Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Bakterilerde inorganik polifosfat için raporlaması

Published: January 21, 2019 doi: 10.3791/58818
Automatic Translation
1, 2, 2, 1
1Department of Microbiology, University of Alabama at Birmingham, 2Division of Infectious Diseases, University of Alabama at Birmingham

Summary

İnorganik polifosfat, gram pozitif, gram-negatif ve Mikobakteriyel türler de dahil olmak üzere çeşitli bakterilerde hızlı miktar için basit bir yöntem açıklanmaktadır.

Abstract

İnorganik polifosfat (polip) yaşamın tüm etki alanları arasındaki bulundu biyolojik bir polimerdir ve virülans ve stres yanıt olarak birçok bakteri için gereklidir. Sayısal polip Biyolojik materyallerde, emek yoğun ya da duyarsız, kullanışlılığı sınırlama birçoğu için yöntemler vardır. Burada bakteri, polip miktar için akıcı bir yöntem birden çok örnekleri, polip polip özgü exopolyphosphatase ScPPX ile sindirim ve tespiti hızlı işlem için optimize edilmiş bir silika membran sütun çıkarma kullanarak mevcut hassas bir askorbik asit tabanlı kolorimetrik yöntemi ile elde edilen ücretsiz fosfat. Bu yordamı basit, ucuz ve güvenilir polip miktar farklı bakteriyel türler sağlar. Biz temsilcisi polip miktar gram-negatif bakteri (Escherichia coli), gram-pozitif laktik asit bakteri (Lactobacillus reuteri) ve Mikobakteriyel türler (Mycobacterium smegmatis) mevcut. Biz de şu anda ticari olarak kullanılabilir durumda değilse nikel benzeşme arıtma ScPPX, mg miktarlarda için basit bir protokol içerir.

Introduction

İnorganik polifosfat (polip) hayat1,2,3tüm etki alanlarında bulunan doğrusal bir biyopolimer fosfat phosphoanhydride bağlı birimlerin var. Çeşitli bakteri, polip stres tepkisi, hareketliliği, biyofilm oluşumu, hücre döngüsü kontrol, antibiyotik direnci ve virülans4,5,6,7,8 için önemlidir ,9,10,11. Bakteri metabolizmasında polip çalışmaların bu nedenle hastalığa neden ve farklı ortamlarda gelişirler için bakteri yeteneğini temel anlayışlar verim potansiyeline sahip. Birçok durumda, ancak, bu çalışmalarda kısıtlayıcı bir faktör bakteri hücreleri içinde sayısal polip için kullanılabilen yöntemleri vardır.

Şu anda Biyolojik materyallerde polip düzeylerini ölçmek için kullanılan çeşitli yöntemler vardır. Bu yöntemler genellikle iki farklı adımları içerir: polip ayıklanması ve polip miktarının mevcut bu özler. Maya Saccharomyces cerevisiae Bru ve meslektaşları12, özleri polip yanı sıra DNA ve RNA fenol kullanarak tarafından geliştirilen geçerli altın standart yöntem ve kloroform, etanol yağış, tedavi ile takip deoksiribonükleaz (DNaz) ve ribonükleaz (RNase) ve sonra kullanarak sayısal ücretsiz fosfat verim S. cerevisiae polip aşağılayıcı enzim exopolyphosphatase (ScPPX)-13 ile elde edilen arıtılmış polip sindirim bir malakit Renkölçer tahlil yeşil tabanlı. Bu yordamı son derece nicel ama emek yoğun, tek bir deneyde işlenebilir ve bakteriyel örnekleri için optimize edilmemiştir örneklerini sayısını sınırlama. Diğerleri polip hücre ve dokuların silis boncuk ("glassmilk") veya silis membran sütunları6,14,15,16,17kullanarak çeşitli ayıklama bildirdin, 18. Bu bakteriler, genellikle öncelikle sentezlemek için düşünülen için daha az endişe olmasına rağmen bu yöntemleri verimli bir şekilde kısa zincir polip (az 60 fosfat adet)12,14,15, ayıklamak değil uzun zincirli polip3. Polip asidik koşulları12altında kararsız olduğundan polip ekstraksiyon kuvvetli asit19,20 kullanarak eski yöntemler artık yaygın olarak kullanılmaktadır.

Ayrıca sayısal polip için bildirilen yöntemler vardır. En ' 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), genellikle DNA leke için kullanılan bir floresan boya daha yaygındır. DAPI-polip kompleksler farklı floresan uyarma ve emisyon maxima DAPI-DNA komplekslerinde21,22daha var ama diğer hücresel bileşenleri, RNA, nükleotit ve inositol de dahil olmak üzere önemli girişim yapmaktadır özgüllük ve polip ölçümleri bu yöntem kullanılarak yapılan duyarlılığını azaltarak fosfatlar12,15,16,23. Alternatif olarak, polip ve adenozin nükleotittir (ADP) adenozin arıtılmış Escherichia coli kullanarak trifosfat (ATP) dönüştürülebilir polip kinaz (PPK) ve luciferase14,17 kullanarak sayısal sonuç ATP ,18. Bu polip çok az miktarda algılanmasını sağlar, ancak iki enzimatik reaksiyon adımları ve hem biyoluminesans hem de çok saf ADP, pahalı reaktifler olan gerektirir. ScPPX, özellikle digests polip ücretsiz fosfat6,12,13,daha basit yöntemleri ama ScPPX kullanarak tespit24, içine DNA ve RNA12tarafından inhibe DNaz ve RNase tedavi gerektiren polip içeren ayıklar. Ne PPK ne de ScPPX ticari olarak mevcut, ve PPK arıtma oldukça karmaşık25,26.

