Summary
I detta papper, vi strävar efter att beskriva utförandet av täthet lutning centrifugering tekniken och dess tillämpning i spermier fysiologi forskning.
Abstract
I sexuell reproduktion, en manliga könsceller eller spermie säkringar med en kvinnlig könscell att åstadkomma befruktning. Dock krävs ett stort antal spermier med gödsling förmåga att interagera med en kvinnlig könscell att säkerställa befruktning. Som sådan, är gödsla förmågan av enskilda spermier avgörande för framgångsrik fortplantningen. Densitet gradient centrifugering har använts i flera decennier som en reproducerbar, snabb, effektiv, effektiv och extremt anpassningsbart metod att samla endast högkvalitativa spermier ska användas i assisterad reproduktiv teknologi. De protokoll som vi beskrivs häri fokusera på utnyttjandet av diskontinuerlig Percoll täthet lutning centrifugering (PDGC) tekniken att isolera tre distinkta populationer av tupp spermier av deras kvalitet. Vi kunde samla in låg-, medel- och hög kvalitet spermier. Vi beskriver också reproducerbara protokoll som medför avgörande fertilitet potential av spermier genom att bedöma deras livskraft, rörlighet och genomtränglighet. Insamling av sperma av kvaliteten med PDGC teknik skulle vara användbart för att korrekt och noggrant karakterisera spermier med differentiell fertilitet potentiella.
Introduction
Hos ryggradsdjur genomgår manliga könsceller intensiv selektiv tryck; reproduktiv konditionen av en manlig är därför avgörande för att uppnå framgångsrik befruktning. Hanar av någon viss ryggradsdjur arter måste kunna producera spermier i stora mängder och av tillräcklig kvalitet för att tillgodose behovet för befruktning. Spermier celler, som har både en spermier huvudet och en flagellen, är de mest polariserade cellerna i kroppen. De är också mycket heterogen i kvaliteten på spermierna (levande och döda, morfologiskt normala och onormala och orörlig, låg mobil och hög mobil), som avslöjas genom den stora variationen i reproduktiv effektivitet av hanarna. Ju större andelen högkvalitativa spermier, färre till antalet parningar som krävs för att framgångsrikt befrukta en äggcell. Men för att uppnå fertilitet, morfologiskt normala spermier lita på framåtdrivande krafter genereras av deras flagella att nå platsen för befruktning samt att penetrera zona pellucida1 (ZP; i fråga om däggdjur) eller inre perivitelline lager2 (IPVL; i fråga om fåglar och reptiler) av det ägget efter naturlig parning eller artificiell insemination (AI). Att fastställa spermier kvalitet är nödvändigt för användning i assisterad befruktning3 (konst) och urval av avel hanar som ska användas i AI program4. Däremot, framgången för konst enbart förlitar sig på noggrann utvärdering av spermiernas kvalitet. Ett antal laboratorietester har utvecklats för att fastställa funktionella egenskaper hos spermier. De viktigaste parametrarna är spermiernas morfologi, livskraft, rörlighet, capacitation (aviär spermier inte kräver capacitation5), akrosomen reaktion (AR; exocytos och frisläppandet av ett proteolytiskt enzym från akrosomen av spermier huvudet), sperma penetration av ZP eller IPVL och gödsling6,7,8,9,10,11. Åtgärder för fertilitet ensam ger inte en korrekt utvärdering av en spermie befolkningen11gödsla förmåga. Åtgärder av de flera händelser som leder till befruktningen av ett ägg möjliggöra en lämplig representation av enskilda spermatocyter7prestanda.
Den metod som utvecklats för att mäta spermier funktion är primärt artspecifika. Exempelvis i aviär spermier är livskraft, mobilitet och genomträngningen av IPVL de vanligaste parametrarna som används för att bedöma spermier kvalitet8,11,12. Antalet levande spermier i ejakulatet spelar en avgörande roll för överlevnaden av spermier eftersom förekomsten av ett stort antal döda spermier i sädesvätskan påverkar kvaliteten på sperma. Detta förbättrar produktionen av reaktiva syreradikaler i sädesvätskan och orsakar oxidativa skador på levande spermier13. Spermier rörlighet, kapacitet för flagellar rörelse av aviär sperma mot motstånd vid kroppstemperatur, är känd för att spela en direkt roll att föra om gödsling8. Det är väletablerat att mobilitet är positivt korrelerad med fertilitet och är därför en primär faktor för fertilitet8. En mobil spermier måste dock också ha förmåga att genomgå en AR och att penetrera IPVL11. IPVL penetration analyser beaktas för varje spermier som deltar i processen befruktning11.
