gekozen moet minstens 20 maal de geraamde KD waarde.
    3. De 8,5 μl van assay buffer aan Tubes2-16 met behulp van een nieuwe Pipet tip voor elk aliquot toevoegen. Hergebruik van Pipetteer tips kan invloed hebben op de nauwkeurigheid (voor advies over nauwkeurige pipetting zie aanwijzingen van de fabrikant). Breng 8,5 μl van ligand van Tube1 naar Tube2 langzaam het vrijgeven van de oplossing in de buffer assay zonder bubbels. Meng de ligand en de buffer door pipetteren omhoog en omlaag minstens 6 maal, weer zonder bubbels. De E-PRD in de meest geconcentreerde buis was 1,5 mM en de gelabelde VimRod was aanwezig bij een eindconcentratie van 50 nM.
    4. 8,5 μl van ligand overzetten van Tube2 naar Tube3 en meng met de assay-buffer. Herhaal de seriële verdunning totdat alle buizen ligand toegevoegd hebben. Gooi 8,5 μl van Tube16 zodat alle buizen 8,5 μl van ligand in een reeks tweevoudige verdunningen bevatten.
  4. Voorbereiding van het experiment bindend reactie en MST
    1. 1.5 μL van de gelabelde doel eiwit toevoegen aan elk van de buizen en meng zachtjes door pipetteren op en neer voorzichtig om te voorkomen dat de bubbels. Incubeer gedurende 15 minuten.
    2. Selecteer de Expert modus voor de bindende assay en voer in de parameters voor een seriële verdunningsreeks. Zorg ervoor dat de temperatuurregeling wordt ingesteld tot 25 ° C, de excitatie-kracht op 40%, en de MST-bevoegdheid op gemiddeld is ingesteld. Deze parameters moeten worden geoptimaliseerd voor andere partners van de bindende bestudeerd.
    3. Vul de haarvaten met de bindende reacties en plaats in de capillaire lade. De lade te laden in het instrument, wachten op de temperatuur om te herwinnen van 25 ° C en start de meting.
  5. Data-analyse
    1. Open het bindende assay-bestand in de software van de analyse van de affiniteit. Bekijk de capillaire scans; Fluorescentie niveaus niet meer dan 10% van het gemiddelde afwijken, geen samenvoeging of adsorptie moet worden gedetecteerd als beschreven in punt 3.6.
    2. Selecteer de MST analysis op het juiste paneel en sleep de assay-gegevens naar het analyse-apparaat. Als er meerdere punten van de dezelfde doel-ligand bindende bepaling onder identieke omstandigheden kunnen ze worden samengevoegd door slepen en neerzetten in dezelfde set. U kunt ook kan elke run wegvallen in analyse onafhankelijk.
    3. Verplaatsen naar het tabblad dosis reactie passen naar de grafiek van de gegevens. Kies het model KD als een enkele bindende site wordt verwacht. Het Hill model is ook een optie voor meerdere bandplaatsen met coöperatief gedrag. Uitschieter punten die niet is geslaagd voor kwaliteitscontrole kunnen worden verwijderd uit de pasvorm in dit stadium. Samenvoegen sets met meerdere tests zal worden gemiddeld en fouten berekend als de standaardafwijking.
    4. Open de laatste tabblad en vergelijken van resultaten tussen alle percelen op een enkele grafiek. Montage resultaten voor elke kromme opgehaald uit de tabel die wordt gegenereerd. De gegevens of exporteren ingerichte bochten naar andere presentatie of analyse software indien gewenst.