Polip hücre lysates veya özleri de polyacrylamide jeller üzerinde27,28,29,30, zincir uzunluğu değerlendirilmesi izin vermez, ancak bir yöntem boyama negatif DAPI tarafından görüntülenmeyecektir düşük işlem hacmi ve kötü nicel.

Biz şimdi polip hızlı miktar seviyelerinde farklı bakteri türleri sağlar bir hızlı, ucuz, orta-den geçerek polip tahlil raporu. Bu yöntem, 4 M guanidin isothiocyanate (GITC)14 95 ° C'de bakteri hücreleri hücresel fosfatazlar, birden fazla örnekleri hızlı işlem için optimize edilmiş bir silika membran sütun çıkarma ardından devre dışı bırakabilirsiniz için lysing tarafından başlar. Elde edilen polip içeren özü sonra DNaz ve RNase muamele için ihtiyacını ortadan kaldırarak ScPPX, büyük bir fazlalığı ile sindirilir. Biz basit nikel benzeşme arıtma ScPPX miktarda mg için bir iletişim kuralı içerir. Son olarak, ücretsiz fosfat polip kaynaklı basit, hassas, askorbik asit tabanlı Renkölçer tahlil24 ile sayısal ve toplam hücresel protein için normalleştirilmiş. Bu yöntem polip bakteri hücreleri içinde ölçümü akıcılık ve biz kullanımı gram-negatif bakteriler, gram-pozitif bakteri ve mikobakteriler temsilci türleri ile göstermek.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. arındırıcı Maya Exopolyphosphatase (ScPPX)

  1. E. coli protein overexpression gerilme BL21(DE3)31 plazmid pScPPX26 Elektroporasyon32 veya kimyasal dönüştürme33tarafından dönüşümü.
  2. Lysogeny suyu (LB) bir 2 L unbaffled şişesi ile pScPPX2 içeren BL21(DE3) bir koloni içinde 100 µg mL-1 ampisilin içeren 1 L aşılamak ve gecede 37 ° C'de, 600 bir absorbans için sallayarak olmadan kuluçkaya nm (bir600) yaklaşık 0.3, spektrofotometre içinde ölçülen.
  3. (180 rpm) sallayarak kültür başlatmak ve zaman zarfında hücreleri bir A600 itibaren 0.4 - için büyür 37 ° C'de 30 dk için kuluçkaya 0,5.
  4. İzopropil β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) 1 mM ve bir ek 100 µg mL-1 ampisilin son bir konsantrasyon ekleyin, sonra 37 ° C 180 rpm'de sallayarak ile 4 h için kuluçkaya.
    Not: Bu overexpression Protokolü çözünür ScPPX büyük miktarda oluşturur. Ancak, ScPPX overexpression çok bağışlayıcı ve diğer genel protein overexpression protokollerini çeşitli başarıyla ScPPX arındırmak için kullanılmıştır.
  5. Hücreleri bir 1 L santrifüj biberondan aktarmak ve bunları 5000 x g 4 ° C'de 20 min için centrifuging tarafından hasat Ve hücre Pelet 50 mL konik tüp transfer süpernatant çıkarın.
    Not: Hücre topakları süresiz olarak-80 ° C'de saklanabilir
  6. Pelet buz çözme, sonra 50 mm HEPES 9 mL, 0.5 M NaCl ve 5 mM imidazole (pH 8) toplam hacmi yaklaşık 10 mL için resuspend.
  7. (Son konsantrasyonları) 1 mg mL-1 lizozim, 2 mM MgCl2ve 50 adet mL-1 , RNA ve DNA onur kırıcı bir endonükleaz ekleyin ( Tablo malzemelerigörmek) ve buz üzerinde 30 dk için kuluçkaya.
    Not: ScPPX nükleik asitler (veri) gösterilmez, bağlar nükleaz tedavi arıtma sırasında bu nedenle esastır.
  8. Bir sonicator bir microtip ile kullanarak (bkz. Tablo reçetesi) sonication on Ice 5 darbe % 50 güç 2 döngüleri tarafından hücreleri parçalayıcı s 2 dk dinlenme döngüleri arasında ile kapalı, açık ve 5 s.
    Not: uygun işitme koruma sonication sırasında kullanın. Benzer şekilde overexpression ile durum için çeşitli hücre lizis Yöntemler ScPPX arıtma için kabul edilebilir.
  9. Lysate, 20.000 x g 4 ° C'de 20 dk centrifuging tarafından çözünmez enkaz kaldırma Elde edilen süpernatant (yaklaşık 10 mL) 0.8 µm gözenek boyutu selüloz asetat şırınga filtre ile filtre.
  10. Lysate bir nikel-ücret 5 sütun şelat mL üzerine yük ( Tablo malzemelerigörmek) peristaltik pompa ya da büyük bir şırınga kullanarak.
  11. Sütun 50 mL 50 mM HEPES, 0.5 M NaCl, 5 mM imidazole (pH 8) ile yıkayın.
  12. Sütun 50 mL 50 mM HEPES, 0.5 M NaCl, 20 mM imidazole (pH 8) ile yıkayın.
  13. ScPPX ile 50 mM HEPES, 0.5 M NaCl ve 0,5 M imidazole (pH 8), toplama 15 1 mL kesirler elute. Protein ile Bradford protein tahlil34 içerik için bu elüsyon kesirler test ( Tablo malzemelerigörmek) ve hangi kesirler arıtılmış ScPPX içeren onaylamak için bir SDS-sayfa jel35 çalıştırın (Moleküler ağırlığı 45 kDa =).
  14. Saf ScPPX içeren kesirleri havuz ve 50 mM HEPES ile yaklaşık 2 mg mL-1 ve 0,5 M NaCl havuza alınan protein konsantrasyonu ayarlayın. Yüksek protein konsantrasyonları sonraki adımda çökelti.
  15. Saf ScPPX depolama arabellek (20 mM Tris-[pH 7,5], HCl 50 mM KCl, %10 [v/v] gliserol) diyaliz tarafından değişimi. Havuza alınan ScPPX kesirler 12.000-14.000 Da moleküler ağırlık kesme diyaliz membran ( Tablo malzemelerigörmek) boru, mühürlü bir uzunluğu yerleştirin ve depolama arabellek en az 4 h yinelemek için bu adımı ile taze ile sürekli karıştırarak 4 ° C'de 1 L askıya 3 arabellek değişiklikleri toplam depolama arabellek.
  16. Arıtılmış, diyaliz protein bir santrifüj tüpü ya da tüpler ve 20.000 x g 4 ° C'de herhangi bir çözünmez toplamları kaldırmak için de 20 dk santrifüj aktarın. Dikkatle süpernatant temiz 15 mL konik tüp aktarın.
  17. Ayarlamak için 1 mg mL-1 depolama arabellek ile arıtılmış ScPPX konsantrasyonu, % 0,1 (w/v) eklemek proteaz-Alerjik Sığır serum albumin (BSA; son konsantrasyonu) ve 6 ay 4 ° C'de mağaza
    Not: dondurulmuş13olduğunda faaliyete fazla % 90 ScPPX kaybeder.

