この記事は、ニコチンの調査によるマウス脳切片でニコチン性アセチルコリン受容体 (nAChRs) を研究するための方法を示します。同時パッチ ・ クランプ記録および多光子励起レーザ走査型顕微鏡と組み合わせることで、ニコチンの調査は、コリン作動性神経の生物学のより深い理解を提供し、細胞の形態とニコチン性受容体機能を接続します。
さまざまな神経プロセスを調節する受容体を介して機能するアセチルコリン (ACh) が、この関数が行われる場所の細胞内の細胞内の局在と ACh 受容体機能をリンクにチャレンジしております。ニコチン性 ACh 受容体 (nAChRs) ネイティブの脳組織中の細胞レベル下の場所を研究するには、光学的手法は電気生理学的記録中に神経細胞膜近く離れた場所でニコチンの正確なリリースのために開発されました。2 光子レーザー顕微鏡、中にその形態を視覚化するスライスが満ちている脳内のニューロンのパッチ クランプを染めるし、光のフラッシュで実行する 1 つまたは複数の細胞膜近くの 405 nm のレーザ光の焦点を当て、ニコチンの調査。携帯電話の現在のたわみを測定、記録されたニューロンの高分解能三次元 (3 D) 画像は nAChR 応答細胞形態との和解を許可させます。このメソッドは、複雑なティッシュの準備、コリン作動性神経伝達の理解を高めることを約束の nAChR 機能分布の詳細な分析できます。
コリン作動性シグナル伝達注意制御、随意運動と報酬1,2を含む多数の脳のプロセスを調節します。アセチルコリン (ACh) の伝送を向上させる薬は、アルツハイマー病、認知3におけるコリン作動系の重要な役割を意味に関連する認知機能障害を治療するために使用されます。コリン作動性受容体と健康と病気の状態の回路の改善された理解は、いくつかの神経学的疾患/障害に対するより良い治療法につながる可能性があります。
ニコチン性 ACh 受容体 (nAChRs) は、たばこ製品からの内因性 ACh または外因性のニコチンに応答中の陽イオンをフラックス リガンド依存性イオン チャネルの家族です。説明4非常に最初の神経伝達物質受容体の間であったという事実を考えると、nAChR 薬理学および筋線維内の場所は筋肉型受容体の周知。対照的に、比較的少しは薬理学およびネイティブ nAChRs 脳内の細胞内分布について知られています。知識で、このギャップは最近細胞イメージング、電気生理学的記録5の中に脳組織の nAChRs の空間的制限と急速な活性化を可能にする化学プローブを開発することによって解決されました。ここでは、神経構造を持つ nAChR 機能を接続する能力を高めの全体的な目標と、このアプローチの重要な方法論的手順はとおりです。
活性型ニコチン (PA Nic; 化学名: 1-[7-[bis(carboxymethyl) – アミノ] クマリン-4-イル] メチル ニコチン) 効率的にニコチン5,6をリリースする 〜 405 nm レーザー フラッシュと photolyzed をすることができます。調査、前に PA Nic にソリューションで安定し厄介な薬理学的または光化学機能5を示さない。光分解後に、リリースされたニコチンは予想通り nAChRs をアクティブにし、uncaging 神経の副産物が薬理学的に不活性5。連続発振レーザーは出力電力が光分解光源として使用される > 1 mW がサンプルで測定されます。ローカライズ対象の光刺激が多光子励起レーザ走査型顕微鏡 (2PLSM) の細胞膜を検索する機能と組み合わされて、このアプローチの 2 つのキー利点は、完全に実現: 光分解速度と空間的な精度。
ほとんどの点で PA Nic の光分解は nAChR 配位子を脳スライス内の受容体に配信する他の方法より優れています。このようなアプローチは、風呂アプリケーション7および薬剤の局所配信を介してフグ ピペット8に含まれます。前者のアプローチは応用の薬剤の長期効果が過度に強調する傾向があり、一方後者は試験間および細胞応答動態の変動に苦しむことができます。これらの代替アプローチのどちらも適切に同じニューロンから別の細胞の場所で受容体の活動を区別できます。ACh の放出を生じる活性化は、ネイティブの nAChRs9,10,11の調査のため使用されていますが、それはないマッピングの細胞内局在の nAChR 場所が役立っています。さらに、ほとんどの研究がこのアプローチを利用して依存している ChR2 表現の細菌人工染色体・遺伝子改変マウス コリン作動性透過率の異常12,13,14,15,16,17。
