Summary
في هذه الورقة، ونحن نهدف إلى وصف أداء تقنية الطرد المركزي التدرج الكثافة وتطبيقه في بحوث فسيولوجيا الحيوانات المنوية.
Abstract
في التناسل الجنسي، الصمامات خلية الحيوانات المنوية أو مشيج الذكور مع مشيج أنثى لتحقيق الإخصاب. ومع ذلك، عدد كبير من الخلايا المنوية مع التسميد القدرة مطلوبة لتتفاعل مع مشيج الإناث لضمان الإخصاب. على هذا النحو، قدرة تخصيب الخلايا المنوية الفردية أمر حاسم لنجاح الاستنساخ. وقد استخدمت الكثافة المتدرجة الطرد المركزي لعدة عقود كأسلوب استنساخه، وسريعة، والكفاءة والفعالية والغاية قابلة للتكيف لجمع فقط جودة الحيوانات المنوية لاستخدامها في مساعدة التكنولوجيا الإنجابية. البروتوكولات ونحن المبينة في هذا التقرير تركز على استخدام أسلوب التدرج الطرد المركزي (بدجك) الكثافة بركل متقطع لعزل السكان ثلاثة متميزة من الحيوانات المنوية الديك بجودتها. كنا قادرين على جمع منخفضة ومتوسطة وعالية الجودة الحيوانات المنوية. كما يصف لنا استنساخه من البروتوكولات التي يترتب عليها تحديد إمكانات خصوبة الحيوانات المنوية بتقييم الجدوى والتنقل بينيترابيليتي. جمع الحيوانات المنوية بجودتها باستخدام تقنية بدجك سوف يكون من المفيد بدقة ودقة توصيف الحيوانات المنوية مع الخصوبة التفاضلية المحتملة.
Introduction
في الفقاريات، الأمشاج الذكور الخضوع لضغوط مكثفة انتقائية؛ ولذلك اللياقة البدنية التناسلية للذكور محوري لتحقيق نجاح الإخصاب. الذكور من أي الأنواع الفقارية معين يجب أن يكون قادراً على إنتاج خلايا الحيوانات المنوية بكميات كبيرة وذات نوعية كافية لتلبية احتياجات التسميد. خلايا الحيوانات المنوية، وقد رأس الحيوانات المنوية والسوط، هي الخلايا الأكثر استقطابا في الجسم. فأيضا متباينة للغاية في جودة الحيوانات المنوية (منخفضة حية وميتة شكلياً العادي وغير طبيعي وغير متحركة، متنقلة وعالية المتنقلة)، التي كشفت من خلال التفاوت الواسع في الكفاءة التناسلية للذكور. أكبر نسبة عالية الجودة من الحيوانات المنوية، أقل عدد ماتينجس المطلوبة لتسميد بنجاح البويضة. ومع ذلك، تحقيقا للخصوبة، خلايا الحيوانات المنوية العادية شكلياً الاعتماد على قوات دفعي تولدها سياط للوصول إلى الموقع للتسميد، وكذلك فيما يتعلق باختراق zona pellucida1 (ZP؛ وفي حالة الثدييات) أو بيريفيتيليني الداخلية الطبقة2 (إيبفل؛ وفي حالة الطيور والزواحف) للبويضة بعد التزاوج الطبيعي أو التلقيح الاصطناعي (منظمة العفو الدولية). تحديد الحيوانات المنوية الجودة اللازمة لاستخدامها في تقنيات الإنجاب المساعدة3 (الفن) وبرامج مختارة من تربية الذكور لاستخدامها في منظمة العفو الدولية4. من ناحية أخرى، يعتمد نجاح الفن فقط بناء على تقييم دقيق لنوعية الحيوانات المنوية. قد وضعت عددا من الاختبارات المعملية لتحديد الخصائص الوظيفية للحيوانات المنوية. المعلمات الأكثر أهمية هي مورفولوجية الحيوانات المنوية، الجدوى، التنقل، وتأهيلية (إنفلونزا الطيور في الحيوانات المنوية لا تتطلب تأهيلية5)، رد فعل أكروسومي (AR؛ والرقابة وإطلاق سراح إنزيم proteolytic من acrosome رأس الحيوانات المنوية)، والحيوانات المنوية اختراق ZP أو إيبفل، والتسميد6،،من78،9،،من1011. تدابير للخصوبة وحدها لا توفر تقييما دقيقا لقدرة صنع الأسمدة السكان الحيوانات المنوية11. تدابير للعديد من الأحداث المؤدية إلى إخصاب البويضة يسمح بتمثيل ملائم لأداء spermatocytes الفردية7.