Representative Results

Het domein van de E-PRD (residuen 1822-2014 gekloond in pProEX-HTC) van het gen van menselijke envoplakin en het VimRod domein (residuen 99-249 gekloond in pET21a) van menselijke vimentin4 werden uitgedrukt met His6 tags en gezuiverd. Figuur 6 en Figuur 7 laten zien dat de niveaus van de zuiverheid van VimRod (18.8 kDa) en de E-PRD (21.8 kDa) deze methode van eiwitreiniging verkregen. De verwijdering van de markering van het E-PRD-construct essentieel voor de MST experimenten is zoals het eiwit VimRod is gemarkeerd met behulp van een His6 tag bindende kleurstof en eventuele E-PRD behoud van haar His6 tag voor de binding van de kleurstof concurreren kan His6. De tweede kolom van de IMAC na de splitsing van de tag met TEV protease verwijdert de TEV protease, de gekloofd tag en eventuele uncleaved His6-E-PRD die bleef. De laatste polijsten stap van de zuivering is grootte uitsluiting chromatografie. Ondanks het beide eiwitten zijn van een vergelijkbare grootte, GC de VimRod uit de kolom bij een 51 mL terwijl de E-PRD elutie piek is gecentreerd op 72 mL waar een eiwit monomeer van deze omvang zou worden verwacht. Deze toename in grootte van VimRod is waarschijnlijk vanwege het haar kenmerken als een banale lange staaf vormige eiwit als analytisch ultracentrifuge experimenten aangetoond dat VimRod monomeer4 was. Lagere rendementen van eiwitten worden verkregen van de culturen geteeld in de M9 dan die van rijke Bouillon als gevolg van een lager bedrag van cellen wordt geproduceerd in de minimale media. De initiële groei van grotere starterculturen M9 preparaten TB kunt verbetering van cel rendementen met behoud van de omvang van 15N etikettering nodig voor de NMR experimenten.

De 15N -1H HSQCs werden verworven voor het wild type en R1914E mutant van E-PRD in aanwezigheid of afwezigheid van VimRod (figuur 8A-8 D). Het spectrum van E-PRD in figuur 8A toont het verwachte aantal goed opgelost pieken, indicatief voor een goed gevouwen proteïne. In aanwezigheid van VimRod (Figuur 8) toont het spectrum uitgebreide lijn verbreding en piek verdwijning, overeenkomt met de binding tussen de E-PRD en VimRod. Deze binding is verloren door mutatie van R1914E zoals blijkt door vergelijking van figuur 8C en 8 D. Weinig verandering wordt geconstateerd in het spectrum van toevoeging van VimRod aan de R1914E mutant met vermelding van een gebrek aan binding tussen deze mutant E-PRD en VimRod. De E-PRD piek intensiteit in de aanwezigheid/afwezigheid van VimRod werden vergeleken en uitgezet als de relatieve piek intensiteit in figuur 8E, waarin het bereik van de verbreding van de piek in de E-PRD-complex. De mutant R1914E van E-PRD (niet afgebeeld) behouden ongeveer 97% van pieken bij 20% of hogere intensiteiten van de piek in aanwezigheid van VimRod in vergelijking met ongeveer 20% voor het wild-type (figuur 8E). Dit vertegenwoordigt een verlies van functie punt mutant, met extra mutanten met tussenliggende effecten ook heb bestudeerde4.

Om te valideren en kwantificeren van de binding van VimRod en E-PRD MST analyse met behulp van His6-VimRod aangeduid met fluorescente kleurstof van RED-tris-NTA als doel gemengd met de ligand E-PRD van 1,28 mM naar 39,1 PM10 nM werden uitgevoerd. Drie bindende titraties werden uitgevoerd en de resultaten zijn gemiddeld en aangegeven in Figuur 9. De gegevens werden passen bij een standaardmodel voor een-site ligand bindende en gaf een KD van 25.7 ± 2.1 μM. Evaluatie van de binding tussen VimRod en E-PRD door oppervlakte plasmon resonantie gaf een gelijksoortige KD waarde van 19,1 ± 1,3 μM4.

