Summary
מאמר זה מציג שיטה ללימוד קולטני אצטילכולין nicotinic (nAChRs) העכבר פרוסות המוח על-ידי uncaging ניקוטין. כאשר משולב עם הקלטה מלחציים תיקון בו זמנית של סריקת מיקרוסקופ לייזר הפוטונים 2, ניקוטין uncaging מחבר קולטן nicotinic פונקציה עם מורפולוגיה הסלולר, מתן הבנה עמוקה יותר של שימוש הנוירו-ביולוגיה.
Abstract
אצטילכולין (ACh) פועל באמצעות קולטנים לווסת מגוון רחב של תהליכים עצביים, אבל זה מאתגר לקשר ACh פונקציה קולטן עם subcellular מיקום בתוך התאים שם פונקציה זו מבוצעת. ללמוד את המיקום subcellular של הקולטנים ACh nicotinic (nAChRs) בתוך רקמת המוח מקורית, פותחה שיטה אופטית לשחרור מדויק של ניקוטין מקומות דיסקרטית ליד ממברנות העצבית במהלך הקלטות אלקטרופיזיולוגיות. תיקון מהודקי נוירונים במוח פרוסות מלאים לצבוע כדי להמחיש את המורפולוגיה שלהם במהלך מיקרוסקופ לייזר הפוטונים 2 סריקה, ניקוטין uncaging מתבצע בעזרת הבזק אור על ידי התמקדות קרן לייזר 405 ננומטר ליד אחד או יותר ממברנות הסלולר. Deflections הנוכחי הסלולר נמדדים, תמונה (3D) תלת-ממדית ברזולוציה גבוהה של מוקלטת הנוירון עשוי לאפשר התאמה של תגובות nAChR עם מורפולוגיה הסלולר. שיטה זו מאפשרת ניתוח מפורט של התפלגות פונקציונלי nAChR רקמות מורכבות ההכנות, מבטיח לשפר את ההבנה של שימוש עצבית.
Introduction
שימוש באיתות ממיקרו תהליכים מוחיים רבים, כולל שליטה כל מעסיק, תנועה ופרסומיה פרס1,2. תרופות המשפרים את שידור אצטילכולין (ACh) משמשים לטיפול ליקוי קוגנטיבי הקשורים עם מחלת אלצהיימר, רומז תפקיד חשוב עבור מערכות שימוש קוגניציה3. הבנה משופרת של קולטנים שימוש ואת המעגלים במצבים בריאים וחולים עלול להוביל יותר גישות טיפוליות עבור מספר מחלות/הפרעות נוירולוגיות.
ACh nicotinic קולטנים (nAChRs) הם משפחה של תעלות יונים ממותגת ליגנד זה שטף קטיונים בתגובה אנדוגני ACh או ניקוטין אקסוגני של מוצרי טבק. בהתחשב בעובדה כי הם היו בין קולטני עצבי הראשון שתואר4, פרמקולוגיה nAChR מיקום בתוך סיבי השריר הוא מובנות על רצפטורים שרירים-סוג. לעומת זאת, יחסית מעט מאוד ידוע על פרמקולוגיה, subcellular והפצה של יליד nAChRs במוח. פער זה מתוך ידיעה זו נדונה לאחרונה על ידי פיתוח מכשיר בדיקה כימית הרומן המאפשר הפעלה במרחב מוגבל ומהירה של nAChRs ברקמת המוח במהלך דימות הסלולר, הקלטה אלקטרופיזיולוגיות5. . הנה, השלבים מתודולוגי המפתח מעורבים בגישה זו מתוארים, עם המטרה הכוללת של שיפור היכולת להתחבר nAChR פונקציה עם מבנה עצביים.
Photoactivatable ניקוטין (PA-Nic; שם כימי: 1-[7-[bis(carboxymethyl)-אמינו] קומרין-4-yl] מתיל-ניקוטין) יכול להיות photolyzed עם ~ 405 ננומטר לייזר הבזקים לשחרר ביעילות ניקוטין5,6. לפני uncaging, הרשות הפלסטינית-Nic יציב בפתרון ותערוכות לא רע לא תרופתי או פוטו אטמוספרי תכונות5. לאחר פוטוליזה, שפורסמו ניקוטין מפעיל כצפוי nAChRs, uncaging לוואי פרמקולוגית אינרטי5. לייזר מכ משמש מקור האור פוטוליזה עם כוח פלט > 1 mW נמדד ב המדגם. כאשר מקומי, צילום יישוב-גירוי בשילוב עם היכולת לאתר ממברנות הסלולר עם לייזר הפוטונים 2 סריקה מיקרוסקופ (2PLSM), שני יתרונות מרכזיים של גישה זו הם הבינו במלואם: פוטוליזה מהירות ודיוק מרחבית.
בכל הכבוד, פוטוליזה של הרשות הפלסטינית-Nic עדיפה בשיטות אחרות של העברת nAChR ליגנדים לקולטנים בתוך פרוסות המוח. גישות כאלה כוללים אמבט יישום7 , סמים מקומי משלוח באמצעות פיפטה puffer8. בעוד הגישה נוטה להדגיש יתר על המידה את ההשפעות ארוכות הטווח של הסם יישומית, הצגנו יכולה סובלים השתנות ב קינטיקה התגובה בין ניסויים על-פני תאים. גם גישות חלופיות אלה יכולים להבחין שלמאחה קולטן הפעילויות במיקומים שונים הסלולר של נוירון אותו. מופעל Optogenetically שחרור ACh שימש במשך החקירה של יליד nAChRs9,10,11, אבל זה לא הוכיח שימושי עבור מיפוי subcellular nAChR מקומות. יתר על כן, רוב המחקרים ניצול גישה זו צריכים לסמוך על הבעת ChR2 חיידקי מלאכותי כרומוזום עכבר עם שידור שימוש חריג12,13,14, 15 , 16 , 17.
הרשות הפלסטינית-Nic פוטוליזה אינה הגישה אופטי רק ללמוד שימוש קולטנים. Carbachol בכלובים שימש למיפוי פונקציונלית ACh פעילות הקולטן תאים בתרבית18 ו המוח פרוסות19, אבל לא היה זמינים מסחרית עבור מחקרים השוואתיים, במהלך הפיתוח של הרשות הפלסטינית-nic. Bis רותניום (bipyridine)-ניקוטין מורכבים (RuBi-ניקוטין) דווח כדי לאפשר uncaging ניקוטין20, אבל ההכנות מסחרי של רובי-ניקוטין הוכיחה הרשות הפלסטינית-Nic נחות בהשוואה עפות ללמוד5. זה עשוי להיות שימושי לחזור על ניסויים אלה השוואתית עם מסחרי, מאוד מטוהרים RuBi-ניקוטין, כמו בליעה גלוי יכול להחמיא התכונות של הרשות הפלסטינית-Nic ללימודי שימוש. לבסוף, nAChRs יש גם שטיחות תומרנו באמצעות שילוב של קולטנים מהונדס גנטית21של ליגנדים צילום-להחלפה. גישה זו היא משלימה את הרשות הפלסטינית-Nic פוטוליזה ברקמת המוח, עם הדרישה/היכולת של התמקדות גנטי nAChR ששונה לראות גם יתרון וגם חיסרון.