I tillämpningen av ART, är ejakulat vanligtvis bearbetas för att maximera koncentrationen av hög kvalitet spermier och minimera koncentrationen av låg kvalitet spermier. Efter samlingen av sperma, kan andelen högkvalitativa spermier berikas genom sperma avskiljandetillvägagångssätt vanligen används i både industrins och praxis. Många av dessa förfaranden har utvecklats, alla med respektive fördelar och begränsningar, men alla utnyttja de heterogena karaktären av spermier att samla endast spermier med hög gödning förmåga. Dessa förfaranden omfatta metoder för migrering av spermier, följsamhet kolumn filtrering och täthet lutning centrifugering (DGC)14,15,16,17,18,19 , 20. bland de tillgängliga teknikerna, DGC har befunnits vara mycket enkel, repeterbara, kostnadseffektiv och effektiv isolera den maximala mängden högkvalitativa spermier för användning i konst med målet att maximera chansen för befruktning14 , 15. Dessutom DGC är inte skadliga för spermier cellmembranet. Däremot spermier migreringsmetoder samla endast gradvis mobila spermier18,19, men mängden sperma som samlats in är mycket låg, vilket gör den ineffektiva i att samla in stora mängder spermier18, 20. följsamhet kolumn filtrering är mycket effektiv i filtrering mycket rörliga spermier från sperma17; men tenderar det att vara skadliga för spermier membran20,21.
I DGC tekniken är den vanligaste substraten för att generera täthetlutningen Percoll, som består av kolloidal kiseldioxid partiklar belagd i polyvinylpryrolidone. Percoll täthet lutning centrifugering (PDGC) kan antingen vara kontinuerliga eller diskontinuerliga men en diskontinuerlig toning används oftast för hög kapacitet isolering mycket rörliga spermier13,16,20. I en diskontinuerlig lutning flyter lägre densitet media ovanför högre densitet media, skapa en övertoning som ökar i densitet från toppen till botten av ett koniskt rör. Detta skapar gränser i gränssnittet mellan de två medierna med olika densitet. Effektiviteten i PDGC härleds från två faktorer: 1) framåtdrivande möjligheten för enskilda spermier och 2) spermier celler med hög strukturell integritet tendens att ha en ökad täthet. Spermier med högre rörlighet är bättre på att korsa från lägre densitet media och tränga in i en högre densitet media. Lägre rörlighet spermier är mer benägna att fastna vid gränsen skapad av gränssnittet mellan media med olika densitet. Spermier med hög strukturell integritet och rörlighet tenderar att ha en högre densitet än döda, onormal eller låg mobila sädesceller. När centrifugalkraften används i PDGC, underlättar detta rörligheten för spermier med olika densiteter för att deras respektive plats i övertoningen.
I allmän praxis, efter PDGC utförs, mjuk pelleten spermier med hög fertilitet potentiella längst ned på den koniska rör samlas, och resten ignoreras. En underutnyttjad fördelen med denna teknik är dock dess förmåga att separera sädesceller i flera grupper baserat på skillnaderna i kvalitet. För forskningsändamål möjliggör separation av spermier av grad av kvalitet utnyttja PDGC tekniken studie av spermiernas kvalitet som det avser den fysiologiska, metabolomiska och proteomiska skillnader. Här, siktar vi på att i detalj hur denna teknik kan användas för att avgränsa sperma kvalitet, liksom demonstrera dessa skillnader i kvalitet, med hjälp av tidigare fastställda eosin-nigrosin vitala färgning för livskraft, Accudenz assay för rörlighet och sperma-IPVL interaktion-analysen för genomtränglighet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla metoderna som beskrivs här har godkänts av den institutionella djur vård och användning kommittén (IACUC) av University of Georgia.
1. tvättning med traditionella centrifugering
- Förbereda fosfatbuffertlösning (PBS). Tillsätt 8,0 g NaCl, 0,2 g kaliumklorid, 1,44 g av Na2HPO4 och 0.24 g KH2PO4 800 ml destillerat vatten (dH2O). Justera pH till 7,4 använder 0,1 N HCl och föra lösningen till 1 L med dH2O.