المنهجية التي وضعت لقياس وظيفة الحيوانات المنوية يتم إبلاغها أساسا. على سبيل المثال، هي البقاء والتنقل وتغلغل إيبفل في إنفلونزا الطيور من الحيوانات المنوية، المعلمات الأكثر شيوعاً المستخدمة لتقييم الحيوانات المنوية نوعية8،،من1112. عدد الحيوانات المنوية حية في السائل المنوي يلعب دوراً حاسما لبقاء الحيوانات المنوية نظراً لوجود عدد كبير من الحيوانات المنوية ميتة في السائل المنوي يؤثر على نوعية الحيوانات المنوية. وهذا يعزز إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية في السائل المنوي ويسبب الضرر التأكسدي ل الحيوانات المنوية الحية13. تنقل الحيوانات المنوية، القدرة على الحركة فلاجلر الطيور الحيوانات المنوية ضد المقاومة في درجة حرارة الجسم، من المعروف أن تلعب دوراً مباشرا في أحداث الإخصاب8. كذلك ثبت أن الحراك يرتبط ارتباطاً إيجابيا بالخصوبة، وهي لذلك، أحد المحددات أساسية للخصوبة8. ومع ذلك، كما يجب الحيوانات المنوية متحركة القدرة على الخضوع AR واختراق إيبفل11. إيبفل فحوصات الاختراق تأخذ في الاعتبار لكل الحيوانات المنوية التي تشارك في عملية التسميد11.
في تطبيق الفن، عادة ما تتم معالجة السائل المنوي بغية تحقيق أقصى قدر من تركيز الحيوانات المنوية عالية الجودة وتقليل تركيز الحيوانات المنوية منخفضة الجودة. وبعد جمع السائل المنوي ويمكن إثراء نسبة الحيوانات المنوية عالية الجودة من خلال إجراءات فصل الحيوانات المنوية شيوعاً في ممارسات الصناعة والبحوث. العديد من هذه الإجراءات وضعت، مع جميع المزايا الخاصة بكل منها والقيود، ولكن الجميع الاستفادة من الطابع غير المتجانس للحيوانات المنوية لجمع الحيوانات المنوية فقط مع القدرة على صنع الأسمدة عالية. وتشمل هذه الإجراءات طرق هجرة الحيوانات المنوية، وتمسك العمود الترشيح وكثافة التدرج الطرد المركزي (DGC)14،15،16،18،،من1719 , 20-من بين التقنيات المتاحة، تم العثور على DGC أن تكون بسيطة جداً، وقابلة للتكرار، وفعالة من حيث التكلفة والكفاءة في عزل أقصى قدر ممكن من الحيوانات المنوية عالية الجودة للاستخدام في الفن مع الهدف المتمثل في تعظيم فرصة الإخصاب14 , 15-وبالإضافة إلى ذلك، DGC لا تضر بغشاء الخلية المنوية. وفي المقابل، طرق هجرة الحيوانات المنوية جمع الحيوانات المنوية إلا تدريجيا الجوال18،19، ولكن كمية الحيوانات المنوية التي جمعت منخفضة جداً، مما يجعلها غير فعالة في جمع كميات كبيرة من الحيوانات المنوية18، 20-تمسك العمود الترشيح فعالة جداً في تصفية الكثيري الحيوانات المنوية من السائل المنوي17؛ ومع ذلك، فإنه يميل إلى أن يكون تضر بالحيوانات المنوية الأغشية20،21.
في الأسلوب DGC، هو الركيزة الأكثر استخداماً لتوليد التدرج الكثافة بركل، التي تتألف من جزيئات السليكا الغروية المغلفة في بوليفينيلبريروليدوني. بركل الكثافة المتدرجة الطرد المركزي (بدجك) يمكن أن يكون أما مستمر أو متقطع ولكن تدرج الانقطاع هو الأكثر استخداماً لعزل عالية الغلة من الحيوانات المنوية الكثيري13،،من1620. في تدرج متقطع، أقل كثافة وسائل الإعلام يعوم فوق أعلى كثافة الإعلام، إنشاء تدرج الذي يزيد في الكثافة من الأعلى إلى أسفل أنبوب مخروطي. يؤدي هذا إلى إنشاء حدود في مجال التفاعل بين وسائط الإعلام اثنين من كثافة مختلفة. كفاءة بدجك مشتق من عاملين هما: 1) دفعي قدرة الحيوانات المنوية خلايا فردية و 2) ميل الخلايا المنوية مع السلامة الهيكلية عالية يكون زيادة كثافة. أفضل الحيوانات المنوية مع التنقل أعلى قادرة على عبور من انخفاض كثافة وسائل الإعلام وتخترق أعلى كثافة وسائل الإعلام. انخفاض الحيوانات المنوية التنقل من المرجح أن تصبح المحاصرين في الحدود تم إنشاؤها بواسطة التفاعل بين وسائط الإعلام المختلفة ذات الكثافة. الخلايا المنوية مع السلامة الهيكلية عالية والحراك تميل إلى أن تكون أعلى كثافة من خلايا الحيوانات المنوية متحركة ميتة أو غير طبيعي أو منخفض. عندما يتم تطبيق قوة الطرد المركزي في بدجك، وهذا يسهل حركة الحيوانات المنوية بكثافات مختلفة إلى مكان كل منهما في التدرج.