Figure 1
Figuur 1: Screen Capture van de Setup van de NMR Experiment. Het getoonde venster wordt gebruikt voor het instellen van een standaard experiment om te verzamelen van een HSQC dataset. Experiment parameters worden gelezen grenzend aan Experiment. Het experiment van de ZGPR komt te staan is gekozen als een eerste experiment te laden van de standaard en oplosmiddel afhankelijke proton-parameters. Het venster titel wordt gebruikt voor het invoeren van experimentele gegevens voor het bijhouden van een register doeleinden. Voor het verzamelen van het spectrum van de HSQC wordt de ZGPR-experiment vervangen door SFHMQC3GPPH. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2: aanpassing van NMR experimentele Parameters. Het getoonde venster wordt gebruikt voor het invoeren van de fundamentele parameters voor de NMR pulse-reeks voor het optimaliseren van het signaal. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3: de verwerking van de gegevens van de NMR. Parameters die worden gebruikt voor het verwerken van elk van de twee dimensies van de NMR-spectrum worden weergegeven, met pijlen waarin wordt aangegeven welke die gewoonlijk worden aangepast. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4: Parameters voor NMR piek picken. De parameters die worden gebruikt voor het plukken van NMR pieken in het verwerkte NMR spectrum worden weergegeven met typische waarden. Pas de ppm bereik, intensiteit en aantal pieken te optimaliseren de spectra. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 5
Figuur 5: vertegenwoordiger Peaklist met intensiteiten. Elke piek die is geplukt in het spectrum van de NMR is gezien een aantal, en haar 1H en 15N chemische verschuivingen en signaalsterkte worden weergegeven. Deze peaklist kan vervolgens worden gebruikt om te vergelijken spectra verkregen in de aanwezigheid/afwezigheid van een interactie partner. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 6
Figuur 6: zuivering van VimRod His6-gelabeld door IMAC en S. A. Het chromatogram voor de elutie van de IMAC kolom toont een grote piek van VimRod. B. het chromatogram voor de elutie van de S-kolom toont een grote piek. C. SDS-PAGE van breuken verzameld in de loop van zuivering: MW normen met de MW aangegeven in kDa aan de linkerkant van de gel (M), cel lysate (1), IMAC doorstroming (2), wassen (3), gebundelde elutie (E1), gebundeld S elutie (E2). Bands zichtbaar op hogere molecuulgewichten in rijstroken E1 en E2 zijn oligomeren van zuivere VimRod zoals bevestigd door westelijke vlek (gegevens niet worden weergegeven). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 7
Figuur 7: zuivering van E-PRD door IMAC en S. A. SDS-pagina van de zuivering van de IMAC met de normen van het molecuulgewicht met de MW aangegeven in kDa aan de linkerkant van de gel (M) en het eluaat uit de eerste IMAC kolom (E1), de TEV decollete producten (+ TEV), en de stroom door uit de tweede kolom van de IMAC (FT). B. de chromatograaf uit de S-kolom toont een grote piek. C. SDS-PAGE van het molecuulgewicht normen (M) en de breuken van S piek. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 8
Figuur 8: HSQC Spectra van Wild-type en R1914E Mutant van E-PRD in de aanwezigheid en de afwezigheid van VimRod. De spectra HSQC Toon wild-type E-PRD (100 µM) in 20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1 mM DTT, pH 7 bij afwezigheid (A) of aanwezigheid van 50 µM VimRod (B). Panelen C en D zijn de spectra van de HSQC van de mutant R1914E (100µM) in de afwezigheid of de aanwezigheid van 50 µM VimRod, respectievelijk. In paneel E de relatieve 1H -15N piek worden intensiteiten van de E-PRD met of zonder VimRod bindend weergegeven als een functie van het piek-nummer, dat is willekeurig toegewezen en niet op basis van volgorde positie. Deze waarden kunnen worden gebruikt om te definiëren een betekenis cutoff voor vermindering van de intensiteit van de piek bij toevoeging van een ligand. Als toewijzingen beschikbaar zijn, kunnen het significante waarden vaak toewijzen aan een bindende-gebied worden gezien. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 9
Figuur 9: binden van E-PRD naar VimRod. E-PRD werd verdund in een reeks tweevoudige verdunningen van 1,28 mM naar 39,1 nM en geïncubeerd met gelabelde VimRod alvorens MST analyse uit te voeren. Gegevens uit drie onafhankelijke tests werden samengevoegd. De gegevens werden passen aan een KD model geven een KD van 25.7 μM met een KD vertrouwen van ± 2.1 μM. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Reagens Hoeveelheid
Natriumfosfaat, dibasische (watervrij) 6.0 g
Kalium fosfaat, monobasisch (watervrij) 3,0 g
Natriumchloride 0.5 g
H2O Tot 950 mL

Tabel 1. M9 media voor het labelen van isotopische.

Reagens Hoeveelheid
15 NH4Cl 1,0 g
Glucose (of 13C-glucose) 2.0 g
1 M MgSO4 2 mL
50 mM CaCl2 4 mL
20 mg/mL Thiamine 1,0 mL
3 mM FeCl3 400 ΜL
Metalen Mix (tabel 3) 500 ΜL
H2O Tot 50 mL

Tabel 2. Nutriënten Mix voor suppletie van M9 media.

Reagens Hoeveelheid
4 mM ZnSO4 323 mg
1 mM MnSO4 75,5 mg
4,7 mM H3BO3 145 mg
0,7 mM CuSO4 55,9 mg
H2O Tot 500 mL

Tabel 3. Metalen Mix Supplement voor het verrijken van de MT nutriënten Mix.

Monster 1 mM E-PRD in buffer A1 (µL) 1mM VimRod in buffer A (µL) Buffer een (µL) 200 µM DSS in D2O (µL) Buffer B2 (µL) Totaalvolume (µL)
E-PRD alleen 50 0 50 50 350 500
E-PRD + VimRod 50 50 0 50 350 500
1 Buffer A: 20 mM Tris-HCl, 1 mM DTT, pH 7
2 Buffer B: 23 mM Tris-HCl, 1.14 mM DTT, pH 7

Tabel 4. Bereiding van de monsters van de NMR.

Discussion

De 2D 15N-resolved NMR experiment is een van de meest gebruikte methoden om te laten zien hoe twee moleculen samenwerken. Het is de meest informatie-rijke methode waarmee signalen uit beide partners naar permanent te worden bewaakt door een titratie experiment in oplossing staat. Hoewel meestal kwalitatieve in het geval van grote complexen, de methode kan ook worden gebruikt in gunstige gevallen voor het meten van bindende affiniteiten waar NMR signalen kunnen worden getraceerd in hoge resolutie spectra. Indien toewijzingen kunnen gemakkelijk worden gedaan, kunnen zoals in het geval van veel eiwitten onder 20 kDa in grootte, de bandplaatsen ook worden toegewezen. Aanvullende tests zoals MST kwantitatieve informatie verschaffen over interacties in oplossing, en vereist minder eiwit in labelloze Staten. Vergelijking van mutant bindende gegevens is nuttig voor het verstrekken van de controles om ervoor te zorgen dat interacties blijkt door NMR lijn verbreding echte en niet artefacten van, bijvoorbeeld, aggregatie of viscositeit veranderingen.

Eiwit expressie

Stroomlijning van het proces van expressie, vermindert de hoeveelheid arbeid intensieve eiwitproductie. Onderdeel van deze optimalisatieproces omvat identificatie van een passende stam van E. coli om recombinant eiwit. Stam voorkeur hangt af van elementen met inbegrip van de aard van de vector in gebruik en, meer in het bijzonder, de ultieme stabiliteit van de recombinant eiwit wordt uitgedrukt7. Het risico van aantasting van het heterologe eiwit door endogene E. coli proteasen kunnen worden verminderd door gebruik van protease gebrekkig E. coli zoals de BL21-stam. Voor genen met zeldzame codonen, kan een stam zoals BL21-CodonPlus (DE3) RIPL zijn voorkeur. Deze spanning combineert de protease gebrekkige aard van de BL21-stam met extra endogene kopieën van zeldzame codon tRNAs voor arginine, isoleucine, leucine en proline. Anderzijds kunnen zeldzame codonen die overexpressie in gevaar kunnen brengen worden vermeden door het bestellen van een codon-geoptimaliseerde constructie van een commerciële bron. Veel stammen van E. coli zijn beschikbaar voor recombinante genexpressie, elk geoptimaliseerd voor omzeiling van een bepaald probleem tijdens expressie7. In het geval van deze studie, de standaard protease gebrekkig stam BL21(DE3) geproduceerd voldoende hoeveelheden van oplosbare eiwitten voor verdere zuivering en analyse.

Eiwitreiniging

Het protocol van de reiniging voor een bepaald eiwit is vaak uniek in die zin dat elke proteïne stabiel en oplosbare onder verschillende omstandigheden zoals zoute concentratie, temperatuur en pH blijft. De algehele effectiviteit van de zuivering door affiniteitchromatografie is ook gevoelig voor de concentratie van eluerende soorten zoals imidazool op verschillende stappen tijdens het zuiveringsproces. In dit werk waren kritisch buffer voorwaarden voor IMAC pH voor de E-PRD en imidazol concentratie voor de VimRod. Een pH van 7.5 was nodig om te voorkomen dat neerslag van de E-PRD na eerste elutie van de IMAC-kolom. Voor de IMAC zuivering van VimRod, verhoging van de concentratie van imidazool van 30 tot 50 mM tijdens de kolom wassen stap bleek te hebben een substantiële verbetering in de zuiverheid van de definitieve elutie breuken. Voor de elutie stap, verhoging van de concentratie van imidazool van 250 tot 350 mM ook bleek te verbeteren van het rendement van de uiteindelijke elutie. Eerste pogingen om het eiwit met behulp van 250 mM imidazool Elueer geleid tot onvolledige elutie van VimRod zoals onthuld door een definitieve 1 M imidazool strook van de kolom (gegevens niet worden weergegeven). Verhoging van de concentratie van de imidazool tot 350 mM voor de elutie was voldoende om te herstellen van alle van het eiwit gebonden aan de kolom. S kan dienen een tweeledig doel omdat het fungeert als een polijst stap voor eiwitreiniging tijdens het gelijktijdig uitvoeren van buffer uitwisseling. Buffer uitwisseling is een cruciale stap voor latere bindende analyse, aangezien het verwijdert de imidazool gewend Elueer His6-gelabeld eiwit. Het dient ook als een kans om te veranderen van aandoeningen zoals zoutconcentratie of pH, die mogelijk van invloed op de werkzaamheid van bepaalde downstream technieken of testen. Eiwit thermische shift (PTS) kan worden gebruikt voor het identificeren van de optimale buffers voor downstream testen, vooral voor diegenen die van stabiele eiwitten voor langdurige perioden bij kamertemperatuur8,9.