ראוי לציין מספר דרישות המפתח של גישה זו. ראשית, שיטת הדמיה המתאימה נחוץ כדי לאתר במדויק את הקרום עצביים. הדמיה עם מיקרוסקופ אפינפרין קונבנציונלי-ידי קרינה פלואורסצנטית עשוי להיות מספיק כשלמדתי תאים בתרבית, אך עבור הקלטה של נוירונים במוח פרוסות או תכשירים אחרים רקמות עבות, 2PLSM או מיקרוסקופיה קונפוקלית היא דרישה. שנית, שיטה מתאימה יש צורך למקם את קרן הלייזר פוטוליזה. גישה זו מנצל ראש כפול-גלוונומטר סריקה עם שתי מראות עצמאיות x-y עבור סריקה סריקה של קרן הדמיה, נקודת photoactivation באמצעות uncaging לייזר קרן22,23,24. פתרונות מוגבלת יותר אפשריות, כגון (1) ראש חד-גלוונומטר סריקה כי לחלופין רסטר סורקת קרן הדמיה, קרן uncaging, או פשוט (2) בבימוי קרן uncaging למרכז שדה הראייה כך התא הוא הביא עמדה זו עבור פלאש פוטוליזה. שלישית, מערכת נדרש אלקטרופיזיולוגיות הקלטה סימולטני אם אדם רוצה לאסוף אותות פיזיולוגיים במהלך הניסויים. הדרישות לעיל ניתן נפגשו עם טכניקה מתאימה כל-אופטיים הדמיה, כמו תיאר לאחרונה5. להלן, פרוטוקול מפורט נכלל זה מתאר את השלבים החשובים של גישה זו.
Protocol
עבודה הנוגעים המוח פרוסה הכנה נבדקו ואושר על ידי חיה אוניברסיטת נורת'ווסטרן אכפת ועל שימוש הוועדה (פרוטוקול #IS00003604).
התראה: לייזרים המשמש נקודת צילום-גירוי הם גלויים לייזרים IIIb מחלקה אשר יש פוטנציאל לגרום נזק לעיניים. 2PLSM דורש לייזר אינפרא אדום (ניר) השיעור הרביעי (> 500 mW), אשר יש פוטנציאל לגרום נזק רציני העיניים ואת ואפילו כוויות ברקמות אחרות. בלימה קרן לייזר מתאים, משתלב במערכת, וכן מהונדסים בקרות מנהליות נדרשים כדי להבטיח פעולה בטוחה של ציוד מבוססת לייזר. תמיד מחפשים אנשי בטיחות לייזר מקומי בעת עבודה עם לייזרים.
1. כיול ואימות של Laser(s) Uncaging
-
לכמת את עוצמת הלייזר יועבר המדגם.
- להפעיל את 405 ננומטר לייזר (100 מגה-וואט מקסימום כוח עם אותות הבקרה V 5) ולתת את מערכת הלייזר לחמם כ 10 דקות.
הערה: הלייזר עדיין יסגרו (עם כונן 0 V) ואין שום כוח פלט עד הלייזר נשלחת מתח הבקרה לווסת את הספק. - מקם מד כוח במישור דגימת רקמה או במקום העדשה מעבה. מרכז ידנית המונה ביחס העדשה נתיב אופטי/אובייקטיבי.
- הגדר את מד טווח אורך הגל הנכון (400-1100 ננומטר). אפס את המונה על ידי מדכא הלחצן המתאים.
- באמצעות פקדי תוכנה, בחר 100 (מתוך מקסימום 1000; 1000 = 5 V) לכוח 405 ננומטר לייזר, אשר מגדיר את הלייזר על 10% של כוח מלא. אם רצונך בכך, המתח שליטה לייזר יכול גם להיות מוזן לתוך PrairieView מערכת דרך VoltageRecord כדי לספק רשומה דיגיטלית של הפקודה איתות העיתוי ואת רמת כוח.
- להקליט את הקריאה של מד הכוח.
- בחר 150 (15% מקסימום 1000) עבור הפלט כוח 405 ננומטר לייזר ולהקליט את הקריאה של מד הכוח. חזור על פעולה זו של כוחות הפלט הבאות לאסוף את עקומת כוח לייזר: 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, ולא 1000.
- להפעיל את 405 ננומטר לייזר (100 מגה-וואט מקסימום כוח עם אותות הבקרה V 5) ולתת את מערכת הלייזר לחמם כ 10 דקות.
-
כיילו את galvanometers לייזר uncaging. בצע את השלבים הבאים בכל פעם שיש שינוי רכיבים אופטיים של המערכת, בכל פעם שיש חשש לגבי מיקום נקודה מדויקת, או באופן קבוע כל חודש.
- התקן את 60 x טובלים במים מיקרוסקופ המטרה עדשה אשר ישמש photostimulation וניסויים הדמיה. התוכנה רכישת/דימות, בחר את 60 x עדשה המטרה והגדרת זום אופטי של 1 (ראה שלב 3.1.4.2.).
- לסמן עיגול מלא על מיקרוסקופ זכוכית נקי עם סמן קבוע אדום. הצב את השקופית על הבמה מיקרוסקופ, עם סמן לעבר המטרה.
- מראש להתמקד המיקרוסקופ על אזור סימון אדום עם 4 x או המטרה 10 x. להוסיף 1-2 מ ל מים לחלק העליון של הנקודה/נקודת סימון אדום, ואז תעבור המטרה 60 x ויציפו את המטרה לתוך המים. למקד את העדשה אובייקטיבי על אזור סימון אדום דק.
- לעבור סריקת לייזר הפוטונים 2. עבור רוב מערכות, להזיז צריח כדי למקם #1, להזיז את המנסרה trinocular החוצה נתיב האור, לעבור המראה ראש הסריקה הקדמי, והגדר את אורך הגל של הלייזר ~ 900 ננומטר. בחר באפשרות תיבת 512 x 512 פיקסלים עבור הפרמטרים רכישת התמונה, אשר הוא היסוד פיקסל ברירת המחדל עבור השגרה כיול מראה גירוי.
- הפעלת מערכת סריקה עם כוח לייזר הדמיה גדול מהמינימום וללטש את המוקד אובייקטיבית על גבי השכבה פלורסצנטיות סימון אדום דק. בחר שדה בשטח פלורסצנטיות ברורה של פסולת ומצופות אחיד עם סמן.