في الممارسة العامة، بعد إجراء بدجك، يتم جمع بيليه لينة للحيوانات المنوية مع الخصوبة المرتفعة المحتملة في الجزء السفلي من الأنبوبة المخروطية، ويتم تجاهل الباقي. ومع ذلك، ميزة غير مستغلة من هذا الأسلوب هو قدرته على فصل الخلايا المنوية إلى عدة مجموعات استناداً إلى الاختلافات النوعية. لأغراض البحث، يتيح فصل الحيوانات المنوية بدرجة جودة استخدام تقنية بدجك لدراسة نوعية الحيوانات المنوية أنها تتعلق بالاختلافات الفسيولوجية، metabolomic والبروتين. هنا، نحن نهدف إلى بالتفصيل كيف يمكن استخدام هذا الأسلوب فصل الحيوانات المنوية بالجودة، فضلا عن إثبات هذه الاختلافات في الجودة، باستخدام nigrosin ويوزين المحددة سابقا تلطيخ حيوية للبقاء، الإنزيم أككودينز للتنقل، والحيوانات المنوية-إيبفل تحليل التفاعل بينيترابيليتي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
عليها جميع الأساليب الموصوفة هنا "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (إياكوك) من جامعة جورجيا.
1-الغسيل باستخدام "الطرد المركزي التقليدي"
- إعداد الفوسفات المخزن المؤقت الحل (PBS). إضافة ز 8.0 من كلوريد الصوديوم، 0.2 جم بوكل، ز 1.44 غ2هبو4 و 0.24 ز خ2ص4 إلى 800 مل ماء المقطر (dH2س). ضبط ال pH إلى 7.4 استخدام 0.1 N HCl وجلب الحل إلى 1 لتر استخدام dH2o.
- إعداد المخزن المؤقت للحركة. إضافة 6.5 غرام من كلوريد الصوديوم، 4.5 غرام السكر، ز 0.444 كاكل2 و 11.5 ز ن-تريس-[هيدروكسيميثيل] حامض الميثيل-2-أمينو اثانيسولفونيك (الامتحانات) لمل 800 dH2سين ضبط ال pH إلى 7.4 استخدام هيدروكسيد الصوديوم م 1 وتحقيق الحل إلى 1 لتر استخدام dH2o.
- "الماصة؛" 0.5 مل من السائل المنوي في أنبوب ميكروسينتريفوجي البولي بروبلين. إضافة مل 1.0 من برنامج تلفزيوني وتخلط برفق.
- الطرد المركزي في 1,500 س ز لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT) وتجاهل المادة طافية. ريسوسبيند بيليه الحيوانات المنوية مع برنامج تلفزيوني يصل إلى 1.5 مل.
- أجهزة الطرد المركزي في 1,500 س ز لمدة 10 دقائق في "الرايت ريسوسبيند" الحيوانات المنوية بيليه مع حركية المخزن المؤقت يصل إلى 0.5 مل.
2-أداء تقنية بدجك
ملاحظة: تنفيذ العملية برمتها من بدجك في درجة حرارة الغرفة.
- جعل 3.0 مل حلول بركل 1.08 g/mL و 1.07 g/mL في أنابيب منفصلة اثنين.
- أضف في أنبوب اختبار نظيفة، مل 1.712 ز 1.13/مل بيركول الأصلي إلى 0.3 مل محلول كلوريد الصوديوم 1.5 متر. إضافة مل 0.988 dH2س ومزيج من انعكاس لطيف جعل مل 3.0 1.08 غ/مل حل الكثافة.
- أضف في أنبوب اختبار نظيفة، مل 1.482 ز 1.13/مل بركل الأصلي إلى 0.3 مل محلول كلوريد الصوديوم 1.5 متر. إضافة مل 1.218 dH2س ومزيج من انعكاس لطيف جعل 3.0 مل من 1.07 غ/مل حل الكثافة.
- في أنبوب اختبار نظيفة، تمييع 1.0 مل من عينة السائل المنوي 1:2 مع مل 2.0 من برنامج تلفزيوني. المزيج بلطف بيبيتينج.
- بيبيت 3.0 مل الحل كثافة 1.07 g/mL في أنبوب عقيم 15 مل مخروطية الشكل. عناية بيبيت 3.0 مل الحل 1.08 g/mL الكثافة تحت الحل كثافة 1.07 g/mL. تأكد من أن لا تخلط الطبقتين. نموذج طويل (في 9) ماصة باستور يمكن أن تسهل هذه الخطوة.