- Förbereda motilitet buffert. Lägg till 6.5 g NaCl, 4,5 g glukos, 0.444 g CaCl2 och 11,5 g N - tris-[hydroxymetyl] metyl-2-amino-ethanesulfonic syra (TES) till 800 mL dH2O. Justera pH till 7,4 med 1 M NaOH och föra lösningen till 1 L med dH2O.
- Pipettera 0,5 mL av sperma i en polypropylen mikrocentrifug rör. Tillsätt 1,0 mL PBS och blanda försiktigt.
- Centrifugera vid 1 500 x g under 10 minuter vid rumstemperatur (RT) och Kassera supernatanten. Återsuspendera pelleten spermier med PBS upp till 1,5 mL.
- Centrifugera vid 1500 x g under 10 minuter vid RT. Omsuspendera spermier pellet med motilitet buffra upp till 0,5 mL.
2. utföra PDGC tekniken
Obs: Utföra hela processen för PDGC vid rumstemperatur.
- Gör 3,0 mL 1,08 g/mL och 1,07 g/mL Percoll lösningar i två separata rör.
- I ett rent provrör, tillsätt 1.712 mL 1,13 g/ml ursprungliga Percoll 0,3 ml av 1,5 M NaCl lösning. Tillsätt 0,988 mL dH2O och blanda genom varsam inversion att göra 3,0 mL av en 1,08 g/mL densitet lösning.
- I ett rent provrör, tillsätt 1.482 mL 1,13 g/ml ursprungliga Percoll 0,3 ml av 1,5 M NaCl lösning. Tillsätt 1.218 mL dH2O och blanda genom varsam inversion att göra 3,0 mL av en 1,07 g/mL densitet lösning.
- I ett rent provrör, späd 1,0 mL av sperma prov 1:2 med 2,0 mL PBS. Blanda försiktigt genom pipettering.
- Pipettera 3,0 mL av 1,07 g/mL densitet lösningen i en steril 15 mL koniska rör. Pipettera omsorgsfullt 3,0 mL av 1,08 g/mL densitet lösning under 1,07 g/mL densitet lösningen. Se till att de två skikten inte blanda. En lång-form (9 tum) Pasteur-pipett kan underlätta detta steg.
- Pipettera 3,0 mL utspätt spermaprov ovanpå PDG. För att säkerställa att sperma provet inte blandar sig med PDG, luta försiktigt koniska röret som innehåller PDG i 45° vinkel. Pipettera provet längs väggen i röret och låt det rinna ner röret och över PDG.
- Förbereda ett tomt rör att matcha massan av PDG med putsade provet. Centrifugera båda rören vid 1500 x g för 20 min. var noga med att upprätthålla diskontinuerligt övertoningen samtidigt överföra rören från bänken till balansen och sedan till centrifugen.
Obs: Använd inte bromsen i slutet av centrifugering. - Iaktta resultaten. Se till att tre distinkta sperma lager har bildats i röret, som kan ses i figur 1.
- Aspirera isolerade sperma lager med en pipett. Samla det översta lagret av sperma först, mitten lager andra och sista hårda pelleten på botten av röret. Överföra varje till en ren och steril polypropylenmikrocentrifug rör.
- Späd varje prov till 1,5 mL med PBS. Centrifugera vid 1500 x g i 10 min.
- Häll av supernatanten. Beredes spermier pelleten med motilitet buffert av mild pipettering.
Obs: Alternativa tätheter kan användas till utredaren behov. Bestämma mängder av ingredienser som används med följande ekvation, där v0 är volym besättningstäthet lösning användas, v är slutlig volym lösning önskas, p är tätheten av slutliga densitet lösning önskas och p0 är tätheten av besättningstäthet lösning:
Använd alltid 0,3 mL 1,5 M NaCl i beredning av densitet lösningar för att matcha NaCl koncentrationen av fysiologisk koksaltlösning.
3. bestämma spermiernas kvalitet
- Beräkna spermiekoncentration som tidigare beskrivs22.
- Utföra eosin-nigrosin vitala färgning som tidigare beskrivits12 med följande ändringar:
- Förbereda 100 µL av spermier lösning med en koncentration på 1 x 108 celler/mL.
- Överför med pipett 50 µL spermier lösning i en polypropylen mikrocentrifug rör som innehåller en lika stor volym av eosin-nigrosin fläcken. Inkubera blandningen 5 minuter i rumstemperatur.
