Summary
本文提出了一种用烟碱不加污染的方法研究小鼠脑片中烟碱乙酰胆碱受体 (nachr)。当与同时膜片钳记录和 2-光子激光扫描显微镜, 尼古丁发现连接烟碱受体功能与细胞形态, 提供了更深入的了解胆碱能神经生物学。
Abstract
乙酰胆碱 (ach) 通过受体调节各种神经元的过程, 但它一直是一个挑战, 连接 ach 受体功能与细胞内的亚细胞位置, 其中这个功能进行。为了研究烟碱 ach 受体 (nacr) 在原生脑组织中的亚细胞位置, 提出了一种在电生理记录过程中在神经元膜附近离散位置精确释放尼古丁的光学方法。在 2-光子激光扫描显微镜下, 大脑切片中的斑块夹紧神经元充满染料, 以显示其形态, 而尼古丁的不老化是通过将 405 nm 激光束聚焦在一个或多个细胞膜附近而通过光闪光进行的。测量了细胞电流偏转, 并制作了记录神经元的高分辨率三维 (3d) 图像, 以便将 nahr 响应与细胞形态进行协调。该方法可以详细分析 nahr 在复杂组织制剂中的功能分布, 有望提高对胆碱能神经传递的认识。
Introduction
胆碱能信号调节许多大脑过程, 包括注意力控制、意志运动和奖励1, 2.增强乙酰胆碱 (ach) 传播的药物被用来治疗与阿尔茨海默氏症相关的认知障碍, 这意味着胆碱能系统在认知3中的重要作用。改善对健康和患病状态中胆碱能受体和电路的了解, 可以为几种神经疾病带来更好的治疗方法。
烟碱性 ach 受体 (nahr) 是一个由配体门控离子通道组成的家族, 可根据烟草制品的内源性 ach 或外源性尼古丁来控制阳离子。考虑到它们是最早被描述为4的神经递质受体之一, nahr 的药理学和在肌肉纤维中的位置是很好理解肌肉类型的受体。相比之下, 对本地 nahr 在大脑中的药理和亚细胞分布的了解相对较少。最近开发了一种新型化学探针, 在细胞成像和电生理记录5的过程中, 通过空间限制和快速激活脑组织中的 nahr 来解决这一知识差距问题。在这里, 介绍了这种方法所涉及的关键方法步骤, 其总体目标是提高将 nahr 功能与神经元结构连接的能力。
可活性尼古丁 (pa-nic; 化学名称: 1-[之二 (羧甲基-氨基] 香豆素-4------可以用 ~ 405 纳米激光闪光光解, 有效释放尼古丁5,6。在发现之前, pa-nic 在溶液中是稳定的, 没有不愉快的药理或光化学特征5。光解后, 释放出的尼古丁可预见地激活 nahr 和未消毒的副产品是药理惰性5。采用连续波激光作为光解光源, 在样品上测量输出功率 & gt;1 mw。局部时, 有针对性的光刺激与用2光子激光扫描显微镜 (2plsm) 定位细胞膜的能力相结合, 充分实现了该方法的两个关键优点: 光解速度和空间精度。
在大多数方面, pa-nic 的光解优于其他将 nahr 配体传递到脑片内受体的方法。这种方法包括洗澡应用7和通过吸管器8号在当地输送药物.前一种方法往往过分强调应用药物的长期影响, 而后一种方法可能会受到试验之间和细胞间反应动力学的变异性的影响。这两种替代方法都不能充分区分不同细胞位置的受体活性和同一个神经元。光基因激活的 ach 释放已被用于研究本地 nahr9,10,11, 但它已被证明是有用的映射亚细胞 nahr 位置。此外, 大多数利用这种方法的研究都依赖于具有异常胆碱能传播的 chr2 表达的细菌人工染色体转基因小鼠,12、13、14、15,16,17岁
pa-nic 光解并不是研究胆碱能受体的唯一光学方法。在 pa-nic 的发育过程中, 用一种笼型卡巴酚对培养细胞 18 和大脑切片19 中的 ach 受体活性进行了功能映射, 但在商业上无法用于比较研究。据报道, 一种二 (双吡啶)-尼古丁复合物 (rubi-ticantis) 允许尼古丁氧化老化20, 但在面对面比较研究5中, rubi-anticine 的商业制剂被证明不如 pa-nic。用非商业的、高度纯化的 rubi-tin假定重复这种比较实验可能是有用的, 因为它的可见吸收可以补充 pa-nic 的胆碱能研究功能。最后, nAChRs 也被光可转换配体和基因修饰受体21的组合进行了光学操作.该方法是对脑组织中 pa-nic 光解的补充, 对改性性 nahr 的遗传靶向能力要求既被视为优势又被视为缺点。
应注意到这一办法的几个关键要求。首先, 需要一种合适的可视化方法来准确定位神经元膜。在研究培养细胞时, 使用传统的表荧光显微镜进行成像可能就足够了, 但对于从脑片或其他厚组织制剂中的神经元记录, 2plsm 或共聚焦显微镜是一项要求。其次, 需要一种合适的光解激光束定位方法。这种方法利用双电流计扫描头与两个独立的 x-y 反射镜的光栅扫描成像光束和点光激活使用不变的激光束22,23,24。其他更有限的解决方案是可能的, 例如 (1) 单电流计扫描头, 交替栅格扫描成像光束和未造影光束, 或 (2) 简单地将未造影光束定向到视场的中心, 使电池被带到这个位置的闪光光解。第三, 如果希望在实验过程中收集生理信号, 需要一个系统同时进行电生理记录。上述要求可以满足与一个合适的全光学成像技术, 如最近所述5。下面包含了一个详细的协议, 描述了此方法的关键步骤。
Protocol
西北大学动物护理和使用委员会 (#IS00003604) 审查并批准了与大脑切片制备有关的工作。
注意事项:用于点光刺激的激光是可见的一类 iii b 激光, 有可能对眼睛造成伤害。2plsm 需要近红外 (nir) iv 类激光 (& gt;500 mw), 这可能会对眼睛造成严重伤害, 甚至在其他组织中烧伤。需要适当的激光束包容、系统联锁以及工程和管理控制, 以确保激光设备的安全运行。使用激光时, 请务必寻找当地的激光安全人员。
1. 释放激光器的校准和验证
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量化要传递到样品的激光功率。
- 打开 405 nm 激光 (具有5v 控制信号的最大功率 100 mw), 让激光系统预热约10分钟。
请注意:激光仍然关闭 (与 0 v 驱动), 并没有输出功率, 直到激光发送控制电压来调节输出功率。 - 将功率计放置在组织样品平面或冷凝器透镜的位置。相对于光学路径/物镜, 手动居中仪表。
- 将仪表设置为正确的波长范围 (400-1100 nm)。通过按相应的按钮将仪表归零。
- 使用软件控制, 为 405 nm 激光功率选择 100 (最大 1000; 1000 = 5 v), 将激光设置为全功率的10%。如果需要, 还可以通过 voltagerecord 将激光控制电压输入 PrairieView 系统, 以提供命令信号定时和功率电平的数字记录.
- 记录电能表的读数。
- 为 405 nm 激光功率输出选择 150 (最大1000的 15%), 并记录功率计的读数。重复此操作以收集激光功率曲线: 200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950和1000。
- 打开 405 nm 激光 (具有5v 控制信号的最大功率 100 mw), 让激光系统预热约10分钟。
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校准未老化的激光电流计。每当系统的光学元件发生变化时, 只要担心准确的现场定位, 或每月定期执行以下步骤。
- 安装将用于光刺激和成像实验的60x 浸水显微镜物镜物镜。在采集/成像软件中, 选择60x 物镜和光学变焦设置 1 (请参阅步骤 3.1.4.2)。
- 用红色永久标记将填充的圆圈标记在干净的玻璃显微镜幻灯片上。将幻灯片放置在显微镜舞台上, 并向目标放置标记。
- 将显微镜预聚焦于具有4倍或10倍目标的红色标记区域。在红色标记点的顶部加入1-2 毫升的水, 然后切换到60x 目标, 将目标浸入水中。将物镜聚焦在薄红色标记区域上。
- 切换到2光子激光扫描。对于大多数系统, 将炮塔移动到 #1 位置, 将三眼棱镜移出光路, 将扫描头镜移动到前面, 并将激光波长设置为 ~ 900 nm。为图像采集参数选择 512 x 512 像素框选项, 该选项是刺激镜像校准例程的默认像素元素。
- 启动系统扫描, 成像激光功率大于最小, 并微调目标焦点到薄红色标记荧光层。选择荧光场中清除碎片的场, 并均匀地涂上标记物。
请注意:此协议中的设置使用PrairieView 5.4 采集软件。 - 在软件的 "工具" – "校准"/"对齐" 菜单中打开"取消 cd galvo校准" 功能。通过烧伤点教程, 对第二个电流计反射镜对进行空间校准。
- 在烧伤点教程中, 选择 405 nm 激光, 选择400的激光刺激功率和20毫秒的刺激持续时间, 这应该会产生小 (~ 1-5μm 直径) 孔的红色标记。
请注意:通常使用 ~ 2-4 mw 和 1-10 ms 等设置, 但这些设置由示例确定。pa-nic 光刺激功率设置可能远远低于校准过程中烧蚀红色标记滑块上可见孔所需的功率。此校准例程可用于定位光刺激点, 但不应用于推断生理反应期间的绝对光刺激量。 - 选择 "更新" 可在中心点刻录后刺激和刷新图像, 并将圆形红色指示器移动到实际的点位置。这样做的中心点, 正确的中心点, 较低的中心点, 最后为九个点 (所有角落和边缘加上图像的中心) 的网格。
请注意:中心、右、下校正点位置确定刺激电流计电压, 以定义真正的中心和 x 和 y 缩放因子, 使刺激镜对与成像镜对相匹配。该软件将缩放和更新所有随后在不同于空间校准缩放的缩放设置下执行的标记点实验。
- 在烧伤点教程中, 选择 405 nm 激光, 选择400的激光刺激功率和20毫秒的刺激持续时间, 这应该会产生小 (~ 1-5μm 直径) 孔的红色标记。
- 通过打开markpoint窗口并在样品的新区域中手动激活已定义位置的刺激参数来测试校准。确保将正确的最新校准文件加载到 "标记点" 窗口中。在定义的位置激活 markpoints/ group或markpoint 系列功能, 或在实时扫描 过程中右键单击图像上的鼠标以应用测试脉冲并验证正确的校准。
请注意:激光刻录点现在应该完全以"标记点" 指示器为中心。 - 通过将驱动电压敲掉到voltagerecord程序中, 监视和记录激光脉冲功率和时间持续时间的激活 (请参阅步骤 1.1.4)。同样, 使用从一对光刺激电流计反射镜中获得的反馈信号的缩放电压信号记录每个刺激点的位置。
2. 可光电尼古丁 (pa-nic) 的制备
- 从贮存中提取一种冻干光致活性药物。
请注意:以下协议是专门针对 pa-nic 的;根据需要调整其他可拍照药物。虽然 pa-nic 表现出出色的稳定性5, 但在制备和实验过程中, 应采取合理的预防措施, 以防止其暴露在明亮的光线下。这可以通过在低光下简单地工作来实现;限制为红色滤光灯是没有必要的。 -
执行 pa-nic 的本地应用。
- 使用可编程的移液器拉起开口直径为20-40μm 的玻璃微型移液器。
- 用0.22μm 滤光片的记录溶液的过滤器 ~ 1 毫升。在过滤记录溶液中重新选择一定数量的 pa-nic, 最终产生 2 mm 的浓度。例如, 在50μl 的过滤记录溶液中溶解 100 nmol 冻干脂肪。
请注意:在最近的出版物5,6中, 使用 pa-nic 光解, 可以找到建议的记录溶液组成。 - 用50μl 的 2 mm pa-nic 回填本地应用移液器。
- 将本地应用程序移液器固定在安装在微机械手上的移液器支架中。通过适当的管道将移液器支架连接到能够持续低压应用的压力喷射系统 (1-2 psi)。
- 使用微机械手, 将局部应用移液器操纵到细胞外记录液中, 并将移液器尖端稍微置于距离感兴趣细胞约50μm 的小鼠脑组织上方。有关小鼠大脑切片制备和膜片钳记录的详细协议, 请参阅上一份报告8。
- 通过短暂施加压力 (1-2 psi) 检查应用参数。感兴趣的细胞应该有最小或没有位移。如果确实发生明显的运动, 将局部应用程序移液器重新定位在离感兴趣的细胞更远的地方 (侧向和/或轴向)。
- 在实现稳定的整个电池膜片夹具 (详情包括在以前的出版物8) 后, 使用压力弹射装置上的适当手动开关打开低压 (1-2 p. s. i.) 应用程序。用 pa-nic 将细胞周围的组织饱和 1-2分钟, 然后再进入下一步。
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对脑片进行 pa-nic 的沐浴应用 (超融合)。
- 在适合连续再循环的记录溶液中溶解一定数量的 pa-nic, 最终浓度为100μm。例如, 使用标准的15毫升管将 1μml aliquot 溶解到记录溶液中的10ml 中。
- 通过在灌注系统中打开适当的流量控制, 以 1.5-2 mL/min 的速度开始 pa-nic 溶液的再循环。循环发生在录制期间。为了保存有价值的药物, 使用内径最小的油管, 或通过缩短灌注系统中使用的油管的整体长度, 最大限度地减少循环体积。
请注意:通过采取这些步骤, 可以将浴循环的体积减少到 pa-nic 溶液的5毫升。如果在4°c 下存储防光保护, pa-nic 解决方案通常可以在同一周内连续使用两个录制日。 - 在循环过程中, 用碳原 (5% o2, 95% co2) 连续泡泡溶液, 并将浴温保持在32°c。
- 在低光照条件下使用 pa-nic 时, 将大脑切片保留在记录溶液中。
3. 2 光子激光扫描显微镜成像神经元
- 执行单元格的实时可视化。
- 使用透射光或红外差分对比度 (ir/dic) 光学器件和摄像机可视化内侧哈布努拉 (mhb) 神经元, 并建立稳定的整个细胞膜片夹片记录。有关从尖锐碱制备的小鼠大脑切片8中的神经元的膜片钳记录的详细信息, 请参阅以前的协议。
- 在建立高电阻 (& gt;1 gω) 细胞连接配置后, 但在闯入前, 将设置和软件切换到激光扫描模式。
- 闯入后, 使用激光扫描来验证成像染料 (稀释到 100-200μm 的最终浓度为 100-200μm 的标准细胞内移液溶液, 如前8所述) 是被动的 (通过扩散) 填充神经元。允许染料 (例如,绿色光电倍增管 [pmt] 通道中的亚历克莎 flor 488, pmt 2; 或红色 pmt 通道中的亚历克莎 fluor 568 或 568, pmt 1) 在尝试需要可视化的实验之前, 将细胞隔间填充至少20-30。soma 外的任何细胞隔间。
请注意:远端隔间 (树突状结构、刺、轴突等) 可能需要30-40 才能完全填充25分钟. - 使用软件实时扫描功能来可视化所感兴趣的神经元和亚细胞隔间。选择成像参数, 以便准确地实时显示神经元特征。操作各种设置以影响或更改显示可视化 (对比度)、分辨率、信噪比 (sn) 和图像帧采集时间:
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可查阅表 (lut)。使用任何图像窗口一侧的相应图标打开 lut 窗口。打开后, 调整特定图像通道的 lut 地板 (最小) 和天花板 (最大) 设置, 以增强屏幕上显示的信号对比度的可视化效果。将最大值降低到 ~ 1000 (4096, 12位检测), 这将有助于在首次搜索单元格、信号和结构时提取调光器信号。
注: 这些设置只影响显示的信号, 而不影响检测到的/记录的值。人类的眼睛通常只能与 ~ 50个灰色水平26形成对比。 -
光学变焦。使用软件控件选择1X 光学变焦, 并使用平移控件定位组织中所需的区域。此缩放设置产生最大的正方形, 扫描的视野, 并发送最大的伏重/扫描角度, 到电流计反射镜。
请注意:默认配置用于扫描头内的12毫米 x 12 mm 视场, 该景景转换为12毫米除以样品内的目标放大倍率。因此, 在1x 的光学变焦下, 60x 物镜可产生每侧200微米的扫描图像。较高的光学变焦值扫描面积更少。2倍光学变焦通常是可视化整个神经元最有用的设置。4倍可用于可视化神经元的亚细胞方面。 -
像素数.要补充1次光学变焦, 请使用软件控件选择每行 1024 x 1024 像素。在拍摄和显示的图像中设置每行的像素数,以免从客观镜头中丢失可能的细节。对于60x/1.0 数字光圈 (na) 目标, 请使用以下实用像素值: 缩放1为 1024 x 1024, 缩放2为 512 x 512, 缩放4为 256 x 256。端像素大小 (~ 0.17μm; 12 mm/magnification/zoom/pixels 像素) 应为物镜定义的横向分辨率的一半或更少。
请注意:图像分辨率仅由激光波长和目标 na (双光子激发 [2pe] 的0.4μm 分辨率定义, 具有 920 nm 和 1.0 na 目标)27。在透镜上列出的全激发 na 的标准是, 激光束直径的半2强度与物镜的入口瞳孔 (2 x 管镜头焦距 x na/放大倍率) 相匹配。这里描述的系统中的管透镜的焦距为180毫米。 -
像素停留时间.使用软件控件为像素停留时间选择 4μs, 这是一个有用的默认值。
请注意:更改像素停留时间不会更改检测到的平均信号;它只影响像素内的平均, 这些变化可以通过像 n 的图像质量来可视化。图像像素停留时间始终是0.4μs 单位的倍数, 对于较大的停留时间, 每个图像像素的12位有限强度值是0.4μs 样本的平均值。由于 sn 比率作为每个像素停留时间样本数的平方根提高 (4μs 等于十个样本, 或 sw 的3.16倍改进), 图像质量的提高会使大于12μs 的值获得递减的回报。 -
扫描旋转和感兴趣的区域 (roi).使用软件控件将图像角度设置为0°旋转 (可能不需要任何操作, 因为0°旋转是大多数成像系统的默认设置)。如果样品以 "倒置" 的方向放置, 请选择180°旋转以 "翻转" 图像。
请注意:在任何给定的角度旋转图像都可以为填充单元的整个感兴趣区域提供更适合的位置。旋转还可以为调整结构变化和进行后续分析提供更明确的基础。在给定的缩放 (步骤 3.1.4.2) 设置中选择扫描图像中感兴趣的区域将保留本机像素号 (步骤 3.1.4.3), 但对总面积和像素的限制可以显著提高帧速率, 从而提供提高了信号变化的时间分辨率。 -
帧平均.使用软件控件选择2个帧的起始帧平均设置。
请注意:最终图像对比度 (sn) 由在图像的信号像素内检测到的总光子定义。平均多个图像帧可以提高 sn 比, 前提是样品在成像过程中不移动或不漂白。在帧平均过程中, 感兴趣的信号保持不变的值, 而图像中的噪声则由平均帧数的平方根减小。荧光图像中的小结构通常需要像素间平均, 结合图像 (通常称为 roi) 中的像素和帧平均。帧平均通过选择平均的图像数量来增加扫描时间。
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可查阅表 (lut)。使用任何图像窗口一侧的相应图标打开 lut 窗口。打开后, 调整特定图像通道的 lut 地板 (最小) 和天花板 (最大) 设置, 以增强屏幕上显示的信号对比度的可视化效果。将最大值降低到 ~ 1000 (4096, 12位检测), 这将有助于在首次搜索单元格、信号和结构时提取调光器信号。
- 使用"平移控制 "、"扫描旋转"和"光学缩放" 工具, 在扫描时确定采样位置的定位。如果需要电机级操作来定位样品, 请避免 x、y 和 z 轴的较大步长, 以防止目标/冷凝器碰撞、振动或激光束暴露在反射表面。
- 收集 z 堆栈。使用z 系列工具, 选择包含感兴趣的单元格的开始和停止位置。选择一个步长 (1μm), 然后连续成像包含单元的每个 z 平面中的神经元。
请注意:z 堆栈采集设置因神经元类型和填充染料而异。z 堆栈采集的最佳参数应独立于用于实时成像的参数来确定。z 堆栈采集可以在光学实验之前和之后进行。如果可能的话, 在光学生物学之后进行 z 堆栈采集, 以避免2plsm 引起的任何细胞损伤, 并允许小细胞隔间的最佳染料填充。
4. 电生理记录过程中的激光闪光光解
请注意:应用 405 nm 或 405 nm 激光功率≥1 mw 产生荧光内的玻璃的客观和冷凝器镜头。这种产生的光与激光照明功率直接相关;发射存在于绿色和红色的光谱窗口中, 并在毫秒范围内具有激发状态寿命。这种背景刺激文物可以在所有测试的镜片和所有主要的物镜制造商的浸水物镜中看到。与物镜镜片相比, 冷凝器镜片产生的磷光要高得多。这一 "信号" 促使使用机械快门保护敏感的砷化镓 (gaasp) pmt 阴极在光刺激事件中。使用通常闭合的机械快门 (在不主动扫描时关闭) 是保护冷却 gaasp pmt 的最佳解决方案。
- 对于沙漏型光刺激光束几何形状, 请移除光路光学中的任何聚焦透镜, 否则, 当激光束进入目标入口瞳孔时, 这些聚焦透镜会将其窄窄。
- 使用"标记点", 选择单个点设置。
请注意:其他光刺激设置 (多个点, 一个点的网格, 螺旋扫描) 是可能的在标记点。单点是最简单的。实验目标和生物差异可能需要不同的环境。 - 使用 "实时扫描" 选项更新图像, 以简要进行图像成像并定位感兴趣的亚蜂窝区域。定期更新图像, 以识别焦点中的任何潜在的小漂移。
- 如有必要, 使用软件控件可增加光学变焦 (即, 选择比当前更高的光学变焦设置), 以可视化小型结构 (即脊柱或远端树突)。
- 将标记单点十字线放在紧邻细胞膜 (约0.5 微米) 的地方。不要将光刺激点直接放置在细胞特征上, 因为这可能导致光斑。
- 使用标记点中的软件控件设置光刺激参数。应用启动指南如下: 1-50 ms 持续时间, 1-4 mw 激光功率, 和≥1试验。
- 选择"运行标记点"启动标记点协议, 实时观察电生理数据采集。
- 重复步骤 4.2-4.7 几次, 以评估响应振幅和动力学的一致性和稳定性, 或缺乏一致性和稳定性。
Representative Results
对于光解刺激, 曝光剂量 (强度和时间)、曝光位置和光束几何形状是关键变量。本文所描述的系统能够产生两种不同的光刺激光束, 在光束进入电流计系统之前,通过将镜头从光调制光路径中移动来调节。如果没有这个透镜, 光刺激光束就会充满 60x/1.0 na 浸渍 [60x wd] 目标的入口瞳孔, 在样品内的焦面上产生一个近衍射有限的子微米点。这与具有沙漏形状的光刺激光相关, 在与光轴对称的焦点上方和下方延伸。随着镜头插入路径, 光刺激激光聚焦到客观镜头的入口瞳孔, 然后作为铅笔状光束退出。对于60x 目标, 预计直径为 ~ 10μm, 它在整个样品中垂直扩展了均匀性。在这种模式下, 在刺激点内的任何给定位置的光强将是近衍射有限的小斑点强度的 ~ 1%。因此, 使用 ~ 10μm 的光斑刺激时, 通常需要更高的激光功率。本文报道的所有实验都采用了沙漏式光刺激光束。
在使用功率计测量样品上的激光功率后, 可根据输入电压设置绘制交付的采样功率。这些研究使用工作距离为2毫米的 60x wd 目标, 但它不被淹没在水中进行功率测量, 以避免对探测器元件的潜在损坏。当在空气中测量列出的 na > 0.95 的目标 (不含浸入液) 时, 由于指数 (空气) 较低, 镜头前表面元件可能会出现总的内部反射损失。在这种情况下, 为了更精确地测量样品功率 (以纠正总的内部反射损耗), 增加测量功率的 1.0 na 目标 (1.0/0.95)2在空气中测量。图 1a 显示了在本研究中集成到激光发射系统中的 405 nm 和 405 nm 可见光激光器的典型输入输出图。这些激光系统是光刺激曝光剂量控制的理想选择, 原因如下: (1) 它们经过预校准, 可直接提供相对于输入电压 (0-5 v) 的线性功率输出, (2) 它们提供了一个快门操作 (不静音)输出), 和 (3) 它们具有快速、亚毫秒强度脉冲持续时间控制 (0.1 毫秒响应)。在激光系统中使用点照片刺激时,对 markpoint点进行常规校准是一项重要任务。图 1b(左面板) 演示了一个不在校准的系统 (所需的光致刺激点不会导致准确刺激该点, 如烧孔位置所示), 并在校准后返回到准确定位的点 (图 1b, 右面板)。
pa-nic 是适度荧光 (发射峰值在 ~ 510 nm), 表现出有效激发在350-450 纳米 (1-光子激发) 或 700-900 nm (2-光子激发)5之间。为了在局部应用过程中显示 pa-nic (1 mm), 在脑组织附近应用 pa-nic (1 mm), 然后通过 dodt 对比和 (2) 从pa-nic. pa-nic 2pe 荧光在从本地应用移液器喷射压力时很容易检测到 (图 2PE)。尼古丁和单烷基香豆素, 7-羧甲基氨基-4-甲基香豆素, 是 pa-nic 光解反应5的主要光化学产物。使用与 pa-nic 成像相同的成像设置参数, 在输送尼古丁 (1 mm) 或 7-羧甲基氨基-4-甲基香豆素 (1 mm) 的过程中对组织进行成像。未检测到荧光信号 (图 2a, 中、下面板), 这表明了 pa-nic 结果的特异性。最后, 在脑组织中应用 pa-nic, 对 pa-nic 荧光发射进行了成像 (图 2b)。这种方法证实 pa-nic 存在于本地应用移液器的100-200μm 范围内。这些数据共同证实, pa-nic 通过局部应用有效地传递到脑组织。
同时进行2plsm 的电生理记录, 用于可视化细胞结构, 要求研究者平衡实验两个组成部分的考虑因素, 通常可以使用一个狭窄的时间窗口 (~ 20分钟)从修补单元格中采集样本数据。在不考虑细胞可视化的情况下, 最好在闯入后尽快开始记录, 因为记录稳定性往往会随着时间的推移而下降。然而, 当成像是一项要求时, 电生理考虑因素必须允许足够的时间增加荧光浓度在小远程结构。这是一个例子, 通过检查染料浓度填充曲线28, 这有时是有用的推导时, 成像一个新的细胞类型。图 3显示了几个通过2plsm 成像为 z 堆栈的示例神经元, 并折叠成最大强度投影以用于表示目的。图 3a显示了高质量的图像, 其中神经元形态似乎是完整的, 噪音最小化, 碎片不会干扰对细胞形态的解释。图 3b显示了由于信噪比较低和碎片较大而质量较低的图像。这种碎片通常表现为强烈荧光的球形口袋, 是在接近细胞时从贴片移液器中喷射出的。值得注意的是, 在浴缸中加入 100μm pa-nic (在进行沐浴应用时) 往往会降低信噪比, 并导致图像对比度不理想。亚历克莎 fluor 568 或568通常是非常有用的本地应用实验作为查找器染料或归一化的2pe 参考归一化信号。这些染料的双光子激发的有效波长是 ~ 780 nm27, 它允许同时显示 pa-nic 和识别细胞隔间。然而, 这种波长并不能完全避免 pa-nic 5 的双光子光解.亚历克沙·福陆488在 pa-nic 浴应用实验中具有优势;当激发合适的波长≥900 nm 时, 可以避免 pa-nic 5 的双光子光解, 同时保持细胞隔间的适当可视化。
图 4显示了在脑片中 mhb 神经元局部 pa-nic 激光闪光光解的示例数据。图 4a(上面板) 显示了一个 "参考" 图像的示例, 它是在运行 markpoint协议之前拍摄的最后一个2plsm 图像的屏幕捕获, 并与光刺激点位置叠加。图 4a(下图像面板) 显示了覆盖在细胞形态上的光刺激点的放大视图。图 4a的下面板显示了 pa-nic 光解的相应时间相关电生理反应。先前的研究表明, 这些电流对 nahr 拮抗剂 5很敏感。图 4b显示了来自不同细胞的代表性数据, 其中单点光解是在1秒或10秒的时间间隔内进行的. 而10秒的间隔允许基线保持电流有足够的恢复时间, 较短的1秒间隔导致随着协议的实施, 持有电流逐渐增加。不断增加的电流表明, 尼古丁没有足够的时间在1赫兹间隔29的情况下从系统中扩散。这种时间反应分析必须对正在研究的任何新的细胞类型重新进行, 因为 nacr 的神经药理学可能因细胞类型而异。
图 1: 光调制激光校准.(a) 光刺激激光功率输出。在指定的输出设置下, 测量了 405 nm 和405纳米光刺激激光器的样品平面功率 (通过 60x/1.0 na 浸水目标)。(b) 光刺激激光校准。屏幕捕获图像显示预期的光刺激点与标记点 (左) 和之后 (右) 运行校准之前 (烧孔) 发生的相应位置之间的空间关系. 请点击这里查看此图的较大版本.
图2:pa-nic 本地应用程序.(a) 从当地应用移液器中检测 pa-nic。1 mm pa-nic、光解副产物或尼古丁被溶解在 acsf 中, 装入局部应用移液器, 并在 2plsm (900 纳米激发) 成像期间使用每种药物相同的成像设置分配到脑组织。激光扫描 dodt 对比传输图像显示了组织/移液器, 而 gaasp 阴极 pmt 被用来捕获荧光发射。(b) pa-nic (1 mm) 被注入脑组织, 并通过2plsm 成像, 如 (a) 所示, 以显示 pa-nic 利用其固有荧光的横向扩散。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3: 2 光子激光扫描显微镜图像的采集.(a) 最佳的 2plsm z 堆栈。给出了两个 2plsm z-堆栈最大强度投影的例子, 说明 mhb 神经元有很好的树突和很少或没有干扰碎片。(b) 次优 2plsm z 堆栈。两个 2plsm z-堆栈最大强度投影的例子显示了 mhb 神经元周围的碎片 (染料从移液器在细胞接近过程中排出)。这样的图像比 (a) 中显示的图像更难解释。请点击这里查看此图的较大版本.