- بيبيت 3.0 مل عينة السائل المنوي المخفف يعلو PDG. للتأكد من أن عينة السائل المنوي لا تخلط مع PDG، إمالة بلطف الأنبوبة المخروطية التي تحتوي على PDG بزاوية 45 درجة. بيبيت العينة على طول الجدار للأنبوب والسماح لها بالتدفق أسفل الأنبوب وعلى PDG.
- إعداد أنبوب فارغ بحيث تتطابق مع كتلة PDG مع عينة متراكبة. الطرد المركزي كل الأنابيب في 1500 غ س ل 20 دقيقة يكون حريصا على الحفاظ على التدرج متقطع بينما نقل الأنابيب من على مقاعد البدلاء لتحقيق التوازن، ومن ثم إلى النابذة.
ملاحظة: لا تستخدم الفرامل في نهاية الطرد المركزي. - مراقبة النتائج. ضمان أنه قد شكلت ثلاث طبقات السائل المنوي متميزة في الأنبوب، كما هو مبين في الشكل 1.
- نضح طبقات السائل المنوي معزولة مع ماصة. جمع الطبقة العليا من السائل المنوي أولاً، والمنتصف الطبقة الثانية، وآخر بيليه الثابت في الجزء السفلي من الأنبوب. نقل بعضهم إلى روبلين نظيفة ومعقمةأنبوب ميكروسينتريفوجي.
- تمييع كل عينة إلى 1.5 مل مع برنامج تلفزيوني. الطرد المركزي في 1500 غ س لمدة 10 دقائق.
- من أجل إيقاف المادة طافية. إعادة تشكيل الحيوانات المنوية بيليه مع المخزن المؤقت للحركة التي بيبيتينج لطيف.
ملاحظة: يمكن استخدام كثافات بديلة لتناسب احتياجات المحقق. تحديد استخدام مبالغ من المكونات المستخدمة مع المعادلة التالية، حيث هو الخامس0 حجم الحل كثافة المخزون، الخامس الحجم النهائي للحل المنشود، ف كثافة حل النهائي الكثافة المرغوب وهو ف0 كثافة كثافة المخزون الحل:
دائماً استخدام 0.3 مل من 1.5 م كلوريد الصوديوم في إعداد الحلول الكثافة بحيث تتطابق مع كلوريد الصوديوم تركيز المحلول الملحي الفسيولوجي.
3-تحديد نوعية الحيوانات المنوية
- حساب تركيز الحيوانات المنوية كما تم وصفه سابقا22.
- تنفيذ ويوزين-نيجروسين الحيوية تلطيخ كما هو موضح سابقا12 مع التعديلات التالية:
- إعداد 100 ميليلتر من حل الحيوانات المنوية بتركيز 1 × 108 خلايا/مل.
- بيبيت 50 ميليلتر حل الحيوانات المنوية في أنبوب ميكروسينتريفوجي البولي بروبلين الذي يحتوي على وحدة تخزين متساوية من nigrosin ويوزين وصمة عار. احتضان هذا الخليط لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- مسحات مكان ميليلتر 20 قطره من عينة الحيوانات المنوية الملون في نهاية واحدة من شريحة زجاجية وتشويه صورة موحدة بطريقة مشابهة لتلك المستخدمة للدم. أيردري الشرائح بقع في درجة حرارة الغرفة لمدة 3-5 دقائق.
- مراقبة اللطاخة تحت المجهر. حساب عدد الحيوانات المنوية الحية (لا وصمة عار) والحيوانات المنوية ميتة (الملون الوردي) وحساب النسبة المئوية للحيوانات المنوية حية.
- تنفيذ المقايسة أككودينز، كما سبق التصديق عليه من الحيوانات المنوية الدجاج، تقييم موضوعي تنقل الحيوانات المنوية8 مع التعديلات التالية:
- بيبيت 1.0 مل من محلول الإنزيم 6% في الترعة البوليستيرين، كما هو موضح في الشكل 2. احتضان إلى 41 درجة مئوية.
ملاحظة: يتم استخدام 41 درجة مئوية لتتناسب مع درجة الحرارة الداخلية دجاجة. يجب أن يتطابق مع درجة حرارة الحضانة التناسلي الإناث من الأنواع التي يجري التحقيق فيها. - تراكب الحل المقايسة مسخن مع 100 ميكروليتر من عينة السائل المنوي بتركيز 5 × 108 خلايا/مل.
- المكان الذي يحتوي على ومبومو مضافين عينة الحيوانات المنوية في جهاز المطياف الضوئي. تسجيل قيمة امتصاص في 550 نانومتر.
- بيبيت 1.0 مل من محلول الإنزيم 6% في الترعة البوليستيرين، كما هو موضح في الشكل 2. احتضان إلى 41 درجة مئوية.
- تنفيذ المقايسة إيبفل-الاختراق كما هو موضح سابقا11 مع التعديلات التالية:
- قص قطعة (0.5 سم × 0.5 سم) من منطقة القرص غير جيرمنال إيبفل سليمة.