- Plats en 20 µL släppa färgade sperma prov i ena änden av en glasskiva och smeta jämnt på ett sätt som liknar den som används för blod cellprov. Lufttorka utsmetad bilderna i rumstemperatur i 3-5 min.
- Iaktta utstryket under mikroskop. Räkna antalet levande spermier (ingen fläck) och döda spermier (färgas rosa) och beräkna procentandelen av levande spermier.
- Utföra Accudenz analysen, som tidigare godkänts för kyckling spermier, att objektivt bedöma den spermier rörlighet8 med följande ändringar:
- Pipettera 1,0 mL 6% analyslösningen i polystyren kyvetter, vilket illustreras i figur 2. Inkubera till 41 ° C.
Obs: 41 ° C används för att matcha den inre temperaturen i en höna. Inkubation temperaturen bör matcha kvinnliga fortplantningsorganen av de arter som utreds. - Överlagra förvärmd analyslösningen med 100 µL av spermaprov vid en koncentration på 5 x 108 celler/mL.
- Plats i kyvetten som innehåller överlagras sperma prov i spektrofotometern. Spela in absorptionsvärdet vid 550 nm.
- Pipettera 1,0 mL 6% analyslösningen i polystyren kyvetter, vilket illustreras i figur 2. Inkubera till 41 ° C.
- Utföra IPVL-penetration test som tidigare beskrivits11 med följande ändringar:
- Skär en bit (0,5 x 0,5 cm) av icke-germinal skiva regionen intakt IPVL.
- Justera spermiekoncentration till 4 x 106 celler/mL
- Inkubera spermier motilitet buffert med IPVL i en liten glasflaska under 15 minuter vid 37 ° C, vilket illustreras i figur 3.
- Sänk IPVL lappa i 3% NaCl att stoppa samspelet mellan IPVL och spermier.
- Montera IPVL lappa på ett objektglas och fläcken med Schiff's reagens för 10 min efter fixering med 10% formalin för 20 s.
- Observera IPVL under ett mikroskop för framgångsrika spermier penetration hål och räkna antalet alla synliga hål per 0,25 mm2 på 40 X förstoring.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
PDGC tekniken resulterade i distinkt avskiljande av tre lager av sperma av graden av kvalitet över alla parametrar. Spermier separerar i ett högkvalitativt lager under den högsta densitet lösningen, en medelhög kvalitet lager mellan det högre och lägre densitet lösning och en låg kvalitet lager ovanför lägre densitet lösningen. Dessa skillnader i kvalitet är framgår av tydliga skillnader i livskraft (figur 4), rörlighet (figur 5) och genomtränglighet (figur 6). Spermier som isolerad från det högkvalitativa lagret av PDG utställda ökar i alla tre parametrar i förhållande till de av traditionellt tvättas provet. Dessa lager noterat som medel - och låg-kvalitet vid separation av PDGC visar måttlig och dramatisk respektive minskar över alla testparametrar.
Figur 1 : Isolering av spermier med differentiell kvalitet med hjälp av PDGC. Överlagra 3 mL Spermier lösning på beredd PDG lösning. Centrifugera vid 1500 x g i 20 min. Samla tre distinkta grupper av spermier med låg-, medel- och hög kvalitet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Bestämning av spermier rörlighet med Accudenz analys. Överlagra 100 µL av sperma prov på en 6% assay lösning i en kyvetten. Inkubera vid 41 ° C för 5 min. post rörlighet spermier som en funktion av absorbansen vid 550 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : En modell av bildandet av spermier penetration hål i IPVL. Inkubera spermier med en liten del av IPVL vid 37 ° C i 15 min. Vid kontakt med IPVL, spermier celler binda med IPVL, genomgå en akrosomen reaktion och penetrera den IPVL, att skapa penetration hål. Räkna antalet penetration hål och mäta genomtränglighet av spermier. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : Livskraften hos spermier enligt bedömning av eosin-nigrosin vitala färgning. Digital micrographs visar eosin-nigrosin vitala färgning av spermier som erhållits genom en process av traditionella wash (A) och PDGC (B, låga rörliga spermier; C, medellång rörliga spermier; D, höga rörliga spermier). Skalstapeln = 50 µm på 40 x förstoring. Rosa färgning anger döda spermier som har tagit upp eosin fläcken. Data utsattes för one-way ANOVA, följt av testet Tukey-Kramer. Felstaplar visar standardavvikelsen för medelvärdet (SEM). Värden presenteras som den medelvärde ± SEM (n = 5). a-d Värden utan en gemensam upphöjd skilde sig (P < 0,05). Spermier som isolerats av PDGC i låg-, medel- och hög kvalitet grupper (E) avslöjar betydande skillnader i procentuell viabilitet, 66,0 ± 4,7, 77,0 8.9 och 92,8 ± 3.4, respektive. Spermierna tvättas av traditionella metoder visas en 81,6 ± 4,9% livskraft, lägre än gruppen hög kvalitet men högre än de medel - och låg-kvalitet-grupperna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5 : Rörlighet spermier bedömt genom Accudenz assay. Absorbansvärdena fungera som en proxy åtgärd för spermier rörlighet i bedömningen av Accudenz analysen. Data utsattes för one-way ANOVA, följt av testet Tukey-Kramer. Felstaplar visar standardavvikelsen för medelvärdet (SEM). Värden presenteras som den medelvärde ± SEM (n = 5). a-d Värden utan en gemensam upphöjd skilde sig (P < 0,05). Spermier som isolerade i låg-, medel- och hög kvalitet grupper med PDGC teknik ställde ut markant olika låg (0,11 ± 0,03), medium (0,34 ± 0,01) och hög (0,87 ± 0,03) absorptionsvärden, respektive. Spermierna tvättas av traditionella metoder uppvisade en absorbans 0,71 ± 0,03, en absorbans som är lägre än för gruppen hög kvalitet, men högre än de medel - och låg-kvalitet-grupperna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6 : Genomtränglighet av spermier som bedömts av spermier-inner perivitelline lager (IPVL) interaktion assay. Digital micrographs visar i vitro bildandet av hål på ytan av IPVL av kyckling spermier (4 x 106 celler/mL) under inkubation i motilitet buffert vid 37 ° C i 15 min. Micrographs representerar IPVL penetrerad av spermier att ha genomgått traditionella wash (A) och spermier från låg - b, medellång (C) och high - d kvalitet grupper från PDGC. Skalstapeln = 50 µm på 40 X förstoring. Data utsattes för one-way ANOVA, följt av testet Tukey-Kramer. Felstaplar visar standardavvikelsen för medelvärdet (SEM). Värden presenteras som den medelvärde ± SEM (n = 5). a-d Värden utan en gemensam upphöjd skilde sig (P < 0,05). Antal penetration hål per 0,25 mm2 (E) skilde sig mellan spermier isolerade från de olika lutningarna densitet media. Spermier som isolerats i låg-, medel- och hög kvalitet grupper av PDGC producerade en låg (24.40 ± 1,1), medium (33.20 ± 1,4) och hög (51.20 ± 1,3) antal penetration hål, respektive. Spermierna tvättas med den traditionella metoden produceras 46.40 ± 1,8 penetration hål, ett värde som är lägre än gruppen hög kvalitet men högre än de medel - och låg-kvalitet-grupperna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fertilitet inte bara bestämmer lönsamheten för animalisk produktion men fungerar också som ett sätt att naturligt urval av arter för existens. En spermie ultimata funktion är att befrukta en äggcell. I äggledaren av en kvinnlig väljer endast de starkaste spermierna för att säkerställa befruktning av en äggcell23,24. In vitro studier har också visat en nära korrelation mellan kvalitativa spermier drag och befruktning framgång4,11,23,24. Minskad fertilitet är förknippat med dålig kvalitet på spermierna4,11,25. Som sådan, kräver det bearbetning sperma för förbättring av spermiernas kvalitet. I konst, har PDGC tillämpats för att samla in endast högkvalitativa spermier för att komplettera fertiliteten hos människor och agriculturally-viktigt djur13,16,20,26. Med denna teknik, visade vi dock en mild, icke-invasiv teknik för att separera låg-, medel- och hög kvalitet spermier i inhemska kyckling modellen.