2. hasat örnekleri polifosfat çıkarma için

  1. Bakteri polip içeriği belirlemek için vade farkı şartları altında büyür. Bu iletişim kuralı için Lactobacillus reuteri36 37 ° C'de gecede seçeneği enzim İndüksiyon (Mey) orta37 sistein (Mey-C) olmadan sallayarak olmadan büyümek.
  2. Santrifüjü 50-100 µg hücresel protein toplam 1.5 mL microcentrifuge tüp içinde tarafından yeterince hücre hasat (bkz. Adım 3 aşağı). E. coliiçin bu bir günlük faz kültür 0.2 - A600 1 mL 0,4. L. reuteriiçin bu bir gecede kültür 1 mL dir. İlgi diğer türler için gerektiği şekilde ayarlayın.
  3. Tamamen süpernatant hücre çökeltilerini kaldırın.
  4. Hücre granül GITC lizis arabellek (4 M guanidin isothiocyanate, 50 mM Tris-HCl, pH 7) 250 µL içinde resuspend ve kuluçka deposu lysates-80 ° C'de 10 dakika süreyle 95 ° C'de tarafından parçalayıcı
    Not: yüksek sıcaklıkta genişletilmiş kuluçka polip düşmesine hidroliz38tarafından neden olabilir bu yana lizis zamanla tutarlı olması. Lysates süresiz olarak-80 ° C'de saklanabilir
    Dikkat: Guanidin isothiocyanate chaotropic tuzudur ve olmalı eldiven ile ele ve tehlikeli atık kurtulduk.

3. ölçme hücre Lysates Protein içeriği

  1. BSA standartları 0, 0.1, 0,2 ve 0.4 mg mL-1 BSA, GITC lizis arabelleği hazırlayın.
    Not: GITC Bradford tahlil renk gelişimi etkiler GITC, BSA standartları yapmak önemlidir. BSA standartları-20 ° C'de süresiz olarak depolanabilir
  2. Aliquot 5 µL çözdürülen, iyi karma hücre lysates ve kuyu temiz 96-şey plaka ayırmak için BSA standartları.
  3. Her şey için 195 µL Bradford reaktifi34 ekleyin ve 595 absorbans ölçmek nm (bir595) bir plaka okuyucu ( Tablo malzemelerigörmek).
  4. Karşılaştırma için formül y kullanarak BSA standart eğri olarak her iyi protein miktarı hesaplamak = mx + b, nereye i ise595, x BSA µg, standart eğrinin eğimini metredir, ve b standart eğri y kesişimi. Sonuç değeri 0,05 Toplam mg protein her örnek içinde belirlemek için çarpmak.

4. açılan polifosfat

  1. 250 µL % 95 etanol her GITC lysed örnek ve girdap karışımı ekleyin.
  2. Silis membran spin sütun ve santrifüj 30 için bu karışımı uygulamak 16,100 x g s.
  3. Akış-üzerinden atmak, sonra 50 mM NaCl, 5 mM EDTA, % 50 Etanol ve santrifüj 30 750 µL (pH 7.5), 5 mm Tris-HCl ekleyin 16,100 x g s.
  4. Akış-through ve santrifüj 16,100 x g de 2 min için atmak.
  5. Sütun bir temiz 1.5 mL microfuge tüpü yerleştirin ve 50 mm Tris-HCl (pH 8) 150 µL ekleyin.
  6. 5 min için oda sıcaklığında kuluçkaya sonra polip 8.000 x g de 2 min için centrifuging tarafından elute.
    Not: arzu edilirse, eluates-20 ° C'de en az 1 hafta boyunca saklanır.