PA Nic の光分解は、コリン作動性受容体を研究するため唯一の光学的方法ではありません。ケージ カルバコール機能的細胞18と脳スライスの19、ACh 受容体活性をマップに使用されたが PA nic の開発中には比較用に市販なかった(ビピリジン) ルテニウム bis-ニコチン複雑な (ルビ-ニコチン) はニコチン uncaging 神経20、ように報告されましたが、頭に頭の比較では PA Nic に劣る証明したルビ ニコチンの商業準備研究5。非営利でこのような比較実験を繰り返す便利なことがありますその可視吸収はコリン作動性研究 PA Nic 機能をほめることができるよう、ルビ ニコチンを高度精製します。最後に、nAChRs も操作されている光学写真切替可能なリガンドと受容体の遺伝子組み換え21の組み合わせを使用しています。このアプローチの利点と欠点を見て変更された nAChR の遺伝子ターゲティングの能力/要件と、脳組織の PA Nic 光分解に補足であります。
このアプローチのいくつかの要件は、注意してください。まず、適切な可視化法は神経細胞膜を正確に特定する必要です。培養細胞の研究と従来のエピ蛍光顕微鏡を用いたイメージングで十分かもしれませんが、脳スライスまたはその他の厚いティッシュの準備のニューロンから記録、2PLSM または共焦点顕微鏡が必要。第二に、光分解レーザー ビームを配置する適切な方法が必要です。このアプローチは、ラスター スキャン イメージングのビームおよび uncaging 神経レーザー ビーム22,23,24を使用してポイントの photoactivation のため 2 つの独立した x と y ミラー付きデュアル ガルバノ スキャン ヘッドを採用しています。他より限定されたソリューションが可能であれば、代わりにラスター スキャンする画像のビームと uncaging 神経ビームまたはそのセルを連れて (2) 単にビューのフィールドの中央に uncaging 神経のビームを演出 (1) 単一ガルバノ スキャン ヘッドなどフラッシュ ・ フォトリシス法のこの位置。第三に、システムは、実験中に生体信号を収集する希望する場合は同時に電気生理学的記録のため必要です。最近説明5として適切な全光イメージングと上記の要件を満たすことが。以下では、詳細なプロトコルが含まれているはこのアプローチの主要な手順について説明します。
PA Nic アプリケーション/配送方法の選択は、このローカライズされた光刺激法の最も重要なステップです。2 つの方法、風呂アプリケーションおよび局所灌流それぞれの明確な利点と制限事項を提供しています。選択主、興味のセル型で nAChR 機能発現レベルに影響されます。よく、バス アプリケーションの均一なプローブ濃度データの解釈を促進する、記録されたセルを囲むことができ、機能発現レベルが高いとき、お風呂のアプリケーションを使用することをお勧めします。お風呂アプリケーションも全体のプロセスを容易にして、組織の 2 番目の灌流ピペットの必要があります。ただし、高価なバス アプリケーション化合物実験あたりのコストの。
一般的に、トラブルシューティング nAChR 活性化に見られる次のせん光がない理由を理解しようとして含まれます。捜査官が ACh のローカル パフ アプリケーションを実行する必要があります PA Nic と以前に検討されていないセル型を操作する場合、または十分な受容体が機能的かどうかニコチン5を表明しました。システムが光分解反応を検出できることを検証するため内側 habenula ニューロン受容体30の大量を表す制御実験を行う必要があります。この脳領域では、PA Nic 風呂アプリケーションは検証実験のために望ましいである可能です。これらの検証実験を実行した後のみ 1 つに進みます巧まないセルタイプ。NAChR を強化する nAChR 正アロステリック変調器を追加それは PA Nic の濃度を高める、フラッシュ強度やパルス持続時間増加する正当化されるかもしれない実験システムの検証し、応答残る非常に少ないか検出できなかった場合「アクティビティ6」、またはこれらのいくつかの組み合わせ。