Bindende analyse

Eiwit dat is vers bereid is essentieel voor nauwkeurige bindende analyses, hoewel bevroren eiwit kan ook worden gebruikt, zolang de resultaten worden vergeleken. Filamenteuze eiwitten zoals vimentin multimerize in een zout en pH afhankelijke mode, en dus de oplossing moet worden geoptimaliseerd en de oligomere staat geschat door een methode zoals SEC10,11, dynamisch licht verstrooiing conditie 12 of analytische ultracentrifugatie13,14,15. NMR-spectroscopie is geschikt voor het meten van de ligand interacties van kleine eiwitten met atomaire resolutie. Echter, wanneer een eiwit met grotere molecuul interageert, langzamer tumbling ontstaat en dit in verlies van signalen, die bindende bevestigen resulteert, kan hoewel het niet noodzakelijkerwijs toestaan toewijzing van bindende sites, waarbij ook toewijzing van ten minste ruggengraat resonanties. In dit scenario staan NMR experimenten geen identificatie van de interactie-site. Dus geleide plaats mutagenese wordt toegepast ter identificatie van de kritische residuen die nodig zijn voor de binding. Dergelijke mutanten daarom vertonen geen signaalverlies. In dit protocol, een gemuteerde vorm met een substitutie op positie 1914 behoudt de piek-intensiteiten in aanwezigheid van VimRod en bevestigt derhalve verstoring van de interactie van E-PRD en VimRod. Toewijzing van de ruggengraat en sidechain resonanties zou een toegevoegde waarde aan deze aanpak, vooral omdat de structuur voor de gratis E-PRD is opgelost door middel van röntgendiffractie4. Toekomstige toepassingen van de NMR omvatten karakterisatie van complexe interacties tussen grotere moleculen en zullen profiteren van ultra hoge veld magneten en het gebruik van andere waarneembare groepen zoals 13C-gelabeld en trifluor methylgroepen als verslaggevers.

MST heeft een aantal voordelen voor de studie van bindende interacties16. De bindende-partners zijn vrij in de oplossing en niet geïmmobiliseerdet. Analyse van de kwaliteit van de monsters is ingebouwd in de software met kwaliteitscontrole rapportage van aggregatie, adsorptie aan de haarvaten of onvoldoende fluorescerende labeling van de doelmolecule. Kleine hoeveelheden van het doel worden doorgaans gebruikt, de concentratie van de gelabelde doel is meestal tussen 20-50 nM in een 10-20 μL volume/reactie. Dit protocol maakt gebruik van zeer kleine reactie volumes (10 μL) te maximaliseren van de concentratie van ligand die kan worden bereikt in de titraties waardoor zwak bindend interacties te worden gekarakteriseerd. Dit vereist nauwkeurige pipetteren en zorg worden genomen om te voorkomen dat de invoering van bellen terwijl nog grondig mengen. Voldoende mengen is essentieel voor accurate, consistente fluorescentie metingen langs de seriële verdunningen. De hoeveelheid van de Tween-20 in de MST experimenten werd teruggebracht van een standaard 0,05 tot 0,015% te verlagen van de neiging om te maken bellen en verbeteren mengen.