PDGC, när de utförs korrekt, presenteras protokoll tillåter separation av inte bara hög kvalitet spermier, men också effektiv åtskillnad mellan låg - och medel-kvalitet spermier. Graden av framgång av PDGC är beroende av noggrann förberedelse av diskontinuerlig övertoningen samt lika försiktig samling av isolerade lager. Diameter på den koniska rör som används påverkar också framgång av PDGC. Vi har observerat att en större rördiameter resulterar i minskad effektivitet av tekniken. Det är viktigt att PDGC utförs vid rumstemperatur för att upprätthålla integriteten i PDG. Alla tidigare kylda prover bör anpassas till rumstemperatur innan de släpps ut på PDG. Den vanligaste frågan som kunde observeras efter utför PDGC är ineffektiva separation; de isolerade lagrarna kan inte skiljer sig från varandra. Om problemet uppstår, förutom att ta itu med kritiska stegen ovan, det kan korrigeras genom att minska provspädning, öka volymerna av densitet lösningar används och att säkerställa volymerna av lösningar som används är lika.
PDGC är mycket anpassningsbar. Någon rad densiteter mellan 1,00 och 1,13 g/mL kan användas för beredning av övertoningen. Vi har funnit att 1,07 och 1,08 g/mL densitet lösningar fungerar väl för separering av kyckling spermier av kvalitet, men dessa tätheter kan behöva justeras för andra typer av prov eller experimentella syften. Antalet densitet lösningar används i övertoningen kan också justeras för att passa behoven hos försöksledaren. Antalet kvalitetsgrupper isolerade kommer alltid att vara en mer än antalet densitet lösningar används.
PDGC är mycket mer effektiv än alternativa metoder av provet separation i situationer där stora mängder av provet behövs13,16,20,26. Migration-analyser separera effektivt högsta kvalitet spermier från en prov18,19, men de kan inte användas för att lösa provet något ytterligare. Migration analyser finns också oförmögna att förbereda stora volymer av prov18,20. Följsamhet kolumn analyser separera effektivt stora mängder prov17; processen är dock skadliga kvaliteten på sperman samlas in, att göra bekräftelse av kvalitetsgrupper efter separation svårt20,21. PDGC, men har sina egna begränsningar. Vid spermiereceptorn, bör det inte användas för beredning av prover för in vitro- fertilisering, på grund av den möjliga föroreningen med endotoxiner27. Effekten av Percoll kontaminering med endotoxiner har inte undersökts i andra djurklasser. Spermier prestanda påverkas inte av endotoxiner, vilket innebär att PDGC är fortfarande lämplig för forskningsändamål.
Insamling av sperma av deras kvalitet med PDGC teknik blir avgörande för en rad tillämpningar inklusive studier på spermier fysiologiska, metabolomiska, transcriptomic och proteomiska forskning. Tillämpningen av denna teknik kommer att bidra till upptäckten av biomarkörer för spermiernas kvalitet för användning i markör-assisted fertilitet förbättringsprogram.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Ingen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Accudenz | Accurate Chemical and Scientific Corporation, Westbury, NY, USA | AN7050 | |
| Percoll | Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA | P7828 | |
| Schiff’s reagent | Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA | 3952016 | |
| TES | Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA | T1375 | |
| Eosin Y | Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA | E4009 | |
| Nigrosin | Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA | 198285 | |
| ST 40R Centrifuge | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA | 75004524 | |
| DU 530 Life Sciences UV/Vis Spectrophotometer | Beckman Coulter, Brea, CA, USA | No catalogue is found | |
| Olympus IX 71 Inverted Fluorescence and Phase Contrast Microscope | Olympus America Inc., PA, USA | No catalogue is found |
References
- Spargo, S. C., Hope, R. M. Evolution and nomenclature of the zona pellucida gene family. Biology Reproduction. 68, 358-362 (2003).
- Okamura, F., Nishiyama, H. The passage of spermatozoa through the vitelline membrane in the domestic fowl, Gallus gallus. Cell and Tissue Research. 188 (3), 497-508 (1978).
- Henkel, R., et al. Sperm function and assisted reproduction technology. Reproductive Medicine and Biology. 4, 7-30 (2005).
- Reddy, R. P. Artificial Insemination of broilers: Economic and management implications. Proceedings of 1st International Symposium on Artificial Insemination of Poultry. Poultry Science Association. Bakst, M. R., Wishart, G. J. , Savoy, Il. 73-89 (1995).
- Howarth, B. Jr An Examination for Sperm Capacitation in the Fowl. Biology of Reproduction. 3, 338-341 (1971).
- Menkveld, R., Holleboom, C. A. G., Rhemrev, J. P. T. Measurement and significance of sperm morphology. Asian Journal of Andrology. 13, 59-68 (2011).
- Kumaresan, A., Johannisson, A., Al-Essawe, E. M., Morrell, J. M. Sperm viability, reactive oxygen species, and DNA fragmentation index combined can discriminate between above- and below-average fertility bulls. Journal of Dairy Science. 100, 5824-5836 (2017).
- Froman, D. P., McLean, D. J. Objective measurement of sperm motility based upon sperm penetration of Accudenz. Poultry Science. 75, 776-784 (1996).
- Zaneveld, L. J., De Jonge, C. J., Anderson, R. A., Mack, S. R. Human sperm capacitation and the acrosome reaction. Human Reproduction. 6 (9), 1265-1274 (1991).
- Ahammad, M. U., et al. Acrosome reaction of fowl sperm: Evidence for shedding of acrosomal cap in intact form to release acrosomal enzyme. Poultry Science. 92 (3), 798-803 (2013).
- Ahammad, M. U., et al. Maturational changes in motility, acrosomal proteolytic activity, and penetrability of the inner perivitelline layer of fowl sperm, during their passage through the male genital tract. Theriogenology. 76 (6), 1100-1109 (2011).
- Chalah, T., Brillard, J. P. Comparison of assessment of fowl sperm viability by eosin-nigrosin and dual fluorescence. Theriogenology. 50 (3), 487-493 (1998).
- Aitken, R. J., West, K. M. Analysis of the relationship between reactive oxygen species production and leukocyte infiltration in fractions of human semen separated on Percoll gradients. International Journal of Andrology. 13, 433-451 (1990).
- Mortimer, D., Mortimer, S. T. Density Gradient Separation of Sperm for Artificial Insemination. Spermatogenesis. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols. Carrell, D., Aston, K. , Humana Press. Totowa, NJ, USA. 927 (2013).
- Qingling, Y., et al. Processing of semen by density gradient centrifugation selects spermatozoa with longer telomeres for assisted reproduction techniques. Reproductive BioMedicine Online. 31, 44-50 (2015).
- Moohan, J. M., Lindsay, K. S. Spermatozoa selected by a discontinuous Percoll density gradient exhibit better motion characteristics, more hyperactivation, and longer survival than direct swim-up. Fertility and Sterility. 64 (1), 160-165 (1995).
- Paulson, J. D., Polakoski, K. L. A glass wool column procedure for removing extraneous material from human ejaculate. Fertility and Sterility. 28, 178-181 (1977).
- Ahammad, M. U., Chiaki, N., Tatemoto, H., Kawamoto, Y., Nakada, T. Utilization of the swim-up migration sedimentation technique to separate viable and progressively motile fowl spermatozoa. World's Poultry Science Association Proceedings. , Cambridge University Press. (2010).
- Lucena, E., et al. Recovery of motile sperm using the migration-sedimentation technique in an in vitro fertilization-embryo transfer programme. Human Reproduction. 4 (2), 163-165 (1989).
- Henkel, R. Sperm Processing for IVF. Clinical Embryology: A Practical Guide. , Springer Science and Business Media. New York, USA. (2013).
- Sherman, J., Paulson, D., Liu, K. Effect of glass wool filtration on ultrastructure of human spermatozoa. Fertility and Sterility. 36, 643-647 (1981).
- Freund, M., Carol, B. Factors affecting haemocytometer counts of sperm concentration in human semen. Journal of Reproduction and Fertility. 8, 149-155 (1964).
- Bakst, M. R., Wishart, G. J., Brillard, J. P. Oviducal sperm selection, transport and storage in poultry. Poultry Science Review. 5, 117-143 (1994).
- Ahammad, M. U., Okamoto, S., Kawamoto, Y., Nakada, T. The effects of regular fluid secretion from the uterus of laying hens on the longevity and fertilization ability of fowl sperm in the oviduct. Poultry Science Journal. 1 (1), 13-22 (2013).
- Ahammad, M. U., et al. Maturational changes in the survivability and fertility of fowl sperm during their passage through the male reproductive tract. Animal Reproduction Science. 128 (1-4), 129-136 (2011).
- Choi, K. H., Emery, D. A., Straub, D. E., Lee, C. S. Percoll process can improve semen quality and fertility in turkey breeders. Asian-Australasian Journal of Animal Sciences. 12 (5), 702-707 (1999).
- Chen, M. J., Bongso, A. Comparative evaluation of two density gradient preparations for sperm separation for medically assisted conception. Human Reproduction. 14 (3), 759-764 (1999).