時折、uncaging 神経応答が大きすぎて、間接電圧の結果として重要な nAChR 活性化ゲート Na+チャネルの活性化と貧しい空間クランプによりアンクランプの内向きの電流。完全に無名の nAChR 内向きの電流とデータ解釈は不可能、これらのアーティファクトを記録ピペットで QX-314 (2 mM) を含めることによって回避できます。PA Nic の濃度を減らすことによってまたはフラッシュの発光量や脈拍の持続期間を減らすことによっても廃止される可能性があります。すべての可視光写真刺激実験の意図しない刺激光/分解目的の焦点面の上下を避けるために刺激部位を選択するときにケアを行使しなければなりません。さらに、該当するレーザー出力の必要があります常に滴定する生理学的応答を再現します。特に z 軸組む上/下の焦点スポット活性化配位子がまだ拡散し、調査の下で生物学的システム (すなわち,受容体) との対話にケージの配位子を扱うときに注意することが重要です。
いくつかの制限が存在すると、PA Nic レーザー フラッシュ ・ フォトリシス法はすべての調査官のことは適さない場合があります。最初の適切なセットアップのコストが比較的高いです。そのまま脳スライスを使用するとき樹状突起は、2 光子励起顕微鏡など高度な可視化システムを必要とするような小径構造近く調査。チタンサファイアレーザー、実行する 2 光子顕微鏡用可変 IR パルス レーザーのコストが高いは別としてさらに 2 つのレーザー光の位置を独立してできるデュアル検流計システム システム コストが増えます。捜査官に十分な専門知識と構築、トラブルシューティング、およびそのようなシステムを維持する時間あればホームが構築したシステムを使用して、システム全体のコストを削減できます。しばしば第 2 の制限は、低 nAChR の機能発現は、部分的に前述の手順を実行して軽減することができます、しかし、これは成功を保証しないかもしれない。通常、1 つはアゴニストのパフを申請リガンド活性化電流を測定できない、電圧クランプ下 PA Nic せん光は、ないその許容可能な結果をもたらす可能性があります。第 3 の制限を含む組み込み蛍光 PA PA の nic Nic の 〜 405 nm の光を吸収して緑色蛍光タンパク質 (GFP) またはアレクサ 4885として類似の範囲で出力します。PA Nic 濃度超える 〜 1 mM と、この蛍光特性が同時に神経細胞の構造を視覚化する挑戦的な行うことができます。これを緩和するには、灌流ピペットから PA Nic の流れを簡単に制御することができることが重要です。定期的に、PA Nic 流れはすぐ拡散する蛍光分子を許可する停止しました。これは uncaging 神経のビーム スポット位置をチェックするためのニューロンの再イメージ化が許可されます。言及する第 4 の潜在的な制限には、光分解の 405 nm の光の使用が含まれます。405 など短い波長 nm は、脳スライスなど複雑な組織散乱しやすい。したがって、特定のフラッシュの発光量、期間、uncaging 神経応答振幅と減衰機構差分による影響はスライス内 uncaging 神経の焦点深度。NAChRs の生物学的側面についての結論では、この重要な注意点を考慮する必要があります。
このローカライズされたレーザー フラッシュ光分解手法は nAChR 神経生物学に関する新たな詳細を明らかにする最近使用されています。たとえば、慢性ニコチン曝露は、perisomatic と内側 habenula ニューロン5樹状 nAChR 機能を高めます。それはまた perisomatic の樹状細胞コンパートメント6機能 nAChRs を腹側被蓋野グルタミン酸ニューロンに表現を最初に示すために使用されました。これから多くの可能性をこの技術の使用があるし、知られている大脳皮質錐体細胞31など大脳皮質の32、介在ニューロンのエクスプレス nAChRs 線条体33 他のキーのニューロン タイプにアプローチを適用できます。、および海馬19。この手法は、薬理学および/または nAChR の遺伝子が異なる神経細胞のコンパートメントに特定の受容体サブタイプをローカライズする34の編集とも組み合わせることができます。アプローチ、PA Nic5と並行して開発されたものに限定されないなどの他のクマリン ケージ化合に容易に適応があります。最後に、PA Nic せん光 5 月 1 日使用目を覚まし行動動物の行動薬理学の新しいパラダイムの中でニコチンのアクションを勉強します。
The authors have nothing to disclose.
