Analyse av skjær flyt-indusert migrering av murint Marginal sone B celler In Vitro

Summary

Marginal sone B celler (MZBs) svarer på styrken av skjær flyt ved å reorientere sine overføringsbane flyten. Denne protokollen viser hvordan du registrerer og analysere overføring ved hjelp av en fluidics enhet, pumpe, mikroskop tenkelig system og fri programvare.

Abstract

Marginal sone B celler (MZBs) er en befolkning på B celler som befinner seg i musen splenic marginale soner som innhylle follikler. For å nå follikler, må MZBs overføre opp skjær styrken av blodstrøm. Vi presenterer her en metode for å analysere dette flyt-indusert MZB migrasjon i vitro. Først er MZBs isolert fra mus milten. Andre er MZBs avgjort på integrin ligander i flow chamber lysbilder, utsatt for å skråstille flyt, og fotografert under et mikroskop under overføring. Tredje bilder av de overfører MZBs behandles med MTrack2 automatiske cellen sporing plugin for ImageJ, og resultatet celle spor er kvantifisert ved hjelp av verktøyet Ibidi chemotaxis. Migrasjon data avslører hvor raskt cellene flytte, hvor ofte de endre retning, om skjær flyt vektoren påvirker deres migrasjon retning og hvilke integrin ligander er involvert. Selv om vi bruker MZBs, kan lett metoden tilpasses for å analysere migrering av noen leukocytter som svarer til styrken av skjær.

Introduction

Immunceller er mest motile cellene i kroppen og ofte må kjempe med skjæring kraft fra blod og lymfe. Men er det relativt få studier på skjær kraft-indusert migrasjon av leukocytter,^1,,^2,,^3,,^4,,⁵. Vi presenterer her en pålitelig og kvantitative protokoll for å analysere responsen på en immun cellen flyt i vitro. Utfører analysen krever ikke fabrikasjon av komponenter, og alt utstyr og forbruksmateriell er kommersielt tilgjengelig. Protokollen, inkludert celle rensing og migrasjon analyse, kan utføres på én dag. Til slutt, selv om vi beskrive overføring av marginal sone B-celler (MZBs), protokollen kan tilpasses analysere migrering mot strømmen av andre typer immunceller. Derfor er det mulig å bruke denne analysen til å systematisk analysere et bredt spekter av leukocytter med en omfattende forhold.

MZBs er en befolkning av B-celler som i musen, finnes bare i milten og transport mellom innsiden av hårsekkene og marginale soner^6,7,8,9. Marginale sonen er et lag av immunceller ca 5-10 celler tykk. Cellen laget omslutter hårsekken, og består hovedsakelig av MZBs og makrofager, men også konstant naturlig killer T (iNKT) celler, dendrittiske celler (DCs) og nøytrofile, blant annet¹⁰. Cellene i marginale sonen er utsatt for enveis blodstrøm som stammer fra splenic arteries som avsluttet i en marginal sinus rundt hårsekken. Blodet er strømmer fra hull i marginale sinus gjennom marginale sonen samlet i venøse bihulene i rød cellulose og restaurert til sirkulasjon¹¹. Fri-flyt av blod vasker over MZBs og viser dem mot antigener i blodet. MZBs la antigen i hårsekken ved skytling automatisk mellom marginale sonen og inne i hårsekken, som ikke utsettes for blod. Dermed som MZBs Flyplasstransport mot hårsekken, må de overføre opp skjær kraften av blodet flyt¹² (figur 1A).

I denne protokollen, vi beskriver kvantitativt fastslå hvordan immunceller som MZBs svarer ikke flyte eller høy flow i vitro, for å avsløre hvordan de er programmert til å overføre i vivo. I det første trinnet, er MZBs renset fra en mus milt med magnetiske perler koblet til antistoffer fra kommersielt tilgjengelige kits. De ferske isolert MZBs introdusert i av en flow chamber lysbildet, slå seg ned på integrin ligander og utsatt til flyt av migrasjon buffer med en pumpesystem (figur 2A). Cellene er avbildet med en time-lapse video mikroskopi system. Bildene behandles deretter for analyse med en gratis ImageJ plugin, MTrack2^13,14, automatisk spore cellene. Spor kan deretter kvantifiseres med gratis Ibidi Chemotaxis verktøyet¹⁵ å bestemme ulike parametere inkludert hastighet, rett linje og migrasjon indeks. Disse verdiene kan brukes til å fastslå effekten av overføringen hemmere, celle stimulators, chemokines og andre overføring-påvirker kjemikalier på skjær-flow indusert overføringen for å forstå krefter kontrollere immun celle bevegelse i vivo.

Protocol

Alle eksperimenter med bruk av dyr har godkjent av den Landesverwaltungsamt Halle (Sachsen-Anhalt), Tyskland, tidligere alle retningslinjer av det medisinske fakultetet OVGU Universitetet i Magdeburg.

1. MZB celle rensing

1. Isolere leukocytter.
   1. Ofre en 8 til 16 uke gamle musen og fjerne milt¹⁶. Distansere milten i 5 mL iskald celle bufferen [fosfat-bufret saltvann (PBS) + 0,5% fettstoffer syre-fri bovin serum albumin (BSA)], ved å bruke en vev dissociator eller forsiktig mose milten gjennom en 70 µm celle sil mesh i en brønn på en 6-vel plate med stempelet fra 5 mL sprøyte.
   2. Overføre cellene i cellen buffer til en 15 mL konisk rør. Samle flere celler ved å legge en annen 5 mL iskald celle bufferen til vev dissociator tube eller nylon maske i brønnen. Overføre den ytterligere 5 mL celle buffer pluss celler til konisk røret. Sentrifuge på 300 x g i 10 min ved romtemperatur (RT, 20 ° C) og kast nedbryting.
2. Utføre røde blodlegemer lysis.
   1. Nytt suspendere celle pellet i 1 mL av røde blodlegemer (RBC) lyseringsbuffer (150 mM NH₄Cl, 10 mM KHCO₃, 0,1 mM EDTA) som er forvarmes RT. legge en ekstra 1,5 mL RBC lyseringsbuffer og virvel for å blande. Ruge på RT (20 ° C) totalt 2 min, inkludert tiden det tar å suspendere pellet.
   2. Legge til 7,5 mL iskald celle bufferen celle suspensjon å stoppe lyse. Sentrifuge på 300 x g og 4 ° C i 10 min og kast nedbryting.
   3. Nytt suspendere celle pellet i 1 mL av cellen bufferen og legge en ekstra 9 mL celle bufferen. Pipetter 10 mL celle suspensjon gjennom et 30 µm pre separasjon filter i en ny 15 mL konisk tube fjerne celle rusk.
   4. Sentrifuge cellene på 300 x g og 4 ° C i 10 min og kast nedbryting. Nytt avbryte celle pellet 500 µL celle bufferen. Holde celler i kaldt på alle etterfølgende trinnene av fremgangsmåten til inkubasjon i flow chamber lysbildene.
3. Rens MZBs.
   1. Legge til 50 µL av biotin-kombinert antistoffer fra et kommersielt tilgjengelig kit mot alle uønskede celler, inkludert CD43 (på ikke-B celler), CD4 (på T celler), CD93 (på umodne B celler) og Ter119 (på erytrocytter), i celle suspensjon i et konisk rør. Riste eller flick røret forsiktig å blande, men gjør ikke vortex cellene. Lå konisk røret på en seng av is i en nesten-flat vinkel og 25 RPM i 15 min.
   2. Legge til magnetiske perler koblet til anti-biotin antistoffer i et totalt volum på 100 µL til celle suspensjon. Fortsette å rocke celle suspensjon på 25 rpm på is 20 min. vask cellene ved 5 mL av cellen buffer, sentrifugering 300 x g og 4 ° C i 10 min og forkaster nedbryting. Nytt suspendere celler i 1 mL av cellen buffer.
   3. Tømme cellen suspensjon av magnetiske perle-koblede cellene ved å beholde dem i en magnetisk kolonne. Forkast merket celler (alle ikke-B celler og umodne B celler). Samle ikke-merket cellene (modne B celler) i en 15 mL konisk rør som er pre-belagt med et kort program 5 ml av cellen buffer, for å hindre ikke-spesifikke vedheft av MZBs.
   4. Vask celle suspensjon med 5 mL celle buffer. Sentrifuge på 300 x g og 4 ° C i 10 min og kast nedbryting. Nytt suspendere celler i 90 µL celle bufferen og legge 10 µL av anti-CD23-kombinert perler. Rock celle suspensjon forsiktig på is 20 min på 25 rpm.
   5. Vask celle suspensjon med 5 mL celle buffer. Sentrifuge på 300 x g og 4 ° C i 10 min og kast nedbryting. Nytt suspendere celler i 1 mL av cellen buffer.
   6. Tømme cellen suspensjon av magnetiske perle-koblede cellene ved å beholde dem i en magnetisk kolonne. Sletter merket cellene (follikulær B celler). Samle ikke-merket cellene (MZBs), i et 15 mL konisk rør som har vært pre-belagt med et kort program 5 ml celle bufferen. Fjerne 50 µL av celler for telling, og sjekke renhet.
4. Flekk de sorterte MZBs sjekke for renhet.
   1. Legge til 10% volum (5 µL) Fc blokk 10 000 celler i 50 µL og ruge ved 4 ° C i 5 min. legge 50 µL celle bufferen som inneholder 0,3 µL hver av B220-FITC (0,15 µg), CD21-PE (0,06 µg), og CD23-APC (0,06 µg) i et totalt volum på 105 µL (hver antistoff fortynnet 1:350) , eller andre kombinasjoner av fluorophores for å skille mellom follikulær B-celler og MZBs. flekken cellene på 4 ° C i mørket i 15 min.
   2. Vask farget cellene gang med 1 mL av cellen buffer. Sentrifuge på 300 x g og 4 ° C i 5 min og kast nedbryting. Resuspend i 300 µL celle bufferen og få prøver ved å bruke en flow cytometer og standard metoder. Porten på live lymfocytter, deretter på B220⁺ celler, og til slutt på CD23^lave . CD21^høy celler (figur 1B).
      Merk: Prosedyren vanligvis gir 500.000 MZBs per milt fra C57B/6 mus.
5. Forberede MZBs flyt migrasjon.
   1. Vask renset MZBs en gang i 1-2 mL kaldt migrasjon bufferen [Hanks' balansert salt løsning (HBSS) inneholder kasjoner, 10 mM Hepes, 0,2% fettstoffer syre-fri BSA] slik at kasjon inneholder migrasjon bufferen ikke er utvannet av gjenværende kasjon-fri PBS buffer. Sentrifuge på 300 x g og 4 ° C i 10 min og kast nedbryting. Nytt avbryte MZBs kaldt migrasjon buffer en konsentrasjon av 50 000 MZBs per 30 µL (tilsvarer beløpet i en brønn en flow chamber lysbildet).
      Merk: De ferske isolert MZBs bør brukes så snart som mulig. Men er de fremdeles dugelig av overfører opptil 8 timer eller mer etter starten av eksperimentet for så lenge de holdes på is. Optimal temperatur bør testes for andre celletyper. For eksempel kan det være bedre å holde kulturperler T-celler på 37 ° C før starten av migrasjon.

2. flyten eksperiment

1. Lag lysbilder med integrin ligand.
   1. Dagen før eksperimentet, tine en aliquot av ICAM-1 (400 µg/mL). Fortynne ICAM-1 med en faktor på 1:80 i PBS nå en siste konsentrasjon av 5 µg/mL. Legge til 30 µL av ICAM-1 i et kammer på et flyt lysbilde for hver overføring film kreves. Inkuber lysbildet i et fuktig rom på 4 ° C over natten.
      Merk: Hvert lysbilde inneholder 6 kamre og opptil 8 filmer i én økt kan lett registreres.
2. Blokkere belagt brønnene.
   1. På dagen for eksperimentet, vask kammeret ved å legge 100 µL av PBS en brønn og uttak 100 µL fra andre godt av kammeret. Legg 100 µL blokkerer bufferen (2% fettstoffer syre-fri BSA i PBS) til en kammer og ruge lysbildet i et fuktig kammer på RT for 1,5 t.
   2. Vask kammeret ved å legge til 100 µL av PBS en brønn, trekke det fra den andre godt, deretter legge 100 µL migrasjon bufferen til kammeret. Lagre lysbilder i en fuktig kammer på RT til eksperimentet.
3. Forberede fluidics enheten.
   1. Koble en væske pumpe, kobler den fluidics, og slå på pumpen programvare. Vask slangen når med 5-10 mL migrasjon buffer, deretter legge til 11,7 mL migrasjon bufferen like i begge reservoarer og fjerne luftboblene.
   2. Klemme slangen ca 10 cm fra kontakten stykket. Plass fluidic enheten i oppvarmet inkubasjon kammer på mikroskopet.
   3. Angi til lysbildet valg "μ-slide VI 0,4" og slangen til "hvit" i programvaren. Angi det ønskede skjæring stresset (f.eks 4 dyn cm^-2). Angi tidspunktet for bildebehandling til 30 min.
   4. Still inn kalibreringsfaktoren slangen ved å bestemme infusjonshastigheten gjennom slangen i mL/min. måle tiden som kreves for 2 mL bufferen flyte fra én reservoar av den andre og dividerer med 2. Gjøre minst 4 mål for nøyaktighet. Bruke faktiske infusjonshastigheten angi ønsket strømningshastighet og skjæring stress ved å angi verdier i pumpen programvare.
4. Forberede tenkelig systemet.
   1. Forvarm til mikroskopet inkubasjon kammer, fluidics enhet og migrasjon buffer dele 37 ° c (figur 2B). Test fluidic pumpen ved å sikre at bufferen som migrasjon flyter frem og tilbake i reservoarene og at det er ingen luft bobler i systemet.
5. Veieceller på lysbildet.
   1. Rengjør undersiden av lysbildet med en etanol fuktet vev. Legge til 30 µL av cellen suspensjon i en brønn av kammer og trekke 30 µL fra andre brønnen. Inkuber lysbildet med en cover på å hindre fordampning på 37 ° C i 30 minutter til at cellene å feste.
   2. Sakte legge forvarmes migrasjon bufferen i hver brønn flow chamber lysbildet til en positiv menisk av brønnen og fjern eventuelle luftbobler pipette spissen.
6. Fest lysbildet til den fluidics enheten.
   1. Klemme lysbildet til mikroskopet scenen. Fjerne den umerkede siden av fluidic slangen fra kontakten stykket og fylle opp slutten med migrasjon buffer til en positiv menisk uten luftbobler av slutten.
   2. Flip slutten av slangen over og sette den inn i toppen godt av flyt kammeret, mopping opp sølt buffer med en vev. Samtidig slangen festet, gjenta den markerte slutten av slangen.
7. Bilde cellene.
   1. Bytte tenkelig systemet til "Live" å sette fokus på cellene. Velg en synsfelt som er midten av lysbildet. De fokus cellene litt for å forbedre det sorte omrisset av cellen og produsere et hvitt interiør, som deretter kan thresholded en runde svart celle figur på en hvit bakgrunn for bruk med et automatisert sporing program.
   2. Start bilderedigeringsprogrammet sekvens og post 1 bilde hvert 5 s i 30 min med 10 x tørr mål. Fjerne klemmen fra slangen og slå pumpen på, så ikke-tilhenger celler vil vaske og tilhenger celler vil begynne å overføre. Bilde for 30 min eller lengre bruker en 10 x målet eller høyere, som ønsket. Merke og lagre filmen.
8. Løsne fluidic enheten fra lysbildet.
   1. På slutten av bildebehandlingsprogrammet, tilbakestille pumpen for neste eksperimentet: nytt feste klemme til slangen, ta av slangen fra lysbildet, re-fest kontakt stykket, åpne klemmen og bruke den manuelle kontrollen av pumpen til å presse flere mL bufferen fra en reserv OIR til den andre å fjerne luftboblene. Nytt feste klemme og lå festet slangen på mikroskopet scenen for den neste filmen.
      Merk: Protokollen kan pauses uendelige her. Hvis bruker en inhibitor modifikator av celle migrasjon, avhengig av modus for handling, legge det til enten celle suspensjon før settling i migrasjon kammeret eller overføring bufferen i fluidic enheten.

3. migrasjon spor analyse

Merk: Cellene kan spores automatisk med MTrack2 plugin eller for hånd med manuell oppfølging plugin¹⁷. Automatisk sporing fungerer godt med MZBs fordi disse cellene er hovedsakelig rundt og beholdt under overføring, gjør det enkelt å terskelen bildet av cellene på svarte objekter på en hvit bakgrunn. Automatisk sporing er vanskeligere hvis andre celletyper brukes, som kulturperler, aktivert CD8 + T celler, fordi disse cellene strekke ut under overføringen og blir litt gjennomskinnelige, slik at det er vanskelig å definere kantene. I dette tilfellet kan enten (1) celler være farget med en intra viktig fluorescerende farge å produsere bilder som kan være thresholded å vise svarte objekter på en hvit bakgrunn, eller (2) andre programmer å skissere cellene som bildet segmentering og/eller kant gjenkjenning kan være brukt. Manuell sporing er et nyttig alternativ når produserer en høy kontrast bilde av celle skisserer ikke er mulig.

1. Utføre manuell oppfølging med plugg.
   1. Installer plugin "Manuell sporing" i ImageJ og åpne filmen i ImageJ. Velg "Legg til nytt spor" under menyen "Manuell sporing". Klikk midt i en celle som filmen fremskritt automatisk frame-by-frame. Når cellen som er valgt i hver ramme, velg "Legg til nytt spor" å starte etter en ny celle.
   2. Når sporene er spilt, kopiere output resultatene til en data-regneark. Endre formatet for desimal visning for alle regnearkceller til null steder etter desimaltegnet. Lagre filen som en "tab stopp skilt" txt-fil for senere analyse.
      Merk: Vanligvis spores 50-100 celler, som tar ca 1 time å fullføre 20 min filmen rundt 240 rammer.
2. Utføre automatisk sporing bruker MTrack2 plugin. Dataoverføre og installere MTrack2 kt plugin i henhold til instruksjonene i filen (se ekstra kode-fil).
   1. Terskelen bildene fra celle migrasjon filmen. Åpne bildestakk i ImageJ. Prosessen bildene i ImageJ konvertere video fra farge høy kontrast bilder å vise cellene som svarte objekter på en hvit bakgrunn (figur 3A).
      1. Skarpere bilder dobbelt Støvfjernar bildene og konvertere bilder til 8 bit. Velg den "bilde | Juster lysstyrke/kontrast"sub-meny og sette kontrastskyveknappen på maksimal kontrast og cellene vises som hvite objekter på svart bakgrunn. Velg den "bilde | Juster terskelen"undermenyen slik at cellene vises som svarte objekter på en hvit bakgrunn.
   2. Kjøre automatisk cellen sporing plugin "MTrack2 kt" (se Ekstra koding fil). Angi følgende parametere i skjermbildet Alternativer.
      1. Angi partikkelstørrelse minimum på 1 bildepunkt og partikkelstørrelse maksimalt 30 piksler for MZBs.
      2. For hastighet (Maksimumsavstanden mellom 2 partikler på påfølgende rammer i filmen), hvis cellen tettheten på lysbildet er høy, angir denne verdien for å unngå å ha sporet "hoppe" fra en celle til en annen. For MZBs, angi denne verdien 10 piksler fange outliers, selv om MZBs generelt ikke vil overstige 2 piksler på påfølgende rammer som er 5 s fra hverandre.
      3. Antallet rammer som en partikkel har finnes spores, angi denne verdien på antall rammer i filmen for MZBs (f.eks, 240) for en 20 min film med 12 rammer/min. Imidlertid hvis cellene er rask nok til å forlate synsfelt før slutten av imaging, deretter angi minimum antall rammer på mindre enn varigheten av filmen. For eksempel med raske T-celler, kan du angi minimumsantallet på tilsvarende 5-10 min bildebehandling.
         Merk: Makroregistreringen disse trinnene (terskelverdi og MTrack2-kt) til å automatisere denne del av prosedyren og spare tid (se Ekstra koding fil). Bruke makroen automatisk spore en film i ImageJ tar mindre enn et minutt.
   3. Kopier output resultatene til en data-regnearket. Endre formatet for desimal visning for alle regnearkceller til null steder etter desimaltegnet. Legge til en tom rad på toppen av cellen sporene i regnearket og slette kolonnen "D". Lagre filen som en "tab stopp skilt" txt fil for påfølgende analyse i verktøyet Ibidi Chemotaxis.
      Merk: MTrack2 plugin utganger celle sporene i rader med 75 parallelle kolonner. For analyse i verktøyet Ibidi chemotaxis må cellen sporene i en enkelt kolonne. Slik konverterer resultatet, MTrack2 plugin ble endret sende enten i originalformatet eller som en enkelt kolonne (figur 3B) (se Ekstra koding filen "MTrack2 kt", som er skrevet i Java). Kopier filen .java til mappen ImageJ plugins. ImageJ, velg "Plugins > kompilere og kjøre". Omstart ImageJ og den endrede versjonen av MTrack2 skal vises i Plugins-menyen.
3. Analysere celle spor med verktøyet Ibidi Chemotaxis, dataoverføre Ibidi Chemotaxis og overføringsverktøyet v2.0 ("stand alone") og åpne programmet.
   1. Velg "Importer data" og gå til txt celle spor-filer. Du kan velge flere filer samtidig. Importerte filer vises i ruten "Datasett" i rødt. Velg alle og angi riktige verdier i "Initialiseringen" menyen nedenfor gjelder følgende innstillinger.
   2. Angi det nøyaktige antallet eller en rekke antall sektorer (antall rammer i filmen).
   3. I menyen Calibration (X / Y kalibrering), angi størrelsen på en piksel. Finne denne informasjonen i filen egenskaper av filmen. For MZBs, ble en 10 x mål brukt, gir en pikselstørrelse på 1.14 µm. I "kalibrering menyen | Tidsintervaller", angi tiden mellom rammene i filmen.
   4. Bruk innstillingene. Velg "Plott data" å vise spor tomter og bekrefte at spor filene åpnes. Fra dette punktet er mange alternativer tilgjengelige som er beskrevet i dokumentasjonen for programmet, inkludert merke sporene med forskjellige farger basert på ulike egenskaper og personlige eller gjennomsnittlig verdier for hastighet, videresende overføring indeks, direkthet og mer (figur 3B).
      Merk: MZBs ta ca 10 min å oppdage og reagere på strømmen, antagelig ved polariserende deres integrin komplekser flyt fram poenget med cellen. En graf av migrasjon indeksen over tid viser en første slipp under null, tilsvarer de første par minutter at cellen er utsatt for flow, etterfulgt av en gradvis økning oppover til videresende vandring indeksverdiene er positive. Dermed kan det være optimalt å utelukke disse første minuttene i siste beregningene, med mindre dette er av interesse.

Representative Results

Vi brukte protokollen skissert ovenfor sammenligne migrering av MZBs på ICAM-1-belagt lysbilder uten strøm (0 dyn/cm²) og utsatt for å skråstille flyt (4 dyn/cm²). Cellene ble sporet automatisk med MTrack2 og den resulterende banen filer ble lagt på celle migrasjon filmer av ingen flyt (0 dyn/cm²) og (4 dyn/cm²) for å vise distribusjonen og formen på sporene (figur 4A). Cellen spor ble deretter importeres til Ibidi Chemotaxis verktøyet (IKT) til å generere spor tomter hver film (figur 4B). Gjennomsnittlig overføring indeksen (kalt "FMIy" av IKT), hastighet, rett linje (kalt "direkthet" av IKT), og lineær avstand (kalt "Euklidsk avstand" av IKT) av cellen spor fra 4 filmer hver for begge betingelsene ble beregnet i den Chemotaxis verktøy ved hjelp av kommandoen "målt verdier". Disse gjennomsnittsverdiene ble deretter kopieres til GraphPad prisme for generere grafer og beregne statistisk signifikans (figur 4C).

Figur 1: MZB skytling. (A) modell av MZB skytteltrafikk mellom marginale sonen og hårsekken i milten. MZBs krever internalization av S1PR1, en reseptor for S1P og funksjonelle CXCR5, en reseptor for CXCL13 chemokine, for å angi hårsekken. I tillegg for å nå hårsekken, må MZBs overføre mot blodstrøm fra porene i marginale sinus som omslutter hårsekken. Hvis en MZB mister vedheft til ICAM-1, ligand for LFA-1 Integra er det skjøvet til den røde massen av strømmen, der økte mengder VCAM-1, ligand for VLA-4, ville ikke støtter overføring. (B) flowcytometri gating strategi for å teste renhet sortert MZBs bruker antistoffer mot B220 og CD23 CD21. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2: oppsett av fluidics system, pumpe, mikroskop og inkubasjon kammeret. (A) bilde av pumpesystem (Ibidi¹⁸) som består av en pumpe koblet fluidics enhet og bærbar PC som kjører programvaren kontrollere pumpen. Høyere forstørrelse bilde: flow chamber lysbildet med 6 flyt chambers, først som er knyttet til slangen av fluidics. (B) vanlig installasjon for å måle i vitro migrering av MZBs mot strømmen. Mikroskop utstyrt med en oppvarming kammer (svart boks) inneholder fluidics enheten koblet til en pumpe (blå firkant objekt til nederst til høyre på mikroskopet) utenfor mikroskopet. Høyere forstørrelse bilde: fluidics-enheten i mikroskopet oppvarming kammer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3: kvantifisering av bildebehandling data. (A) representant bilder av en ramme fra en film overføre MZBs før (venstre) og etter (til høyre) terskelverdi bildet å konvertere cellene til svarte objekter på en hvit bakgrunn. Skalere barer i både lav og høy forstørrelse bilder = 100 µm. (B) venstre panel: bilde av typiske resultater fra MTrack2 (enkelt kolonne output) plugin. Høyre panel: bilde av verktøyet Ibidi Chemotaxis og migrasjon 2.0 etter inndata MTrack2 resultater viser et spor plott overføre MZBs og en "målte verdier" vise vinduet viser gjennomsnitt av parametere som hastighet, overføring indeks og direkthet ( grønne bokser), blant andre. Kalibrering innstillingene vises inkluderer pixel oppløsning 1.14 µm per piksel og et tidsintervall 5 s (0.083 min) per filmrammen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4: eksempel på resultatene ved hjelp av protokollen for å måle MZB skytling. (A) representant stillbilder av overfører MZBs med overlegg spor fra ImageJ plugin "MTrack2 kt". Merk: spor fargene var vilkårlig satt av "Manuell sporing" plugg for ImageJ. Skalere barer i både lav og høy forstørrelse insets = 100 µm. (B) representant spor tomter overføre MZBs fra verktøyet Ibidi Chemotaxis og migrasjon 2.0. Røde linjer og svarte linjer representerer cellen spor som avslutte under eller over den vannrette aksen, henholdsvis. I (A) og (B): venstre, MZBs migrerer med ingen flyt (0 dyn/cm²); høyre, MZBs migrere til en 4 dyn/cm² flyt. (C) overføring indeks (FMIy), hastighet, rett linje (direkthet) og avstand for MZBs overføring uten flyt (0 dyn/cm²) eller flow (4 dyn/cm²) (n = 4 mus i 4 separate forsøk). Feilfelt = gjennomsnittlig ± SD; Student t -test, ** p < 0,01, *** p < 0,001. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Ekstra fil 1: MTrack2_kt.java. Klikk her for å laste ned denne filen.  

Discussion

Her beskriver vi en metode for å analysere migrering av celler som gjenkjenner kraft av skjær flyt og svare ved å endre deres migrasjon. En analyse av MZBs viste at MZBs overføre spontant på ICAM-1 og i nærvær av flyt, vil migrere flyten. I vår tidligere arbeid viste vi at MZBs overfører ikke flyten på VCAM-1 men i stedet forblir fast på plass. Murine splenic marginale sonen inneholder hovedsakelig ICAM-1, mens rød masse inneholder både ICAM-1 og VCAM-1. Fra disse dataene, kan det konkluderes at MZBs ville overføre flyten mens i marginale sonen, men ikke i den rød massen. Analysen ble validert i vivo MZBs med defekt vedheft som var mislocalized i splenic rød massen av flyt¹². For disse grunner representerer MZBs en god positive kontroll for å teste flyt overføring systemet beskrevet her, selv om systemet brukes til å studere en annen celle type.

Den mest kritiske aspekten av prosedyren er å sikre konsekvens i celle håndtering på lysbildet. Fordi kvantifiserbare aspektene av celle migrasjon, avhenger av graden som cellene overholder lysbildet, ville noen reduksjon av mobilnettet vedheft gjøre reproduserbar resultater vanskelig. Redusert mobilnettet vedheft kan skyldes inkonsekvens i flere faktorer, inkludert temperaturer på migrasjon bufferen eller boksen oppvarmet inkubering (kalde reduserer vedheft), nivåer av kasjoner i cellen suspensjon (kasjoner påvirker integrin bindende), Skyv håndtering (trykke eller bøye lysbildet kunne fortrenge celler), og tetthet (kollisjoner mellom celler kan påvirke overføringen parametere). Andre sensitive punkter under prosedyren inkluderer ikke pipettering bufferen i lysbildet brønner med for mye kraft før feste slangen (som dette kan redusere celleadhesjon) og holde tiden som kreves for protokollen trinn konsekvent i alle eksperimentet ( cellen bosetting tid kan påvirke vedheft). Oppsummert må noen mulig innflytelse på celleadhesjon holdes konsekvent gjentakelser til å produsere pålitelige celle migrasjon data.

Denne metoden er enkel å konfigurere siden den bruker kommersielt tilgjengelig utstyr og forsyninger, og ingen av trinnene krever avansert instruksjon. For analyse av MZB, samt andre celletyper som kulturperler CD8⁺ T celler, belegg lysbilder med ulike integrin ligander er tilstrekkelig til å observere overføringen flyten. Studere flyt-indusert migrasjon svar på ulike integrin ligander fører til direkte identifikasjon av aktive integrins på celleoverflaten, muligens avsløre mekanismer gjelder i vivo funksjoner som med MZB overføring flyten på ICAM-1, men ikke VCAM-1. Det er imidlertid også mulig å legge til et endothelial celle lag til flyt kamre. Et eksempel på immun celle migrasjon som påvirkes av skjær flyt er T cellen bloduttredelse til endotelial lag³. Denne fremgangsmåten ble brukt til å løse aktiveringen av T celle vedheft via integrins, selectins og chemokines, og modellen lymfocytt migrasjon gjennom blod - hjerne barrieren. Den eneste begrensningen til cellene som kan analyseres med denne metoden er at de må være i stand til å oppfatte kraft av flyt som en retningsbestemt signal.

Selv om metoden skissert her brukes til å beskrive mobilnettet atferd som hastighet og snu, kan det også utvides til analyse av molekylære aspekter av overføring. Molekylær komplekser relevant for flyt-indusert overføring, inkludert integrins som LFA-1 og deres cellen cytoskjelett adaptere, ville være innenfor 200 nM på overflaten av lysbildet mottakelig for visualisering TIRF mikroskopi. Dette tillegg til metoden ville være ideelt for å studere celler fra mus mutasjoner i integrin - eller cytoskeleton-relaterte proteiner. Som mange immunceller overføre på ulike stadier i deres utvikling gjennom blodet eller lymfesystemet flyter, kan i vitro overføringen beskrevet brukes å systematisk teste mange typer kulturperler eller primære leukocytter for Svar å flyte og avslører hvordan cellene er programmert for å migrere i en immunrespons i vivo. Avslutningsvis gir analysen beskrevet her en pålitelig og enkel metode for å analysere flyt-indusert migrering av MZBs som kan også utvides til andre celletyper.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
VWR Cell Strainer, 70 µm	VWR	10199-656
Pre-Separation Filters, 30 µm	Miltenyi	130-095-823
MZB and FOB cell isolation kit	Miltenyi	130-100-366
B220 CD45R, clone RA3-6B2, FITC	Biolegend	103206
CD21 / CD 35, clone 7G6, APC	BD Biosciences	558658
CD23, clone B3B4, PE	Biolegend	101608
HBSS	Biochrom	L2035
D-PBS 1x	Gibco by Life Technologies	14190-094
BSA albumin fraction V, fatty acid-free	Roth	"0052.3"
ICAM-1	R&D Systems	796-IC-050
Ibidi µ-slides VI 0.4, hydrophobic, uncoated	Ibidi	80601
Perfusion set, white, 50 cm, 0.8 mm	Ibidi	10963
Ibidi Pump system	Ibidi	10902