הערה: ההתקנה, פרוטוקול זה משתמש PrairieView 5.4 רכישת/הדמיה בתוכנה. - פתח את הפונקציה Uncaging Galvo כיול בתוך התפריט כלים-כיול/יישור של התוכנה. ללכת דרך ההדרכה לשרוף נקודות עבור כיול המרחבי של הזוג השני גלוונומטר מראה.
- בתוך ההדרכה לשרוף נקודות , לבחור את 405 ננומטר לייזר, בחר כוח גירוי לייזר של 400 ומשך גירוי של גב' 20 זה אמור להניב קטן (~ 1-5 מיקרומטר קוטר) חורים סמן אדום.
הערה: הגדרות כגון ~ 2-4 מגה-וואט ו- ms 1-10 משמשים בדרך כלל, אך ההגדרות נקבעות לפי המדגם. הרשות הפלסטינית-Nic צילום-גירוי הגדרות צריכת החשמל צפויים להיות נמוך בהרבה מאשר הכוח הנדרש במהלך כיול כדי ablate חור גלויים בשקופית סימון אדום. רוטינה כיול זו שימושית עבור איתור נקודות photostimulation אבל צריך לשמש להסיק כרכים photostimulation מוחלטת במהלך תגובות פיזיולוגיות. - בחר עדכון כדי לעורר ולרענן את התמונה לאחר במקום מרכז לצרוב, הזיזו את מציין אדום עגול למיקום ספוט בפועל. לעשות את זה במקום מרכז, נקודת מרכז הנכון, במקום מרכז נמוך יותר, ולבסוף עבור רשת תשע נקודות (כל הפינות ואת הקצוות בתוספת במרכז התמונה).
הערה: מרכז, שמאל והמיקומים התחתון המתוקן ספוט לקבוע את המתחים גלוונומטר גירוי להגדרת מרכז אמיתי ו- X ו- Y דרוג גורמים כדי להתאים את גירוי מראה את הזוג מראה הדמיה. התוכנה קנה מידה, לעדכן, כל הניסויים הבאים MarkPoints בנטילת הגדרות הזום שונה ההגדלה המרחבית כיול.
- בתוך ההדרכה לשרוף נקודות , לבחור את 405 ננומטר לייזר, בחר כוח גירוי לייזר של 400 ומשך גירוי של גב' 20 זה אמור להניב קטן (~ 1-5 מיקרומטר קוטר) חורים סמן אדום.
- מבחן הכיול על ידי פתיחת החלון MarkPoints והפעלת ידנית הפרמטרים גירוי spot(s) מוגדרים באזור החדש של המדגם. ודא כי הקובץ הנכון, האחרונים כיול נטען לתוך חלון MarkPoints . להפעיל את תכונת MarkPoints/קבוצה או סדרת MarkPoints -spot(s) מוגדר או לנצל את התכונה Live/אבלציה ימינה/שמאלה ללחוץ על העכבר בכל מקום על התמונה במהלך חיים סריקה כדי להחיל דופק בדיקה כדי לוודא כיול הנכון.
הערה: צריבת לייזר ספוט צריך עכשיו להיות לגמרי מרוכז על מחוון MarkPoints . - לפקח ולתעד את ההפעלה של עוצמת הדופק הלייזר ואת משך זמן על-ידי הקשה את המתח נסיעה לתוכנית VoltageRecord (ראה שלב 1.1.4). באופן דומה, להקליט את המיקום של כל נקודת גירוי באמצעות אות מתח שקנה המידה שלה השתנה מן האותות משוב נגזר על זוג מראות גלוונומטר צילום-גירוי.
2. הכנת Photoactivatable ניקוטין (PA-Nic)
- לאחזר של aliquot של lyophilized photoactivatable סמים אחסון.
הערה: להלן כללי התנהגות הוא ספציפי הרשות הפלסטינית-Nic; להתאים לפי הצורך עבור תרופות אחרות photoactivatable. למרות הרשות הפלסטינית-Nic מפגינה יציבות יוצאת דופן5, לנקוט אמצעי זהירות סבירים כדי להגן עליה מפני חשיפה לאור בהיר במהלך ההכנה ו/או ניסויים. זה יכול להתבצע על-ידי עבודה פשוט באור נמוך; הגבלת אור מסונן אדום אינה הכרחית. -
לבצע יישום מקומי של הרשות הפלסטינית-nic.
- משוך micropipette זכוכית בקוטר הפתיחה של 20-40 מיקרומטר עם פולר פיפטה לתכנות.
- לסנן ~ 1 מ"ל של הקלטה פתרון עם מסנן 0.22 מיקרומטר. Resuspend כמות של הרשות הפלסטינית-Nic בפתרון הקלטה מסוננים להניב ריכוז סופי של 2 מ מ. לדוגמה, התמוססות של 100 nmol lyophilized aliquot ב µL 50 של פתרון הקלטה מסוננים.
הערה: ניתן למצוא הקלטה הציע פתרון קומפוזיציה האחרונות פרסומים5,6 העסקת פוטוליזה הרשות הפלסטינית-Nic. - מילוי חוזר פיפטה יישום מקומי עם 50 µL של 2 מ מ הרשות הפלסטינית-nic.
- אבטח את פיפטה יישום מקומי לתוך בעל פיפטה רכוב על micromanipulator. להתחבר פיפטה מחזיק דרך המתאימה הצנרת מערכת הפליטה לחץ מסוגל מתמשכת ליישום בלחץ נמוך (1-2 psi).
- באמצעות את micromanipulator, לתמרן את פיפטה יישום מקומי לתוך פתרון הקלטה חוץ-תאית והמיקום בקצה פיפטה מעט מעל רקמת המוח העכבר ממוקם ~ 50 μm מהתא של עניין. התייעץ עם הדוח הקודם עבור פרוטוקול מפורט של העכבר מוח פרוסה והכנה תיקון קלאמפ הקלטות8.
- בדוק את הפרמטרים ליישום על ידי בקצרה הפעלת לחץ (1-2 psi). צריך להיות מינימלי כדי אין תזוזה של התא של ריבית. אם תנועה משמעותית להתרחש, למקם מחדש את פיפטה יישום מקומי נוסף משם (בכיוון לרוחב ו/או מפוח) מהתא של עניין.
- לאחר השגת מלחציים תיקון יציבה התא כולו (פרטים אשר כלולות ב- פרסום מראש8), להפעיל את היישום לחץ נמוך (1-2 p.s.i.) באמצעות המתג ידנית המתאימה על המכשיר הפליטה בלחץ. עיתוני רקמות המקיפים את התא עם הרשות הפלסטינית-Nic למשך 1-2 דקות לפני שתמשיך לשלב הבא.
-
לבצע אמבט יישום (superfusion) של הרשות הפלסטינית-Nic על הפרוסה המוח.
- לפזר כמות של הרשות הפלסטינית-Nic באמצעי אחסון של הקלטה הפתרון המתאים מחזור רציף להניב ריכוז סופי של 100 μM. לדוגמה, יתמוסס μmol 1 aliquot 10 מ"ל של פתרון הקלטה באמצעות צינור רגיל 15 מ"ל.
- מתחילים recirculation של הפתרון הרשות הפלסטינית-Nic בקצב של 1.5-2 mL/min על-ידי פתיחת בקרת הזרימה המתאימה למערכת זלוף. Recirculation מתרחש עבור משך ההקלטה. כדי לשמר את ערך סמים, למזער את העוצמה recirculation באמצעות צינורות בקוטר פנימי מינימלי ו/או על ידי קיצור האורך הכולל של אבובים בשימוש במערכת זלוף.
הערה: לפי שלבים אלה, ניתן להפחית את עוצמת הקול עבור אמבט recirculation 5 מ של הרשות הפלסטינית-Nic פתרון. פתרונות הרשות הפלסטינית-Nic יכול לשמש לעיתים קרובות עבור שניים רצופים הקלטה יום בתוך באותו השבוע אם המאוחסן מוגן מפני אור ב 4 º C. - במהלך מחזור, ברציפות בועה הפתרון עם carbogen (5% או2, 95% CO2), לשמור על הטמפרטורה אמבט-32 מעלות צלזיוס.
- שומרים על הפרוסה המוח ההקלטות פתרון תוך כדי עבודה עם הרשות הפלסטינית-Nic בתנאי אור נמוך.
3. הדמיה נוירונים עם סריקת מיקרוסקופ לייזר הפוטונים 2
- לבצע הדמיה חיה של התא.
- לזהות/דמיינו נוירון habenula המדיאלי (MHb) באמצעות אור ששודרו או התערבות דיפרנציאלית אינפרא אדום ניגודיות אופטיקה (IR/DIC) ומצלמת וידאו ולהקים הקלטה מלחציים תיקון יציבה כל התא. עיין פרוטוקול הקודם לקבלת פרטים אודות תיקון קלאמפ הקלטות של נוירונים ב העכבר בחריפות, מוכנים-המוח-פרוסות-8.
- לאחר הקמת המחתרת גבוהה (> 1 GΩ) צמוד-תא תצורה, אך לפני הפריצה, לשנות את הגדרת והתוכנה לייזר מצב סריקה.
- לאחר הפריצה, להשתמש סריקת לייזר שיכול לאמת את זה של צבע דימות (מדולל כדי ריכוז סופי של 100-200 מיקרומטר לתוך פתרון פיפטה תאיים רגיל כפי שתוארה לעיל8) הוא פסיבי (על-ידי דיפוזיה) מילוי הנוירון. אפשר לצבוע (למשל, אלקסה עבור חיל הים 488 האופטיקה ירוק צינור [PMT] ערוץ, PMT 2; או אלקסה עבור חיל הים 568 594 בערוץ PMT אדום, PMT 1) כדי למלא את התאים הסלולר לפחות 20-30 דקות לפני שתנסה לבצע ניסויים הדורשים ויזואליזציה של כל תאי סלולר מחוץ סומא.
הערה: תאים הדיסטלי (מבנים דנדריטים, קוצים, אקסונים, ועוד.) עשוי לדרוש 30-40 דקות למלא לגמרי25. - להשתמש בתוכנה פונקציית Live לסרוק כדי להמחיש את תא עצב, תא subcellular עניין. לבחור פרמטרים הדמיה לאפשר מדויק לחיות ויזואליזציה של תכונות עצביים. לשנות הגדרות שונות כדי להשפיע או לשנות את התצוגה ויזואליזציה (חדות), רזולוציה, יחס אות לרעש (S/N) ושעה תמונת מסגרת רכישה:
-
Look-up-טבלה (LUT). פתח את החלון LUT באמצעות הסמל המתאים בצד כל חלון התמונה. פעם אחת פתוחה, להתאים את הרצפה LUT (דקות) ואת התקרה הגדרה (מרבית) של ערוץ תמונה ספציפית כדי לשפר ויזואליזציה של ניגודיות האות המוצגת על המסך. הנמך את הערך המרבי ~ 1000 (מתוך 4096, 12 סיביות זיהוי), אשר יעזור למשוך החוצה את עמעם אותות בעת חיפוש קודם תאים, אות ומבנה.
הערה: הגדרות אלה משפיעות רק על האות המוצגת, לא הערכים שאותרו/תכנים מוקלטים. העיניים האנושיות ניתן בדרך כלל רק להפוך ניגודיות ~ 50 רמות אפור26. -
זום אופטי. השתמש בפקדי תוכנה כדי לבחור 1 X זום אופטי ושימוש panning פקדים כדי לאתר את האזור הרצוי של הרקמה. ההגדרה זום התשואות הכיכר הגדולה, סריקה שדה ראייה, ושולח הזוויות המתחים/סרוק הגדול, למראות גלוונומטר.
הערה: תצורת ברירת המחדל הוא 12 מ"מ x 12 מ"מ שדה ראייה בתוך הראש סריקה שמתורגם ל 12 מ"מ חלקי. אובייקטיבי הגדלה בתוך המדגם. לכן, 60 x עדשה המטרה התשואות סריקת תמונות של מיקרומטר 200 בכל צד-1 x זום אופטי. ערכים גבוהים יותר זום אופטי לסרוק את האזור פחות. 2 x זום אופטי לעתים קרובות ההגדרה הכי שימושי להמחשת הנוירונים כולו. 4 x יכול להיות שימושי להמחשת היבטים subcellular של נוירונים. -
מספר הפיקסלים. כדי להשלים 1 x זום אופטי, בחר 1024 x 1024 פיקסלים בכל שורה באמצעות פקדי תוכנה. הגדר את מספר הפיקסלים בכל שורה התמונה שנתפסו ומוצג ולא לאבד פרטים האפשר מן העדשה אובייקטיבי. השתמש בערכים פיקסל מעשי הבאים עבור סימן x 60 / 1.0 מפתח נומרי (NA) המטרה: 1024 x 1024 על זום 1, 512 x 512 של הזום 2 ו 256 x 256 בשביל זום 4. גודל פיקסל הקצה (מיקרומטר ~0.17; 12 מ מ/הגדלה/זום/פיקסלים) צריך להיות חצי, או פחות, של הרזולוציה לרוחב שהוגדר על-ידי העדשה אובייקטיבי.
הערה: רזולוציית התמונה מוגדרת רק על ידי אורך הגל לייזר ו- NA אובייקטיבית (רזולוציה מיקרומטר 0.4 מ שני הפוטונים נרגש [2PE] עם 920 nm ו מטרה נה 1.0)27. הקריטריונים עירור מלא NA, כפי שרשום על העדשה, זה עוצמת2 1/e הגפרורים קוטר אלומת לייזר (או "מילוי") התלמיד כניסה (2 x אורך המוקד של העדשה צינור x נה / הגדלה) של העדשה אובייקטיבי. העדשה צינור במערכת המתוארים כאן יש אורך מוקד של 180 מ מ. -
פיקסל להתעכב זמן . השתמש בפקדי תוכנה כדי לבחור 4 µs בפעם להתעכב פיקסל, ערך ברירת מחדל שימושי.