De RED-Tris-NTA kleurstof biedt een snelle, gemakkelijke en handige manier om fluorescently label een eiwit dat een heeft label. De etikettering is effectief voltooid in slechts 30 minuten en is zeer strak, zodat de procedure voor het verwijderen van geen kleurstof nodig is. Geen wijzigingen zijn aangebracht in aminozuurresidu's in het eiwit dat de ligand bindende eigenschappen kunnen wijzigen. Een valkuil is dat alleen het eiwit worden gelabeld een tag His6 moet hebben. Dit vereist het splijten van de tag van het ligand-eiwit, E-PRD en de verwijdering van de tag en de uncleaved E-PRD met een tweede stap van de kolom in de IMAC. Indien mogelijk, moet de ligand-eiwit bereid zijn zonder het gebruik van een zijn label. U kunt ook kunnen eiwitten covalent worden aangeduid met een fluorophore door middel van amine koppelen aan lysine residuen of thiol koppelen aan cysteïne residuen. Echter wees voorzichtig bij het gebruik van dergelijke systemen sinds de covalente bevestiging van een fluorophore invloed kan zijn op elektrostatische of polar bindende interacties afhankelijk van lysine of cysteïne residuen. De kwantificering van bindende affiniteit tussen de VimRod en de E-PRD door MST was ongewoon gevoelig voor de concentratie zout. Dit probleem werd verzacht door in eerste instantie zowel de doelgroep als ligand in dezelfde batch van assay buffer dialyzing. Niettemin, verzadiging van de MST bindende curve niet kon worden bereikt bij het uitvoeren van de bepaling van de MST in aanwezigheid van 150 mM NaCl als gevolg van de complexe gedrag van VimRod. Betrouwbare, volledige gegevens is verworven zodra de concentratie van NaCl werd verlaagd tot 10 mM, waardoor nauwkeurige berekening van de K-D. Vandaar, zorgvuldige optimalisatie van oplossing voorwaarden en vergelijking met aanvullende tests worden aanbevolen om robuuste resultaten te bereiken. MST kan bovendien worden gebruikt om kwantificeren van de zout afhankelijkheid voor een gegeven interactie, kwantificeren stoichiometrische eigenschappen van eiwit interacties, vouwing van de eiwitten van de monitor en sonde in enzyme kinetics17.

Disclosures

De auteurs vermelden geen belangenconflicten.

Acknowledgments

Dit project werd ondersteund door NSERC RGPIN-2018-04994, Campus Alberta innovatie programma (RCP-12-002 C) en Alberta Prion Research Institute / Alberta innoveert Bio oplossingen (201600018), toegekend aan M.O en genoom Canada en Canada Stichting voor Innovatie subsidies toegekend aan The metabolomica innovatie centrum (TMIC) en NANUC.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Monolith NT.115, includes control and analysis software NanoTemper Technologies MO-G008 Instrument for microscal thermophoresis
His-Tag Labeling Kit RED-Tris-NTA NanoTemper Technologies MO-L008 RED-tris-NTA dye for MST
Standard capillaries NanoTemper Technologies MO-K022 capillaries for MST
HisTrap HP, 5 mL GE Healthcare 17524801 IMAC column
HisPur Ni-NTA resin, 100 mL Thermo Fisher Scientific 88222 IMAC resin
HiLoad 16/600 Superdex 75 pg GE Healthcare 28989333 SEC column
TEV protease Sigma Aldrich T4455 cleavage of his tag from E-PRD
BL21(DE3) Competent E. coli New England Biolabs C2527H cells for protein expression
cOmplete Protease Inhibitor Cocktail Tablets EDTA-Free Sigma Aldrich 11873580001 protease inhibitors for protein purification by IMAC
TCEP, Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride Sigma Aldrich C4706 reducing agent for protein purification
Reagents (HEPES, NaCl, etc) Sigma Aldrich various Preparation of media and buffers
Ammonium chloride (15N, 99%) Cambridge Isotope Laboratories NLM-467 isotope labelling for NMR
D2O, Deuterium Oxide (D, 99.8%) Cambridge Isotope Laboratories DLM-2259 NMR sample preparation
DSS, Sodium 2,2-dimethyl-2-silapentane-5-sulfonate-D6 (D,98%) Cambridge Isotope Laboratories DLM-8206 reference for NMR
Precision 5 mm NMR Tubes, 7” long SJM/Deuterotubes BOROECO-5-7 NMR tubes
NMR spectrometer (14.1 Tesla) Bruker acquisition of NMR data
TCI 5mm z-PFG cryogenic probe Bruker acquisition of NMR data
Name Company Catalog Number Comments
Software
Bruker TopSpin 4.0.1 Bruker processing of NMR data
MO.Control NanoTemper Technologies included with Monlith NT.115
MO.Affinity Analysis NanoTemper Technologies included with Monlith NT.115

