Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Анализ миграционных потока индуцированного сдвига мышиных маргинальные зоны B клеток In Vitro

Published: November 26, 2018 doi: 10.3791/58759
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Institute of Biochemistry and Cell Biology, OVGU University of Magdeburg

Summary

Маргинальные зоны B клеток (MZBs) реагировать силы сдвига потока путем переориентации их миграции путь вверх поток. Этот протокол показано, как записывать и анализировать миграции с помощью fluidics блока, насоса, Микроскоп съемочной системы и свободного программного обеспечения.

Abstract

Маргинальные зоны B клетки (MZBs) являются население B-клетки, которые находятся в мыши селезеночной маргинальных зонах, которые окутывают фолликулов. Чтобы достичь фолликулов, MZBs необходимо перенести вверх поперечной силы потока крови. Мы представляем здесь метод для анализа этого потока индуцированной MZB миграции в пробирке. Во-первых MZBs изолированы от Хандра мыши. Во-вторых MZBs поселились на Интегрин лигандов в поток камеры слайды, подвергается сдвига потока и образ под микроскопом во время миграции. В-третьих изображения перенос MZBs обрабатываются с помощью MTrack2 автоматическая ячейки отслеживания плагинов ImageJ, и результирующий треков ячейки являются количественно с помощью инструмента хемотаксис Ibidi. Миграции данных показывают, как быстро переместить ячейки, как часто они изменить направление, ли вектор сдвига потока влияет на их направление миграции и какие Интегрин лигандов участвуют. Хотя мы используем MZBs, метод может быть легко адаптирована для анализа миграции лейкоцитов, который реагирует на силы сдвига потока.

Introduction

Иммунные клетки являются наиболее подвижные клетки в организме человека и часто должны бороться с поперечной силы от крови и лимфы. Однако существует сравнительно мало исследований на сдвиг силы индуцированной миграции лейкоцитов1,2,3,,45. Мы представляем здесь надежный и количественный протокол для анализа реакции иммунной клетки потока в пробирке. Выполнение анализа не требуется изготовление компонентов, и все оборудование и расходные материалы являются коммерчески доступными. В протокол, включая анализ очищения и миграции клеток, может выполняться в один день. Наконец хотя мы описываем миграции маргинальной зоне В-клеток (MZBs), протокол может быть адаптирована для анализа миграции против потока других типов иммунных клеток. Таким образом это возможно использовать этот assay систематически анализировать широкий спектр лейкоциты с панелью всеобъемлющего условий.

MZBs являются население B-клеток, которые, в мыши, находятся только в селезенке и трансфер между интерьер фолликулов и маргинальных зонах6,,78,9. Маргинальные зоны — это слой клеток иммунных клеток примерно 5 – 10 толщиной. Слой клетки окружает фолликулов и состоит главным образом из MZBs и макрофагов, но также инвариантные естественных убийца клеток T (iNKT), дендритных клеток (DCs) и нейтрофилов, среди прочих10. Клетки в маргинальной зоне подвергаются однонаправленный кровотока, возникая от Селезеночной артерии, которые заканчиваются в маргинальных синуса, окружающих фолликула. Кровь течет из отверстия в маргинальных пазухи через краевой зоне и затем собраны в венозные синусы в красной пульпы и восстановлен в циркуляции11. Свободный поток крови моет над MZBs и подвергает их антигенов в крови. MZBs нести антигена в фолликул челночные автоматически между маргинальной зоне и внутри фолликула, который не подвергается крови. Таким образом как MZBs к фолликул, они должны перенести вверх поперечная сила в крови поток12 (Рисунок 1A).

В этом протоколе мы описываем как количественно определить, как иммунной клетки, такие, как MZBs реагировать или нет потока потока в пробирке, для того, чтобы выявить, как они запрограммированы для переноса в естественных условиях. На первом шаге MZBs очищаются от мыши селезенки, используя магнитные бусы, сочетании антитела от коммерчески доступных наборов. Свежевыделенных MZBs представил в колодец слайда потока камеры, разрешено селиться на Интегрин лигандов и воздействию потока миграции буфера с помощью насоса системы (рис. 2A). Клетки отражаются с помощью системы покадровой видео микроскопии. Затем изображения обрабатываются для анализа с бесплатный плагин ImageJ, MTrack213,14, автоматически отслеживать клетки. Треки могут быть количественно затем с бесплатный инструмент Ibidi хемотаксис15 для определения различных параметров, включая скорость прямолинейность и миграции индекс. Эти значения могут использоваться для определения воздействия миграции ингибиторы, стимуляторы клеток, chemokines и других химических веществ, влияющих на миграцию на индуцированного сдвига потока миграции для того чтобы понять силы, контролируя иммунные клетки движение в естественных условиях.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все эксперименты, связанные с использованием животных были ранее одобрены Landesverwaltungsamt Галле (Саксония-Анхальт), Германия, в соответствии с все руководящие принципы медицинского факультета OVGU Университета Магдебурга.

1. MZB клетки очистки

  1. Изолируйте лейкоцитов.
    1. Жертву 8 до 16 недели старая мышь и удаление селезенки16. Отделить селезенки в 5 мл ледяной клеток буфера [фосфат амортизированное saline (PBS) + 0.5% свободных жирных кислот бычьим сывороточным альбумином (БСА)], либо с помощью диссоциатором ткани или аккуратно затирания селезенки через сетку фильтра клеток 70 мкм в скважину на тарелку, 6-а с поршень от шприц 5 мл.
    2. Перевод ячейки в буфер клетки в коническую пробирку 15 мл. Собирайте дополнительные ячейки, добавив еще 5 мл ледяной клеток буфера трубка диссоциатором ткани или сетки нейлона в колодец. Передать дополнительные 5 мл буфера ячейка плюс клетки Конические трубки. Центрифуга на 300 x g 10 мин при комнатной температуре (RT, 20 ° C) и удалить супернатант.
  2. Выполняйте Лизис эритроцитов.
    1. Вновь приостановить Пелле клеток в 1 мл буфера lysis эритроцитов (РБК) (150 мм NH4Cl, 10 мм KHCO3, ЭДТА 0,1 мм), что подогретым RT. добавить еще 1,5 мл буфера lysis РБК и взболтать. Инкубируйте на RT (20 ° C) для в общей сложности 2 мин, включая время, необходимое для повторного приостановить гранулы.
    2. Добавьте 7,5 мл буфера ледяной клеток в суспензии клеток, чтобы остановить lysis. Центрифуга 300 x g и 4 ° C на 10 минут и удалить супернатант.
    3. Вновь приостановить Пелле клеток в 1 мл буфера клеток и добавить дополнительные 9 мл буфера ячейка. Пипетка 10 мл суспензии клеток через разделительный фильтр 30 мкм в новой 15 мл Конические трубки для удаления мусора ячейки.
    4. Центрифуга клетки на 300 x g и 4 ° C на 10 минут и удалить супернатант. Вновь приостановите Пелле клеток в 500 мкл буфера ячейка. Держите клетки холодной на всех последующих этапах процедуры до инкубации в слайды камеры потока.
  3. Очищайте MZBs.
    1. Добавьте 50 мкл антител, биотина в сочетании с коммерчески доступных комплект против всех нежелательных клеток, включая CD43 (на клетки-B), CD4 (на Т-клетки), CD93 (на незрелые клетки) и Ter119 (на эритроцитах), суспензию клеток в коническую пробирку. Встряхнуть или проведите трубки осторожно смешать, но сделать не вихревой клетки. Конические трубки лежала на кровати льда под углом почти плоским и рок в 25 об/мин, 15 мин.
    2. Добавление магнитные бусы, в сочетании с антител анти биотина в суммарный объем 100 мкл суспензии клеток. По-прежнему рок суспензию клеток при 25 об/мин на льду на 20 мин мыть ячейки, добавив 5 мл буфера ячейка, центрифугирование на 300 x g и 4 ° C на 10 мин и отменяя супернатант. Вновь приостановите клеток в 1 мл буфера ячейка.
    3. Разрушающим клетки суспензию клеток магнитные шарик-в сочетании, сохраняя их на магнитной столбца. Отменить помечены клетки (все-B клетки и незрелые клетки B). Собирайте-меченых (клетки зрелых B) в 15 мл Конические трубки, которая была предварительно покрытых с приложением краткого 5 мл буфера ячейка, во избежание неспецифической адгезии к MZBs.
    4. Вымойте суспензию клеток с 5 мл буфера ячейка. Центрифуга 300 x g и 4 ° C на 10 минут и удалить супернатант. Вновь приостановить клетки в 90 мкл буфера клеток и 10 мкл анти CD23-сочетании бусины. Суспензию клеток в рок мягко на льду для 20 минут 25 об/мин.
    5. Вымойте суспензию клеток с 5 мл буфера ячейка. Центрифуга 300 x g и 4 ° C на 10 минут и удалить супернатант. Вновь приостановите клеток в 1 мл буфера ячейка.
    6. Разрушающим клетки суспензию клеток магнитные шарик-в сочетании, сохраняя их на магнитной столбца. Отбрасывать помеченных клеток (фолликулярные клетки B). Соберите-меченых клетки (MZBs), в 15 мл Конические трубки, который предварительно покрытых краткое приложение 5 мл буфера ячейка. Удаление 50 мкл клеток для подсчета и проверка чистоты.
  4. Пятно отсортированный MZBs для проверки чистоты.
    1. Добавить 10% объема (5 мкл) ФК блока в 10 000 ячеек в 50 мкл и Инкубируйте на 4 ° C за 5 мин добавьте 50 мкл буфера ячейки, содержащие 0,3 мкл каждого B220-FITC (0,15 мкг), CD21-PE (0,06 мкг) и CD23-APC (0,06 мкг) в общем объеме 105 мкл (каждое антитело разводят 1: 350) , или любой другой комбинации флуорофоров для различения фолликулярные клетки B и MZBs. пятно клетки на 4 ° C в темноте за 15 мин.
    2. Мойте окрашенных клеток с 1 мл буфера ячейка. Центрифуга 300 x g и 4 ° C на 5 мин и удалить супернатант. Ресуспензируйте в 300 мкл буфера клеток и приобрести образцы с использованием проточный цитометр и стандартные методы. Ворота на живой лимфоцитов, затем на B220+ клетки и наконец на CD23низкой CD21высокой клеток (рис. 1B).
      Примечание: Процедура обычно дает 500 000 MZBs за Хандра мыши C57B/6.
  5. Подготовка MZBs для потока миграции.
    1. Мыть очищенный MZBs один раз в 1-2 мл холодного миграции буфера [Hanks сбалансированного солевого раствора (HBSS) содержащий катионы, 10 мм Hepes, 0,2% свободных жирных кислот BSA], чтобы гарантировать, что буфер катион содержащих миграции не разбавлена остаточного катион бесплатная буфер PBS. Центрифуга 300 x g и 4 ° C на 10 минут и удалить супернатант. Вновь приостановите MZBs в холодных миграции буфера к концентрации 50 000 MZBs за 30 мкл (эквивалент на сумму, загруженной в одной скважины потока камеры слайда).
      Примечание: Свежевыделенных MZBs должны использоваться как можно скорее. Однако они по-прежнему способны миграции до 8 час или больше после начала эксперимента для до тех пор, как они хранятся на льду. Оптимальной температуры должны быть проверены на других типов клеток. Например она может быть лучше держать культивируемых клеток T при 37 ° C до начала миграции.