- ضبط تركيز الحيوانات المنوية إلى 4 × 106 خلايا/مل
- تبني الحيوانات المنوية في المخزن المؤقت للحركة مع إيبفل في قنينة زجاجية صغيرة لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية، كما هو مبين في الشكل 3.
- تزج قطعة إيبفل في 3% كلوريد الصوديوم لوقف التفاعل بين إيبفل والحيوانات المنوية.
- جبل قطعة إيبفل على شريحة المجهر ووصمة عار مع كاشف شيف الشعبية لمدة 10 دقيقة بعد التثبيت مع الفورمالين 10% ل 20 ثانية.
- مراقبة إيبفل تحت مجهر لنجاح الحيوانات المنوية اختراق الثقوب وإحصاء عدد جميع الثقوب تظهر الواحد 0.25 مم2 في 40 X التكبير.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تقنية بدجك وأسفر فصل متميزة من ثلاث طبقات من الحيوانات المنوية بدرجة من الجودة عبر كافة المعلمات. ويفصل بين الحيوانات المنوية إلى طبقة عالية الجودة فيما يلي الحل كثافة أعلى، طبقة متوسطة الجودة بين أعلى وأقل كثافة الحل وطبقة منخفضة الجودة أعلاه حل أقل كثافة. والدليل هذه الاختلافات في نوعية هي فروق واضحة في البقاء (الشكل 4) والتنقل (الشكل 5) بينيترابيليتي (الشكل 6). الحيوانات المنوية معزولة من طبقة عالية الجودة PDG أظهرت الزيادات في كافة المعلمات الثلاث، مقارنة بتلك العينة تقليديا غسلها. تلك الطبقات ذات النوعية المتدنية والمتوسطة عند انتهاء الخدمة قبل بدجك عرض معتدلة ودرامية، على التوالي، ولاحظت انخفاض عبر كل اختبار المعلمات.
الشكل 1 : عزل الحيوانات المنوية مع فرق الجودة باستخدام بدجك- تراكب 3 مل من محلول الحيوانات المنوية على استعداد PDG الحل. أجهزة الطرد المركزي في 1500 x غ 20 دقيقة لجمع ثلاث مجموعات متميزة من الحيوانات المنوية مع منخفضة ومتوسطة وعالية الجودة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : تحديد تنقل الحيوانات المنوية باستخدام مقايسة أككودينز. تراكب 100 ميكروليتر من عينة الحيوانات المنوية في حل مقايسة 6% في ومبومو. احتضان في 41 درجة مئوية للحد الأدنى 5 سجل الحركة الحيوانات المنوية كدالة لامتصاص في 550 نانومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 : نموذج لتشكيل الحيوانات المنوية اختراق الثقوب في إيبفل- تبني الحيوانات المنوية مع قسم صغير من إيبفل في 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. عند الاتصال مع إيبفل، ربط مع إيبفل خلايا الحيوانات المنوية والخضوع لفعل أكروسومي واختراق إيبفل، خلق ثغرات الاختراق. عد العدد من الثقوب الاختراق وقياس بينيترابيليتي للحيوانات المنوية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4 : بقاء الحيوانات المنوية حسب تقييم تلطيخ الحيوية ويوزين-نيجروسين- ميكروجرافس الرقمية عرض nigrosin ويوزين تلطيخ الحيوية للحيوانات المنوية التي تم الحصول عليها من خلال عملية الغسيل التقليدية (A) وبدجك (ب، انخفاض الحيوانات المنوية متحركة؛ ج، الحيوانات المنوية متحركة متوسطة؛ د الحيوانات المنوية متحركة عالية). شريط المقياس = 50 ميكرومتر في 40 x التكبير. تلوين الوردي يشير إلى الحيوانات المنوية ميتة التي اتخذت ويوزين وصمة عار. تعرض البيانات ل ANOVA أحادي الاتجاه، متبوعاً باختبار توكي-كرامر. أشرطة الخطأ تشير إلى الخطأ المعياري للوسط (SEM). يتم عرض القيم يعني ± ووزارة شؤون المرأة (n = 5). من أ إلى د القيم دون اختلف مرتفع مشتركة (ف < 0.05). الحيوانات المنوية معزولة من بدجك إلى مجموعات منخفضة ومتوسطة وعالية الجودة (ه) تكشف عن وجود اختلافات كبيرة في النسبة المئوية الجدوى، ± 