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vinogradova, O., Qin, J. NMR as a unique tool in assessment and complex determination of weak protein-protein interactions. Topics in Current Chemistry. 326, 35-45 (2012).
  2. McKercher, M. A., Wuttke, D. S. NMR Chemical Shift Mapping of SH2 Peptide Interactions. Methods in Molecular Biology. 1555, Clifton, N.J. 269-290 (2017).
  3. Al-Jassar, C., Bikker, H., Overduin, M., Chidgey, M. Mechanistic Basis of Desmosome-Targeted Diseases. Journal of Molecular Biology. 425 (21), 4006-4022 (2013).
  4. Fogl, C., et al. Mechanism of intermediate filament recognition by plakin repeat domains revealed by envoplakin targeting of vimentin. Nature Communications. 7, (2016).
  5. The Protein Protocols Handbook. Walker, J. M. , 2nd ed, Humana Press. (2002).
  6. Wishart, D. S., et al. 1H, 13C and 15N chemical shift referencing in biomolecular NMR. J. Biomol. NMR. 6, 135-140 (1995).
  7. Casali, N. Escherichia coli Host Strains. E. coli Plasmid Vectors. , Humana Press. 27-48 (2003).
  8. Ericsson, U. B., Hallberg, B. M., DeTitta, G. T., Dekker, N., Nordlund, P. Thermofluor-based high-throughput stability optimization of proteins for structural studies. Analytical Biochemistry. 357 (2), 289-298 (2006).
  9. Kozak, S., et al. Optimization of protein samples for NMR using thermal shift assays. Journal of Biomolecular Nmr. 64, 281-289 (2016).
  10. Burgess, R. R. A brief practical review of size exclusion chromatography: Rules of thumb, limitations, and troubleshooting. Protein Expression and Purification. , In Press (2018).
  11. Kunji, E. R. S., Harding, M., Butler, P. J. G., Akamine, P. Determination of the molecular mass and dimensions of membrane proteins by size exclusion chromatography. Methods. 46 (2), 62-72 (2008).
  12. Stetefeld, J., McKenna, S. A., Patel, T. R. Dynamic light scattering: a practical guide and applications in biomedical sciences. Biophysical Reviews. 8 (4), 409-427 (2016).
  13. Patel, T. R., Winzor, D. J., Scott, D. J. Analytical ultracentrifugation: A versatile tool for the characterisation of macromolecular complexes in solution. Methods. 95, 55-61 (2016).
  14. Pearson, J. Z., et al. Chapter One - Next-Generation AUC Adds a Spectral Dimension: Development of Multiwavelength Detectors for the Analytical Ultracentrifuge. Methods in Enzymology. Cole, J. L. 562, Academic Press. 1-26 (2015).
  15. Gorbet, G. E., Pearson, J. Z., Demeler, A. K., Cölfen, H., Demeler, B. Chapter Two - Next-Generation AUC: Analysis of Multiwavelength Analytical Ultracentrifugation Data. Methods in Enzymology. Cole, J. L. 562, Academic Press. 27-47 (2015).
  16. Wienken, C. J., Baaske, P., Rothbauer, U., Braun, D., Duhr, S. Protein-binding assays in biological liquids using microscale thermophoresis. Nature Communications. 1, 100 (2010).
  17. Jerabek-Willemsen, M., et al. MicroScale Thermophoresis: Interaction analysis and beyond. Journal of Molecular Structure. 1077, 101-113 (2014).

Tags

Biochemie kwestie 141 cel adhesiondesmosome desmoplakin draadvormige proteïne intermediaire filamenten microscale thermophoresis nucleaire magnetische resonantie spectroscopie eiwit interactie vimentin
Meten van interacties van bolvormige en filamenteuze eiwitten door nucleaire magnetische resonantie spectroscopie (NMR) en Microscale Thermophoresis (MST)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Winkelaar, G., Trieber, C., Kumar,… More

Winkelaar, G., Trieber, C., Kumar, J., Overduin, M. Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (NMR) and Microscale Thermophoresis (MST). J. Vis. Exp. (141), e58537, doi:10.3791/58537 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter