Summary
Hier evalueren we de effecten van het water extract van Ruta graveolens op de vorming van een vat netwerk door gebruik te maken van een buis vormings test op een opgestijfde kelder matrix.
Abstract
Angiogenese is een fenomeen dat verschillende processen omvat, zoals de proliferatie van endotheliale cellen, differentiatie en migratie, die leiden tot de vorming van nieuwe bloedvaten en betrekking hebben op verschillende signaaltransductie trajecten. Hier tonen we aan dat de buis vormings test een eenvoudige in vitro methode is om de impact van natuurlijke producten op angiogenese te evalueren en om de betrokken moleculaire mechanismen te onderzoeken. In het bijzonder, in de aanwezigheid van het water extract van Ruta graveolens (rgwe), zijn endotheelcellen niet langer in staat om een cel-celnetwerk te vormen en dat de rgwe-effecten op menselijke navelstreng ader endotheliale cel (huvec) buis vorming wordt afgeschaft door de constitutieve activering van MEK.
Introduction
Angiogenese is een fysiologisch proces dat leidt tot de vorming van nieuwe bloedvaten van bestaande en treedt op tijdens embryogenese en orgel groei. In de volwassenheid wordt angiogenese alleen geactiveerd in de fiets-eierstok, in de placenta tijdens de zwangerschap en tijdens wondgenezing en-herstel. Angiogenese is afhankelijk van het vermogen van endotheel cellen om te vermenigvuldigen, te differentiëren en migreren naar een intact vasculaire netwerk vormen1. Echter, in verschillende aandoeningen, zoals inflammatoire, metabole, en reumatische aandoeningen, angiogene processen worden gewijzigd en angiogenese wordt overmatig. Bovendien stimuleren ongecontroleerde angiogene processen ook de progressie van de tumor en metastasen1. Om deze redenen, in de afgelopen tien jaar, onderzoeken zijn gericht op de ontwikkeling van nieuwe therapeutische strategieën gericht op de remming van overmatige angiogenese in Cancer, oculaire, gewricht, of huidaandoeningen2,3.
Vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF) vertegenwoordigt het belangrijkste doelwit van huidige antiangiogenic therapieën4, en verschillende anti-VEGF monoklonale antilichamen zijn ontwikkeld en gesynthetiseerd om overmatige angiogenese te voorkomen. Echter, deze synthetische drugs vertonen ernstige bijwerkingen en hebben een ongunstige kosten/batenverhouding5,6. Daarom is het noodzakelijk om nieuwe therapeutische strategieën te vinden om buitensporige angiogenese met minimale bijwerkingen te vullen en te combineren met momenteel gebruikte drugs. Deze nieuwe geneesmiddelen kunnen worden gevonden onder natuurlijke producten die worden gekenmerkt door een hoge chemische diversiteit en biochemische specificiteit.
In dit artikel stellen we een eenvoudige methode voor om de impact van de rgwe te evalueren op het vermogen van huvecs om tubuli te vormen op een opgestijfde-kelder matrix in vitro5. Inderdaad, RGWE is een mengsel van secundaire metabolieten zoals flavonoïden en polyfenolen, waaronder rutine is de belangrijkste component5. Velen van hen zijn al getest als anti-inflammatoire en vasoprotective agenten7,8,9,10,11. Bovendien hebben we onlangs aangetoond dat rgwe, maar niet rutin, in staat is om het huvec-vermogen te remmen om tubuli te vormen op een opgestijfde-kelder matrix en dat dit fenomeen wordt gemedieerd door de MEK-ERK-route, wat rgwe aangeeft als een potentieel therapeutisch instrument dat in staat is om Voorkom overmatige nieuwe bloedvat vorming5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. RGWE voorbereiding
- Verzamel R. graveolens bladeren van planten tijdens de lente/zomermaanden onder toezicht van een botanicus.
Opmerking: In dit geval werden de bladeren verzameld in de experimentele sectie van medicinale planten in de botanische tuin van Napels, Italië5. De plant is spontaan, blijvend en is aanwezig in de mediterrane regio's (Figuur 1). - Weeg 250 g bladeren af en hak ze fijn met een schaar.
- Leg de blaadjes in een conische kolf en voeg 1 L gedestilleerd water toe aan 250 g gehakte bladeren en breng dat aan de kook bij 110 °C gedurende 60 min. Bedek de kolf met aluminiumfolie om overmatige verdamping te voorkomen.
- Gebruik 3 mm-trechter filterpapier om de gekookte bladeren te scheiden van de vloeibare fase die het water extract vertegenwoordigt.
- Filtreer de vloeibare fase door een filter van 0,22 μm en verzamel het in een bekerglas. Bedek het bekerglas met Parafilm en Vries het extract 's nachts in bij-80 °C.
- Maak 10-15 gaten met een naald in de Parafilm en lyophilize het extract in een lyophilizer. Merk op dat het een paar dagen kan duren om het poeder te verkrijgen.
- Weeg het verkregen poeder af, verdeel het in aliquots en bewaar het op 4 °C totdat het nodig is. Het is mogelijk om het voor een jaar op te slaan.
- Indien nodig voor de experimenten, bereid een stamoplossing, verdunning van het poeder met gedestilleerd water tot een standaard concentratie van 50 mg/mL. In kleine hoeveelheden (bijv. 1 mL) aliquots te scheiden. Dit preparaat kan bij-20 °C worden bewaard tot het wordt gebruikt, maar kan gedurende meer dan een paar dagen niet bij 4 °C worden bewaard vanwege de oxideringen van de moleculen. Vermijd bevriezen en ontdooien.
2. celcultuur
- Cultiveer HUVECs in endotheliale celgroei medium: endotheliaal Basaal medium aangevuld met 1 μg/mL hydrocortison en 1 ng/mL epidermale groeifactor, 10% FBS en penicillaire/streptomycine bij 37 °C in een atmosfeer van 5% CO2.
- Wanneer 80% Confluent, splitst u de cellen in de verhouding van 1:3 elke passage. Gebruik cellen van twee tot vijf passages, die geen schijnbare verschillen vertonen in reactie op groeifactoren. Na de zesde passage, cellen worden senescentie en vormen geen buizen op de opgestijfde kelder matrix.
3. transfectie
- Wanneer de HUVECs 70% Confluent zijn, transfect ze met het gewenste gen.
- Gebruik voor een plaat van 100 mm 1 μg lege pCDNA3 vector als controle en 1 μg pCDNA3 vector met het gen van belang (constitutief actieve MEK [caMEK], in dit geval).
- Complex 1 μg DNA met 3 μL lipofectamine 2.000, verdund met een verlaagd serum medium (Zie tabel van de materialen) tot het eindvolume van 200 ΜL. Verwijder het medium uit de cellen en vervang het door 1 ml vers volledig medium; Voeg vervolgens de transfecting oplossing toe aan de cellen. Incuberen de cellen in de incubator bij 37 °C, met 5% CO2. Het is mogelijk om ook gebruik maken van andere transfectie agenten anders dan lipofectamine 2.000, volgens de instructies van de fabrikant.
- Voeg 7 mL volledig vers medium 3 h toe na de transfectie en verbroed vervolgens de cellen bij 37 °C voor 24-48 h voordat u verdergaat met de volgende assays. De dag na de transfectie, vervang het medium met vers volledig medium.
4. bepaling van de buis vorming
- Koel een 96-put en pipetpunten bij 4 °c gedurende 1 uur voordat u de opgestijfde-kelder voorbereidt.
- Op het moment van de bereiding van de kelder, zet de plaat op ijs (0 °C) en voeg 50 μL koude matrix in elk goed terwijl het vermijden van de vorming van bubbels. Houd er rekening mee dat de matrix-bevattende injectieflacon tijdens de procedure op ijs moet worden gehouden, aangezien de matrix bij kamertemperatuur stevig wordt.
- Plaats de plaat in de incubator bij 37 °C met 5% CO2 gedurende ten minste 30 min om de kelder te laten polymeriseren.
- Oogst intussen de cellen. Was de HUVECs met 1 mL van een 0,25% trypsine/0.53 mM EDTA-oplossing; Voeg vervolgens 2 mL trypsine-EDTA-oplossing toe en incuberen bij 37 °C gedurende 5 minuten. observeer de cellen onder een omgekeerde Microscoop om te controleren of de cellaag volledig is gedispergeerd. Verzamel vervolgens het medium waarin de cellen zijn opgehangen en oogst de losgekoppelde cellen door centrifugeren bij 264 x g gedurende 3 min. resuspendeer ze in 1 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
- Om de cellen te tellen, voegt u 0,2 mL van de celsuspensie toe aan 0,5 mL PBS en 0,3 mL 0,4% trypeen blauwe oplossing. Tel na 5 minuten bij kamertemperatuur de cellen in een Bürker-kamer.
- Hervat de cellen in volledig medium bij een concentratie van 2 x 104 cellen/50 μL. zaai ze op de opgestijfde-kelder bij de concentratie van 2 x 104 -cellen per put en laat ze zich daarop vestigen.
- Let op het aantal cellen. Te veel of te weinig cellen vormen geen buizen op de juiste manier op de opgestijfde kelder.
- Voorbereiding van toenemende doses RGWE (0,01, 0,1 en 1 mg/mL), verdunnen van de stamoplossing in kweekmedium of rutine (12, 120 en 300 μg/mL), alles in het uiteindelijke volume van 50 μL/goed, en voeg ze toe aan 50 μL/well van celsuspensie. Het uiteindelijke volume in elke put is 100 μL. Bereid vier tot zes putjes voor elke experimentele conditie. Als controle wordt gedistilleerd water (voertuig) in het kweekmedium verdund met een verhouding van 1:50.
- Incuberen de cellen in de incubator bij 37 °C en 5% CO2 voor een tijd variërend van 6 tot 24 uur.
- Observeer de cellen binnen een tijdsbereik van 6 tot 24 uur na het zaaien, met behulp van een fase-contrast Microscoop met een vergroting van 10X. HUVECs zijn in staat om buis-achtige structuren binnen 6 h te vormen, maar het is mogelijk om betere resultaten te observeren na 12-18 h. fotografeer de buis achtige structuren op elke put en beeld een gemiddelde van drie tot vijf willekeurige velden in elk goed.
- Na het verzamelen van de afbeelding, kunnen de cellen worden losgekoppeld van de kelder matrix en geteld om het effect van de behandeling op het aantal cellen te evalueren. Voor elk goed, verwijder het medium, voeg dispase toe met een concentratie van 24 U/mL en plaats de plaat bij 37 °C gedurende 1 uur. Vervolgens, van elke put, verzamelen van het medium waarin de cellen zijn geschorst en oogst de vrijstaande cellen door centrifugeren op 264 x g gedurende 3 min. resuspendeer ze in 0,2 ml PBS. Om de cellen te tellen, voegt u 0,2 mL celsuspensie toe aan 0,5 mL PBS en 0,3 mL 0,4% trypeen blauwe oplossing. Tel na 5 minuten bij kamertemperatuur de cellen in de Bürker-kamer.
- Om de resultaten van de buis vormings test te kwantificeren, is het mogelijk om het aantal vertakkingspunten te tellen waarin ten minste drie buizen toetreden. Gebruik de juiste afbeeldings software en tel voor elk veld in elke Microscoop het aantal vertakkingspunten en bereken het gemiddelde ± de standaardfout (SE) voor elke experimentele aandoening. Gebruik een tweezijdige t-toets om statistische significantie te evalueren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om de invloed van rgwe op angiogenese te evalueren, hebben we een buis vormings test uitgevoerd op een opgestijfde-kelder matrix. Bij het kweken op het, HUVECs vormen buis-achtige structuren die afkomstig zijn van cellen die langwerpig lijken en die elkaar verbinden om een cel-celnetwerk te vormen (Figuur 2). In Figuur 3tonen we aan dat het aantal vertakkingen in HUVECs die behandeld werden met rgwe significant lager was in vergelijking met de controle omstandigheden. Met name, in de aanwezigheid van 0,1 mg/mL en 1 mg/mL RGWE, het aantal van de takken zijn lager door 40% en 60%, respectievelijk, in vergelijking met de voorwaarde van de controle. Aangezien rutine is geïndiceerd als de belangrijkste component van RGWE5, analyseerden we het effect ervan op de huvec-buis vormings test. Zoals weergegeven in Figuur 4, kan rutine alleen niet invloed hebben op de mogelijkheid van HUVECs om een celcelnetwerk te vormen. Vervolgens gebruikten we de buis vormings test om de moleculaire mechanismen te onderzoeken die onderliggende de RGWE-geïnduceerde remming van buis vorming. Het MEK/ERK intracellulaire signalerings traject oefent een cruciale rol uit in angiogene processen. Huvecs is door camek behandeld met rgwe en gecultiveerd op de opgestijfde-kelder matrix. Zoals getoond in Figuur 5, in camek-getransfuneerde endotheliale cellen, rgwe niet langer remt de vorming van de buis, terwijl mock-transport cellen, gebruikt als controle, nog steeds vormen een cel-cel netwerk op de opgestijfde kelder matrix en reageren op rgwe, zodat dat het RGWE-effect in angiogenese wordt gemedieerd door de MEK-ERK-route.
Figuur 1: Ruta graveolens. Een Ruta graveolens struik. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: huvecs vormen buis achtige structuren op een opgestijfde-kelder matrix. Representatieve microscopische foto's van huvecs gekweekt in polystyreen schotel (links) en op opgestijfde kelder matrix (rechts). Schaalbalk = 10 μm.
Figuur 3: RGWE remt de vorming van buizen in HUVECs. A) hoogvermogen microscopische foto's van huvecs gekweekt op een opgestijfde-kelder matrix behandeld met rgwe (0, 0,01, 0,1 en 1,0 mg/ml). De schaalbalk is 10 μm.B) het percentage van het huvec-vertakkingspunt (donkergrijs) in aanwezigheid van rgwe (0,01, 0,1 en 1,0 mg/ml) in vergelijking met onbehandelde cellen (0 mg/ml) en de trypan Blue-uitsluitings test (lichtgrijs) op de behandelde HUVECs (0,01 , 0,1, en 1 mg/mL) of niet (0 mg/mL) met RGWE voor 24 h. *p < 0,01 VS. de conditie van het besturingselement (0 mg/ml). De resultaten worden uitgedrukt als het gemiddelde ± de SE van drie onafhankelijke experimenten. De statistische significantie werd verkregen door een tweezijdige t-toets.
Figuur 4: rutine heeft geen invloed op de vorming van HUVEC-buizen. A) hoogvermogen microscopische foto's van huvecs die op een opgestijfde-kelder matrix zijn geseeld en behandeld (12, 120 en 300 μg/ml) of niet (0 μg/ml) met rutine gedurende 24 uur. De schaalbalk is 10 μm.B) het percentage huvec-vertakkingspunt (donkergrijs) in aanwezigheid van stijgende doses rutine (12, 120 en 300 μ/ml) in vergelijking met de controle omstandigheden (0 μg/ml) en de trypan Blue-uitsluitings test (lichtgrijs) op de behandelde HUVECs (12 , 120 en 300 μ/mL) of niet (0 μg/mL) met rutine gedurende 24 uur. De resultaten worden uitgedrukt als het gemiddelde ± de SE van drie onafhankelijke experimenten. De statistische significantie werd verkregen door een tweezijdige t-toets.
Figuur 5: MEK-pathway bemiddelt RGWE-effecten op de HUVEC-buis vorming. A) High-Power microscopische foto's van huvecs met lege Vector (mock transfectie) of met camek, die op de opgestijfde-kelder matrix zijn geseeld en behandeld met toenemende doses rgwe (0, 0,01, 0,1 en 1 mg/ml). De schaalbalk is 10 μm.B) het percentage van het aantal vertakkingspunten in huvecs (donkergrijs) en in Huvecs met camek (lichtgrijs) en behandeld met toenemende doses rgwe (0,01, 0,1 en 1 mg/ml) in vergelijking met de controle voorwaarden (0 mg/mL). *p < 0,01 VS. de controle voorwaarde; § p < 0,05 VS. cellen die met de lege Vector zijn getransffecteerd en met dezelfde hoeveelheid rgwe worden behandeld. De resultaten worden uitgedrukt als het gemiddelde ± de SE van drie onafhankelijke experimenten. De statistische significantie werd verkregen door een tweezijdige t-toets.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Natuurlijke verbindingen worden gekenmerkt door een hoge chemische diversiteit en biochemische specificiteit en vertegenwoordigen een bron van potentieel therapeutische moleculen. Hier laten we zien hoe we water extract van de plant R. graveolens kunnen verkrijgen en de buis vormings test voorstellen als een eenvoudig te vervullen, betrouwbare en kwantitatieve methode die nuttig is om de effecten van rgwe op angiogenese te onderzoeken. Het is belangrijk om de R. graveolens bladeren te koken voor 1 uur om zeker te zijn van het volledige water extract. Het koken gedurende minder dan 1 uur was niet toegestaan voor de extractie van alle moleculen en het extract kon het verwachte biologische effect niet uitoefenen.
Buis vorming assay vertegenwoordigt een in vitro test om te bestuderen van de moleculaire mechanismen die onderliggende de verschillende stappen die leiden tot de vorming van nieuwe bloedvaten. Deze test stelt onderzoekers in staat om stoffen te identificeren die angiogenese kunnen moduleren, evenals de eiwitten en signalering van Cascades die betrokken zijn. Bovendien stelt deze bepaling onderzoekers in staat om stoffen te testen die tegelijkertijd invloed kunnen hebben op de proliferatie van endotheliale cellen, adhesie, migratie en protease activiteit, alle belangrijke mechanismen in de vorming van bloedvat vaten. Met behulp van alleen dit soort test, laten we zien dat RGWE, maar niet de belangrijkste component rutine, in staat is om het vermogen van HUVECs te verminderen om buis achtige structuren te vormen zonder de levensvatbaarheid van de cel te beïnvloeden en dat dit effect afhangt van de activering van MEK-ERK pathway. Het is echter belangrijk om de test uit te voeren met het juiste aantal cellen. In feite, te weinig of te veel cellen kon niet toestaan dat de juiste vorming van de buizen. Om deze reden is het raadzaam om een inleidende test uit te voeren om het juiste aantal cellen te vinden. Bovendien is het aantal celpassages net zo belangrijk als het celnummer, omdat, om de juiste buis vormings test te verkrijgen, cellen twee tot vijf keer moeten worden door gevoerd. Na passage 6 treden senescentie mechanismen op die de juiste buis vorming kunnen aantasten.
De buis vormings test is een zeer reproduceerbare assay en werpt licht op de Fysiologie van endotheliale cellen, zelfs als het niet de gouden standaard is voor de driedimensionale studie van buis vorming8,9,10, 11. Driedimensionale collageen en fibrine modellen zijn aangetoond beter voor onderzoeken van vasculaire tubulogenese, kiemen, en endotheliale cel-pericyt interactie. Vergeleken met de buis vormings test op opgestijfde-kelder matrix, zijn deze tests echter meer tijd-en geld verbruikende11, wat suggereert dat de eerste een goede test zou kunnen zijn om voorlopige resultaten te verkrijgen die de basis kunnen zijn voor meer gerichte in vivo-studies. Tot slot kan de buis vormings test worden uitgevoerd in 24 uur, omdat niet-getransformeerde huvecs in staat zijn om buis achtige structuren te vormen binnen 6 h12,13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gefinancierd door Fondi di Ateneo aan Luca Colucci-D'Amato en VALERE Program funds aan Maria Teresa Gentile en AIRC Fund IG18999 aan Maurizio Bifulco.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HUVEC cells | Clontech | C2519A | |
| FBS | Invitrogen | 10270106 | |
| EBM-2 basal medium | Clontech | cc3156 | |
| Single quot kit- supplemets and growth factors | clontech | cc4147 | |
| Matrigel | Corning | 354234 | |
| 96-well plates | Thermo Scientific | 167008 | |
| 15 mL conical tubes | Sarstedt | 62,554,502 | |
| 10 mL disposable serological pipette | Sarstedt | 861,254,001 | |
| 5 mL disposable serological pipette | Sarstedt | 861,253,001 | |
| 1,000 μL pipette | Gilson | Pipetman classic | |
| 100 μL pipette | Gilson | Pipetman classic | |
| 20 μL pipette | Gilson | Pipetman classic | |
| p1000 pipette tips | Sarstedt | ||
| p20-200 pipette tips | Sarstedt | 70,760,502 | |
| Burker chamber | Fortuna | ||
| Trypan blu stain | Gibco | 15250-061 | |
| DPBS | Gibco | 14190-094 | |
| mill-ex 0.22 μm filters | Millipore | SLGS033SS | |
| Lyophilizer | VirTis-SP Scientific | ||
| Incubator | Thermo Scientific | ||
| CO2 | AirCos | ||
| Pen-Strep | Gibco | 15070-063 | |
| 100 mm dish | Sarstedt | 833,902 | |
| pcDNA3 | Invitrogen | v79020 | |
| Lipofectamine-2000 | Invitrogen | 11668027 | |
| Opti-MEM | Gibco | 31985070 | Reduced serum medium |
| Rutin | Sigma-Aldrich | R5143-50G | |
| Axiovert 25 microscope | Zeiss | ||
| AmScope MD500 camera | AmScope | ||
| Dispase | Thermo Scientific | D4818 | |
| Lab heater | Falc | ||
| ParaFilm | American National Can |
References
- Carmeliet, P. Angiogenesis in life, disease and medicine. Nature. 438 (7070), 932-936 (2005).
- Carmeliet, P., Jain, R. K. Molecular mechanisms and clinical applications of angiogenesis. Nature. 473 (7347), 298-307 (2011).
- Ferrara, N., Kerbel, R. S. Angiogenesis as a therapeutic target. Nature. 438 (7070), 967-974 (2005).
- Ravishankar, D., Rajora, A. K., Greco, F., Osborn, H. M. I. Flavonoids as prospective compounds for anti-cancer therapy. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 45, 2821-2831 (2013).
- Gentile, M. T., et al. Ruta graveolens water extract inhibits cell-cell network formation in human umbilical endothelial cells via MEK-ERK1/2 pathway. Experimental Cell Research. 364 (1), 50-58 (2018).
- Butler, M. S. Natural products to drugs: natural product-derived compounds in clinical trials. Natural Product Reports. 25, 475-516 (2008).
- Sulaiman, R. S., Basavarajappa, H. D., Corson, T. W. Natural product inhibitors of ocular angiogenesis. Experimental Eye Research. 129, 161-171 (2014).
- Risau, W.
- Trung, N. X. In vitro models for angiogenesis. Journal of Science & Development. 13 (4), 850-858 (2015).
- Ucuzian, A. A., Greisler, H. P.
- Simons, M., et al. American Heart Association Council on Basic Cardiovascular Sciences and Council on Cardiovascular Surgery and Anaesthesia. State-of-the-Art Methods for Evaluation of Angiogenesis and Tissue Vascularisation: A Scientific Statement From the American Heart Association. Circulation Research. 116 (11), e99-e132 (2015).
- Arnaoutova, I., Kleinman, H. K. In vitro angiogenesis: endothelial cell tube formation on gelled basement membrane extract. Nature Protocols. 5 (4), 628-635 (2010).
- DeCicco-Skinner, K. L., et al. Endothelial cell tube formation assay for the in vitro study of angiogenesis. Journal of Visualized Experiments. (91), e51312 (2014).