הערה: שינוי הזמן להתעכב פיקסל אינה משנה את האות רשע זוהה; היא משפיעה רק על הפיקסל-"אינטרה" בממוצע, שינויים אלה, ניתן לאבחן באמצעות איכות התמונה באמצעות S/ש ע הזמן להתעכב התמונה פיקסל הוא תמיד כפולה של יחידות µs 0.4, עבור להתעכב יותר פעמים עוצמת 12-bit-מוגבלת הערך של כל פיקסל בתמונה הוא הממוצע של הדגימות 0.4 µs. מאז היחס S/N משפר גם השורש הריבועי של מספר דוגמאות לכל הזמן להתעכב פיקסל (4 µs שווה עשר דוגמאות, או שיפור 3.16-fold S/N), השיפור באיכות התמונה מגיע פוחתת עבור ערכים הרבה יותר גדול מאשר 12 µs. -
סרוק סיבוב ואזור עניין (ROI). לקבוע את זווית התמונה על סיבוב 0° באמצעות פקדי תוכנה (ללא פעולה עשוי להיות נחוץ, כמו סיבוב 0° היא הגדרת ברירת המחדל עבור רוב מערכות הדמיה). אם המדגם נמצא במחלקה אוריינטציה "הפוך", בחר ב 180 מעלות סיבוב כדי "להפוך" את התמונה.
הערה: סיבוב התמונה, מכל זווית נתון, יכול לספק התאמה טובה יותר עבור האזור כולו עניין של תא מלא. סיבוב יכולות להניב גם בסיס ברור יותר עבור יישור שינויים מבניים, ביצוע ניתוח עוקבות. בחירת אזור של עניין בתוך התמונה הסרוקה ב הגדרה נתונה זום (שלב 3.1.4.2) שומרת את מספר הפיקסלים מקורי (שלב 3.1.4.3), אך ההגבלה על המספר הכולל של פיקסלים ושטח שיכולים להגדיל באופן משמעותי את קצב המסגרות, מתן רזולוציה טמפורלית משופרת של האות משתנה. -
מסגרת בממוצע. בחר מסגרת ההתחלה הגדרת הממוצע של 2 מסגרות באמצעות פקדי תוכנה.
הערה: הניגוד התמונה הסופית (S/N) מוגדר על ידי פוטונים הכולל אסף/אותר בתוך האות הפיקסלים של התמונה. חישוב ממוצע של מספר מסגרות תמונה יכול לשפר את היחס S/N, בתנאי המדגם לא זזה או הוא לא מולבן במהלך דימות. האות של עניין נשאר אותו ערך במהלך מסגרת בממוצע ואילו הרעש בתמונה הוא מופחת על ידי השורש הריבועי של מספר המסגרות בממוצע. מבנים קטנים בתמונות פלורסצנטיות דורשים לעיתים קרובות הבין-פיקסל חישוב ממוצע, שילוב פיקסלים בתוך התמונה (נקרא לעתים ROIs), ו/או של מסגרת בממוצע. מסגרת ממוצע של עליות סריקה זמן על-ידי מספר תמונות אחד בוחר את הממוצע.
-
Look-up-טבלה (LUT). פתח את החלון LUT באמצעות הסמל המתאים בצד כל חלון התמונה. פעם אחת פתוחה, להתאים את הרצפה LUT (דקות) ואת התקרה הגדרה (מרבית) של ערוץ תמונה ספציפית כדי לשפר ויזואליזציה של ניגודיות האות המוצגת על המסך. הנמך את הערך המרבי ~ 1000 (מתוך 4096, 12 סיביות זיהוי), אשר יעזור למשוך החוצה את עמעם אותות בעת חיפוש קודם תאים, אות ומבנה.
- השתמש בכלי בקרה פאן לסרוק סיבוב, זום אופטי כדי להציב את מיקום הדגימה בזמן הסריקה. אם הבמה מנוע מניפולציה הדרוש כדי למקם את הדגימה, להימנע הגדלים צעד גדול לציר X, Y ו- Z כדי למנוע התנגשויות המטרה/מעבה, תנודות או חשיפה של קרן הלייזר רפלקטיבית משטחים.
- לאסוף ערימה-Z. באמצעות הכלי מסדרת Z , בחר התחלה, הפסק מיקום המכילה את התא של עניין. בחר גודל צעד (1 מיקרומטר), ואז ברצף תמונה הנוירון במישור כל Z-המכילה את התא.
הערה: Z-מחסנית רכישה הגדרות משתנים בין מילוי צבע וסוג נוירון. פרמטרים אופטימליים עבור רכישת Z-מחסנית צריך להיקבע עצמאית של פרמטרים המשמש הדמיה בשידור חי. ניתן לבצע רכישה Z-מחסנית לפני ו/או לאחר ניסויים optopharmacology. במידת האפשר, בצע Z-מחסנית רכישה לאחר optopharmacology כדי למנוע נזק תאי המושרה 2PLSM וכדי לאפשר אופטימלית צבע מילוי תאים סלולריים קטן.
4. לייזר פלאש פוטוליזה במהלך הקלטות אלקטרופיזיולוגיות
הערה: החלת 405 ננומטר או 473 ננומטר לייזר סמכויות ≥ 1 mW מייצרת זרחורנות בתוך הזכוכית של עדשות אובייקטיבית, מעבה. האור שנוצר הזה קשור ישירות עוצמת תאורה של הלייזר; הפליטה נוכח מהחלון ספקטרלי ירוק ואדום ויש מצבים מתרגש תקופות חיים בטווח של ms. רקע גירוי החפץ הוא ראה כל עדשות נבדק, טובלים במים עדשות המטרה של כל היצרנים הגדולים של עדשות אובייקטיבי. מעבה עדשות לייצר הרבה זרחורנות גבוה יותר מאשר עדשות אובייקטיבי. זה "אות" מניע השימוש סוגרת מכני להגנת cathodes PMT גבישי (חאספ) רגיש גליום ארסניד במהלך אירועים צילום-גירוי. באמצעות תריס מכני כלל סגור (סגור בסריקת לא פעיל) מייצג את הפתרון הטוב ביותר עבור הגנה על PMTs חאספ מקורר.
- גיאומטריה בים חול-סוג photostimulation, להסיר עדשות התמקדות בתחום האופטיקה נתיב האור זה אחרת צר/מתכווצים קרן הלייזר המתאוששת התלמיד כניסה אובייקטיבי.
- באמצעות MarkPoints, בחר את ההגדרה ספוט יחיד.
הערה: הגדרות אחרות צילום-גירוי (כתמים מרובים, רשת של מקומות, ספירלה סריקה) אפשריות בתוך MarkPoints. נקודה בודדת היא הפשוטה ביותר. הבדלים ביולוגיים ומטרות ניסיוני המחייב הגדרה שונה. - לעדכן את התמונה באמצעות האפשרות לחיות לסרוק תמונה ולאתר את האזור subcellular עניין לזמן קצר. מעת לעת לעדכן את התמונה כדי לזהות כל נשתל קטן פוטנציאל בפוקוס.
- השתמש בפקדי תוכנה כדי להגדיל את הזום האופטי (קרי, בחר הגדרת זום אופטי גבוה מהנוכחי), במידת הצורך, כדי להמחיש מבנים קטנים (קרי, קוצים או דיסטלי דנדריטים).
- מניחים על MarkPoints יחיד ספוט הכוונת ומייד בסמוך (~0.5 μm) את קרום התא. לא המקום צילום-הגירוי המקום ישירות על תכונה הסלולר, כמו זה עלול להוביל נזקי.
- להגדיר את הפרמטרים עבור צילום-גירוי באמצעות פקדי תוכנה ב- MarkPoints. להחיל את ההנחיות המוצא כדלקמן: 1-50 ms משך עוצמת הלייזר mW 1-4, ≥1 למשפט.
- בחר להפעיל MarkPoints ליזום את פרוטוקול MarkPoints ולצפות אלקטרופיזיולוגיה רכישת נתונים בזמן אמת.
- חזור על שלבים 4.2-4.7 מספר פעמים כדי להעריך עקביות ויציבות, או היעדרה, של תגובת משרעת וקינטיקה.
Representative Results
עבור פוטוליזה גירוי, מינון החשיפה (עוצמה וזמן), חשיפה, והמיקום קרן הגיאומטריה הם משתני מפתח. המערכת המתוארות במאמר זה הוא מסוגל שתי הקורות photostimulation שונים, הניתנים לשינוי באמצעות הזזת עדשה וצ'ק אאוט של נתיב האור photostimulation לפני הקורה נכנס למערכת גלוונומטר. ללא עדשה זו, קרן photostimulation ממלא את התלמיד הכניסה של 60 x / נה 1.0 מים-טבילה [60 x WD] המטרה, בהפקת ליד-עקיפה-מוגבל, sub-מיקרומטר ספוט על המטוס מוקד בתוך המדגם. זה משויך photostimulation אור עם צורת שעון החול, הרחבת מעל ומתחת נקודת מוקד סימטרי לציר האופטי. עם העדשה מוכנס לתוך הנתיב, photostimulation אור לייזר ממוקד אל התלמיד הכניסה של העדשה המטרה ולאחר מכן נסגר כמו קרן דמוי-עיפרון. קרן זו, אשר צפוי להיות ~ 10 מיקרומטר בקוטר עבור מטרה 60 x, מרחיב בצורה אחידה/אנכית לאורך כל המדגם. במצב זה, עוצמת האור בכל מיקום נתון בתוך המקום גירוי יהיה ~ 1% של עוצמת ספוט קטן ליד-עקיפה-מוגבלת. לפיכך, הכוחות לייזר נדרשים בדרך כלל כאשר באמצעות גירוי ספוט ~ 10 מיקרומטר. לניסויים כל דיווח במאמר זה, שימשה קרן שעון חול-סוג photostimulation.
ניתן להתוות את הכוח מדגם ונמסרו נגד ההגדרה מתח קלט, לאחר מדידה את עוצמת הלייזר ב המדגם באמצעות מד כוח. מחקרים אלה להשתמש 60 x WD המטרה עם מרחק עבודה של 2 מ מ, אבל זה לא שקוע במים למדידות חשמל למנוע נזק אפשרי לרכיב גלאי. כאשר המטרות עם רשומה נה > 0.95 נמדדים באוויר (ללא טבילה נוזל), שם יכול להיות גמורה הפסדים ברכיב לפנים עדשה בשל מדד נמוך (אוויר). במקרה זה, עבור מדויקת יותר דוגמת כוח מידה (לתיקון גמורה הפסדים), להגדיל את כוח נמדד על ידי 1.0 נה אובייקטיבית (1.0/0.95)2 נמדדו באוויר. איור 1a מציג מגרש קלט/פלט טיפוסי על 405 ננומטר 473 ננומטר לייזר גלוי זה משולבים הלייזר השקת מערכת במחקר זה. מערכות לייזר אלה הם אידיאליים עבור צילום-גירוי חשיפה מנה מלאה מהסיבות הבאות: (1) הם מראש המכויל לספק כוח לינארי ישירות פלט יחסי הקלט מתח (0-5 V), (2) הם לספק מבצע תריס שקט (לא לייזר פלט), (3) להם מהירה, sub-ms עוצמת הדופק משך שליטה (0.1 ms תגובה). בעת שימוש צילום ספוט-גירוי עם מערכת לייזר/galvo, כיול שוטף של כתמים MarkPoints היא משימה חיונית. איור 1b (החלונית הימנית) מדגים מערכת מחוץ כיול (הנקודה הרצויה לעורר על-ידי צילום לא לגרום גירוי מדויק של הנקודה הזו, כמצוין על-ידי מיקום הכוויה-חור), עם חזרה מיקום מדויק של המקום לאחר כיול ( איור 1b, לוח נכון).
הרשות הפלסטינית-Nic זה בצניעות פלורסנט (פליטת לשיא בגיל ~ 510 ננומטר), מפגין עירור יעיל בין 350-450 nm (1-פוטון עירור) או 700-900 ננומטר (2-פוטון עירור)5. להמחיש הרשות הפלסטינית-Nic במהלך יישום מקומיות, הרשות הפלסטינית-Nic (1 מ מ) הוחל ליד רקמת המוח ואחריה סימולטני הדמיה של המוח (1) רקמת שידור משרטוטי אופטי הקשר דרך הניגוד Dodt ו- (2) על ידי קרינה פלואורסצנטית הנפלט עירור (900 ננומטר) של הרשות הפלסטינית-ניק-Nic 2PE זריחה היה בקלות לזיהוי במהלך הפליטה בלחץ של פיפטה יישום מקומי (איור 2 א). ניקוטין המחפשים לשלב בין טיפול אלטרנטיבי ונוחות המוצרים פוטו אטמוספרי העיקריים של הרשות הפלסטינית-Nic פוטוליזה תגובה5monoalkylcoumarin, 7-carboxymethylamino-4-methyl קומרין. באמצעות אותן הגדרות או פרמטרים לצורכי הרשות הפלסטינית-Nic הדמיה הדימות, הרקמה צולמה במהלך הלידה של ניקוטין (1 מ מ) או 7-carboxymethylamino-4-methyl קומרין (1 מ"מ). אין אות ניאון זוהה (איור 2 א, לוחות האמצעי והתחתון), הוכחת יחודיות של התוצאות הרשות הפלסטינית-Nic. לבסוף, הרשות הפלסטינית-Nic הוחלה בתוך רקמת המוח, פליטת קרינה פלואורסצנטית הרשות הפלסטינית-Nic היה עם תמונה (איור 2b). גישה זו מאשר כי הרשות הפלסטינית-Nic הוא מתנה בתוך 100-200 מיקרומטר של פיפטה יישום מקומי... יחד, נתונים אלו מאשרים כי הרשות הפלסטינית-Nic ביעילות יועברו אל המוח רקמות באמצעות יישום מקומי.
אלקטרופיזיולוגיה הקלטות עם 2PLSM בו זמנית עבור ויזואליזציה של מבנים הסלולר מחייב לחוקר איזון שיקולים עבור שני הרכיבים של הניסוי, לעיתים קרובות חלון זמן קצר (~ 20 דקות) זמין עבור חוקי רכישת נתונים לדוגמה מתא תוקנו. בלי לקחת בחשבון הסלולר ויזואליזציה, זה הכי טוב להתאמן כדי להתחיל בהקלטת בהקדם האפשרי לאחר הפריצה כי הקלטת יציבות נוטה לרדת עם הזמן. עם זאת, כאשר ההדמיה היא דרישה, שיקולים אלקטרופיזיולוגיות לאפשר מספיק זמן עבור מגביר ריכוז קרינה פלואורסצנטית במבנים קטנים/מרחוק. דוגמה לכך הוא על-ידי בדיקת ריכוז צבע מילוי עקומת28, אשר שימושי לפעמים להפיק כאשר הדמיה סוג חדש של התא. איור 3 מראה מספר הנוירונים דוגמה עם תמונה כמו Z-במחסן באמצעות 2PLSM, התמוטטה לתוך הקרנה העוצמה המקסימלית למטרות המצגת. איור 3a מציג תמונות באיכות גבוהה שבו מורפולוגיה עצביים שנראה מלא, רעש הוא ממוזער, פסולת לא מפריע פרשנות של מורפולוגיה הסלולר. איור 3b מציג תמונות באיכות נמוכה יותר, בשל יחס אות-כדי-ברקע התחתון ופסולת משמעותי. פסולת זו מופיעה לעיתים קרובות כיסים כדורית של קרינה פלואורסצנטית אינטנסיבי, הנובעים הוצאה של הדמיה מ פיפטה תיקון בעודם מתקרבים התא. ראוי לציין, הכללת 100 מיקרומטר הרשות הפלסטינית-Nic באמבטיה (בעת ביצוע יישום אמבט) נוטה להפחית את יחס אות-כדי-ברקע ומוביל בחדות התמונה תת אופטימלית. אלקסה עבור חיל הים 568 או 594 הוא לעיתים קרובות שימושי בניסויים יישום מקומי כמו צבע finder או אות הפניה/נורמליזציה תהליך 2PE. יעיל עבור שני הפוטונים עירור של צבעים אלה הוא ~ 780 nm27, המאפשר ויזואליזציה סימולטני של הרשות הפלסטינית-Nic וזיהוי של תאים סלולריים. הגל הזה, עם זאת, לא לחלוטין להימנע שני הפוטונים פוטוליזה של הרשות הפלסטינית-Nic5. אלקסה עבור חיל הים 488 יש יתרון בניסויים אמבט-יישום הרשות הפלסטינית-Nic; כשהוא מתרגש עם nm ≥900 אורך גל המתאים, ניתן להימנע שני הפוטונים פוטוליזה של הרשות הפלסטינית-Nic5 תוך שמירה על ויזואליזציה מתאים של תאים סלולריים.
איור 4 מראה דוגמה נתונים עבור לשפות אחרות הרשות הפלסטינית-Nic לייזר פלאש פוטוליזה MHb נוירונים במוח פרוסות. איור 4a מראה (לוחות העליון) דוגמה של תמונה "אסמכתא", אשר לכידת מסך של תמונת 2PLSM האחרון נלקח לפני הפעלת בפרוטוקול MarkPoints , בשכבות עם המיקום ספוט צילום-גירוי. איור 4a (להוריד את התמונה פאנלים) מראה תצוגה מוגדלת של צילום-הגירוי ספוט על המורפולוגיה הסלולר. המתאימים בקורלציה זמן אלקטרופיזיולוגיות תגובת הרשות הפלסטינית-Nic פוטוליזה מוצג הלוחות התחתון של איור 4a. העבודות הקודמות הפגינו כי זרמים אלו רגישים היריבים nAChR5. איור 4b מציג נתונים נציג מתאי שונה שבו בוצעה פוטוליזה ספוט יחיד במרווח של 1 או s או 10 ס' ואילו מרווח s 10 מותר זמן התאוששות מספיק הבסיס מחזיק הנוכחי, מרווח s 1 קצר הוביל עלייה הדרגתית החזקתו הנוכחי כמו הפרוטוקול המשיך. הגדלת הנוכחי עולה כי ניקוטין לא היה מספיק זמן כדי לפזר מן המערכת עם מרווח 1 הרץ29. תגובה כזו טמפורלית ניתוחים בטח לבצע דה נובו כל סוג התא החדש, נחקר גם neuropharmacology של nAChRs עשויות להיות שונות בין סוגי תאים.
