Summary
यहाँ, हम एक gelled तहखाने मैट्रिक्स पर एक ट्यूब गठन परख का उपयोग करके पोत नेटवर्क गठन पर Ruta graveolens के पानी निकालने के प्रभाव का मूल्यांकन.
Abstract
एंजियोजेनेसिस एक घटना है जिसमें विभिन्न प्रक्रियाएं शामिल हैं, जैसे एंडोथेलियल सेल प्रसार, भेदभाव, और प्रवास, जो नए रक्त वाहिकाओं के गठन का कारण बनते हैं और कई संकेत ट्रांसक्शन रास्ते शामिल करते हैं। यहाँ हम बताते हैं कि ट्यूब गठन परख एंजियोजेनेसिस पर प्राकृतिक उत्पादों के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए और शामिल आणविक तंत्र की जांच करने के लिए इन विट्रो विधि में एक सरल है। विशेष रूप से, Ruta graveolens (RGWE) के पानी निकालने की उपस्थिति में, endothelial कोशिकाओं अब एक सेल सेल नेटवर्क बनाने में सक्षम हैं और यह कि मानव नाभि नस endothelial सेल पर RGWE प्रभाव (HUVEC) ट्यूब गठन द्वारा समाप्त कर दिया है MEK के संरचक सक्रियण.
Introduction
एंजियोजेनेसिस एक शारीरिक प्रक्रिया है जो पहले से मौजूद लोगों से नए रक्त वाहिकाओं के गठन की ओर जाता है और भ्रूणजनन और अंग विकास के दौरान होता है। वयस्कता में, एंजियोजेनेसिस केवल साइकिल िंग अंडाशय में, गर्भावस्था के दौरान प्लेसेंटा में, और घाव भरने और मरम्मत के दौरान सक्रिय होता है। एंजियोजेनेसिस एंडोथेलियल कोशिकाओं की क्षमता पर निर्भर करता है ताकि एक बरकरार संवहनी नेटवर्क1का निर्माण किया जा सके, अंतर किया जा सके और माइग्रेट किया जा सके। हालांकि, कई विकारों में, जैसे सूजन, चयापचय, और आमवाती रोग, एंजियोजेनिक प्रक्रियाओं को बदल दिया जाता है और एंजियोजेनेसिस अत्यधिक हो जाता है। इसके अलावा, अनियंत्रित एंजियोजेनिक प्रक्रियाएं ट्यूमर प्रगति और मेटास्टेसिस1को भी प्रोत्साहित करती हैं। इन कारणों से, पिछले दशक में, अनुसंधान अध्ययन कैंसर, नेत्र, संयुक्त, या त्वचा विकारों2,3में अत्यधिक एंजियोजेनेसिस के निषेध के उद्देश्य से नई चिकित्सीय रणनीतियों के विकास पर ध्यान केंद्रित कर रहे हैं।
संवहनी endothelial विकास कारक (VEGF) वर्तमान antiangiogenic उपचार के मुख्य लक्ष्य का प्रतिनिधित्व करता है4, और कई विरोधी VEGF monoclonal एंटीबॉडी विकसित किया गया है और अत्यधिक एंजियोजेनेसिस को रोकने के लिए संश्लेषित. तथापि, ये सिंथेटिक दवाएं गंभीर दुष्प्रभाव दर्शाती हैं और इसका प्रतिकूल लागत-से-लाभ अनुपात5,6होता है। इसलिए, यह पूरक और वर्तमान में इस्तेमाल किया दवाओं के साथ गठबंधन करने के लिए कम से कम साइड इफेक्ट के साथ अत्यधिक एंजियोजेनेसिस को सीमित करने के लिए नई चिकित्सीय रणनीतियों को खोजने के लिए आवश्यक है। इन नई दवाओं प्राकृतिक उत्पादों है कि एक उच्च रासायनिक विविधता और जैव रासायनिक विशिष्टता की विशेषता है के बीच पाया जा सकता है.
इस अनुच्छेद में, हम एक सरल विधि का प्रस्ताव करने के लिए HUVECs की क्षमता पर RGWE के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए एक gelled तहखाने मैट्रिक्स पर इन विट्रो5में tubules फार्म . वास्तव में, RGWE माध्यमिक चयापचयों का एक मिश्रण है जैसे flavonoids और polyphenols जिनमें से रूटिन प्रमुख घटकहै 5. उनमें से कई पहले से ही विरोधी भड़काऊ और vasoprotective एजेंट7,8,9,10,11के रूप में परीक्षण किया गया है . इसके अलावा, हम हाल ही में दिखा दिया है कि RGWE, लेकिन नहीं rutin, एक gelled तहखाने मैट्रिक्स पर tubules फार्म करने के लिए HUVEC क्षमता को बाधित करने में सक्षम है और यह कि इस घटना MEK-ERK मार्ग द्वारा मध्यस्थता है, एक संभावित चिकित्सीय उपकरण के रूप में RGWE का संकेत करने में सक्षम अत्यधिक नए रक्त वाहिका गठन को रोकने5|
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Protocol
1. आरजीडब्ल्यूई तैयारी
- वनस्पतिशास्त्री की देखरेख में वसंत/ग्रीष्म महीनों के दौरान पौधों से आर ग्रेवलियोलेन्स के पत्तों को एकत्र कीजिए।
नोट: इस मामले में, पत्तियों नेपल्स, इटली5के बॉटनिकल गार्डन में औषधीय पौधों के प्रायोगिक अनुभाग में एकत्र किए गए थे। यह पौधा सहज, बारहमासी होता है और यह भूमध्य क्षेत्रों में मौजूद होताहै(चित्र 1)। - 250 ग्राम पत्तियों को तौलकर उन्हें कैंची से बारीक काट लें।
- पत्तियों को शंकु फ्लास्क में रखें और 250 ग्राम कटी हुई पत्तियों में 1 L मिलाएं और इसे 60 मिनट के लिए 110 डिग्री सेल्सियस पर उबालें। अत्यधिक वाष्पीकरण से बचने के लिए फ्लास्क को एल्यूमीनियम पन्नी के साथ ढक दें।
- पानी निकालने का प्रतिनिधित्व करता है कि तरल चरण से उबला हुआ पत्तियों को अलग करने के लिए 3 मिमी-फ़नल फिल्टर पेपर का उपयोग करें।
- एक 0.22 डिग्री मीटर फिल्टर के माध्यम से तरल चरण फ़िल्टर, यह एक बीकर में इकट्ठा. बीकर को पैराफिल्म के साथ कवर करें और निकालने को रात भर -80 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज करें।
- पैराफिल्म में सुई के साथ 10 - 15 छेद करें और एक लाइफिलाइज़र में निकालने को लाइफिलाइज़ करें। ध्यान दें कि पाउडर प्राप्त करने में कुछ दिन लग सकते हैं।
- प्राप्त पाउडर का वजन करें, इसे एलिकोट्स में विभाजित करें, और आवश्यक होने तक इसे 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। यह एक वर्ष के लिए इसे स्टोर करने के लिए संभव है.
- प्रयोगों के लिए आवश्यक होने पर, एक स्टॉक समाधान तैयार करें, आसुत जल के साथ पाउडर को 50 मिलीग्राम/एमएल की मानक सांद्रता में कम करें। इसे छोटे-खंडों (उदा., 1 एमएल) में अलग करें। इस तैयारी को -20 डिग्री सेल्सियस पर तब तक संग्रहित किया जा सकता है जब तक कि इसका उपयोग नहीं किया जाता लेकिन अणुओं के ऑक्सीकरण के कारण कुछ दिनों से अधिक समय तक 4 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित नहीं किया जा सकता। फ्रीज और thaw से बचें.
2. सेल संस्कृति
- अंत:चिकित्सा कोशिका वृद्धि माध्यम में एचयूवीसी की खेती करें: एंडोथेलियल बेसल मीडियम 1 ग्राम/एमएल हाइड्रोकॉर्टिसोन और 1 एनजी/एमएल एपिडर्मल वृद्धि कारक, 10% एफबीएस, और पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन के वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस के वातावरण में 5% सीओ2के वातावरण में पूरक।
- जब 80% confluent, 1:3 हर मार्ग के अनुपात में कोशिकाओं को विभाजित. दो से पांच मार्ग से कोशिकाओं का उपयोग करें, कि विकास कारकों के जवाब में स्पष्ट मतभेद नहीं दिखा. छठे मार्ग के बाद, कोशिकाओं जीर्ण हो जाते हैं और gelled तहखाने मैट्रिक्स पर ट्यूब फार्म नहीं है.
3. ट्रांसफेक्शन
- जब HUVECs 70% confluent हैं, उन्हें वांछित जीन के साथ transfect.
- 100 मिमी प्लेट के लिए, नियंत्रण के रूप में खाली pCDNA3 वेक्टर के 1 $g और pCDNA3 वेक्टर के 1 $g का उपयोग करें जिसमें ब्याज के जीन होते हैं (इस स्थिति में विशेष रूप से सक्रिय MEK [CAMEK])।
- होंठ के 3 डिग्री एल के साथ डीएनए का 1 डिग्री ग्राम, कम सीरम माध्यम के साथ पतला (सामग्री की तालिकादेखें) 200 डिग्री सेल्सियस के अंतिम मात्रा में। कोशिकाओं से माध्यम निकालें और इसे ताजा पूर्ण माध्यम के 1 एमएल के साथ बदलें; उसके बाद, कोशिकाओं के लिए transfecting समाधान जोड़ें. इनक्यूबेटर में कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें, जिसमें 5% सीओ2है। यह भी अन्य transfection एजेंटों lipofectamine से अलग का उपयोग करने के लिए संभव है 2,000, निर्माता के निर्देशों का पालन.
- ट्रांसफेक्शन के बाद पूर्ण ताजा मध्यम 3 एच के 7 एमएल जोड़ें और फिर, अगले परख के साथ आगे बढ़ने से पहले 24 - 48 एच के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को और अधिक इनक्यूबेट करें। transfection के बाद दिन, ताजा पूरा माध्यम के साथ माध्यम की जगह.
4. ट्यूब गठन परख
- जेल्ड बेसमेंट तैयार करने से पहले 1 एच के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 96-वेल प्लेट और पिपेट टिप्स को कूल करें।
- तहखाने की तैयारी के क्षण में, बर्फ पर प्लेट डाल (0 डिग्री सेल्सियस) और प्रत्येक अच्छी तरह से ठंड मैट्रिक्स के 50 डिग्री सेल्सियस जोड़ने के लिए, जबकि बुलबुले के गठन से परहेज. ध्यान दें कि मैट्रिक्स युक्त शीशी प्रक्रिया के दौरान बर्फ पर रखा जाना चाहिए के बाद से मैट्रिक्स कमरे के तापमान पर ठोस हो जाता है.
- तहखाने बहुलक की अनुमति देने के लिए कम से कम 30 मिनट के लिए 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटर में प्लेट रखो।
- इस बीच, कोशिकाओं फसल. एक 0.25% trypsin/0.53 m EDTA समाधान के 1 एमएल के साथ HUVECs धो लें; फिर, ट्रिप्सिन-EDTA समाधान का 2 एमएल जोड़ें और 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। यह सत्यापित करने के लिए कि कोशिका परत पूरी तरह से छितरी हुई है, एक उल्टे माइक्रोस्कोप के नीचे कोशिकाओं का निरीक्षण करें। फिर, उस माध्यम को एकत्रित करें जिसमें कोशिकाओं को निलंबित कर दिया जाता है और अलग-अलग कोशिकाओं को 3 मिनट के लिए 264 x ग्राम पर अपकेंद्रण द्वारा फसलित करें। उन्हें 1 एमएल फॉस्फेट-बफर नमकीन (पीबीएस) में पुन: निलंबित करें।
- कोशिकाओं की गणना करने के लिए, 0.2 एमएल कक्ष निलंबन को पीबीएस के 0.5 एमएल और 0.4% ट्रिपैन नीले समाधान के 0.3 एमएल में जोड़ें। कमरे के तापमान पर 5 मिनट के बाद, एक B$rker कक्ष में कोशिकाओं की गिनती.
- 2 x 104 कोशिकाओं/50 डिग्री सेल्सियस की सांद्रता में पूर्ण माध्यम में कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें, उन्हें प्रति अच्छी तरह से 2 x 104 कोशिकाओं की सांद्रता पर जेल्ड बेसमेंट पर बीज दें और उन्हें उस पर व्यवस्थित होने दें।
- कोशिकाओं की संख्या पर ध्यान दें। बहुत अधिक या बहुत कम कोशिकाएं जेल्ड बेसमेंट पर सही तरीके से ट्यूब नहीं बना सकती हैं।
- RGWE की बढ़ती खुराक तैयार (0.01, 0.1, और 1 mg/mL), संस्कृति माध्यम या rutin में शेयर समाधान को कम (12, 120, और 300 डिग्री/ प्रत्येक कुएं में अंतिम मात्रा 100 डिग्री सेल्सियस होगी। प्रत्येक प्रयोगात्मक स्थिति के लिए चार से छह कुओं को तैयार करें। एक नियंत्रण के रूप में, 1:50 के अनुपात में संस्कृति माध्यम में आसुत जल (वाहन) को पतला करें।
- इनक्यूबेटर में कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 में 6 से 24 डिग्री तक के समय के लिए इनक्यूबेट करें।
- बीज बोने के बाद 6 से 24 घंटे तक फैले समय सीमा के भीतर कोशिकाओं का निरीक्षण करें, 10X के आवर्धन पर एक चरण-कंट्रास्ट माइक्रोस्कोप का उपयोग करें। HUVECs 6 h के भीतर ट्यूब की तरह संरचनाओं के रूप में सक्षम हैं, लेकिन यह 12 के बाद बेहतर परिणाम का पालन करने के लिए संभव है - 18 ज. प्रत्येक अच्छी तरह से ट्यूब की तरह संरचनाओं की तस्वीर और प्रत्येक अच्छी तरह से तीन से पांच यादृच्छिक क्षेत्रों से एक औसत छवि.
- छवि अधिग्रहण के बाद, कोशिकाओं तहखाने मैट्रिक्स से अलग किया जा सकता है और कोशिकाओं की संख्या पर उपचार के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए गिना. प्रत्येक कुएँ के लिए, माध्यम को हटा दें, 24 U/mL की सांद्रता में dispase जोड़ें, और 1 h के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेट डाल दिया। फिर, प्रत्येक कुएं से, उस माध्यम को एकत्रित करें जिसमें कोशिकाओं को निलंबित कर दिया जाता है और अलग-अलग कोशिकाओं को 3 मिनट के लिए 264 x ग्राम पर अपकेंद्रण द्वारा फसलित करते हैं। उन्हें पीबीएस के 0.2 एमएल में पुन: निलंबित करें। कोशिकाओं की गणना करने के लिए, 0.2 एमएल सेल निलंबन को पीबीएस के 0.5 एमएल और 0.4% ट्रिपैन ब्लू समाधान के 0.3 एमएल में जोड़ें। कमरे के तापमान पर 5 मिनट के बाद, B$rker कक्ष में कोशिकाओं की गिनती.
- ट्यूब गठन परख के परिणामों की मात्रा निर्धारित करने के लिए, यह कम से कम तीन ट्यूबों में शामिल होने में शाखा बिंदुओं की संख्या की गणना करने के लिए संभव है। उपयुक्त छवि सॉफ्टवेयर का उपयोग करना, प्रत्येक micrograph शाखा बिंदुओं की संख्या में प्रत्येक क्षेत्र के लिए गिनती और मतलब की गणना - मानक त्रुटि (एसई) प्रत्येक प्रयोगात्मक स्थिति के लिए. सांख्यिकीय महत्व का मूल्यांकन करने के लिए दो पूंछ टी-परीक्षण का उपयोग करें।
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Representative Results
एंजियोजेनेसिस पर RGWE के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए, हम एक gelled तहखाने मैट्रिक्स पर एक ट्यूब गठन परख किया. जब इस पर खेती की जाती है, तो एचयूवीसी ट्यूब जैसी संरचनाएं बनाती हैं जो लम्बी दिखाई देने वाले कक्षों से उत्पन्न होती हैं और जो एक-दूसरे को सेल-सेल नेटवर्क बनाने के लिए जोड़ती हैं (चित्र2)। चित्र 3 मेंहम यह दर्शाते हैं कि नियंत्रण स्थितियों की तुलना में आरजीडब्ल्यूई के साथ उपचारित एचयूवीसी में शाखाओं की संख्या काफी कम थी। विशेष रूप से, 0.1 मिलीग्राम/एमएल और 1 मिलीग्राम/एमएल आरजीडब्ल्यूई की उपस्थिति में, नियंत्रण स्थिति की तुलना में शाखाओं की संख्या क्रमश 40% और 60% कम है। चूंकि रूटीन को RGWE5के प्रमुख घटक के रूप में दर्शाया गया है, इसलिए हमने HUVEC ट्यूब-निर्माण परख पर इसके प्रभाव का विश्लेषण किया। जैसा कि चित्र 4में दिखाया गया है, अकेले रूटीन ही सेल-सेल नेटवर्क बनाने की एचयूवीसी की क्षमता को प्रभावित करने में सक्षम नहीं है। फिर, हम ट्यूब गठन के RGWE प्रेरित निषेध अंतर्निहित आणविक तंत्र की जांच करने के लिए ट्यूब गठन परख का इस्तेमाल किया। MEK/ERK intracellular संकेतन मार्ग एंजियोजेनिक प्रक्रियाओं में एक निर्णायक भूमिका डालती है। CAMEK द्वारा transfected HUVECs RGWE के साथ इलाज किया और geled तहखाने मैट्रिक्स पर खेती की गई. जैसा कि चित्र ामाल 5में दिखाया गया है, केमके-ट्रांसफेक्टेड एन्डोथेलियल कोशिकाओं में, आरजीडब्ल्यूई अब ट्यूब गठन को रोकता नहीं है, जबकि नकली-ट्रांसफेक्टेड कोशिकाएं, नियंत्रण के रूप में उपयोग की जाती हैं, अभी भी जेल्ड बेसमेंट मैट्रिक्स पर एक सेल-सेल नेटवर्क बनाती हैं और RGWE के प्रति उत्तरदायी होती हैं, इस प्रकार यह इंगित करती हैं कि एंजियोजेनेसिस में RGWE के प्रभाव MEK-ERK मार्ग द्वारा मध्यस्थता है.
चित्र 1: रुटा ग्रेवियोलेन्स| एक रुटा ग्रेवियोलेन्स झाड़ी। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 2: HUVECs एक gelled तहखाने मैट्रिक्स पर ट्यूब की तरह संरचनाओं के रूप में. ह्यूवेक के प्रतिनिधि सूक्ष्म तस्वीरें polystyrene पकवान में सुसंस्कृत (बाएं) और जेल्ड तहखाने मैट्रिक्स (दाएं) पर. स्केल बार ] 10 डिग्री मी.
चित्र 3: RGWE HUVECs में ट्यूब गठन को रोकता है. (क) आरजीडब्ल्यूई (0, 0.01, 0.1, और 1.0 मिलीग्राम/एमएल) के साथ उपचारित एक जेल्ड बेसमेंट मैट्रिक्स पर सुसंस्कृत एचयूवीसी की उच्च शक्ति सूक्ष्म तस्वीरें। स्केल बार 10 डिग्री सेल्सियस है(बी) RGWE की उपस्थिति में HUVEC शाखा बिंदु (अंधेरे ग्रे) का प्रतिशत (0.01, 0.1, और 1.0 mg/mL) अनुपचारित कोशिकाओं की तुलना में (0 mg/mL) और trypan नीले बहिष्करण परीक्षण (प्रकाश ग्रे) पर इलाज किया (0.01 , 0.1, और 1 mg/mL) या नहीं (0 mg/mL) RGWE के साथ 24 h. * p.lt; 0.01 बनाम नियंत्रण स्थिति (0 mg/ परिणाम मतलब के रूप में व्यक्त कर रहे हैं - तीन स्वतंत्र प्रयोगों के एसई. सांख्यिकीय महत्व एक दो पूंछ टीपरीक्षण द्वारा प्राप्त किया गया था.
चित्रा 4: रुटिन HUVEC ट्यूब गठन को प्रभावित नहीं करता है। (ए) एक जेल्ड बेसमेंट मैट्रिक्स पर seeded HUVECs के उच्च शक्ति सूक्ष्म तस्वीरें और इलाज (12, 120, और 300 g/mL) या नहीं (0 g/ स्केल बार 10 डिग्री सेल्सियस है (बी) रूटिन की बढ़ती खुराक की उपस्थिति में HUVEC शाखा बिंदु (अंधेरे ग्रे) का प्रतिशत (12, 120, और 300 डिग्री/ , 120, और 300 $/mL) या नहीं (0 g/mL) 24 ज के लिए rutin के साथ. परिणाम मतलब के रूप में व्यक्त कर रहे हैं - तीन स्वतंत्र प्रयोगों के एसई. सांख्यिकीय महत्व एक दो पूंछ टीपरीक्षण द्वारा प्राप्त किया गया था.
चित्र 5: MEK मार्ग HUVEC ट्यूब गठन पर RGWE प्रभाव मध्यस्थता. (क) एचयूवीसी की उच्च शक्ति वाली सूक्ष्म तस्वीरें खाली वेक्टर (मॉक ट्रांसफेक्शन) के साथ या केमेक के साथ, जेल्ड बेसमेंट मैट्रिक्स पर बीज और आरजीडब्ल्यूई (0, 0.01, 0.1, और 1 मिलीग्राम/एमएल) की बढ़ती खुराक के साथ इलाज किया जाता है। स्केल बार 10 डिग्री है. (बी) HUVECs में शाखा बिंदुओं की संख्या का प्रतिशत नकली-transfected (अंधेरे ग्रे) और HUVECs में CAMEK (प्रकाश ग्रे) के साथ transfected और नियंत्रण की तुलना में RGWE (0.01, 0.1, और 1 mg/ स्थितियां (0 मिलीग्राम/एमएल)। *पी एंड एलटी; 0.01 बनाम नियंत्रण स्थिति; § p;lt; 0.05 बनाम कोशिकाओं खाली वेक्टर के साथ transfected और RGWE की एक ही राशि के साथ इलाज किया. परिणाम मतलब के रूप में व्यक्त कर रहे हैं - तीन स्वतंत्र प्रयोगों के एसई. सांख्यिकीय महत्व एक दो पूंछ टीपरीक्षण द्वारा प्राप्त किया गया था.
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Discussion
प्राकृतिक यौगिकों एक उच्च रासायनिक विविधता और जैव रासायनिक विशिष्टता की विशेषता है और संभावित चिकित्सीय अणुओं के एक स्रोत का प्रतिनिधित्व करते हैं. यहाँ, हम बताते हैं कि कैसे संयंत्र आर graveolens से पानी निकालने प्राप्त करने के लिए और एक आसान करने के लिए प्रदर्शन के रूप में ट्यूब गठन परख का प्रस्ताव, विश्वसनीय, और मात्रात्मक विधि एंजियोजेनेसिस पर RGWE के प्रभाव की जांच करने के लिए उपयोगी. यह आर graveolens पत्तियों को उबालना महत्वपूर्ण है 1 ज के लिए पूरा पानी निकालने प्राप्त करने के लिए सुनिश्चित हो. कम से कम 1 एच के लिए उबलते सभी अणुओं की निकासी के लिए अनुमति नहीं दी, और निकालने की उम्मीद जैविक प्रभाव लागू नहीं कर सका.
ट्यूब गठन परख कई कदम है कि नए रक्त वाहिकाओं के गठन के लिए नेतृत्व अंतर्निहित आणविक तंत्र का अध्ययन करने के लिए एक इन विट्रो परीक्षण का प्रतिनिधित्व करता है। इस परख शोधकर्ताओं angiogenesis को मॉड्युलेट करने में सक्षम यौगिकों की पहचान करने के लिए अनुमति देता है, साथ ही शामिल प्रोटीन और संकेत cascades. इसके अलावा, इस परख शोधकर्ताओं पदार्थ है कि प्रभावित कर सकते हैं परीक्षण करने के लिए अनुमति देता है, एक ही समय में, endothelial सेल प्रसार, आसंजन, प्रवास, और protease गतिविधि, रक्त वाहिका गठन में सभी महत्वपूर्ण तंत्र. केवल इस तरह के परीक्षण का उपयोग करके, हम बताते हैं कि RGWE, लेकिन नहीं इसके प्रमुख घटक rutin, सेल व्यवहार्यता को प्रभावित किए बिना ट्यूब की तरह संरचनाओं के रूप में HUVECs की क्षमता को कम करने में सक्षम है और यह कि इस प्रभाव MEK-ERK मार्ग सक्रियण पर निर्भर करता है. हालांकि, यह कोशिकाओं की सही संख्या के साथ परीक्षण करने के लिए महत्वपूर्ण है। वास्तव में, बहुत कम या बहुत सारे कोशिकाओं ट्यूबों के सही गठन की अनुमति नहीं दे सकता है. इस कारण से, कोशिकाओं की सही संख्या खोजने के लिए प्रारंभिक परीक्षण करने की सलाह दी जाती है। इसके अलावा, सेल मार्ग की संख्या के रूप में महत्वपूर्ण है के बाद से सेल संख्या, सही ट्यूब गठन परख प्राप्त करने के लिए, कोशिकाओं को दो से पांच बार पारित किया जाना है. पारित होने के बाद 6, जीर्णता तंत्र होते हैं जो सही ट्यूब गठन को ख़राब कर सकते हैं।
ट्यूब गठन परख एक बहुत reproduible परख है, और यह endothelial कोशिकाओं के शरीर क्रिया विज्ञान पर प्रकाश डालता है, भले ही यह ट्यूब गठन के तीन आयामी अध्ययन के लिए सोने के मानक नहीं है8,9,10, 11| तीन आयामी कोलेजन और फाइब्रिन मॉडल संवहनी ट्यूबलोजेनेसिस, अंकुरित, और endothelial सेल-pericyte बातचीत की जांच के लिए बेहतर होने का प्रदर्शन किया गया है. हालांकि, gelled तहखाने मैट्रिक्स पर ट्यूब गठन परख की तुलना में, इन परीक्षणों और अधिक समय और पैसे लेने वाली11हैं, सुझाव है कि पहले प्रारंभिक परिणाम है कि विवो अध्ययन में अधिक ध्यान केंद्रित के लिए आधार हो सकता है प्राप्त करने के लिए एक अच्छा परीक्षण हो सकता है. अंत में, ट्यूब गठन परख 24 घंटे में किया जा सकता है, क्योंकि nontransformed HUVECs 6 एच12,13के भीतर ट्यूब की तरह संरचनाओं के रूप में सक्षम हैं.
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Disclosures
लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
इस काम को फोन्डी डि एटेनेओ द्वारा लुका कलुची-डी'अमाटो और मारिया टेरेसा गैर-जाति और एआईआरसी फंड आईजी 18999 को मैरिजियो बिफुलको को वित्त पोषित किया गया है।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HUVEC cells | Clontech | C2519A | |
| FBS | Invitrogen | 10270106 | |
| EBM-2 basal medium | Clontech | cc3156 | |
| Single quot kit- supplemets and growth factors | clontech | cc4147 | |
| Matrigel | Corning | 354234 | |
| 96-well plates | Thermo Scientific | 167008 | |
| 15 mL conical tubes | Sarstedt | 62,554,502 | |
| 10 mL disposable serological pipette | Sarstedt | 861,254,001 | |
| 5 mL disposable serological pipette | Sarstedt | 861,253,001 | |
| 1,000 μL pipette | Gilson | Pipetman classic | |
| 100 μL pipette | Gilson | Pipetman classic | |
| 20 μL pipette | Gilson | Pipetman classic | |
| p1000 pipette tips | Sarstedt | ||
| p20-200 pipette tips | Sarstedt | 70,760,502 | |
| Burker chamber | Fortuna | ||
| Trypan blu stain | Gibco | 15250-061 | |
| DPBS | Gibco | 14190-094 | |
| mill-ex 0.22 μm filters | Millipore | SLGS033SS | |
| Lyophilizer | VirTis-SP Scientific | ||
| Incubator | Thermo Scientific | ||
| CO2 | AirCos | ||
| Pen-Strep | Gibco | 15070-063 | |
| 100 mm dish | Sarstedt | 833,902 | |
| pcDNA3 | Invitrogen | v79020 | |
| Lipofectamine-2000 | Invitrogen | 11668027 | |
| Opti-MEM | Gibco | 31985070 | Reduced serum medium |
| Rutin | Sigma-Aldrich | R5143-50G | |
| Axiovert 25 microscope | Zeiss | ||
| AmScope MD500 camera | AmScope | ||
| Dispase | Thermo Scientific | D4818 | |
| Lab heater | Falc | ||
| ParaFilm | American National Can |
References
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