5. polifosfat sindirerek

  1. 0, 5, 50 ve 50 mM Tris-HCl (pH 8) 200 µM potasyum fosfat içeren standartlar hazırlamak.
    Not: Potasyum fosfat standartları süresiz olarak oda sıcaklığında muhafaza edilebilir.
  2. Aliquot 100 µL her fosfat standart ve, polip örnekleri temiz 96-şey plaka ayrı kuyu hulâsa.
  3. (Örnek) içeren bir ana karışım hazırlamak: 5 x ScPPX reaksiyon arabellek (100 mM Tris-HCl, 25 mM MgCl2, 250 mM amonyum asetat, pH 7.5)1330 µL, H2O 19 µL ve saf ScPPX (1 mg mL-1) 1 µL.
  4. Ana Mix 50 µL 96-şey plaka her şey için ekleyin. 37 ° C'de 15 dakika kuluçkaya
    Not: arzu edilirse, sindirilmiş polip örnekleri-20 ° C'de süresiz olarak saklanır.

6. ücretsiz fosfat24 algılama

  1. Antimon Potasyum Tartarat 200 ml su, 4 N H2150 mL kadar ekleme 0.185 g çözülerek algılama çözüm temel hazırlamak41,49 g amonyum heptamolybdate ekleme,. Dağıtılması ve 456 mL nihai bir birime getirmek için ilave edin. Parçacıklar kaldırmak ve saklamak için çözüm korunuyorsunuz ışık 4 ° c ilâ 1 ay için filtre.
  2. 1 M askorbik asit stok çözeltisi hazırlamak. Işık 4 ° c ilâ 1 ay için korumalı depolama.
  3. Taze bir çalışma stok algılama çözüm her gün algılama çözüm temel 9,12 mL 1 M askorbik asit 0,88 mL ile karıştırılarak hazır olun. Oda sıcaklığında kullanmadan önce gelmek algılama çözüm izin verin.
  4. Her örnek ve standart 96-şey plaka algılama çözüm 50 µL ekleyin ve renk geliştirme izin vermek yaklaşık 2 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya.
  5. Ölçmek 882 absorbans nm bir plaka okuyucu ile ve her örnek fosfat konsantrasyonu, buna karşılık potasyum fosfat standart eğri hesaplamak.
    Uyarı: Toksik tuzları ve kuvvetli asit algılama çözüm içerir. Eldiven giymek ve aşırı çözüm zehirli atık tedavi.

7. hücresel polifosfat içerik hesaplama

  1. Polip kaynaklı fosfat tüm her hücrede aşağıdaki formüle göre lysate nanomoles 6.5. adımda belirlenen fosfat konsantrasyonları dönüştürmek:
    nmol polip 1.5 x = (µM fosfat / 10)
    Not: Standart eğri tabanlı yöntemi adım 6 fosfat (içinde µM) konsantrasyonu her 100 µL polip örnek adım 5.2 bölünmemeli belirler. Bu konsantrasyon nmol bir sayıya dönüştürmek için 100 µL 10 tarafından ayrılmıştır bir cilt L, vermek için6 konsantrasyon (µmol L-1) tarafından çarpılan, sonra 1.000 (bir µmol nmol sayısı) ile çarpılır. Bu konsantrasyonu 10 tarafından bölünmesi için azaltır. Adım 4'te hazırlanan toplam özü cilt 150 µL, bu fosfat tüm hulâsa içinde mevcut nmol hesaplamak için 1.5 sonuç değeri çarpmak için gerekli bu yüzden.
  2. 3.4. adımda belirlenen her örnek mg toplam protein nmol polip bölünerek toplam hücresel protein içeriğe hücresel polip normalleştirmek. Polip düzeyleri polip kaynaklı bireysel ücretsiz fosfat konsantrasyon açısından ifade edilir.
    Not: bazı durumlarda, fosfat standart eğri (adım 6.5) doğrusal aralığı dışında polip kaynaklı bir örnek mevcut fosfat miktarı düşebilir. Polip düzeyleri çok yüksek ise, aşırı polip içeren eluate adım 4,6 seyreltilmiş 1:10 veya 1: 100, gerekirse olabilir ve 5-7 arası adımları açıklandığı gibi yeniden ölçülür.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Protokolü'nün önemli adımlar Şekil 1' deki Basitleştirilmiş biçimde diyagramını.

Bu iletişim kuralıyla Ayagin Gram-negatif bakteriler, vahşi tipi E. coli kullanımını göstermek için MG165539 LB zengin Orta 37 ° C'de (200 devir/dakika) sallayarak ile orta log fazı için yetiştirilen, sonra durulanır ve ek bir 2s için inkübe 4 g L-1 glikoz ve 0,1 mM K2HPO4, üretim polip14,29ikna etmek için bilinen bir durum içeren morpholinopropanesulfonate arabelleğe alınmış (paspas) en az orta40 . Şekil 2Agösterildiği gibi biz vahşi tipi E. coli LB ve 192 ± 14 (ortalama ± standart sapma [SD]) nmol polip mg-1 toplam protein bezleri, önceki raporlar14ile,29 tutarlı yetiştirilen hiçbir polip tespit . , Hangi yoksun polip kinaz41, üretilen her iki ortamda hiçbir polip, bir ∆ppk mutant6, beklendiği gibi exopolyphosphatase42yoksun, bir ∆ppx mutant6, yaklaşık aynı miktarda üretilen Polip vahşi türü olarak ve fosfat taşımacılığında arızalı olan bir ∆phoB mutant29, vahşi tipi14,29,43daha önemli ölçüde daha az polip üretti.

Bu iletişim kuralıyla gram-pozitif bakteri, vahşi tipi L. reuteri kullanımını göstermek için ATCC okul aile birliği 647536 ve oligo-yönetmen recombineering44, kullanılarak inşa polip kinaz, eksik bir isogenic ppk1 null mutant olduğunu gecede MEI-C 37 ° C'de sallayarak olmadan büyüdü. Ppk1 mutant yarısından daha az miktarda bulunan süre Şekil 2B, vahşi tipi birikmiş 51 ± 6 nmol polip mg-1 toplam protein bu koşullar altında gösterildiği gibi. L. reuteri muhtemelen mevcut hesapları polip için ppk1 null mutant ppk2 gene45tarafından kodlanmış ikinci bir polip kinaz içerir.

Bu iletişim kuralı ile mikobakteriler kullanımını göstermek için Mycobacterium smegmatis gerilme SMR546 Hartmans-de Bont (HdB) orta47, sonra durulanır ve filolarının içinde seyreltilmiş HdB veya HdB % 2 etanol ile orta log fazı için yetişkin. Bu kültürler sonra gecede 37 ° C'de (180 rpm) sallayarak ile inkübe. Etanol tedavi üç kat artış için 437 ± 102 nmol polip mg-1 toplam protein sonuçlandı süre içinde Şekil 2C, etanol, yokluğunda gösterildiği gibi M. smegmatis 141 ± 52 nmol polip mg-1 toplam protein, birikmiş. Etanol M. smegmatis48polip düzeyleri yükseltmek için daha önce bildirilmiştir bu yana bu sonucu bekleniyordu.

Figure 1
Şekil 1: diyagramı polifosfat çıkarma ve ölçüm yordam. Polip miktar Protokolü'nün temel adımlar gösterilmiştir. Bakteri hücre topakları 95 ° c GITC (guanidin isothiocyanate) olarak lysed. Lysates küçük aliquots Bradford tahlil kullanarak protein içeriği için denetlesinler. Polip silis membran sütunları kullanarak ve sonra sindirilmiş ScPPX ile elde edilir. Elde edilen ücretsiz fosfat askorbik asit tahlil kullanarak sayılabilir. Toplam fosfat polip kaynaklı her örnek için toplam protein için normalleştirilmiş. 595 595 absorbans = nm; 882 882 absorbans = nm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2: temsilcisi sonuçları ile çeşitli bakteri. (A) E. coli MG1655 vahşi tipi ve isogenic ∆ppk, ∆ppxve ∆phoB mutantlar 37 ° C'de (200 devir/dakika) için600 sallayarak ile yetişkin = 0,2 - 0,4 zengin LB Orta (siyah daireler) ve en az orta (MOPS kaymıştır 4 g L-1 glikoz ve 0,1 mM K2HPO4içeren) için 2 h (beyaz daireler; n = 3, ± SD). (B) L. reuteri ATCC okul aile birliği 6475 (daireler) ve bir isogenic ppk1 null mutant (üçgen) sallayarak olmadan gecede MEI-C orta 37 ° C'de yetişkin (n = 3, ± SD). (C) M. smegmatis SMR5 37 ° C'de (180 rpm) için600 sallayarak ile yetişkin = 1 HdB Orta (kapalı kareler) ile veya olmadan (açık kareler) % 2 etanol (n = 3, ± SD). Polip düzeyleri polip kaynaklı bireysel ücretsiz fosfat konsantrasyon açısından ifade edilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Burada açıklanan protokol basitleştirir ve tipik bir el tam olarak işlemek için yaklaşık 1,5 saat alarak 24 örnekleri ile çeşitli bakteri, polip düzeylerinin miktar hızlandırır. Bu örnekleri hızlı tarama ve analiz mutant kütüphanelerin izin verir ve kinetik deney polip birikimi zamanla ölçüm kolaylaştırır. Protokol etkili üç farklı kültürlenebilen temsilcileri üzerinde çalışıyor göstermiştir: bakteri, firmicutes ve bunlar, onların esnek için kötü üne sahip olan hücre duvarları49koşullar zor.

Polip sindirim ScPPX ile tarafından algılanması daha belirgin ve daha floresan algılama DAPI ile daha hassas ve daha ucuz ve daha teknik PPK kullanarak ATP polip dönüşüm daha basittir. ScPPX DNA ve RNA12tarafından inhibe rağmen biz bile 6000'den fazla nmol polip mg-1 protein29içeren bakterilerde tam sindirim elde etmek için çok büyük bir enzim (örnek başına 1 µg) fazlalığı kullanarak üstesinden geldiler. Diğer yayımlanmış yöntemleri kullanımı 10-15 ng ScPPX bir reaksiyon12,24başına. Bizim protokol ScPPX arıtma için genellikle daha--dan 5 mg başına 5.000'den fazla deneyleri için yeterli overexpression kültür litre saf ScPPX verir. Biz O'nun öğesini proteinlerin nikel-benzeşme arıtma için birkaç farklı protokoller de pScPPX2 overexpressed ScPPX arındırmak için iş bulduk (veri) gösterilmez, ve çok çeşitli tür iletişim kurallarının değişen labs uygun kullanılabilir vardır Teknik kapasiteleri.

Önceki iletişim kuralları ScPPX sindirim için polip algılama kullanarak kez ücretsiz fosfat6,12ölçmek için malakit yeşil tabanlı Renkölçer deneyleri üzerinde yararlanmıştır. Bu deneyleri duyarlı olarak, ancak genellikle doğru ölçümler24,50,51yapmak için iki ya da üç ayrı reaktifler dikkatle zamanlı sıralı eklenmesi gerektirir. Kullanılan burada24 bir daha geniş doğrusal dizi algılama malakit yeşil daha duyarlılık kaybı var, sadece tek bir reaktif ilavesi içerir ve hassas gerektirmez askorbik asit tabanlı algılama sistemi zamanlama.