66.0 4.7، 77.0 ± 8.9 و 92.8 ± 3، 4، على التوالي. عرض الحيوانات المنوية غسلها بالطرق التقليدية جدوى 4.9% 81.6 ±، أقل مما مجموعة عالية الجودة ولكن أعلى من المجموعات المتوسطة والمنخفضة الجودة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 5 : حركة الحيوانات المنوية حسب تقييم مقايسة أككودينز. امتصاص القيم بمثابة تدبير وكيل لتنقل الحيوانات المنوية في تقييم بمقايسة أككودينز. تعرض البيانات ل ANOVA أحادي الاتجاه، متبوعاً باختبار توكي-كرامر. أشرطة الخطأ تشير إلى الخطأ المعياري للوسط (SEM). يتم عرض القيم يعني ± ووزارة شؤون المرأة (n = 5). من أ إلى د القيم دون اختلف مرتفع مشتركة (ف < 0.05). الحيوانات المنوية معزولة في فئات منخفضة ومتوسطة وعالية الجودة بتقنية بدجك أظهرت اختلافاً منخفضة (0.11 ± 0.03) متوسطة (0.34 ± 0.01) وارتفاع قيم امتصاص (0.87 ± 0.03)، على التوالي. تعرض الحيوانات المنوية غسلها بالطرق التقليدية امتصاص 0.71 ± 0.03، امتصاص أقل من المجموعة عالية الجودة، ولكن أعلى من المجموعات المتوسطة والمنخفضة الجودة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 6 : بينيترابيليتي للحيوانات المنوية حسب تقييم مقايسة التفاعل طبقة (إيبفل) بيريفيتيليني الحيوانات المنوية-الداخلية- ميكروجرافس الرقمية التي تظهر في المختبر تشكيل ثقوب على سطح إيبفل واسطة الدجاج الحيوانات المنوية (4 × 106 خلايا/مل) أثناء حضانة في المخزن المؤقت لحركية في 37 درجة مئوية لتمثل ميكروجرافس 15 دقيقة إيبفل اخترقت بالحيوانات المنوية بعد أن خضع أغسل التقليدية (A) والحيوانات المنوية من منخفضة-(ب) (ج) ومتوسطة عالية-(د) نوعية مجموعات من بدجك. شريط المقياس = 50 ميكرومتر في 40 X التكبير. تعرض البيانات ل ANOVA أحادي الاتجاه، متبوعاً باختبار توكي-كرامر. أشرطة الخطأ تشير إلى الخطأ المعياري للوسط (SEM). يتم عرض القيم يعني ± ووزارة شؤون المرأة (n = 5). من أ إلى د القيم دون اختلف مرتفع مشتركة (ف < 0.05). يختلف العدد من الثقوب الإيلاج الواحد 0.25 مم2 (ه) بين الحيوانات المنوية معزولة عن تدرجات مختلفة من كثافة وسائل الإعلام. الحيوانات المنوية معزول في مجموعات منخفضة ومتوسطة وعالية الجودة بواسطة بدجك أنتج منخفض (24.40 ± 1.1)، متوسط (33.20 ± 1.4) وارتفاع عدد (51.20 ± 1.3) لاختراق الثقوب، على التوالي. إنتاج الحيوانات المنوية غسلها باستخدام الأسلوب التقليدي 46.40 ± 1.8 اختراق الثقوب، قيمة أقل من المجموعة عالية الجودة ولكن أعلى من المجموعات المتوسطة والمنخفضة الجودة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الخصوبة ليس فقط يحدد ربحية الإنتاج الحيواني ولكن أيضا بمثابة وسيلة للانتقاء الطبيعي للأنواع للوجود. الوظيفة في نهاية المطاف من خلية الحيوانات المنوية لتخصيب البويضة. تحديد قناة للإناث فقط تلك الحيوانات المنوية الأصلح ضمانا لاخصاب البويضة23،24. وأظهرت الدراسات في المختبر أيضا ارتباط وثيق بين الصفات النوعية الحيوانات المنوية والإخصاب النجاح4،11،،من2324. ويرتبط انخفاض الخصوبة مع ضعف نوعية الحيوانات المنوية4،11،25. على هذا النحو، فإنه يتطلب معالجة السائل المنوي لتحسين نوعية الحيوانات المنوية. في الفن، وطبق بدجك لجمع الحيوانات المنوية عالية الجودة فقط لتكملة الخصوبة للبشر والحيوانات زراعياً هاما13،16،،من2026. باستخدام هذا الأسلوب، نحن، بيد أن أظهر أسلوب لطيف، وغير الغازية للفصل بين منخفضة ومتوسطة والحيوانات المنوية عالية الجودة في نموذج الدجاج المحلي.
يسمح البروتوكول المقدم من بدجك، عند تنفيذ بشكل صحيح، فصل الحيوانات المنوية عالية الجودة ليس فقط، ولكن أيضا الفصل الفعلي للحيوانات المنوية منخفضة ومتوسطة الجودة. درجة نجاح بدجك يعتمد على التحضير بعناية للتدرج متقطع، فضلا عن التساوي جمع دقيق لطبقات معزولة. قطر الأنبوب المخروطية تستخدم يؤثر أيضا نجاح بدجك. وقد لاحظنا أن قطر أنبوب أكبر النتائج في انخفاض كفاءة التقنية. فمن المهم أن يتم تنفيذ بدجك في درجة حرارة الغرفة من أجل الحفاظ على سلامة PDG. ينبغي تعديل أي عينات مبردة مسبقاً إلى درجة حرارة الغرفة قبل وضعها على PDG. المشكلة الأكثر شيوعاً التي يمكن ملاحظتها بعد أداء بدجك فصل غير فعالة؛ طبقات معزولة لن تكون متميزة عن بعضها البعض. في حالة حدوث هذه المشكلة، بالإضافة إلى التصدي للخطوات الحاسمة المذكورة أعلاه، فيجوز تصحيحها بتقليل تمييع عينة، وزيادة وحدات التخزين من كثافة استخدام الحلول وتأمين وحدات تخزين الحلول المستخدمة على قدم المساواة.
بدجك قابل للتكيف جداً. يمكن استخدام أي مجموعة من كثافة بين 1.00 و 1.13 g/mL لإعداد التدرج. وقد وجدنا أن الحلول كثافة 1.07 و 1.08 g/mL تعمل جيدا لفصل الحيوانات المنوية الدجاج بنوعية، ولكن هذه الكثافة قد تحتاج إلى تعديل لأغراض تجريبية أو أنواع العينات الأخرى. كما يمكن تعديل عدد الحلول الكثافة المستخدمة في التدرج لتناسب احتياجات المجرب. عدد المجموعات النوعية معزولة ستكون دائماً أحد أكثر من عدد الحلول كثافة استخدامها.
بدجك هو أكثر فعالية من الأساليب البديلة لفصل العينة في الحالات التي تكون فيها كميات كبيرة من عينة حاجة13،16،،من2026. فحوصات الهجرة فعالية فصل الحيوانات المنوية جودة أعلى من18،عينة19، ولكن لا يمكن استخدامها لحل العينة أي زيادة. فحوصات الهجرة قادرين أيضا على إعداد كميات كبيرة من العينة18،20. تمسك العمود فحوصات منفصلة فعلياً كميات كبيرة من العينة17؛ ومع ذلك، العملية تضر بنوعية الحيوانات المنوية التي تم جمعها، مما يجعل تأكيدا لمجموعات الجودة بعد الانفصال الصعبة20،21. ومع ذلك، قد بدجك، القيود الخاصة به. في حالة الثدييات من الحيوانات المنوية، ينبغي عدم استخدامه لإعداد العينات في المختبر الإخصاب، بسبب التلوث المحتمل مع اندوتوكسينس27. لم يجر التحقيق فيها تأثير التلوث بركل مع اندوتوكسينس في فئات الحيوانات الأخرى. لا يتأثر الأداء الحيوانات المنوية اندوتوكسينس، بمعنى بدجك ما زال مناسباً لأغراض البحث.
مجموعة من الحيوانات المنوية بجودتها باستخدام تقنية بدجك ستكون مفيدة لمجموعة واسعة من التطبيقات بما في ذلك الدراسات التي تنطوي على الحيوانات المنوية الفسيولوجي، metabolomic، والبحوث ترانسكريبتوميك والبروتين. تطبيق هذه التقنية سوف تساهم في اكتشاف المؤشرات الحيوية لجودة الحيوانات المنوية للاستخدام في برامج تحسين الخصوبة بمساعدة الواسمات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
لا شيء.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Accudenz | Accurate Chemical and Scientific Corporation, Westbury, NY, USA | AN7050 | |
| Percoll | Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA | P7828 | |
| Schiff’s reagent | Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA | 3952016 | |
| TES | Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA | T1375 | |
| Eosin Y | Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA | E4009 | |
| Nigrosin | Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA | 198285 | |
| ST 40R Centrifuge | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA | 75004524 | |
| DU 530 Life Sciences UV/Vis Spectrophotometer | Beckman Coulter, Brea, CA, USA | No catalogue is found | |
| Olympus IX 71 Inverted Fluorescence and Phase Contrast Microscope | Olympus America Inc., PA, USA | No catalogue is found |
References
- Spargo, S. C., Hope, R. M. Evolution and nomenclature of the zona pellucida gene family. Biology Reproduction. 68, 358-362 (2003).
- Okamura, F., Nishiyama, H. The passage of spermatozoa through the vitelline membrane in the domestic fowl, Gallus gallus. Cell and Tissue Research. 188 (3), 497-508 (1978).
- Henkel, R., et al. Sperm function and assisted reproduction technology. Reproductive Medicine and Biology. 4, 7-30 (2005).
- Reddy, R. P. Artificial Insemination of broilers: Economic and management implications. Proceedings of 1st International Symposium on Artificial Insemination of Poultry. Poultry Science Association. Bakst, M. R., Wishart, G. J. , Savoy, Il. 73-89 (1995).