图 4: pa-nic 的激光闪光光解.(a)标记点参考 pa-nic 光解引起的图像和内向电流。对于一个 mhb 神经元, 在单个 (指示的) 细胞位置显示标记点光刺激试验的原始参考图像。请注意, 对于某些光刺激位置 (本系列中最右侧的图像), 树突状结构处于焦点位置, 但 soma 和近端树突不是焦点。在每个参考图像下方, 绘制了尼古丁未引起的内电流。(b) pa-nic 光解的刺激间隔。mhb 神经元的示意图记录显示, 在同一外皮位置反复发现尼古丁, 刺激间隔为 1 s 或 10秒. 请点击此处查看此图的较大版本。
Discussion
pa-nic 应用交付方法的选择是这一局部光刺激技术中最关键的一步。两种方法, 洗浴应用和局部灌注, 各具有明显的优势和局限性。在感兴趣的细胞类型中, nahr 功能表达水平在很大程度上影响了选择。通常最好在功能表达水平较高的情况下使用洗澡时使用洗澡水, 因为洗澡水应用允许在记录的细胞周围有一个均匀的探针浓度, 从而方便了数据解释。浴应用还消除了组织中对第二灌注移液器的需求, 使整个过程更容易。然而, 昂贵的化合物的沐浴应用每次实验的成本更高。
通常, 故障排除包括试图了解为什么在闪光灯光解之后看不到 nahr 激活。当使用以前没有使用 pa-nic 研究过的细胞类型时, 研究人员应在当地进行 ach 或尼古丁的应用, 以确定是否有足够的受体在功能上表达 5.为了验证该系统是否能够检测光解反应, 应在表达大量受体30的内侧哈伯努拉神经元中进行控制实验。在这个大脑区域, pa-nic 浴应用是可能的, 这是最好的验证实验。只有在执行了这些验证实验后, 才应该进入未研究过的细胞类型。如果实验系统已经验证, 响应仍然很小或无法检测到, 则可能需要增加 pa-nic 的浓度, 增加闪光强度或脉冲持续时间, 添加 nahr 正异构调制器, 以增强 nahr活动6, 或这些的一些组合。
有时, 未控制的响应太大, 具有显著的 nahr 激活, 导致间接电压门控 na +通道激活和未夹紧的内电流, 由于空间夹具差。这些伪影完全掩盖了 nachr 的内电流, 使数据解释成为不可能, 通过在记录移液器中加入 qx-314 (2 mm) 可以消除这些伪影。它们也可以通过降低 pa-nic 的浓度或减少闪光强度或脉冲持续时间来消除。在所有可见光光刺激实验中, 在选择刺激部位时必须小心, 以避免在所需的焦面上方或下方进行意外的刺激光解。此外, 在适用的情况下, 必须始终滴定激光功率以再现生理反应。特别重要的是要注意 z 轴光刺激时, 与笼状配体的工作, 因为在焦点下方激活的配体仍可能扩散并与所研究的生物系统 (即受体) 相互作用.
pa-nic 激光闪光光解可能并不适合所有的研究人员, 因为存在一些限制。首先是合适的设置成本相对较高。在处理完整的大脑切片时, 像树突这样在小直径结构附近进行发现需要一个复杂的可视化系统, 如2光子显微镜。除了用于执行 2-光子显微镜的钛蓝宝石 (可调谐红外脉冲激光) 的高成本外, 能够独立定位两种激光束的双电流计系统还进一步增加了系统成本。如果调查员有足够的专业知识和时间来构建、故障排除和维护这样的系统, 则可以通过使用自制系统来降低系统总成本。第二个限制通常涉及低 nahr 功能表达式, 可以通过采取上述步骤部分缓解, 但这可能不能保证成功。通常情况下, 如果不能测量在应用激动剂后的配体激活电流, 在电压钳下的 pa-nic 闪存光解可能不会产生可接受的结果。第三个限制涉及 pa-nic 的固有荧光. pa-nic 吸收 ~ 405 纳米光, 并在类似于绿色荧光蛋白 (gfp) 或亚历克莎 4055 的范围内发出。当 pa-nic 浓度超过 ~ 1 mm 时, 这种荧光特性会使同时可视化神经元结构变得具有挑战性。为了缓解这种情况, 能够轻松控制灌注移液器中的 pa-nic 流量至关重要。pa-nic 的流动会定期停止, 以使荧光分子扩散出去。这允许重新成像的神经元, 以检查未发现的光束的点位置。第四个潜在的限制是使用405纳米光进行光解。较短的波长 (如405纳米) 更容易在复杂的组织 (如大脑切片) 中散射。因此, 在给定的闪光强度和持续时间内, 不腐蚀的响应振幅和衰变动力学可能会受到切片内不变焦点深度的不同影响。关于 nahr 生物学方面的结论应考虑到这一重要的警告。
这种局部激光闪光光解技术最近被用来发现有关 nahr 神经生物学的新细节。例如, 慢性尼古丁暴露增强了间生和树突状的 nahr 功能在内侧哈贝努拉神经元5。它也被用来帮助证明, 第一次, 腹侧结节状神经元表达功能 najr 在他们的外生和树突状细胞隔间 6.这项技术有许多潜在的未来用途, 这种方法可以应用于其他关键神经元类型, 已知表达 nahr, 如皮质锥体神经元31或大脑皮层32的间神经元, 纹状体33, 海马体 19。这项技术也可以结合药理学和/或 nahr 基因编辑34 , 定位特定受体亚型到不同的神经元隔间。该方法可以很容易地适应其他香豆素笼化合物, 包括但不限于与 pa-nic5平行开发的化合物。最后, pa-nic 闪光光解有一天可能会被用于一种有光照行为的动物, 以研究尼古丁在新的行为药理学范式中的作用。
Disclosures
d. l. w. 担任布鲁克纳米荧光显微镜的有偿顾问。
Acknowledgments
作者感谢西北大学以下主要调查人员的实验室成员: ryan drenan、d. james surmeier、yevgenia Kozorovitskiy 和 anis 承包商。这项工作得到了美国国立卫生研究院 (nih) (向 r. c. d. 提供 da035942 和 DA035942)、phrma 基金会 (向医学博士提供研究金) 和 hmi 的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instruments, Consumables, and Miscellaneous Chemicals | |||
| Multiclamp 700B | Molecular Devices Corp. | Patch clamp amplifier | |
| Pneumatic Picopump | World Precision Instruments | PV820 | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument Co | P-97 | |
| Temperature Controller | Warner Instruments | TC-324C | |
| Vibrating blade microtome | Leica Biosystems | VT1200S | |
| Ultrafree-MC Centrifugal Filter | MilliporeSigma | UFC30GV0S | internal solution filter |
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B150F-4 | patch and local application pipette |
| (-)-Nicotine hydrogen tartrate salt | Glentham | GL9693 | nicotine salt |
| 7-carboxymethylamino-4-methyl coumarin | Janelia Research Campus | PA-Nic by-product | |
| 1-[7-[bis(carboxymethyl)- amino]coumarin-4-yl]methyl-nicotine | Janelia Research Campus | PA-Nic | |
| Euthasol (Pentobarbital Sodium and Phenytoin Sodium) | Virbac | ANADA #200-071 | |
| Alexa FluorTM 488 Hydrazide | ThermoFisher | A10436 | green fill dye |
| Alexa FluorTM 568 Hydrazide | ThermoFisher | A10437 | red fill dye |
| 6-carboxy-AF594 (Alexa Fluor 594) | Janelia Research Campus | red fill dye | |
| QX 314 chloride | Tocris | 2313 | voltage-gated sodium channel blocker |
| Power Meter | ThorLabs | S120C | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals for Solutions | |||
| N-Methyl-D-glucamine | Sigma | M2004 | |
| Potassium chloride | Sigma | P3911 | |
| Sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma | S9638 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S6014 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G5767 | |
| (+)-Sodium L-ascorbate | Sigma | A4034 | |
| Thiourea | Sigma | T8656 | |
| Sodium pyruvate | Sigma | P2256 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma | 230391 | |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma | 223506 | |
| Sodium chloride | Sigma | S9625 | |
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid | Sigma | E3889 | |
| Adenosine 5′-triphosphate magnesium salt | Sigma | A9187 | |
| Guanosine 5′-triphosphate sodium salt hydrate | Sigma | G8877 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Components of 2-Photon Microscope | |||
| Ultima Laser Scanner for Olympus BX51 Microscope | Bruker Nano, Inc. | imaging software and galvos | |
| Imaging X-Y galvanometers | Cambridge Technology | ||
| Mai Tai HP1040 | Spectra-Physics | Tuneable IR laser | |
| Pockels cell M350-80-02-BK with M302RM Driver | Conoptics, Inc. | for IR laser attenuation | |
| Integrating Sphere Photodiode Power Sensor | Thorlabs, Inc | laser power pick-off photodiode | |
| Uncaging X-Y galvanometers | Cambridge Technology | ||
| Helios 2-Line Laser Launch | Bruker Nano, Inc. | uncaging laser components | |
| OBIS LX/LS 405 nm (100 mW) | Coherent, Inc. | ||
| OBIS LX/LS 473 nm (75 mW) | Coherent, Inc. | ||
| Point-Photoactivation / Fiber Input Module for Limo Sidecar - Uncaging | Bruker Nano, Inc. | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Upright Microscope | Olympus | BX51WIF | Upright microscope chasis |
| Objective: Olympus M Plan FL 10x; NA 0.3 WD 11 mm | Olympus | 10x objective | |
| Objective: Olympus M Plan Fluorite 60x/1.0 WD=2mm NIR | Olympus | 60x water-dipping objective | |
| X-Cite 110, four-LED LLG coupled epi-fluorescence light source | Excelitas Technologies | LED Light Source | |
| Epi-Fluorescence Filter: ET-GFP (FITC/CY2) for Epi-Turret | Chroma Technologies | LED Filter for blue light excitation | |
| Epi-Fluorescence Filter: ET-DsRed (TRITC/CY3) for Epi-Turret | Chroma Technologies | LED Filter for green light excitation | |
| B&W CCD camera; Watec, 0.5 in B/W CCD | Watec Co., LTD. | CCD camera for patch clamp recording | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| External Detectors - Dual Reflected Emission - Olympus Upright (Multi-Alkali, GaAsP) | Bruker Nano, Inc. | ||
| Multi-alkali side-on PMT | Hamamatsu | R3896 | red channel PMT |
| 595/50m | Chroma Technologies | red channel emission filter | |
| 565lpxr | Chroma Technologies | dichroic beam splitter | |
| GaAsP end-on PMT | Hamamatsu | 7422PA-40 | green channel PMT |
| 525/70m | Chroma Technologies | green channel emission filter | |
| High-Speed Shutter for Hamamatsu H7422 PMT | Vincent Associates / Bruker | 517329 | PMT shutter mount |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dodt Gradient Contrast Transmission Detection Module | Bruker Nano, Inc. | ||
| Multi-alkali side-on PMT | Hamamatsu | R3896 | Dodt PMT |
References
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