2. поток эксперимент

  1. Герб слайды с Интегрин лиганда.
    1. За день до этого эксперимента, оттепель Алиготе ИКАМ-1 (400 мкг/мл). Разбавьте ИКАМ-1 на коэффициент 1:80 в PBS до конечной концентрации 5 мкг/мл. 30 мкл ИКАМ-1, в одной камере на слайде потока для каждого фильма миграции требуется. Инкубируйте слайд в влажной камере при температуре 4 ° C на ночь.
      Примечание: Каждый слайд содержит 6 камер и до 8 фильмов в одном сеансе может быть легко записан.
  2. Блокировать покрытием скважин.
    1. В день эксперимента мыть палата, добавив 100 мкл PBS одной скважиной и снятия 100 µL из других хорошо камеры. 100 мкл блокировки буфера (2% BSA свободных жирных кислот в PBS) к камере и инкубировать слайд в камере влажного в РТ за 1,5 часа.
    2. Вымойте палата, добавив 100 мкл PBS одной скважиной, снятия его с другими хорошо, а затем добавлять 100 мкл миграции буфера в палату. Храните слайды в камере влажного на RT до эксперимента.
  3. Подготовьте устройство fluidics.
    1. Подключите в жидкости насос, Прикрепите блок fluidics и включите насос программного обеспечения. Промойте трубы с 5 – 10 мл буфера миграции, а затем добавить 11.7 мл буфера миграции одинаково в обоих водохранилищ и удалить пузырьки воздуха.
    2. Хомут трубы около 10 см от разъем кусок. Место аэрогидродинамических подразделение в камере с подогревом инкубации на микроскопе.
    3. Установка выбор слайдов «VI 0,4 мкг слайд» и НКТ «белый» в программном обеспечении. Установите желаемый касательное напряжение (например, 4 dyn см-2). Установите время съемки до 30 мин.
    4. Задайте коэффициент калибровки трубки, определяя скорость потока через трубку в мл/мин измерения времени, необходимого для 2 мл буфера потока из одного резервуара в другой и разделите на 2. Сделайте по крайней мере 4 измерения для точности. Используйте фактического расхода для задания нужного расхода и напряжение сдвига, введя значения в программное обеспечение насоса.
  4. Подготовка изображений системы.
    1. Предварительно теплой камеры микроскопа инкубации, fluidics подразделение и миграции аликвоты буфера до 37 ° C (рис. 2B). Тест, оптимизированных насоса, обеспечивая что буфере миграции потоков и обратно в водохранилищах и что есть нет воздуха пузыри в системе.
  5. Тензометрические силоизмерители на слайде.
    1. Чистота в нижней части слайда с этанолом смоченной ткани. 30 мкл суспензии клеток в одну скважину камеры и вывести 30 мкл из других хорошо. Инкубируйте слайд с крышкой на чтобы предотвратить испарение при 37 ° C за 30 минут, чтобы позволить клетки для присоединения.
    2. Медленно добавьте буфер подогретым миграции каждой скважины потока камеры слайд пока положительных мениска поднимается из скважины и удалить все пузырьки воздуха с кончиком пипетки.
  6. Прикрепите слайд к блоку fluidics.
    1. Зажим на слайд, чтобы микроскопа. Удалить немаркированных сторону аэрогидродинамических труб из куска соединителя и заполнить до конца с миграции буфера до тех пор, пока положительных мениска без воздушных пузырьков поднимается из конца.
    2. Флип конец трубы над и вставьте его в топ скважины потока камеры, зачистка пролитой буфер с ткани. Сохраняя трубы зажат, повторите процедуру для помеченной конец трубки.
  7. Изображение клетки.
    1. Переключатель тепловизионные системы «Live», чтобы установить фокус на клетки. Выберите поле зрения, которая находится в середине слайда. Де фокус клетки слегка расширить черный контур ячейки и производят белый интерьер, который затем может быть показатели круглые черные клетки формы на белом фоне для использования с программой автоматизированного отслеживания.
    2. Запустить программу последовательности изображений и запись 1 изображения каждые 5 s 30 мин, с использованием 10 x сухой цели. Снимите скобу из труб и включите насос, то не сторонник клетки будет смыть и адэрентных клеток начинают мигрировать. Изображение для 30 минут или больше с помощью 10 x цели или выше, как хотелось. Этикетки и сохранить фильм.
  8. Отсоедините аэрогидродинамических подразделение из слайда.
    1. В конце программы обработки изображений, сброс насос для следующий эксперимент: повторно прикрепить зажим для трубки, удалить труб из слайда, заново подключите разъем кусок, откройте зажим и использовать ручное управление насоса нажать несколько мл буфера от одного резерв OIR на другую, чтобы удалить пузырьки воздуха. Повторно присоедините зажим и заложить зажимается труб на микроскопа для следующего фильма.
      Примечание: Протокол может быть приостановлена на неопределенный срок здесь. Если с использованием ингибитора или модификатор миграции клеток, в зависимости от способа его действий, добавьте его, либо суспензию клеток, прежде чем поселиться в зале миграции или миграции буфер в блоке аэрогидродинамических.

3. Миграция трек анализ

Примечание: Клетки могут быть отслежены автоматически с помощью плагина MTrack2 или вручную с использованием отслеживания руководство плагин17. Автоматическое отслеживание хорошо работает с MZBs, потому что эти клетки в основном раунде и оставаться таким образом во время миграции, что делает его легко порог изображение клетки объектам черный на белом фоне. Автоматическое отслеживание является более сложным, если другие типы клеток используются, такие как искусственного, активированный CD8 + Т-клеток, потому что эти клетки растянуть во время миграции и стать несколько прозрачным, что делает его трудно определить края. В этом случае либо (1) клетки могут быть окрашены с внутри жизненно Люминесцентную краску для получения изображений, которые могут быть показатели, чтобы показать объекты черный на белом фоне, или (2) другие программы, чтобы наметить клетки, такие как изображения сегментации и/или edge обнаружения может быть используется. Ручного отслеживания является полезным вариантом при производстве высокой контрастности изображения клетки контуров не возможно.

  1. Выполнение ручного отслеживания с помощью плагина.
    1. Установить плагин «Руководство отслеживания» в ImageJ и откройте фильм в ImageJ. В меню «Руководство отслеживания» выберите «Добавить новый трек». Нажмите кнопку центр ячейки как фильм достижений автоматически фрейма. Если ячейка была выбрана в каждом кадре, выберите «Добавить новый трек» начать после новой ячейки.
    2. После того, как записаны, скопируйте результаты вывода в таблицу данных. Измените формат для десятичных отображения для всех ячеек таблицы в ноль места после десятичной запятой. Сохраните файл как «стоп отделенный вкладка» txt-файл для последующего анализа.
      Примечание: Как правило 50-100 клеток отслеживаются, который занимает около 1 ч для завершения для 20 минут фильма около 240 кадров.
  2. Выполните автоматическое слежение с помощью плагина MTrack2. Скачать и установить плагин kt MTrack2 согласно инструкции в файле (см. дополнительное кодирование файла).
    1. Порог изображения из фильма миграции клеток. Откройте стек изображений в ImageJ. Процесс изображения в ImageJ с конвертировать видео от цвета высокой контрастности изображения показаны клетки как черные объекты на белом фоне (Рисунок 3А).
      1. Резкость изображения дважды, очищать изображения и конвертировать изображения в 8 бит. Выберите «изображение | Отрегулируйте яркость/контрастность» подменю и положил ползунок Контрастность на максимальный контраст, а затем клетки будет отображаться как белых объектов на черном фоне. Выберите «изображение | Настройка порога» подменю чтобы убедиться, что клетки появляются как черные объекты на белом фоне.
    2. Запуск автоматического ячейки отслеживания плагин «MTrack2 КТ» (см. Дополнительное кодирование файла). Установите следующие параметры в экране параметры.
      1. Задайте размер частиц, минимум на 1 пиксел и размер частиц максимум на 30 пикселов для MZBs.
      2. Для скорости (максимальное расстояние между 2 частиц на последовательных кадрах фильма) Если высока плотность клеток на слайде, это значение низко, чтобы избежать трек «прыгать» из одной ячейки в другую. Для MZBs, установите это значение на 10 пикселов для захвата останцы, хотя MZBs, как правило, не будет превышать 2 пикселей на последовательные кадры, которые 5 s друг от друга.
      3. Для минимальное количество кадров, которые частицы должен присутствовать отслеживаться, установите это значение на количество кадров в фильме для MZBs (например, 240) за 20 минут фильма с 12 кадров/мин. Однако если клетки достаточно быстро, чтобы оставить поле зрения до конца изображений, затем задайте минимальное количество кадров на меньше, чем продолжительность фильма. Например с быстро Т-клеток, задайте минимальное количество на эквивалент 5-10 мин изображений.
        Примечание: Запись макроса этих шагов (порог и MTrack2-КТ), для автоматизации этой части процедуры и сэкономить время (см. Дополнительное кодирование файла). Использование макроса для автоматического отслеживания фильм в ImageJ занимает меньше чем за минуту.
    3. Скопируйте результаты в таблицу данных. Измените формат для десятичных отображения для всех ячеек таблицы в ноль места после десятичной запятой. Добавить пустую строку в верхней части ячейки треков в электронную таблицу и удалить столбец «D». Сохраните файл как «стоп отделенный вкладка» txt-файл для последующего анализа в средстве Ibidi хемотаксис.
      Примечание: MTrack2 плагин выводит треков ячейки в строках 75 параллельных колонках. Для анализа в средстве хемотаксис Ibidi должны быть треков ячейки в одном столбце. Чтобы преобразовать вывод, MTrack2 плагин был изменен для вывода либо в оригинальном формате или как один столбец (рис. 3B) (см. Дополнительное кодирование файла «MTrack2 kt», который написан на Java). Скопируйте файл .java в папку плагинов ImageJ. В ImageJ выберите «Плагины > скомпилировать и запустить». ImageJ перезапуска и измененная версия MTrack2 должен появиться в меню плагинов.
  3. Для анализа клеток треков с помощью инструмента Ibidi хемотаксис, скачать Ibidi хемотаксис и средство миграции v2.0 («самостоятельных») и откройте программу.
    1. Выберите «Импорт данных» и перейдите к файлам .txt, трек клетки. Несколько файлов могут быть выбраны в то же время. Импортированные файлы отображаются на панели «Наборы данных» в красном. Выбрать все из них и ввести правильные значения в «Инициализация» меню ниже, чтобы применить следующие параметры.
    2. Введите точное число или диапазон число срезов (количество кадров в фильме).
    3. В меню калибровки (X / Y калибровка), введите размер пикселя. Найти эту информацию в файле свойств фильма. Для MZBs был использован 10 x цель, давая размер пикселя 1.14 мкм. В «меню калибровки | Интервал времени», введите интервал времени между кадрами в фильме.
    4. Примените настройки. Выберите «Диаграмма» для просмотра трек участков и подтвердить, что трек файлы будут открыты. С этого момента много вариантов, которые описаны в документации по программе, включая маркировку треки с разными цветами на основе различных свойств и отображение индивидуальных или среднего значения для скорости, вперед миграции Индекс, непосредственность и более (рис. 3B).
      Примечание: MZBs принимать до обнаруживать и реагировать потока, предположительно, поляризационный их Интегрин комплексов к точке потока вперед ячейки около 10 мин. График индекса миграции с течением времени покажет первоначальный падение ниже нуля, соответствует первые пару минут что клетка подвергается воздействию потока, следуют постепенный подъем вверх до тех пор, пока значения индекса вперед миграции являются положительными. Таким образом это может быть оптимальным, чтобы исключить эти первые минуты в окончательные расчеты, если этот процесс не имеет интерес.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Мы использовали протокол, описанные выше для сравнения миграции MZBs на слайдах ИКАМ-1-покрытием без потока (0 Дин/см2) и подвергается сдвига потока (4 Дин/см2). Клетки были автоматически отслеживаются с MTrack2 и в результате трек, что файлы были обложил на фильмы миграции клеток не потока (0 Дин/см2) и (4 Дин/см2), чтобы показать распределение и форма треков (рис. 4A). Затем ячейки треков были импортированы в Ibidi хемотаксис инструмент (ИКТ) для создания трека участки каждого фильма (рис. 4В). Средняя миграции индекс (так называемый «FMIy» в ИКТ), скорость, прямолинейность, (так называемый «непосредственности» в ИКТ) и прямой расстояние (так называемый «Евклидово расстояние» в ИКТ) клеток треков из 4 фильмов, каждый для оба условия были рассчитаны в Хемотаксис инструмент, с помощью команды «измеренные значения». Эти средние значения были затем копируются в GraphPad Призма для создания графов и расчета статистической значимости (рис. 4 c).

Figure 1
Рисунок 1: MZB челночные. (A) модель MZB, курсируя между маргинальной зоне и фолликула в селезенке. MZBs требует интернализации S1PR1, рецептор S1P и функциональных CXCR5, рецептор для CXCL13 хемокиновых, чтобы ввести фолликула. Кроме того чтобы достичь фолликула, MZBs необходимо перенести против силы потока крови, вытекающих из поры в маргинальных синуса, что окружает фолликулов. Если MZB теряет адгезию к ИКАМ-1, лигандом для Интегрин LFA-1, он помещается в красной пульпы сила потока, где увеличение количества VCAM-1, лигандом для VLA-4, не поддерживает миграцию. (B) проточной цитометрии стробирования стратегии для проверки чистоты отсортированы с использованием антител против B220, CD23 и CD21 MZBs. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2: Установка камеры системы, насос, микроскоп и инкубации fluidics. (A) изображение системы насоса (Ibidi18) состоящий из насоса с подключенным fluidics подразделение и ноутбук работает программное обеспечение для управления насосом. Высокое увеличение изображения: потока камеры слайд с 6 потока камер, первый из которых прилагается к труб fluidics единицы. (B) типичная установка для измерения в пробирке миграции MZBs против потока. Микроскоп оснащен нагревательной камеры (черный ящик), содержащий блок fluidics подключен к насоса (голубой квадратный объект в нижнем правом углу микроскопа) за пределами микроскопом. Высокое увеличение изображения: fluidics подразделение внутри Отопление камеры микроскопа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3: количественная оценка визуализации данных. (A) представитель изображения кадра из фильма миграции MZBs до (слева) и после (справа) порога на изображение, чтобы преобразовать ячейки в черные объекты на белом фоне. В обоих изображений низкого и высокого увеличения масштабируемости баров = 100 µm. (B) левой панели: изображение типичные результаты вывода из плагина MTrack2 (выход один столбец). Правая панель: изображение Ibidi хемотаксис и миграции 2.0 инструмента после ввода MTrack2 результаты показаны трек участок переноса MZBs и «измеренных значений» окно показаны средние значения параметров, включая скорость, индекс миграции и прямоту ( зеленые коробки), среди других. Калибровочные параметры включают пикселей 1.14 мкм на пиксель и временной интервал 5 s (0,083 мин) за кадр фильма. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4: пример результатов, используя протокол для измерения MZB челночные. (A) представитель кадры из миграции MZBs с накладкой треков из плагинов ImageJ «MTrack2 kt». Примечание: цвет трека были произвольно установленных «Руководство отслеживания» плагин для ImageJ. В обоих вставок низкого и высокого увеличения масштабируемости баров = 100 µm. (B) представитель трек участки перехода MZBs от Ibidi хемотаксис и миграции 2.0 инструмент. Красные и черные линии представляют клеток треков, которые завершают ниже или выше горизонтальной оси, соответственно. В (A) и (B): слева, MZBs, миграция с нет потока (0 Дин/см2); право, MZBs, переход к потоку 4 Дин/см2 . (C) миграции индекс (FMIy), скорость, прямолинейность (прямого) и расстояние для миграции с без MZBs поток (0 Дин/см2) или потока (4 Дин/см2) (n = 4 мышей в 4 отдельных экспериментов). Планки погрешностей = среднее ± SD; T -тест студента, ** p < 0.01, *** p < 0,001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Дополнительный файл 1: MTrack2_kt.java. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.  

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Здесь мы описываем метод для анализа миграции клеток, которые обнаружить силы сдвига потока и реагировать, не изменяя их миграции. Анализ MZBs показал, что MZBs спонтанно мигрируют на ИКАМ-1 и в присутствии потока, будет мигрировать вверх поток. В нашей предыдущей работы мы показали, что MZBs не переносить вверх поток VCAM-1, но вместо этого остаются зафиксированными на месте. Мышиных селезенки маргинальной зоне содержит главным образом ИКАМ-1, а красная мякоть ИКАМ-1 и VCAM-1. Из этих данных можно сделать вывод, что MZBs будет мигрировать вверх поток во время в маргинальной зоне, но не в красной пульпы. Анализ был апробирован в естественных условиях, с использованием MZBs с дефектных адгезии, которые были mislocalized селезеночной красной пульпы в силу поток12. По этим причинам MZBs представляют собой хороший положительный контроль для тестирования потока миграции системы, описанные здесь, даже если система используется для изучения типа различных ячеек.

Наиболее важным аспектом процедуры является обеспечение согласованности в ячейке, обработка на слайде. Потому что количественные аспекты миграции клеток зависит от степени к которому клетки присоединиться к слайду, любое уменьшение клеточной адгезии затруднит воспроизводимость результатов. Снижение клеточной адгезии может произойти в результате несоответствия в многочисленных факторов, включая температуры миграции буфера или поле с подогревом инкубации (холодной уменьшает адгезию), уровни катионов в суспензию клеток (катионы влияет на Интегрин привязки), слайд обработки (касания или изгибу слайд может выбить клетки) и клеточной плотность (столкновений между ячейками могут повлиять на параметры миграции). Другие чувствительные точки во время процедуры включают в себя не закупорить буфер в слайд скважины с слишком много сил до присоединения трубки (как это может уменьшить клеточной адгезии) и сохраняя время, необходимое для протокола шаги последовательно в каждом эксперименте ( отстойные время клеток может повлиять на адгезию). Таким образом любое возможное влияние на клеточной адгезии должны храниться несогласованной повторений производить надежные ячейки данных миграции.

Этот метод прост в настройке, так как он использует имеющееся оборудование и материалы и ни один из шагов требуется расширенный обучение. Для анализа MZB, а также другие типы клеток, таких как искусственный CD8+ T клетки, покрытие слайды с различных лигандов Интегрин достаточно наблюдать поток миграции. Изучение миграции потока индуцированной ответ на различных лигандов Интегрин приводит к прямой идентификации активного интегринов на поверхности клетки, возможно выявление механизмов, имеющих отношение к в естественных условиях функции как с MZB миграции потока на ИКАМ-1, но не VCAM-1. Однако это также возможно добавить слой эндотелиальных клеток в поток камеры. Одним из примеров миграции иммунных клеток, которая зависит от сдвига потока является Т-клеток кровоподтек через эндотелиального слоя3. Эта процедура была использована для разгадать активации Т клеточной адгезии через интегринов, селектинов и chemokines и модель миграцию лимфоцитов через гематоэнцефалический барьер. Единственным ограничением для клетки, которые могут быть проанализированы с помощью этого метода является, что они должны быть в состоянии чувство силы потока как сигнал, направленный.

Хотя метод конспектированный здесь используется для характеристики сотовых поведения, такие как скорость и поворачивая, он может также распространяться на анализ молекулярных аспектов миграции. Молекулярные комплексы отношение к поток индуцированной миграции, включая интегринов как LFA-1 и их цитоскелета адаптеров, будет находиться в пределах 200 Нм поверхности слайда, поддаются визуализации с TIRF микроскопии. Это дополнение к методу будет идеально подходит для изучения клеток от мышей с мутациями в связанных с Интегрин или цитоскелета белков. Как многие иммунные клетки мигрировать на различных этапах их развития посредством крови или лимфы потоков, описанные в пробирке миграции может использоваться для систематически испытания многих видов культивируемых или первичной лейкоцитов для реагирования на поток и показывают, как клетки запрограммирован, чтобы мигрировать в иммунный ответ в естественных условиях. В заключение проба, описанные здесь обеспечивает надежный и простой метод для анализа потока индуцированной миграции MZBs, которые также может быть распространено на другие типы клеток.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют никаких конфликтов интересов раскрыть.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана грантов от «Deutsche Forschungsgemeinschaft» SFB 854/TP11 K.-д.ф.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
VWR Cell Strainer, 70 µm VWR 10199-656
Pre-Separation Filters, 30 µm Miltenyi 130-095-823
MZB and FOB cell isolation kit Miltenyi 130-100-366
B220 CD45R, clone RA3-6B2, FITC Biolegend 103206
CD21 / CD 35, clone 7G6, APC BD Biosciences 558658
CD23, clone B3B4, PE Biolegend 101608
HBSS Biochrom L2035
D-PBS 1x Gibco by Life Technologies 14190-094
BSA albumin fraction V, fatty acid-free Roth "0052.3"
ICAM-1 R&D Systems 796-IC-050
Ibidi µ-slides VI 0.4, hydrophobic, uncoated Ibidi 80601
Perfusion set, white, 50 cm, 0.8 mm Ibidi 10963
Ibidi Pump system Ibidi 10902

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Alon, R., Ley, K. Cells on the run: shear-regulated integrin activation in leukocyte rolling and arrest on endothelial cells. Current Opinions in Cell Biology. 20 (5), 525-532 (2008).
  2. Dominguez, G. A., Anderson, N. R., Hammer, D. A. The direction of migration of T-lymphocytes under flow depends upon which adhesion receptors are engaged. Integrative Biology (Cambridge). 7 (3), 345-355 (2015).
  3. Steiner, O., et al. Differential roles for endothelial ICAM-1, ICAM-2, and VCAM-1 in shear-resistant T cell arrest, polarization, and directed crawling on blood-brain barrier endothelium. Journal of Immunology. 185 (8), 4846-4855 (2010).
  4. Valignat, M. P., Theodoly, O., Gucciardi, A., Hogg, N., Lellouch, A. C. T lymphocytes orient against the direction of fluid flow during LFA-1-mediated migration. Biophysical Journal. 104 (2), 322-331 (2013).
  5. Woolf, E., et al. Lymph node chemokines promote sustained T lymphocyte motility without triggering stable integrin adhesiveness in the absence of shear forces. Nature Immunology. 8 (10), 1076-1085 (2007).
  6. Cinamon, G., et al. Sphingosine 1-phosphate receptor 1 promotes B cell localization in the splenic marginal zone. Nature Immunology. 5 (7), 713-720 (2004).
  7. Cinamon, G., Zachariah, M. A., Lam, O. M., Foss, F. W., Cyster, J. G. Follicular shuttling of marginal zone B cells facilitates antigen transport. Nature Immunology. 9 (1), 54-62 (2008).
  8. Cyster, J. G., Schwab, S. R. Sphingosine-1-phosphate and lymphocyte egress from lymphoid organs. Annual Reviews in Immunology. 30, 69-94 (2012).
  9. Schwab, S. R., Cyster, J. G. Finding a way out: lymphocyte egress from lymphoid organs. Nature Immunology. 8 (12), 1295-1301 (2007).
  10. Cerutti, A., Cols, M., Puga, I. Marginal zone B cells: virtues of innate-like antibody-producing lymphocytes. Nature Reviews Immunology. 13 (2), 118-132 (2013).
  11. Mebius, R. E., Kraal, G. Structure and function of the spleen. Nature Reviews Immunology. 5 (8), 606-616 (2005).
  12. Tedford, K., et al. The opposing forces of shear flow and sphingosine-1-phosphate control marginal zone B cell shuttling. Nature Communications. 8 (1), 2261 (2017).
  13. ImageJ. MTrack2. , Available from: https://imagej.net/MTrack2 (2018).
  14. MTrack2. , Available from: https://valelab4.ucsf.edu/~nstuurman/IJplugins/MTrack2.html (2018).
  15. ibidi. Chemotaxis and Migration Tool. , Available from: https://ibidi.com/chemotaxis-analysis/171-chemotaxis-and-migration-tool.html (2018).
  16. Reeves, J. P., Reeves, P. A. Removal of lymphoid organs. Current Protocols in Immunology. , Chapter 1 (Unit 1.9) (2001).
  17. ImageJ. Manual Tracking. , Available from: https://imagej.nih.gov/ij/plugins/manual-tracking.html (2018).
  18. ibidi. ibidi Pump System. , Available from: https://ibidi.com/perfusion-system/112-ibidi-pump-system.html. (2018).

Tags

Иммунология и инфекции выпуск 141 клетки B маргинальные зоны миграции наклон потока интегринов адгезии Межмицеллярная молекула-1 (ICAM-1) сосудистый клеток молекулы адгезии-1 (VCAM-1)
Анализ миграционных потока индуцированного сдвига мышиных маргинальные зоны B клеток In Vitro
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tedford, K., Tech, L., Steiner, M.,… More

Tedford, K., Tech, L., Steiner, M., Korthals, M., Fischer, K. D. Analysis of Shear Flow-induced Migration of Murine Marginal Zone B Cells In Vitro. J. Vis. Exp. (141), e58759, doi:10.3791/58759 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter