Summary
I dette papir, vi sigter mod at beskrive tæthed gradient centrifugering teknik og dens anvendelse i sæd fysiologi forskning ydeevne.
Abstract
I seksuel reproduktion, en mandlig gamet eller sædcelle sikringer med en kvindelig gamet at bringe om befrugtning. Men et stort antal sædceller med befrugtende evne skal interagere med en kvindelig gamet at sikre befrugtning. Som sådan, er gødskning evne til individuelle sædceller afgørende for vellykket reproduktion. Tæthed gradient centrifugering har været udnyttet i flere årtier som en reproducerbar, hurtig, effektiv og særdeles fleksibel metode til at indsamle kun høj kvalitet sæd anvendes i assisteret reproduktiv teknologi. De protokoller vi beskrevet heri fokusere på udnyttelse af den diskontinuerlige Percoll tæthed gradient centrifugering (PDGC) teknik til at isolere tre adskilte populationer af hane sperm af deres kvalitet. Vi var i stand til at indsamle lav-, mellem- og lang-seriøs sperm. Vi beskriver også reproducerbare protokoller, der indebærer afgørende frugtbarhed potentiale af sædceller ved at vurdere deres levedygtighed, mobilitet og gennemslagskraft. Samling af sperm af deres kvalitet ved hjælp af PDGC teknik ville være nyttigt at præcist og grundigt karakterisere sperm med differentieret frugtbarhed potentielle.
Introduction
I hvirveldyr gennemgå mandlige kønsceller intens selektivt pres; reproduktiv fitness af en mand er derfor afgørende for at opnå succesfulde befrugtning. Hanner af enhver given vertebrater skal være i stand til at producere sædceller i store mængder og af tilstrækkelig kvalitet for at opfylde behovene hos befrugtning. Sædceller, at have både en sperm hoved og en fimrehår, er de mest polariserede celler i kroppen. De er også meget heterogene i sædkvalitet (levende og døde, morfologisk normale og unormale og immobile, lav mobile og høj mobile), som er åbenbaret gennem den brede variation i reproduktiv effektivitet af hannerne. Jo større andel af høj kvalitet sædceller, færre antallet af parringer kræves for at med held befrugte ægget. Men for at opnå frugtbarhed, morfologisk normale sædceller stole på fremdrivningseffektiviteten styrker genereret af deres flageller at nå stedet for befrugtning samt at trænge igennem zona pellucida1 (ZP; for pattedyr) eller indre perivitelline Layer2 (IPVL, fugle og krybdyr) af ægget efter naturlig parring eller kunstig befrugtning (AI). Bestemmelse af sæd kvalitet er nødvendigt til brug i assisteret reproduktionsteknologi3 (kunst) og udvalg af ynglende hanner skal anvendes i AI programmer4. På den anden side er succes af kunst udelukkende afhængig af den præcise vurdering af sædkvalitet. En række af laboratorieundersøgelser er blevet udviklet for at bestemme de funktionelle egenskaber af sæd. De vigtigste parametre er sperm morfologi, levedygtighed, mobilitet, retsevne (aviær sæd ikke kræver retsevne5), acrosome reaktion (AR; exocytose og frigivelse af et proteolytisk enzym fra acrosome af sperm hoved), sperm penetration af ZP eller IPVL og befrugtning6,7,8,9,10,11. Foranstaltninger af fertilitet alene giver ikke en nøjagtig vurdering af gødskning evne til en sæd befolkning11. Foranstaltninger af de flere begivenheder, der førte til befrugtning af æg giver mulighed for en passende repræsentation af udførelsen af individuelle spermatocytes7.
Den metode, udviklet til måling af sperm funktion er primært artsspecifikke. For eksempel i aviær sperm er levedygtighed, mobilitet og penetration af IPVL de mest almindelige parametre bruges til at vurdere sæd kvalitet8,11,12. Antallet af levende sædceller i sædvæsken spiller en afgørende rolle for overlevelse af sædceller, fordi tilstedeværelsen af et stort antal døde sædceller i sædvæsken påvirker kvaliteten af sperm. Dette øger produktion af reaktive ilt arter i sæden og forårsager oxidative skader på levende sædceller13. Sperm mobilitet, kapacitet til flagellaternes bevægelse af aviær sæd mod modstand ved kropstemperatur, er kendt for at spille en direkte rolle i at bringe om befrugtning8. Det er veletableret, at mobilitet er positivt korreleret med frugtbarhed og er derfor en primær faktor for frugtbarhed8. En mobil sæd skal dog også have mulighed for at gennemgå en AR og trænge IPVL11. IPVL penetration assays tage højde for hver sædceller, der deltager i processen med befrugtning11.
I anvendelsen af kunst behandles ejakulere normalt med henblik på at maksimere koncentrationen af sædceller af høj kvalitet og minimere koncentrationen af sædceller, lav kvalitet. Efter opsamlingen af sæden, kan andelen af høj kvalitet sædceller blive beriget gennem sperm adskillelse procedurer almindeligt anvendt i praksis både industri og forskning. Mange af disse procedurer er blevet udviklet, alle med respektive fordele og begrænsninger, men alle udnytte det heterogene karakter af sæd til at indsamle kun sæd med højt gødskning evne. Disse procedurer omfatter sæd overførselsmetoder, overholdelse af kolonne filtrering og tæthed gradient centrifugering (DGC)14,15,16,17,18,19 , 20. blandt de tilgængelige teknikker, DGC har vist sig for at være meget enkel, repeterbare, omkostningseffektive og effektive i isolere den maksimale mængde af høj kvalitet sæd til brug ved kunst med mål af maksimering chance for befrugtning14 , 15. Derudover DGC er ikke skadelig for sperm cellemembran. Derimod sperm overflytningsmetoder indsamler kun gradvis mobile sperm18,19, men mængden af sæd opsamlet er meget lav, hvilket gør det ineffektivt i at indsamle store mængder sperm18, 20. overholdelse af kolonne filtrering er meget effektiv i filtrering meget mobile sæd fra sæd17; men det har tendens til at være skadelig for sperm membraner20,21.
I DGC teknik er de mest almindeligt anvendte substrat til at generere tæthed farveforløb Percoll, som består af kolloid silica partikler belagt med polyvinylpryrolidone. Percoll tæthed gradient centrifugering (PDGC) kan enten være kontinuerligt eller diskontinuerligt, men en diskontinuerlig gradient er mest brugt til højtydende isolering af stærkt mobile sperm13,16,20. I en diskontinuerlig gradient svæver lavere massefylde media over højere tæthed medier, at skabe et forløb, der øger i tæthed fra toppen til bunden af en konisk slange. Dette skaber grænser på grænsefladen mellem to medier af forskellig densitet. Effektiviteten af PDGC er afledt af to faktorer: 1) fremdrivningseffektiviteten mulighed for individuelle sædceller og 2) sædceller med høj strukturel integritet tendens til at have en øget tæthed. Sæd med højere mobilitet er bedre i stand til at krydse fra lavere massefylde medier og trænge ind i en højere densitet medier. Lavere mobilitet sæd er mere tilbøjelige til at blive fanget på grænsen lavet af grænsefladen mellem medier af forskellig densitet. Sædceller med høj strukturel integritet og mobilitet har tendens til at have en højere densitet end døde, unormal eller lav mobile sædceller. Når centrifugalkraften anvendes i PDGC, letter det bevægelse af sædceller med forskellige tætheder til deres respektive sted i farveforløbet.
I almen praksis, når PDGC er udført, den bløde pellet af sperm med høj fertilitet potentielle nederst i den koniske rør er indsamlet, og resten er kasseret. Men en underudnyttet fordel af denne teknik er dens evne til at adskille sædceller i flere grupper baseret på kvalitetsforskellene. Til forskningsformål, adskillelse af sperm af graden af kvalitet udnytter PDGC teknik giver mulighed for undersøgelse af sædkvaliteten som den vedrører fysiologisk, metabolomic og proteom forskelle. Her, tilstræber vi at detaljer, hvordan denne teknik kan bruges til at adskille sperm af kvaliteten, samt vise disse forskelle i kvalitet, ved hjælp af den tidligere etablerede eosin-nigrosin vitale farvning for levedygtighed, Accudenz assay for mobilitet, og sæd-IPVL interaktion assay for gennemslagskraft.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metoder beskrevet her er blevet godkendt af institutionelle Animal Care og brug udvalg (IACUC) på University of Georgia.
1. vask ved hjælp af traditionelle centrifugering
- Forberede fosfatstødpudeopløsningen (PBS). Tilføje 8,0 g NaCl, 0,2 g af KCl, 1.44 g Na2HPO4 og 0,24 g KH2PO4 til 800 mL destilleret vand (dH2O). PH indstilles til 7.4 ved hjælp af 0,1 N HCl og bringer løsningen til 1 L med dH2O.
- Forberede motilitet buffer. Tilføje 6,5 g NaCl, 4,5 g glucose, 0.444 g af CaCl2 og 11,5 g af N - tris-[hydroxymethyl] methyl-2-amino-ethanesulfonic syre (TES) til 800 mL af dH2O. ph indstilles til 7.4 ved hjælp af 1 M NaOH og bringer løsningen til 1 L med dH2O.
- 0,5 mL af sæd pipetteres i et polypropylen microcentrifuge rør. Tilsæt 1,0 mL PBS og bland forsigtigt.
- Der centrifugeres ved 1.500 x g i 10 min. ved stuetemperatur (RT) og supernatanten. Resuspenderes sperm med PBS op til 1,5 mL.
- Der centrifugeres ved 1.500 x g i 10 min. ved RT. Resuspend sæden pellet med motilitet buffer op til 0,5 mL.
2. udføre PDGC teknik
Bemærk: Udføre hele processen med PDGC ved stuetemperatur.
- Gøre 3,0 mL af 1.08 g/mL og 1.07 g/mL Percoll løsninger i to separate rør.
- I et rent reagensglas tilsættes 1.712 mL 1.13 g/mL original Percoll til 0,3 mL 1,5 M NaCl opløsning. Tilføje 0.988 mL af dH2O og mix af blid inversion at gøre 3,0 mL af en 1.08 g/mL tæthed løsning.
- I et rent reagensglas tilsættes 1.482 mL 1.13 g/mL original Percoll til 0,3 mL 1,5 M NaCl opløsning. Tilføje 1.218 mL af dH2O og mix af blid inversion at gøre 3,0 mL af en 1.07 g/mL tæthed løsning.
- 1,0 mL af sæd prøve 1:2 med 2,0 mL PBS fortyndes i et rent reagensglas. Bland forsigtigt af pipettering.
- Med pipette overfoeres 3,0 mL af 1.07 g/mL tæthed i en steril 15 mL konisk slange. Omhyggeligt afpipetteres 3,0 mL af 1.08 g/mL tæthed under 1.07 g/mL tæthed løsning. Sikre, at de to lag ikke blandes. En lang-form (9 i) Pasteur pipette kan gøre dette trin lettere.
- Med pipette overfoeres 3,0 mL fortyndet sædprøve ovenpå PDG. At sikre, at sædprøven ikke blandes med PDG, forsigtigt vippe den koniske rør indeholdende PDG i en 45° vinkel. Med pipette overfoeres prøve langs mur af røret og lad det flyde ned i røret og over PDG.
- Forberede en tomme rør til at matche massen af PDG med overlejres prøve. Der centrifugeres begge rør på 1500 x g til 20 min. være omhyggelig med at opretholde den diskontinuert gradient mens overføre rørene fra bænken til balancen og derefter til centrifugen.
Bemærk: Brug ikke bremsen i slutningen af centrifugering. - Observere resultaterne. Sikre at tre særskilte sæd lag har dannet i røret, som det ses i figur 1.
- Opsug isolerede sæd lag med en pipette. Indsamle de øverste lag af sæd først, midten lag andet og sidste hårde pellet i bunden af røret. Overføre hver til en ren og steril polypropylenmicrocentrifuge tube.
- Fortynd hver prøve til 1,5 mL med PBS. Der centrifugeres ved 1500 x g i 10 min.
- Hæld supernatanten. Rekonstruere sperm pellet med motilitet buffer ved blid pipettering.
Bemærk: Alternative tætheder kan bruges til investigator behov. Bestemme mængder af ingredienser, der anvendes med følgende ligning, hvor v0 er volumen af materiel tæthed løsning bruges, v er endelige mængden af løsning ønskede, p er tætheden af endelige tæthed løsning ønskede og Pedersen0 er tæthed af den bestand tæthed løsning:
Altid bruge 0,3 mL 1,5 M NaCl i forberedelsen af tæthed løsninger til at matche NaCl-koncentration af fysiologisk saltvand.
3. bestemmelse af sædkvalitet
- Beregne koncentrationen af sædceller som tidligere beskrevet22.
- Udføre eosin-nigrosin vitale farvning som tidligere beskrevet12 med følgende ændringer:
- Forberede 100 µL af sperm løsning ved en koncentration på 1 x 108 celler/mL.
- Med pipette overfoeres 50 µL af sperm løsning i polypropylen microcentrifuge rør indeholdende et lige saa stort volumen af eosin-nigrosin pletten. Inkuber blandingen i 5 min ved stuetemperatur.
- Sted en 20 µL drop af bejdset sædprøve i den ene ende af et glas dias og smøre ensartet på samme måde som der anvendes for blod udstrygninger. Lufttørre udtværet dias ved stuetemperatur i 3-5 min.
- Observere smøre under mikroskop. Tæl antallet af levende sædceller (ingen pletten) og døde sædceller (farves lyserød) og beregne procentdelen af levende sædceller.
- Udføre Accudenz analyse, som tidligere godkendt til kylling sæd, at objektivt vurdere sperm mobilitet8 med følgende ændringer:
- Med pipette overfoeres 1,0 mL af 6% assay løsning i polystyren kuvetter, som illustreret i figur 2. Inkuber til 41 ° C.
Bemærk: 41 ° C bruges til at matche den indre temperatur i en høne. Inkubation temperatur skal matche af den kvindelige forplantningsorganerne for de arter, der undersøges. - Overlay forvarmet assay løsning med 100 µL af sædprøven i en koncentration på 5 x 108 celler/mL.
- Sted kuvette indeholdende overlejret sædprøve i spektrofotometret. Optage værdien absorbans ved 550 nm.
- Med pipette overfoeres 1,0 mL af 6% assay løsning i polystyren kuvetter, som illustreret i figur 2. Inkuber til 41 ° C.
- Udføre IPVL-penetration assay som tidligere beskrevet11 med følgende ændringer:
- Skære et stykke (0,5 cm x 0,5 cm) af ikke-germinale disken region af intakt IPVL.
- Justere koncentrationen af sædceller til 4 x 106 celler/mL
- Inkuber sædceller i motilitet buffer med IPVL i en lille hætteglas i 15 min. ved 37 ° C, som illustreret i figur 3.
- Fordyb IPVL stykke i 3% NaCl at stoppe samspillet mellem IPVL og sperm.
- Mount IPVL stykke på et objektglas og pletten med Schiff's reagens i 10 min efter fiksering med 10% formalin til 20 s.
- Observere IPVL under et mikroskop for vellykket sperm penetration huller og tælle antallet af alle synlige huller pr. 0,25 mm2 på 40 X forstørrelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
PDGC teknik resulterede i tydelig adskillelse af tre lag af sperm af graden af kvalitet på tværs af alle parametre. Sperm adskiller i en høj kvalitet lag under den højere tæthed løsning, et medium kvalitet lag mellem de højere og lavere massefylde løsning og en lav kvalitet lag over den lavere massefylde løsning. Disse forskelle i kvalitet er dokumenteret ved klare forskelle i levedygtighed (figur 4), mobilitet (figur 5) og gennemslagskraft (figur 6). Sperm isoleret fra høj kvalitet lag af PDG udstillet stigninger i alle tre parametre i forhold til de af traditionelt vasket prøven. Disse lag noteret som medium - og lav kvalitet ved adskillelse af PDGC vise moderat og dramatiske, henholdsvis, falder på tværs af alle testparametre.
Figur 1 : Isolering af sperm med differentieret kvalitet ved hjælp af PDGC. Overlay 3 mL af sperm løsning på rede PDG løsning. Der centrifugeres ved 1500 x g i 20 min. indsamle tre forskellige grupper af sperm med low, medium og høj kvalitet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Bestemmelse af sperm mobilitet ved hjælp af Accudenz assay. Overlay 100 µL af sædprøve på en 6% assay løsning i en kuvette. Inkuber ved 41 ° C i 5 min. post mobilitet af sæd som en funktion af absorbans ved 550 nm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : En model for dannelsen af sæd penetration huller i IPVL. Inkuber sæd med en lille afdeling af IPVL ved 37 ° C i 15 min. Ved kontakt med IPVL, sædceller bind med IPVL, undergår en acrosome reaktion og trænge ind i IPVL, at skabe penetration huller. Tæl antallet af penetration huller og måle gennemslagskraft af sædceller. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : Levedygtighed af sperm som vurderet af eosin-nigrosin vitale farvning. Digital micrographs viser eosin-nigrosin vitale farvning af sperm opnået gennem en proces af traditionelle vask (A) og PDGC (B, lav motile sædceller; C, medium motile sædceller; D, høj motile sædceller). Skalalinjen = 50 µm på 40 x forstørrelse. Pink farvning angiver døde sædceller, som har overtaget eosin pletten. Data blev udsat for en-vejs ANOVA, efterfulgt af Tukey-Kramer test. Fejllinjer angiver standardafvigelsen på middelværdien (SEM). Værdier er præsenteret som den gennemsnit ± SEM (n = 5). a-d Værdier uden en fælles hævet afveg (P < 0,05). Sperm isoleret af PDGC i lav-, mellem- og lang-seriøs grupper (E) afslører store forskelle i procentdelen levedygtighed, 66,0 ± 4.7, 77.0 ± 8,9 og 92,8 ± 3.4, henholdsvis. Sperm vasket af traditionelle metoder vises en 81,6 ± 4,9% levedygtighed, lavere end den gruppe, høj kvalitet, men højere end medium og lav kvalitet grupper. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5 : Mobilitet af sperm som vurderet af Accudenz assay. Absorbans værdier fungere som et alternativt mål for sperm mobilitet i vurdering af Accudenz analyse. Data blev udsat for en-vejs ANOVA, efterfulgt af Tukey-Kramer test. Fejllinjer angiver standardafvigelsen på middelværdien (SEM). Værdier er præsenteret som den gennemsnit ± SEM (n = 5). a-d Værdier uden en fælles hævet afveg (P < 0,05). Sperm isoleret i lav-, mellem- og lang-seriøs grupper af PDGC teknik udstillet markant forskellige lav (0,11 ± 0,03), medium (0,34 ± 0,01) og høj (0.87 ± 0,03) absorbans værdier, henholdsvis. Sperm vasket af traditionelle metoder udstillet en absorbans på 0.71 ± 0,03, en lavere end den lang-seriøs gruppe, men højere end i grupperne medium og lav kvalitet absorbans. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6 : Gennemslagskraft af sperm som vurderet af sæd-indre perivitelline lag (IPVL) interaktion assay. Digital micrographs viser in vitro- dannelsen af huller på overfladen af IPVL af kylling sæd (4 x 106 celler/mL) under inkubation i motilitet buffer ved 37 ° C i 15 min. Micrographs repræsenterer IPVL gennemtrænges af sæd har gennemgået traditionelle vask (A) og sæd fra lav - (B), medium - (C) og high - d kvalitetsgrupper fra PDGC. Skalalinjen = 50 µm på 40 X forstørrelse. Data blev udsat for en-vejs ANOVA, efterfulgt af Tukey-Kramer test. Fejllinjer angiver standardafvigelsen på middelværdien (SEM). Værdier er præsenteret som den gennemsnit ± SEM (n = 5). a-d Værdier uden en fælles hævet afveg (P < 0,05). Antallet af penetration huller pr. 0,25 mm2 (E) varierede mellem sæden isoleret fra de forskellige forløb af tæthed medier. Sperm isoleret i lav-, mellem- og lang-seriøs grupper af PDGC produceret en lav (24.40 ± 1.1), medium (33.20 ± 1.4) og høj (51.20 ± 1.3) antallet af penetration huller, henholdsvis. Sæden vasket ved hjælp af den traditionelle metode produceret 46.40 ± 1.8 penetration huller, en værdi lavere end gruppen høj kvalitet men højere end medium og lav kvalitet grupper. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fertilitet ikke kun bestemmer rentabiliteten af animalsk produktion men også fungerer som et middel til naturlig udvælgelse af arter for eksistens. Den ultimative funktion af en sædcelle er at befrugte et æg. Oviduct af en kvinde vælger kun de stærkeste sæd for at sikre befrugtning af ægcellen23,24. In vitro undersøgelser har også afsløret en tæt sammenhæng mellem kvalitativ sperm træk og befrugtning succes4,11,23,24. Nedsat frugtbarhed er forbundet med dårlig kvalitet af sædceller4,11,25. Som sådan, kræver det behandling sæd til forbedring af sædkvaliteten. I kunst, er PDGC blevet anvendt til at indsamle kun høj kvalitet sæd for at supplere fertilitet hos mennesker og landbrugsmæssigt vigtigt dyr13,16,20,26. Brug af denne teknik, påvist vi, dog en blid, ikke-invasiv teknik, adskille low, medium og høj kvalitet sædceller i den indenlandske kylling model.
PDGC, når de udføres korrekt, præsenteres protokollen tillader adskillelse af ikke kun høj kvalitet sæd, men også effektiv adskillelse mellem lav og medium kvalitet sperm. Graden af succes af PDGC er afhængig af omhyggelig forberedelse af diskontinuert gradient samt lige så omhyggelig samling af isolerede lag. Diameter af koniske rør anvendes også indflydelse på succesen med PDGC. Vi har observeret, at en større rørdiameter resulterer i nedsat effektivitet af teknikken. Det er vigtigt, at PDGC udføres ved stuetemperatur for at bevare integriteten af PDG. Eventuelle tidligere nedkølet prøver bør justeres til stuetemperatur før den placeres på PDG. De mest almindelige spørgsmål, der kunne konstateres efter udførelse af PDGC er ineffektive adskillelse; de isolerede lag vil ikke være adskilt fra hinanden. Hvis dette problem opstår, ud over at løse ovenstående kritiske trin, det kan rettes ved at reducere prøveopløsning, øge mængderne af tæthed løsninger anvendes og sikre løsninger anvendes mængder er lige.
PDGC er meget fleksibel. Enhver række tætheder mellem 1,00 og 1.13 g/mL kan anvendes til forberedelse af gradient. Vi har fundet at 1,07 og 1.08 g/mL tæthed løsninger fungerer godt for adskillelse af kylling sperm af kvalitet, men disse tætheder muligvis justering for andre prøve typer eller forsøgsformål. Antallet af tæthed løsninger anvendes i farveforløbet kan også justeres for at passe til behovene hos eksperimentatoren. Antallet af kvalitetsgrupper isoleret vil altid være en mere end antallet af tæthed løsninger anvendes.
PDGC er langt mere effektiv end alternative metoder til prøven adskillelse i situationer, hvor store mængder af prøven nødvendige13,16,20,26. Migration assays adskille effektivt den højeste kvalitet sæd fra en prøve18,19, men de kan ikke bruges til at løse prøven. Migration assays er også i stand til at forberede store mængder af prøven18,20. Overholdelse af kolonne assays adskille effektivt store mængder af prøven17; Men, processen er skadelig for kvaliteten af sæd opsamlet, gør bekræftelse af grupperne kvalitet efter separation vanskeligt20,21. PDGC, har dog sine egne begrænsninger. Ved pattedyr sædceller, bør det ikke anvendes til tilberedning af prøver til in vitro- befrugtning, på grund af den mulige forurening med endotoksin27. Effekten af Percoll forurening med endotoksin er ikke blevet undersøgt i andre dyrs klasser. Sperm ydeevne påvirkes ikke af endotoksiner, hvilket betyder, at PDGC er stadig velegnet til forskningsformål.
Samling af sperm af deres kvalitet ved hjælp af PDGC teknik vil være medvirkende til en bred vifte af applikationer, herunder undersøgelser, hvor sædcellerne fysiologisk, metabolomic, transkriptom og proteom forskning. Anvendelse af denne teknik vil bidrage til opdagelsen af biomarkører af sædkvalitet til brug i markør-assisteret frugtbarhed forbedring programmer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Ingen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Accudenz | Accurate Chemical and Scientific Corporation, Westbury, NY, USA | AN7050 | |
| Percoll | Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA | P7828 | |
| Schiff’s reagent | Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA | 3952016 | |
| TES | Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA | T1375 | |
| Eosin Y | Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA | E4009 | |
| Nigrosin | Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA | 198285 | |
| ST 40R Centrifuge | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA | 75004524 | |
| DU 530 Life Sciences UV/Vis Spectrophotometer | Beckman Coulter, Brea, CA, USA | No catalogue is found | |
| Olympus IX 71 Inverted Fluorescence and Phase Contrast Microscope | Olympus America Inc., PA, USA | No catalogue is found |
References
- Spargo, S. C., Hope, R. M. Evolution and nomenclature of the zona pellucida gene family. Biology Reproduction. 68, 358-362 (2003).
- Okamura, F., Nishiyama, H. The passage of spermatozoa through the vitelline membrane in the domestic fowl, Gallus gallus. Cell and Tissue Research. 188 (3), 497-508 (1978).
- Henkel, R., et al. Sperm function and assisted reproduction technology. Reproductive Medicine and Biology. 4, 7-30 (2005).
- Reddy, R. P. Artificial Insemination of broilers: Economic and management implications. Proceedings of 1st International Symposium on Artificial Insemination of Poultry. Poultry Science Association. Bakst, M. R., Wishart, G. J. , Savoy, Il. 73-89 (1995).
- Howarth, B. Jr An Examination for Sperm Capacitation in the Fowl. Biology of Reproduction. 3, 338-341 (1971).
- Menkveld, R., Holleboom, C. A. G., Rhemrev, J. P. T. Measurement and significance of sperm morphology. Asian Journal of Andrology. 13, 59-68 (2011).
- Kumaresan, A., Johannisson, A., Al-Essawe, E. M., Morrell, J. M. Sperm viability, reactive oxygen species, and DNA fragmentation index combined can discriminate between above- and below-average fertility bulls. Journal of Dairy Science. 100, 5824-5836 (2017).
- Froman, D. P., McLean, D. J. Objective measurement of sperm motility based upon sperm penetration of Accudenz. Poultry Science. 75, 776-784 (1996).
- Zaneveld, L. J., De Jonge, C. J., Anderson, R. A., Mack, S. R. Human sperm capacitation and the acrosome reaction. Human Reproduction. 6 (9), 1265-1274 (1991).
- Ahammad, M. U., et al. Acrosome reaction of fowl sperm: Evidence for shedding of acrosomal cap in intact form to release acrosomal enzyme. Poultry Science. 92 (3), 798-803 (2013).
- Ahammad, M. U., et al. Maturational changes in motility, acrosomal proteolytic activity, and penetrability of the inner perivitelline layer of fowl sperm, during their passage through the male genital tract. Theriogenology. 76 (6), 1100-1109 (2011).
- Chalah, T., Brillard, J. P. Comparison of assessment of fowl sperm viability by eosin-nigrosin and dual fluorescence. Theriogenology. 50 (3), 487-493 (1998).
- Aitken, R. J., West, K. M. Analysis of the relationship between reactive oxygen species production and leukocyte infiltration in fractions of human semen separated on Percoll gradients. International Journal of Andrology. 13, 433-451 (1990).
- Mortimer, D., Mortimer, S. T. Density Gradient Separation of Sperm for Artificial Insemination. Spermatogenesis. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols. Carrell, D., Aston, K. , Humana Press. Totowa, NJ, USA. 927 (2013).
- Qingling, Y., et al. Processing of semen by density gradient centrifugation selects spermatozoa with longer telomeres for assisted reproduction techniques. Reproductive BioMedicine Online. 31, 44-50 (2015).
- Moohan, J. M., Lindsay, K. S. Spermatozoa selected by a discontinuous Percoll density gradient exhibit better motion characteristics, more hyperactivation, and longer survival than direct swim-up. Fertility and Sterility. 64 (1), 160-165 (1995).
- Paulson, J. D., Polakoski, K. L. A glass wool column procedure for removing extraneous material from human ejaculate. Fertility and Sterility. 28, 178-181 (1977).
- Ahammad, M. U., Chiaki, N., Tatemoto, H., Kawamoto, Y., Nakada, T. Utilization of the swim-up migration sedimentation technique to separate viable and progressively motile fowl spermatozoa. World's Poultry Science Association Proceedings. , Cambridge University Press. (2010).
- Lucena, E., et al. Recovery of motile sperm using the migration-sedimentation technique in an in vitro fertilization-embryo transfer programme. Human Reproduction. 4 (2), 163-165 (1989).
- Henkel, R. Sperm Processing for IVF. Clinical Embryology: A Practical Guide. , Springer Science and Business Media. New York, USA. (2013).
- Sherman, J., Paulson, D., Liu, K. Effect of glass wool filtration on ultrastructure of human spermatozoa. Fertility and Sterility. 36, 643-647 (1981).
- Freund, M., Carol, B. Factors affecting haemocytometer counts of sperm concentration in human semen. Journal of Reproduction and Fertility. 8, 149-155 (1964).
- Bakst, M. R., Wishart, G. J., Brillard, J. P. Oviducal sperm selection, transport and storage in poultry. Poultry Science Review. 5, 117-143 (1994).
- Ahammad, M. U., Okamoto, S., Kawamoto, Y., Nakada, T. The effects of regular fluid secretion from the uterus of laying hens on the longevity and fertilization ability of fowl sperm in the oviduct. Poultry Science Journal. 1 (1), 13-22 (2013).
- Ahammad, M. U., et al. Maturational changes in the survivability and fertility of fowl sperm during their passage through the male reproductive tract. Animal Reproduction Science. 128 (1-4), 129-136 (2011).
- Choi, K. H., Emery, D. A., Straub, D. E., Lee, C. S. Percoll process can improve semen quality and fertility in turkey breeders. Asian-Australasian Journal of Animal Sciences. 12 (5), 702-707 (1999).
- Chen, M. J., Bongso, A. Comparative evaluation of two density gradient preparations for sperm separation for medically assisted conception. Human Reproduction. 14 (3), 759-764 (1999).