Bu iletişim kuralı başarısı için kritik olan birkaç adım vardır. İlk, bakteriyel örnekleri GITC içinde hemen hasat sonrası, polip düzeyleri örnekleme süre sonra değiştirmeyin emin olmak ve hızla hücresel fosfatazlar devre dışı bırakabilirsiniz için lysed. İkinci olarak, değil GITC lysates için daha--dan 10 min 95 ° C'de kuluçkaya ve stok onları hemen sonra-80 ° C'de mümkün polip hidroliz en aza indirmek için. Üçüncü olarak, 96-şey plakaları sıçrama ya da bir şey bir örnekten diğerine damla değil protein veya fosfat ölçümler için içine örnekleri pipetting dikkatli olun. Renkölçer deneyleri, fosfat, özellikle için çok hassas ve kirlenme küçük miktarlarda güçlü sonuçları çarpık. Son olarak, bu protokol için (yani ScPPX, algılama çözüm) kullanılan bazı reaktifler raf hayatını sınırlıdır. Her 6 ay ve taze taze ScPPX hazırlamak algılama çözüm her ay.

Bir yöntemimiz Silis sütunları az 60 fosfat birimleri uzun süre çok iyi12,14,15polip bind yapmak kısıtlamasıdır. Bakteriler genellikle çok uzun zincir polip3sentez, ancak kullanmadan önce belirli bir bakteriyel türler zinciri uzunluğu değerlendirmek için polyacrylamide jel elektroforez27,30 kullanarak ön deneyleri öneririz prosedürü. Nerede kısa zincirli polip polip havuzu önemli bir kısmını yapar türünün bizim Protokolü uygun değildir ve biz polip farklı bir yöntem tarafından (Örneğin, fenol kloroform ayıklama12) ayıklanan tavsiye ve ayrıca tavsiye ederim ScPPX sindirim piyasada bulunan S. cereviseae ile ilave ScPPX pirofosfat13 ve bunu sindirmek değil bu yana pyrophosphatase (PPA1)24, daha kısa zincir ölçümler üzerinde nispeten yüksek bir etkisi vardır Polip. Alternatif olarak ScPPX için asit hidroliz38 polip fosfat ücretsiz hidrolize için kullanılan olabilir ama bu sadece polip elde edilen fosfat ölçülen emin olmak için ek DNaz, RNase ve arıtma adımlar gerektirir. Bazı durumlarda, özellikle mikobakteriler gibi kalın hücre duvarları bilinen bakteri suşları veya koşullar, arasında GITC ile polip ayıklama verimliliğini değişir olup olmadığını sınamak için bir alternatif çıkarma yöntemi kullanmak yararlı olabilir. Polip algılama Bu testin sınırın altındaki düzeyde belli çalışmaları için önemli ise, PPK polip son derece hassas kullanarak tespit edilebilir ATP için dönüştürmek için kullanmak gibi bir farklı algılama düzeni kullanmak gerekli olabilir piyasada bulunan luciferase tabanlı deneyleri14,17,18.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

Bu proje Birmingham bölümü Mikrobiyoloji başlangıç fonlar ve NIH hibe R35GM124590 (MJG) ve NIH hibe R01AI121364 (FW) University of Alabama tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
E. coli BL21(DE3) Millipore Sigma 69450
plasmid pScPPX2 Addgene 112877 available to academic and other non-profit institutions
LB broth Fisher Scientific BP1427-2 E. coli growth medium
ampicillin Fisher Scientific BP176025
isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) Gold Biotechnology I2481C
HEPES buffer Gold Biotechnology H-400-1
potassium hydroxide (KOH) Fisher Scientific P250500 for adjusting the pH of HEPES-buffered solutions
sodium chloride (NaCl) Fisher Scientific S27110
imidazole Fisher Scientific O3196500
lysozyme Fisher Scientific AAJ6070106
magnesium chloride (MgCl2) Fisher Scientific BP214-500
Pierce Universal Nuclease Fisher Scientific PI88700 Benzonase (Sigma-Aldrich cat. # E1014) is an acceptable substitute
Model 120 Sonic Dismembrator Fisher Scientific FB-120 other cell lysis methods (e.g. French Press) can also be effective
5 mL HiTrap chelating HP column GE Life Sciences 17040901 any nickel-affinity chromatography column or resin could be substituted
nickel(II) sulfate hexahydrate Fisher Scientific AC415611000 for charging HiTrap column
0.8 µm pore size cellulose acetate syringe filters Fisher Scientific 09-302-168
Bradford reagent Bio-Rad 5000205
Tris buffer Fisher Scientific BP1525
Spectrum Spectra/Por 4 RC Dialysis Membrane Tubing 12,000 to 14,000 Dalton MWCO Fisher Scientific 08-667B other dialysis membranes with MWCO < 30,000 Da should also work
hydrochloric acid (HCl) Fisher Scientific A144-212 for adjusting the pH of Tris-buffered solutions
potassium chloride (KCl) Fisher Scientific P217500
glycerol Fisher Scientific BP2294
10x MOPS medium mixture Teknova M2101 E. coli growth medium
glucose Fisher Scientific D161
monobasic potassium phosphate (KH2PO4) Fisher Scientific BP362-500
dibasic potassium phosphate (K2HPO4) Fisher Scientific BP363-500
dehydrated yeast extract Fisher Scientific DF0886-17-0
tryptone Fisher Scientific BP1421-500
magnesium sulfate heptahydrate Fisher Scientific M63-50
manganese sulfate monohydrate Fisher Scientific M113-500
guanidine isothiocyanate Fisher Scientific BP221-250
bovine serum albumin (protease-free) Fisher Scientific BP9703100
clear flat bottom 96-well plates Sigma-Aldrich M0812-100EA any clear 96-well plate will work
Tecan M1000 Infinite plate reader Tecan, Inc. not applicable any plate reader capable of measuring absorbance at 595 and 882 nm will work
ethanol Fisher Scientific 04-355-451
silica membrane spin columns Epoch Life Science 1910-050/250
ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Fisher Scientific BP120500
1.5 mL microfuge tubes Fisher Scientific NC9580154
ammonium acetate Fisher Scientific A637-500
antimony potassium tartrate Fisher Scientific AAA1088922
4 N sulfuric acid (H2SO4) Fisher Scientific SA818-500
ammonium heptamolybdate Fisher Scientific AAA1376630
ascorbic acid Fisher Scientific AC401471000