著者次北西部主任の研究室メンバーに感謝: ライアン Drenan、D. ジェームス Surmeier、オストモロワ Kozorovitskiy、アニスの建築業者。この作品は、米国国立衛生研究の健康 (NIH) (DA035942、R.M.D.、DA040626 の補助金)、PhRMA 財団 (M.C.A. に交わり) と HHMI によって支えられました。
Instruments, Consumables, and Miscellaneous Chemicals | |||
Multiclamp 700B | Molecular Devices Corp. | Patch clamp amplifier | |
Pneumatic Picopump | World Precision Instruments | PV820 | |
Micropipette puller | Sutter Instrument Co | P-97 | |
Temperature Controller | Warner Instruments | TC-324C | |
Vibrating blade microtome | Leica Biosystems | VT1200S | |
Ultrafree-MC Centrifugal Filter | MilliporeSigma | UFC30GV0S | internal solution filter |
Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B150F-4 | patch and local application pipette |
(-)-Nicotine hydrogen tartrate salt | Glentham | GL9693 | nicotine salt |
7-carboxymethylamino-4-methyl coumarin | Janelia Research Campus | PA-Nic by-product | |
1-[7-[bis(carboxymethyl)- amino]coumarin-4-yl]methyl-nicotine | Janelia Research Campus | PA-Nic | |
Euthasol (Pentobarbital Sodium and Phenytoin Sodium) | Virbac | ANADA #200-071 | |
Alexa FluorTM 488 Hydrazide | ThermoFisher | A10436 | green fill dye |
Alexa FluorTM 568 Hydrazide | ThermoFisher | A10437 | red fill dye |
6-carboxy-AF594 (Alexa Fluor 594) | Janelia Research Campus | red fill dye | |
QX 314 chloride | Tocris | 2313 | voltage-gated sodium channel blocker |
Power Meter | ThorLabs | S120C | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Chemicals for Solutions | |||
N-Methyl-D-glucamine | Sigma | M2004 | |
Potassium chloride | Sigma | P3911 | |
Sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma | S9638 | |
Sodium bicarbonate | Sigma | S6014 | |
HEPES | Sigma | H3375 | |
D-(+)-Glucose | Sigma | G5767 | |
(+)-Sodium L-ascorbate | Sigma | A4034 | |
Thiourea | Sigma | T8656 | |
Sodium pyruvate | Sigma | P2256 | |
Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma | 230391 | |
Calcium chloride dihydrate | Sigma | 223506 | |
Sodium chloride | Sigma | S9625 | |
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid | Sigma | E3889 | |
Adenosine 5′-triphosphate magnesium salt | Sigma | A9187 | |
Guanosine 5′-triphosphate sodium salt hydrate | Sigma | G8877 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Components of 2-Photon Microscope | |||
Ultima Laser Scanner for Olympus BX51 Microscope | Bruker Nano, Inc. | imaging software and galvos | |
Imaging X-Y galvanometers | Cambridge Technology | ||
Mai Tai HP1040 | Spectra-Physics | Tuneable IR laser | |
Pockels cell M350-80-02-BK with M302RM Driver | Conoptics, Inc. | for IR laser attenuation | |
Integrating Sphere Photodiode Power Sensor | Thorlabs, Inc | laser power pick-off photodiode | |
Uncaging X-Y galvanometers | Cambridge Technology | ||
Helios 2-Line Laser Launch | Bruker Nano, Inc. | uncaging laser components | |
OBIS LX/LS 405 nm (100 mW) | Coherent, Inc. | ||
OBIS LX/LS 473 nm (75 mW) | Coherent, Inc. | ||
Point-Photoactivation / Fiber Input Module for Limo Sidecar – Uncaging | Bruker Nano, Inc. | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Upright Microscope | Olympus | BX51WIF | Upright microscope chasis |
Objective: Olympus M Plan FL 10x; NA 0.3 WD 11 mm | Olympus | 10x objective | |
Objective: Olympus M Plan Fluorite 60x/1.0 WD=2mm NIR | Olympus | 60x water-dipping objective | |
X-Cite 110, four-LED LLG coupled epi-fluorescence light source | Excelitas Technologies | LED Light Source | |
Epi-Fluorescence Filter: ET-GFP (FITC/CY2) for Epi-Turret | Chroma Technologies | LED Filter for blue light excitation | |
Epi-Fluorescence Filter: ET-DsRed (TRITC/CY3) for Epi-Turret | Chroma Technologies | LED Filter for green light excitation | |
B&W CCD camera; Watec, 0.5in B/W CCD | Watec Co., LTD. | CCD camera for patch clamp recording | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
External Detectors – Dual Reflected Emission – Olympus Upright (Multi-Alkali, GaAsP) | Bruker Nano, Inc. | ||
Multi-alkali side-on PMT | Hamamatsu | R3896 | red channel PMT |
595/50m | Chroma Technologies | red channel emission filter | |
565lpxr | Chroma Technologies | dichroic beam splitter | |
GaAsP end-on PMT | Hamamatsu | 7422PA-40 | green channel PMT |
525/70m | Chroma Technologies | green channel emission filter | |
High-Speed Shutter for Hamamatsu H7422 PMT | Vincent Associates / Bruker | 517329 | PMT shutter mount |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Dodt Gradient Contrast Transmission Detection Module | Bruker Nano, Inc. | ||
Multi-alkali side-on PMT | Hamamatsu | R3896 | Dodt PMT |