- Howarth, B. Jr An Examination for Sperm Capacitation in the Fowl. Biology of Reproduction. 3, 338-341 (1971).
- Menkveld, R., Holleboom, C. A. G., Rhemrev, J. P. T. Measurement and significance of sperm morphology. Asian Journal of Andrology. 13, 59-68 (2011).
- Kumaresan, A., Johannisson, A., Al-Essawe, E. M., Morrell, J. M. Sperm viability, reactive oxygen species, and DNA fragmentation index combined can discriminate between above- and below-average fertility bulls. Journal of Dairy Science. 100, 5824-5836 (2017).
- Froman, D. P., McLean, D. J. Objective measurement of sperm motility based upon sperm penetration of Accudenz. Poultry Science. 75, 776-784 (1996).
- Zaneveld, L. J., De Jonge, C. J., Anderson, R. A., Mack, S. R. Human sperm capacitation and the acrosome reaction. Human Reproduction. 6 (9), 1265-1274 (1991).
- Ahammad, M. U., et al. Acrosome reaction of fowl sperm: Evidence for shedding of acrosomal cap in intact form to release acrosomal enzyme. Poultry Science. 92 (3), 798-803 (2013).
- Ahammad, M. U., et al. Maturational changes in motility, acrosomal proteolytic activity, and penetrability of the inner perivitelline layer of fowl sperm, during their passage through the male genital tract. Theriogenology. 76 (6), 1100-1109 (2011).
- Chalah, T., Brillard, J. P. Comparison of assessment of fowl sperm viability by eosin-nigrosin and dual fluorescence. Theriogenology. 50 (3), 487-493 (1998).
- Aitken, R. J., West, K. M. Analysis of the relationship between reactive oxygen species production and leukocyte infiltration in fractions of human semen separated on Percoll gradients. International Journal of Andrology. 13, 433-451 (1990).
- Mortimer, D., Mortimer, S. T. Density Gradient Separation of Sperm for Artificial Insemination. Spermatogenesis. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols. Carrell, D., Aston, K. , Humana Press. Totowa, NJ, USA. 927 (2013).
- Qingling, Y., et al. Processing of semen by density gradient centrifugation selects spermatozoa with longer telomeres for assisted reproduction techniques. Reproductive BioMedicine Online. 31, 44-50 (2015).
- Moohan, J. M., Lindsay, K. S. Spermatozoa selected by a discontinuous Percoll density gradient exhibit better motion characteristics, more hyperactivation, and longer survival than direct swim-up. Fertility and Sterility. 64 (1), 160-165 (1995).
- Paulson, J. D., Polakoski, K. L. A glass wool column procedure for removing extraneous material from human ejaculate. Fertility and Sterility. 28, 178-181 (1977).
- Ahammad, M. U., Chiaki, N., Tatemoto, H., Kawamoto, Y., Nakada, T. Utilization of the swim-up migration sedimentation technique to separate viable and progressively motile fowl spermatozoa. World's Poultry Science Association Proceedings. , Cambridge University Press. (2010).
- Lucena, E., et al. Recovery of motile sperm using the migration-sedimentation technique in an in vitro fertilization-embryo transfer programme. Human Reproduction. 4 (2), 163-165 (1989).
- Henkel, R. Sperm Processing for IVF. Clinical Embryology: A Practical Guide. , Springer Science and Business Media. New York, USA. (2013).
- Sherman, J., Paulson, D., Liu, K. Effect of glass wool filtration on ultrastructure of human spermatozoa. Fertility and Sterility. 36, 643-647 (1981).
- Freund, M., Carol, B. Factors affecting haemocytometer counts of sperm concentration in human semen. Journal of Reproduction and Fertility. 8, 149-155 (1964).
- Bakst, M. R., Wishart, G. J., Brillard, J. P. Oviducal sperm selection, transport and storage in poultry. Poultry Science Review. 5, 117-143 (1994).
- Ahammad, M. U., Okamoto, S., Kawamoto, Y., Nakada, T. The effects of regular fluid secretion from the uterus of laying hens on the longevity and fertilization ability of fowl sperm in the oviduct. Poultry Science Journal. 1 (1), 13-22 (2013).
- Ahammad, M. U., et al. Maturational changes in the survivability and fertility of fowl sperm during their passage through the male reproductive tract. Animal Reproduction Science. 128 (1-4), 129-136 (2011).
- Choi, K. H., Emery, D. A., Straub, D. E., Lee, C. S. Percoll process can improve semen quality and fertility in turkey breeders. Asian-Australasian Journal of Animal Sciences. 12 (5), 702-707 (1999).
- Chen, M. J., Bongso, A. Comparative evaluation of two density gradient preparations for sperm separation for medically assisted conception. Human Reproduction. 14 (3), 759-764 (1999).