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rao, N. N., Gomez-Garcia, M. R., Kornberg, A. Inorganic polyphosphate: essential for growth and survival. Annual Review of Biochemistry. 78, 605-647 (2009).
  2. Achbergerova, L., Nahalka, J. Polyphosphate--an ancient energy source and active metabolic regulator. Microbial Cell Factories. 10, 63 (2011).
  3. Kornberg, A., Rao, N. N., Ault-Riche, D. Inorganic polyphosphate: a molecule of many functions. Annual Review of Biochemistry. 68, 89-125 (1999).
  4. Albi, T., Serrano, A. Inorganic polyphosphate in the microbial world. Emerging roles for a multifaceted biopolymer. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 32 (2), 27 (2016).
  5. Gray, M. J., Jakob, U. Oxidative stress protection by polyphosphate--new roles for an old player. Current Opinion in Microbiology. 24, 1-6 (2015).
  6. Gray, M. J., et al. Polyphosphate is a primordial chaperone. Molecular Cell. 53 (5), 689-699 (2014).
  7. Racki, L. R., et al. Polyphosphate granule biogenesis is temporally and functionally tied to cell cycle exit during starvation in Pseudomonas aeruginosa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (12), E2440-E2449 (2017).
  8. Rashid, M. H., et al. Polyphosphate kinase is essential for biofilm development, quorum sensing, and virulence of Pseudomonas aeruginosa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (17), 9636-9641 (2000).
  9. Candon, H. L., Allan, B. J., Fraley, C. D., Gaynor, E. C. Polyphosphate kinase 1 is a pathogenesis determinant in Campylobacter jejuni. Journal of Bacteriology. 189 (22), 8099-8108 (2007).
  10. Richards, M. I., Michell, S. L., Oyston, P. C. An intracellularly inducible gene involved in virulence and polyphosphate production in Francisella. Journal of Medical Microbiology. 57 (Pt 10), 1183-1192 (2008).
  11. Singh, R., et al. Polyphosphate deficiency in Mycobacterium tuberculosis is associated with enhanced drug susceptibility and impaired growth in guinea pigs. Journal of Bacteriology. 195 (12), 2839-2851 (2013).
  12. Bru, S., Jimenez, J., Canadell, D., Arino, J., Clotet, J. Improvement of biochemical methods of polyP quantification. Microbial Cell. 4 (1), 6-15 (2016).
  13. Wurst, H., Kornberg, A. A soluble exopolyphosphatase of Saccharomyces cerevisiae. Purification and characterization. Journal of Biological Chemistry. 269 (15), 10996-11001 (1994).
  14. Ault-Riche, D., Fraley, C. D., Tzeng, C. M., Kornberg, A. Novel assay reveals multiple pathways regulating stress-induced accumulations of inorganic polyphosphate in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 180 (7), 1841-1847 (1998).
  15. Lee, W. D., et al. Simple Silica Column-Based Method to Quantify Inorganic Polyphosphates in Cartilage and Other Tissues. Cartilage. , (2017).
  16. Martin, P., Van Mooy, B. A. Fluorometric quantification of polyphosphate in environmental plankton samples: extraction protocols, matrix effects, and nucleic acid interference. Applied and Environmental Microbiology. 79 (1), 273-281 (2013).
  17. Cremers, C. M., et al. Polyphosphate: A Conserved Modifier of Amyloidogenic Processes. Molecular Cell. 63 (5), 768-780 (2016).
  18. Dahl, J. U., et al. The anti-inflammatory drug mesalamine targets bacterial polyphosphate accumulation. Nature Microbiology. 2, 16267 (2017).
  19. Kulaev, I. S., Vagabov, V. M., Kulakovskaya, T. V. Ch. 2. The Biochemistry of Inorganic Polyphosphates. , John Wiley & Sons, Ltd. 15-35 (2004).
  20. Werner, T. P., Amrhein, N., Freimoser, F. M. Novel method for the quantification of inorganic polyphosphate (iPoP) in Saccharomyces cerevisiae shows dependence of iPoP content on the growth phase. Archives of Microbiology. 184 (2), 129-136 (2005).
  21. Aschar-Sobbi, R., et al. High sensitivity, quantitative measurements of polyphosphate using a new DAPI-based approach. Journal of Fluorescence. 18 (5), 859-866 (2008).
  22. Kulakova, A. N., et al. Direct quantification of inorganic polyphosphate in microbial cells using 4'-6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). Environmental Science and Technology. 45 (18), 7799-7803 (2011).
  23. Kolozsvari, B., Parisi, F., Saiardi, A. Inositol phosphates induce DAPI fluorescence shift. Biochemical Journal. 460 (3), 377-385 (2014).
  24. Christ, J. J., Blank, L. M. Enzymatic quantification and length determination of polyphosphate down to a chain length of two. Analytical Biochemistry. 548, 82-90 (2018).
  25. Ahn, K., Kornberg, A. Polyphosphate kinase from Escherichia coli. Purification and demonstration of a phosphoenzyme intermediate. Journal of Biological Chemistry. 265 (20), 11734-11739 (1990).
  26. Zhu, Y., Lee, S. S., Xu, W. Crystallization and characterization of polyphosphate kinase from Escherichia coli. Biochemical and Biophysical Research Communications. 305 (4), 997-1001 (2003).
  27. Smith, S. A., Morrissey, J. H. Sensitive fluorescence detection of polyphosphate in polyacrylamide gels using 4',6-diamidino-2-phenylindol. Electrophoresis. 28 (19), 3461-3465 (2007).
  28. Livermore, T. M., Chubb, J. R., Saiardi, A. Developmental accumulation of inorganic polyphosphate affects germination and energetic metabolism in Dictyostelium discoideum. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (4), 996-1001 (2016).
  29. Rudat, A. K., Pokhrel, A., Green, T. J., Gray, M. J. Mutations in Escherichia coli Polyphosphate Kinase That Lead to Dramatically Increased In Vivo Polyphosphate Levels. Journal of Bacteriology. 200 (6), e00697-e00617 (2018).
  30. Smith, S. A., Wang, Y., Morrissey, J. H. DNA ladders can be used to size polyphosphate resolved by polyacrylamide gel electrophoresis. Electrophoresis. , (2018).
  31. Studier, F. W., Moffatt, B. A. Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes. Journal of Molecular Biology. 189 (1), 113-130 (1986).
  32. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Bacterial Transformation: Electroporation. , JoVE. Cambridge, MA. (2018).
  33. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Bacterial Transformation: The Heat Shock Method. , JoVE. Cambridge, MA. (2018).
  34. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
  35. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Separating Protein with SDS-PAGE. , JoVE. Cambridge, MA. (2018).
  36. Mu, Q., Tavella, V. J., Luo, X. M. Role of Lactobacillus reuteri in Human Health and Diseases. Frontiers in Microbiology. 9, 757 (2018).
  37. Alcantara, C., Blasco, A., Zuniga, M., Monedero, V. Accumulation of polyphosphate in Lactobacillus spp. and its involvement in stress resistance. Applied and Environmental Microbiology. 80 (5), 1650-1659 (2014).
  38. Kulaev, I. S., Vagabov, V. M., Kulakovskaya, T. V. Ch. 1. The Biochemistry of Inorganic Polyphosphates. , John Wiley & Sons, Ltd. 3-13 (2004).
  39. Blattner, F. R., et al. The complete genome sequence of Escherichia coli K-12. Science. 277 (5331), 1453-1462 (1997).
  40. Neidhardt, F. C., Bloch, P. L., Smith, D. F. Culture medium for enterobacteria. Journal of Bacteriology. 119 (3), 736-747 (1974).
  41. Akiyama, M., Crooke, E., Kornberg, A. The polyphosphate kinase gene of Escherichia coli. Isolation and sequence of the ppk gene and membrane location of the protein. Journal of Biological Chemistry. 267 (31), 22556-22561 (1992).
  42. Akiyama, M., Crooke, E., Kornberg, A. An exopolyphosphatase of Escherichia coli. The enzyme and its ppx gene in a polyphosphate operon. Journal of Biological Chemistry. 268 (1), 633-639 (1993).
  43. Rao, N. N., Liu, S., Kornberg, A. Inorganic polyphosphate in Escherichia coli: the phosphate regulon and the stringent response. Journal of Bacteriology. 180 (8), 2186-2193 (1998).
  44. van Pijkeren, J. P., Britton, R. A. High efficiency recombineering in lactic acid bacteria. Nucleic Acids Research. 40 (10), e76 (2012).
  45. Zhang, H., Ishige, K., Kornberg, A. A polyphosphate kinase (PPK2) widely conserved in bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (26), 16678-16683 (2002).
  46. Sander, P., Meier, A., Bottger, E. C. rpsL+: a dominant selectable marker for gene replacement in mycobacteria. Molecular Microbiology. 16 (5), 991-1000 (1995).
  47. Hartman, S., Bont, J. A. M. D., et al. The Prokaryotes, a handbook on the biology of bacteria: ecophysiology, isolation, application. Balows, A., et al. , Springer-Verlag. New York, Inc. 1215-1237 (1992).
  48. Winder, F. G., Denneny, J. M. The metabolism of inorganic polyphosphate in mycobacteria. Journal of General Microbiology. 17 (3), 573-585 (1957).
  49. Jankute, M., Cox, J. A., Harrison, J., Besra, G. S. Assembly of the Mycobacterial Cell Wall. Annual Review of Microbiology. 69, 405-423 (2015).
  50. Carter, S. G., Karl, D. W. Inorganic phosphate assay with malachite green: an improvement and evaluation. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 7 (1), 7-13 (1982).
  51. Cogan, E. B., Birrell, G. B., Griffith, O. H. A robotics-based automated assay for inorganic and organic phosphates. Analalytical Biochemistry. 271 (1), 29-35 (1999).

Tags

İmmünoloji ve enfeksiyon sayı 143 polifosfat stres tepkisi exopolyphosphatase gram-negatif bakteriler gram-pozitif bakteri Mikobakteri
Bakterilerde inorganik polifosfat için raporlaması
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pokhrel, A., Lingo, J. C.,… More

Pokhrel, A., Lingo, J. C., Wolschendorf, F., Gray, M. J. Assaying for Inorganic Polyphosphate in Bacteria. J. Vis. Exp. (143), e58818, doi:10.3791/58818 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter