Summary
هنا، نقوم بتقييم آثار استخراج المياه من روتا graveolens على تشكيل شبكة السفينة باستخدام اختبار تشكيل أنبوب على مصفوفة الطابق السفلي الهلامية.
Abstract
تكوين الأوعية هو ظاهرة تشمل عمليات مختلفة، مثل انتشار الخلايا البطانية، والتمايز، والهجرة، التي تؤدي إلى تشكيل الأوعية الدموية الجديدة وتنطوي على العديد من مسارات نقل الإشارات. هنا نبين أن اختبار تشكيل الأنبوب هو طريقة بسيطة في المختبر لتقييم تأثير المنتجات الطبيعية على تكوين الأوعية الدموية والتحقيق في الآليات الجزيئية المعنية. على وجه الخصوص، في وجود استخراج المياه من روتا graveolens (RGWE)، الخلايا البطانية لم تعد قادرة على تشكيل شبكة خلية الخلية، وأنه يتم إلغاء آثار RGWE على تكوين بطانة الوريد السري البشري (HUVEC) من قبل تفعيل تأسيسي لMEK.
Introduction
تكوين الأوعية الدموية هو عملية فسيولوجية تؤدي إلى تشكيل أوعية دموية جديدة من الأوعية الموجودة من قبل وتحدث أثناء تكوين الأجنة ونمو الأعضاء. في مرحلة البلوغ، يتم تنشيط تكوين الأوعية الدموية فقط في المبيض ركوب الدراجات، في المشيمة أثناء الحمل، وخلال التئام الجروح وإصلاحها. يعتمد تكوين الأوعية الدموية على قدرة الخلايا البطانية على التكاثر والتميز والهجرة لتشكيل شبكة الأوعية الدموية سليمة1. ومع ذلك، في العديد من الاضطرابات، مثل الأمراض الالتهابية، والأيض، والروماتيزم، يتم تغيير العمليات الوعائية وتصبح الأوعية الدموية مفرطة. وعلاوة على ذلك، فإن العمليات الوعائية غير المنضبطة تحفز أيضا تطور الورم والانبثاث1. لهذه الأسباب، في العقد الماضي، تركز الدراسات البحثية على وضع استراتيجيات علاجية جديدة تهدف إلى تثبيط تكوين الأوعية الدموية المفرط في السرطان، العين، المفاصل، أو اضطرابات الجلد2،3.
يمثل عامل نمو بطانة الأوعية الدموية (VEGF) الهدف الرئيسي للعلاجات المضادة للأوعية الدموية الحالية4، وقد تم تطوير العديد من الأجسام المضادة للمونوكلونات المضادة للVEGF وتوليفها لمنع تكوين الأوعية الدموية المفرط. ومع ذلك، فإن هذه الأدوية الاصطناعية تظهر آثار جانبية شديدة ولها نسبة تكلفة إلى فائدة غير مواتية5،6. ولذلك، لا بد من إيجاد استراتيجيات علاجية جديدة للحد من تكوين الأوعية الدموية المفرط مع الحد الأدنى من الآثار الجانبية لاستكمال والجمع مع الأدوية المستخدمة حاليا. ويمكن العثور على هذه الأدوية الجديدة بين المنتجات الطبيعية التي تتميز بتنوع كيميائي عال وخصوصية البيوكيميائية.
في هذه المقالة، نقترح طريقة بسيطة لتقييم تأثير RGWE على قدرة HUVECs لتشكيل الأنابيب على مصفوفة الطابق السفلي الهلامية في المختبر5. في الواقع، RGWE هو خليط من الأيض الثانوية مثل الفلافونويدات والبوليفينول من بينها روتين هو المكون الرئيسي5. وقد تم بالفعل اختبار العديد منهم كعوامل مضادة للالتهابات وvasoprotective7،8،9،10،11. وعلاوة على ذلك، لقد أثبتنا مؤخرا أن RGWE، ولكن ليس روتين، قادرة على تثبيط قدرة HUVEC على تشكيل الأنابيب على مصفوفة الطابق السفلي الهلامية، وأن هذه الظاهرة يتم التوسط من قبل مسار MEK-ERK، مما يشير إلى RGWE كأداة علاجية محتملة قادرة على منع الإفراط في تشكيل الأوعية الدموية الجديدة5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد RGWE
- جمع أوراق R. graveolens من النباتات خلال أشهر الربيع / الصيف تحت إشراف عالم النبات.
ملاحظة: في هذه الحالة، تم جمع الأوراق في القسم التجريبي من النباتات الطبية في الحديقة النباتية في نابولي، إيطاليا5. المصنع عفوي، دائم، وهو موجود في مناطقالبحر الأبيض المتوسط (الشكل 1). - تزن 250 غرام من الأوراق وتقطيعها ناعما مع مقص.
- ضعي الأوراق في قارورة مخروطية وأضيفي 1 لتر من الماء المقطر إلى 250 غرام من الأوراق المفرومة واغليها عند درجة حرارة 110 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة.
- استخدم ورق فلتر 3 مم قمع لفصل الأوراق المسلوقة من المرحلة السائلة التي تمثل استخراج المياه.
- تصفية المرحلة السائلة من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر، وجمعها في كوب. تغطية الكأس مع بارافيلم وتجميد استخراج في -80 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
- جعل 10 - 15 ثقوب مع إبرة في parafilm وlyophilize استخراج في lyophilizer. لاحظ أنه يمكن أن يستغرق بضعة أيام للحصول على مسحوق.
- وزن المسحوق الذي تم الحصول عليه، وتقسيمه إلى aliquots، وتخزينها في 4 درجة مئوية حتى الضرورة. فمن الممكن لتخزينه لمدة عام.
- عند الضرورة للتجارب، وإعداد حل الأسهم، والتخفيف من مسحوق بالماء المقطر إلى تركيز قياسي من 50 ملغ / مل. قم بفصله إلى كميات صغيرة (على سبيل المثال، 1 مل) aliquots. يمكن تخزين هذا الإعداد في -20 درجة مئوية حتى تستخدم ولكن لا يمكن تخزينها في 4 درجة مئوية لأكثر من بضعة أيام بسبب أكسدة الجزيئات. تجنب التجميد والذوبان.
2. خلية الثقافة
- زراعة HUVECs في متوسط نمو الخلايا البطانية: متوسطة القاعدية البطانية تكملها 1 ميكروغرام / مل هيدروكورتيزون و 1 نانوغرام / مل عامل نمو البشرة، 10٪ FBS، والبنسلين/ العقديات في 37 درجة مئوية في جو من 5٪ CO 2.
- عندما 80٪ confluent، وتقسيم الخلايا في نسبة 1:3 كل ممر. استخدام الخلايا من اثنين إلى خمسة مقاطع، التي لا تظهر اختلافات واضحة في الاستجابة لعوامل النمو. بعد المقطع السادس، تصبح الخلايا مُسنة ولا تشكل أنابيب على مصفوفة الطابق السفلي الهلامية.
3- التغوط
- عندما تكون HUVECs 70٪ مترافقة، transfect لهم مع الجين المطلوب.
- بالنسبة للوحة 100 مم، استخدم 1 ميكروغرام من متجه pCDNA3 الفارغ كتحكم و1 ميكروغرام من متجه pCDNA3 الذي يحتوي على جين الفائدة (MEK النشط بشكل تأسيسي [caMEK]، في هذه الحالة).
- مركب 1 ميكروغرام من الحمض النووي مع 3 ميكرولتر من ليبوفيكتامين 2000، مخفف ة مع انخفاض مصل متوسط (انظر جدولالمواد) إلى الحجم النهائي من 200 درجة مئوية. ثم، إضافة الحل transfecting إلى الخلايا. حضانة الخلايا في الحاضنة في 37 درجة مئوية،مع 5٪ CO 2. ومن الممكن أيضا استخدام عوامل التغوط الأخرى مختلفة عن lipofectamine 2000، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
- إضافة 7 مل من المتوسطة الطازجة كاملة 3 ح بعد التغوط، وبعد ذلك، مزيد من احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية لمدة 24 - 48 ساعة قبل المضي قدما في الاختبارات التالية. في اليوم التالي للتغوط، استبدل المتوسط بوسط جديد كامل.
4. أنبوب تشكيل التبيّاع
- تبرد لوحة 96 جيدا ونصائح ماصة في 4 درجة مئوية لمدة 1 ساعة قبل إعداد الطابق السفلي الهلامي.
- في لحظة التحضير الطابق السفلي، ووضع لوحة على الجليد (0 درجة مئوية) وإضافة 50 درجة مئوية من المصفوفة الباردة في كل بئر مع تجنب تشكيل فقاعات. لاحظ أنه يجب الاحتفاظ بالقارورة التي تحتوي على المصفوفة على الجليد أثناء الإجراء حيث تصبح المصفوفة صلبة في درجة حرارة الغرفة.
- وضع لوحة في الحاضنة في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 لمدة 30 دقيقة على الأقل للسماح للقبو للبلمرة.
- في هذه الأثناء، حصاد الخلايا. غسل HUVECs مع 1 مل من 0.25٪ تريبسين / 0.53 مليون متر EDTA الحل؛ ثم، إضافة 2 مل من الحل التربسين-EDTA وحضانة في 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. ثم، جمع المتوسطة التي يتم تعليق الخلايا وحصاد الخلايا المنفصلة عن طريق الطرد المركزي في 264 × ز لمدة 3 دقائق.
- لحساب الخلايا، إضافة 0.2 مل من تعليق الخلية إلى 0.5 مل من PBS و 0.3 مل من 0.4٪ trypan الحل الأزرق. بعد 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة، عد الخلايا في غرفة Bürker.
- إعادة تعليق الخلايا في وسط كامل في تركيز 2 × 104 خلايا / 50 درجة مئوية.
- إيلاء الاهتمام لعدد من الخلايا. قد لا تشكل خلايا كثيرة جداً أو قليلة جداً أنابيب في الطريق الصحيح على الطابق السفلي الهلامي.
- إعداد جرعات متزايدة من RGWE (0.01, 0.1, و 1 ملغ /مل), تخفيف محلول المخزون في الثقافة المتوسطة أو روتين (12, 120, و 300 ميكروغرام /مل), كل ذلك في المجلد النهائي من 50 € L / بئر, وإضافتها إلى 50 درجة مئوية / جيدا من تعليق الخلية. الحجم النهائي في كل بئر سيكون 100 درجة مئوية. إعداد أربعة إلى ستة آبار لكل حالة تجريبية. كتحكم, يخفّف يقطر يقطر ماء (عربة) في الثقافة وسط في نسبة من 1:50.
- حضانة الخلايا في الحاضنة في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 لفترة تتراوح بين 6 إلى 24 ساعة.
- مراقبة الخلايا في غضون نطاق زمني يمتد من 6 إلى 24 ساعة بعد البذر، وذلك باستخدام مجهر على النقيض من المرحلة في التكبير من 10X. HUVECs قادرة على تشكيل هياكل تشبه أنبوب في غضون 6 ح ولكن من الممكن أن نلاحظ نتائج أفضل بعد 12-18 ح. صورة الهياكل مثل أنبوب على كل بئر وصورة في المتوسط من ثلاثة إلى خمسة حقول عشوائية في كل بئر.
- بعد الحصول على الصورة، يمكن فصل الخلايا من مصفوفة الطابق السفلي وتحسب لتقييم تأثير العلاج على عدد الخلايا. لكل بئر، إزالة المتوسطة، إضافة dispase في تركيز 24 U / مل، ووضع لوحة في 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. ثم، من كل بئر، وجمع المتوسطة التي يتم تعليق الخلايا وحصاد الخلايا المنفصلة عن طريق الطرد المركزي في 264 × ز لمدة 3 دقائق. لحساب الخلايا، إضافة 0.2 مل من تعليق الخلية إلى 0.5 مل من PBS و 0.3 مل من 0.4٪ trypan الحل الأزرق. بعد 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة، عد الخلايا في غرفة Bürker.
- لتحديد نتائج عملية تحديد تشكيل الأنبوب، من الممكن حساب عدد نقاط الفرع التي تنضم إليها ثلاثة أنابيب على الأقل. باستخدام برنامج الصورة المناسب، عد لكل حقل في كل ميكروغراف عدد نقاط الفرع وحساب متوسط ± الخطأ القياسي (SE) لكل حالة تجريبية. استخدم اختبار t-tailed ذو ذيلين لتقييم الأهمية الإحصائية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
لتقييم تأثير RGWE على تكوين الأوعية الدموية، قمنا بفحص تشكيل أنبوب على مصفوفة الطابق السفلي الهلامية. عندما تزرع على ذلك، HUVECs تشكيل هياكل تشبه أنبوب التي تنشأ من الخلايا التي تظهر ممدود التي تربط بعضها البعض لتشكيل شبكة خلية الخلية (الشكل2). في الشكل 3، نبين أن عدد الفروع في HUVECs تعامل مع RGWE كان أقل بكثير بالمقارنة مع ظروف التحكم. وتجدر الإشارة إلى أنه في وجود 0.1 ملغم/مل و1 ملغم/مل RGWE، يكون عدد الفروع أقل بنسبة 40 في المائة و60 في المائة على التوالي، مقارنة بحالة التحكم. منذ تم الإشارة إلى روتين كعنصر رئيسي من RGWE5، قمنا بتحليل تأثيرها على اختبار HUVEC تشكيل أنبوب. كما هو موضح في الشكل 4، روتين وحده غير قادر على التأثير على قدرة HUVECs لتشكيل شبكة خلية خلية. ثم، استخدمنا التفتيش تشكيل أنبوب للتحقيق في الآليات الجزيئية الكامنة وراء تثبيط الناجمة عن RGWE من تشكيل الأنبوب. يقوم مسار الإشارات داخل الخلايا MEK/ERK بدور محوري في العمليات الوعائية. وقد عولجت الهوفيك التي تم نقلها بواسطة caMEK مع RGWE وزرعت على مصفوفة الطابق السفلي الهلامية. كما هو مبين في الشكل 5، في الخلايا البطانية caMEK-transfected، RGWE لم يعد يمنع تشكيل أنبوب، في حين أن الخلايا وهمية transfected، وتستخدم كسيطرة، لا تزال تشكل شبكة خلية الخلية على مصفوفة الطابق السفلي الهلامية وتستجيب لRGWE، مما يشير إلى RGWE أن تأثير RGWE في تكوين الأوعية الدموية يتم التوسط من قبل مسار MEK-ERK.
الشكل 1: روتا غرافولنس. شجيرة روتا الخطيرة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تشكل HUVECs هياكل تشبه الأنبوب على مصفوفة الطابق السفلي الهلامية. صور مجهرية تمثيلية من HUVECs المستزرعة في طبق البوليسترين (يسار) وعلى مصفوفة الطابق السفلي الهلامية (يمين). شريط مقياس = 10 ميكرومتر.
الشكل 3: RGWE يمنع تشكيل أنبوب في HUVECs. (أ) صور مجهرية عالية الطاقة من HUVECs المستزرعة على مصفوفة الطابق السفلي الهلامية تعامل مع RGWE (0, 0.01, 0.1, و 1.0 ملغ / مل). شريط المقياس هو 10 درجةمئوية (B) النسبة المئوية لنقطة فرع HUVEC (رمادي داكن) في وجود RGWE (0.01، 0.1، و 1.0 ملغ / مل) مقارنة مع الخلايا غير المعالجة (0 ملغ / مل) واختبار استبعاد الأزرق تريبان (رمادي فاتح) على HUVECs المعالجة (0.01 ، 0.1، و 1 ملغ / مل) أو لا (0 ملغ / مل) مع RGWE لمدة 24 ساعة *p < 0.01 مقابل حالة التحكم (0 ملغ / مل). يتم التعبير عن النتائج على أنها متوسط ± SE من ثلاث تجارب مستقلة. تم الحصول على الأهمية الإحصائية عن طريق اختبار t-tailed اثنين.
الشكل 4: روتين لا يؤثر على تشكيل أنبوب HUVEC. (أ) صور مجهرية عالية الطاقة من HUVECs البذر على مصفوفة الطابق السفلي الهلامية ومعالجتها (12، 120، و 300 ميكروغرام / مل) أم لا (0 ميكروغرام / مل) مع روتين لمدة 24 ساعة. شريط المقياس هو 10 درجةمئوية (B) النسبة المئوية لنقطة فرع HUVEC (رمادي داكن) في وجود جرعات متزايدة من روتين (12، 120، و 300 درجة مئوية/ مل) مقارنة مع ظروف التحكم (0 ميكروغرام / مل) واختبار استبعاد الأزرق تريبان (رمادي فاتح) على HUVECs المعالجة (12 ، 120، و 300 درجة مئوية / مل) أم لا (0 ميكروغرام / مل) مع روتين لمدة 24 ساعة. يتم التعبير عن النتائج على أنها متوسط ± SE من ثلاث تجارب مستقلة. تم الحصول على أهمية إحصائية عن طريق اختبار t-tailed اثنين.
الشكل 5: مسار MEK يتوسط آثار RGWE على تشكيل أنبوب HUVEC. (أ) صور مجهرية عالية الطاقة من HUVECs المنقولة مع ناقلات فارغة (التغوط وهمية) أو مع caMEK، بذر على مصفوفة الطابق السفلي الهلامية وتعامل مع جرعات متزايدة من RGWE (0، 0.01، 0.1، و 1 ملغ / مل). شريط مقياس هو 10 درجةمئوية (B) النسبة المئوية لعدد نقاط الفرع في HUVECs وهمية transfected (رمادي داكن) وفي HUVECs transfected مع caMEK (رمادي فاتح) وتعامل مع جرعات متزايدة من RGWE (0.01، 0.1، و 1 ملغ / مل) مقارنة مع السيطرة الظروف (0 ملغ / مل). *p < 0.01 مقابل شرط التحكم; § p < 0.05 مقابل الخلايا التي تم نقلها مع المتجه الفارغ ومعالجتها بنفس الكمية من RGWE. يتم التعبير عن النتائج على أنها متوسط ± SE من ثلاث تجارب مستقلة. تم الحصول على الأهمية الإحصائية عن طريق اختبار t-tailed اثنين.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تتميز المركبات الطبيعية بتنوع كيميائي عال وخصوصية كيميائية حيوية وتمثل مصدرا للجزيئات العلاجية المحتملة. هنا، نعرض كيفية الحصول على مستخلص المياه من النبات R. graveolens واقتراح اختبار تشكيل أنبوب كطريقة سهلة الأداء وموثوق بها، وكمية مفيدة للتحقيق في آثار RGWE على تكوين الأوعية الدموية. من المهم أن يغلي أوراق R. graveolens لمدة 1 ساعة للتأكد من الحصول على استخراج الماء الكامل. الغليان لأقل من 1 ساعة لم يسمح لاستخراج جميع الجزيئات، واستخراج لا يمكن أن تمارس التأثير البيولوجي المتوقع.
اختبار تشكيل الأنبوب يمثل اختبار في المختبر لدراسة الآليات الجزيئية الكامنة وراء العديد من الخطوات التي تؤدي إلى تشكيل الأوعية الدموية الجديدة. يسمح هذا الاختبار للباحثين بتحديد المركبات القادرة على تعديل تكوين الأوعية الدموية، فضلا عن البروتينات وسلاسل الإشارات التي ينطوي عليها. وعلاوة على ذلك، يسمح هذا الفحص للباحثين لاختبار المواد التي يمكن أن تؤثر، في الوقت نفسه، على انتشار الخلايا البطانية، والتصاق، والهجرة، والنشاط البروتياز، وجميع الآليات الهامة في تشكيل الأوعية الدموية. باستخدام هذا النوع فقط من الاختبار، ونحن نظهر أن RGWE، ولكن ليس روتين المكون الرئيسي لها، قادرة على الحد من قدرة HUVECs لتشكيل هياكل تشبه أنبوب دون التأثير على بقاء الخلية، وأن هذا التأثير يعتمد على تفعيل مسار MEK-ERK. ومع ذلك، من المهم إجراء الاختبار مع العدد الصحيح من الخلايا. في الواقع، عدد قليل جدا أو عدد كبير جدا من الخلايا لا يمكن أن تسمح تشكيل الحق في الأنابيب. لهذا السبب، من المستحسن إجراء اختبار أولي للعثور على العدد الصحيح من الخلايا. وعلاوة على ذلك، فإن عدد الممرات الخلوية لا يقل أهمية عن عدد الخلايا منذ ذلك الحين، للحصول على فحص تشكيل الأنبوب الصحيح، يجب أن يتم تمرير الخلايا مرتين إلى خمس مرات. بعد مرور 6، تحدث آليات الحساسية التي يمكن أن تضعف تشكيل الأنبوب الصحيح.
اختبار تشكيل أنبوب هو اختبار قابل للاستنساخ جدا، ويلقي الضوء على علم وظائف الأعضاء من الخلايا البطانية، حتى لو لميكن المعيار الذهبي للدراسة ثلاثية الأبعاد من تشكيل أنبوب 8،9،10، 11. وقد ثبت أن نماذج الكولاجين والفيبرين ثلاثية الأبعاد أفضل للتحقيقات في تكوين الأنابيب الوعائية، وتنبت، والتفاعل البطانية الخلية بيريكيت. ومع ذلك، بالمقارنة مع اختبار تشكيل أنبوب على مصفوفة الطابق السفلي الهلامية، وهذه الاختبارات هي أكثر من الوقت والمال المستهلكة11،مما يشير إلى أن الأول يمكن أن يكون اختبارا جيدا للحصول على النتائج الأولية التي يمكن أن تكون أساسا لمزيد من التركيز في الدراسات الحية. وأخيرا، يمكن إجراء فحص تشكيل أنبوب في 24 ح، منذ HUVECs غير المحولة قادرة على تشكيل هياكل تشبه أنبوب في غضون 6 ح12،13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
وقد تم تمويل هذا العمل من قبل فوندي دي أتينيو إلى لوكا كولوتشي-داماتو وبرنامج VALERE الأموال إلى ماريا تيريزا Gentile وصندوق AIRC IG18999 إلى موريزيو Bifulco.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HUVEC cells | Clontech | C2519A | |
| FBS | Invitrogen | 10270106 | |
| EBM-2 basal medium | Clontech | cc3156 | |
| Single quot kit- supplemets and growth factors | clontech | cc4147 | |
| Matrigel | Corning | 354234 | |
| 96-well plates | Thermo Scientific | 167008 | |
| 15 mL conical tubes | Sarstedt | 62,554,502 | |
| 10 mL disposable serological pipette | Sarstedt | 861,254,001 | |
| 5 mL disposable serological pipette | Sarstedt | 861,253,001 | |
| 1,000 μL pipette | Gilson | Pipetman classic | |
| 100 μL pipette | Gilson | Pipetman classic | |
| 20 μL pipette | Gilson | Pipetman classic | |
| p1000 pipette tips | Sarstedt | ||
| p20-200 pipette tips | Sarstedt | 70,760,502 | |
| Burker chamber | Fortuna | ||
| Trypan blu stain | Gibco | 15250-061 | |
| DPBS | Gibco | 14190-094 | |
| mill-ex 0.22 μm filters | Millipore | SLGS033SS | |
| Lyophilizer | VirTis-SP Scientific | ||
| Incubator | Thermo Scientific | ||
| CO2 | AirCos | ||
| Pen-Strep | Gibco | 15070-063 | |
| 100 mm dish | Sarstedt | 833,902 | |
| pcDNA3 | Invitrogen | v79020 | |
| Lipofectamine-2000 | Invitrogen | 11668027 | |
| Opti-MEM | Gibco | 31985070 | Reduced serum medium |
| Rutin | Sigma-Aldrich | R5143-50G | |
| Axiovert 25 microscope | Zeiss | ||
| AmScope MD500 camera | AmScope | ||
| Dispase | Thermo Scientific | D4818 | |
| Lab heater | Falc | ||
| ParaFilm | American National Can |
References
- Carmeliet, P. Angiogenesis in life, disease and medicine. Nature. 438 (7070), 932-936 (2005).
- Carmeliet, P., Jain, R. K. Molecular mechanisms and clinical applications of angiogenesis. Nature. 473 (7347), 298-307 (2011).
- Ferrara, N., Kerbel, R. S. Angiogenesis as a therapeutic target. Nature. 438 (7070), 967-974 (2005).
- Ravishankar, D., Rajora, A. K., Greco, F., Osborn, H. M. I. Flavonoids as prospective compounds for anti-cancer therapy. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 45, 2821-2831 (2013).
- Gentile, M. T., et al. Ruta graveolens water extract inhibits cell-cell network formation in human umbilical endothelial cells via MEK-ERK1/2 pathway. Experimental Cell Research. 364 (1), 50-58 (2018).
- Butler, M. S. Natural products to drugs: natural product-derived compounds in clinical trials. Natural Product Reports. 25, 475-516 (2008).
- Sulaiman, R. S., Basavarajappa, H. D., Corson, T. W. Natural product inhibitors of ocular angiogenesis. Experimental Eye Research. 129, 161-171 (2014).
- Risau, W.
- Trung, N. X. In vitro models for angiogenesis. Journal of Science & Development. 13 (4), 850-858 (2015).
- Ucuzian, A. A., Greisler, H. P.
- Simons, M., et al. American Heart Association Council on Basic Cardiovascular Sciences and Council on Cardiovascular Surgery and Anaesthesia. State-of-the-Art Methods for Evaluation of Angiogenesis and Tissue Vascularisation: A Scientific Statement From the American Heart Association. Circulation Research. 116 (11), e99-e132 (2015).
- Arnaoutova, I., Kleinman, H. K. In vitro angiogenesis: endothelial cell tube formation on gelled basement membrane extract. Nature Protocols. 5 (4), 628-635 (2010).
- DeCicco-Skinner, K. L., et al. Endothelial cell tube formation assay for the in vitro study of angiogenesis. Journal of Visualized Experiments. (91), e51312 (2014).