איור 1: כיול לייזר Photostimulation- () צילום-גירוי לייזר כוח פלט. כוח על המטוס מדגם (באמצעות סימן x 60 / 1.0 נה טובלים במים המטרה) נמדדה על 405 ננומטר, 473 לייזרים צילום-גירוי nm ב ההגדרה הפלט המצוין. (b) צילום-גירוי לייזר כיול. תמונות לכידת מסך להראות את היחסים המרחביים בין המקום המיועד צילום-גירוי המיקום המתאים שבו צילום-גירוי אירעה (צריבה גומות) לפני (משמאל) ואחרי (מימין) כיול פועל ב- MarkPoints. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: יישום מקומי של הרשות הפלסטינית-Nic. פיפטה () זיהוי של הרשות הפלסטינית-Nic מ מקומי יישום. 1 מ מ הרשות הפלסטינית-Nic, כנגזרת פוטוליזה או ניקוטין היו מומס חנה המבר נטען לתוך פיפטה יישום מקומי, ויתרו על רקמת המוח במהלך 2PLSM (900 ננומטר עירור) הדמיה באמצעות אותן הגדרות הדמיה לכל סם. מופעי לייזר סורק Dodt חדות שידור תמונה של הרקמות/פיפטה ואילו הקתודה חאספ PMT שימש כדי ללכוד פליטת קרינה פלואורסצנטית. (b) הרשות הפלסטינית-Nic (1 מ מ) perfused לתוך רקמת המוח, עם תמונה באמצעות 2PLSM כמו () כדי להציג את התפשטות לרוחב של הרשות הפלסטינית-Nic באמצעות קרינה פלואורסצנטית מהותי שלה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: רכישת סריקת תמונות מיקרוסקופ לייזר הפוטונים 2. Z () 2PLSM אופטימלית-במחסן. שתי דוגמאות 2PLSM Z-מחסנית העוצמה המקסימלית הקרנות הינם המוצגות עבור MHb נוירונים עם דנדריטים היטב נפתרה מעט אין פסולת מפריעות. Z 2PLSM תת אופטימלית (b)-במחסן. שתי דוגמאות 2PLSM Z-מחסנית העוצמה המקסימלית תחזיות מוצגים עבור נוירונים MHb מוקף פסולת (צבען שגורשו על פיפטה במהלך תא גישה). תמונות כאלה קשים יותר לפרש יותר תמונות כמו אלה המוצגים (). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: לייזר פלאש פוטוליזה של הרשות הפלסטינית-nic תמונות () MarkPoints התייחסות וזרמים פנימה עורר על-ידי הרשות הפלסטינית-Nic פוטוליזה. עבור נוירון אחד MHb, מוצגות תמונות raw הפניה לניסויים צילום-גירוי MarkPoints במיקום יחיד הסלולר (המצוין). שימו לב כי עבור מיקומים מסוימים צילום-גירוי (התמונה הימנית ביותר בסדרה זו), המבנה הדנדריטי נמצא בפוקוס אך וראשה דנדריט proximal אינם. מתחת לכל תמונה הפניה, מותווים ניקוטין uncaging-עורר פנימה הנוכחי. (b) בין הגירוי מרווחי פוטוליזה הרשות הפלסטינית-Nic. המיתר הקלטות מוצגים עבור MHb נוירונים איפה ניקוטין היה שוב ושוב שברחה מכלוב באותו מיקום perisomatic במרווח הבין-גירוי של 1 s או 10 ס אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Discussion
הבחירה של שיטת יישום/מסירה של הרשות הפלסטינית-Nic היא השלב הקריטי ביותר בטכניקה זו צילום מקומי-גירוי. שתי השיטות, אמבט יישום זלוף מקומיים, אחד מציעים יתרונות ומגבלות. הבחירה מושפע במידה רבה רמת הביטוי פונקציונלי nAChR בסוג התא עניין. לעיתים קרובות עדיף להשתמש ביישום אמבט כאשר הביטוי פונקציונלי רמות גבוהות, כמו אמבט היישום מאפשר ריכוז בדיקה אחידה סביב התא מוקלטות, דבר המקל על פרשנות הנתונים. אמבט היישום גם מבטלת את הצורך פיפטה זלוף השני בתוך הרקמה, המקל על התהליך כולו. עם זאת, יישום אמבט של יקר תרכובות עולה יותר לכל ניסוי.
בדרך כלל, פתרון בעיות כרוך מנסה להבין למה אין הפעלת nAChR היא לראות הבאים פלאש פוטוליזה. בעת עבודה עם סוג התא לא היה בעבר למדה עם הרשות הפלסטינית-Nic, החוקר צריך לבצע פאף-יישום מקומי של ACh או ניקוטין כדי לקבוע אם מספיק רצפטורים פונקציונלית הביע5. כדי לאמת כי המערכת היא מסוגלת לאתר פוטוליזה תגובות, בקרת ניסויים צריך להיעשות בנוירונים habenula המדיאלי לבטא כמויות גדולות של קולטן30. באזור זה של המוח, הרשות הפלסטינית-Nic אמבט יישום אפשרי, אשר עדיפה לניסויים אימות. רק לאחר ביצוע ניסויים אימות אלה צריך אחד לעבור מסוג תא מחקר כלשהו. אם מערכת ניסויית אומתה ולהישאר תגובות מאד קטנה, או לא לגילוי, זה עשוי להיות מוצדקת כדי להגביר את הריכוז של הרשות הפלסטינית-Nic, להגביר את עוצמת פלאש או משך פעימה, להוסיף אפנן חיובי nAChR allosteric כדי לשפר את nAChR פעילות6, או שילוב של אלה.
לעיתים, תגובות uncaging גדולים מדי, עם הפעלת nAChR משמעותי וכתוצאה מכך מתח עקיף מגודרת Na+ ערוץ הפעלה וזרמים פנימה unclamped עקב ענייה שטח קלאמפ. ניתן לסלק לכלוכים אלה, אשר לחלוטין מטשטשים זרמי פנימה nAChR, לעשות פרשנות הנתונים בלתי אפשרי, על ידי הכללת QX-314 (2 מ מ) בפיפטה ההקלטה. הם עשויים להימחק גם על-ידי הפחתת הריכוז של הרשות הפלסטינית-Nic או על-ידי הפחתת בעוצמה פלאש או משך פעימה. בניסויים צילום-גירוי אור לעין כל, החייבים אימון טיפול בעת בחירת אתרי גירוי כדי למנוע גירוי לא מכוונות/פוטוליזה מעל או מתחת למטוס מוקד הרצוי. בנוסף, בעת הצורך, עוצמת הלייזר חייב תמיד להיות טיטרציה להתרבות תגובות פיזיולוגיות. במיוחד חשוב להיות מודעים photostimulation ציר z, כאשר עובדים עם ליגנדים בכלוב, כמו ליגנדים אשר מופעלים מעל/מתחת נקודת מוקד עדיין ייתכן לפזר ולקיים אינטראקציה עם מערכת ביולוגית (קרי קולטנים, ) שנבחנה.
הרשות הפלסטינית-Nic לייזר פלאש פוטוליזה לא ייתכן המתאימה עבור כל החוקרים, כפי קיימות מספר מגבלות. הראשון הוא העלות הגבוהה יחסית של תרגיל מתאים. בעת עבודה עם פרוסות המוח ללא פגע, uncaging ליד מבנים בקוטר קטן כמו דנדריטים דורש מערכת הדמיה מתוחכמות כגון מיקרוסקופ 2-פוטון. מלבד העלות הגבוהה של Ti:sapphire, tunable IR לייזר פעמו עבור ביצוע 2-פוטון מיקרוסקופ, מערכת כפולה-גלוונומטר מסוגל באופן עצמאי מיצוב שתי קרני לייזר נוסף מגדיל את עלות המערכת. מערכת כוללת עלויות ניתן לצמצם באמצעות מערכת מתוצרת בית, אם החוקר מספיק מתמחה ובעל זמן לבנות, פתרון בעיות, ולשמור על מערכת כזו. מגבלה נוספת לעתים קרובות כרוך הביטוי פונקציונלי nAChR נמוך, אשר יכולה להיות חלקית חמאני נקיטת פעולות כאמור לעיל, אבל זה אינו מבטיח הצלחה. בדרך כלל, אם אי אפשר למדוד זרמים מופעל ליגנד בעקבות פאף-בקשה של אגוניסטים, הרשות הפלסטינית-Nic פלאש פוטוליזה תחת מתח קלאמפ לא תניב תוצאות מתקבלות על הדעת. מגבלה שלישית כרוכה מהותי זריחה של הרשות הפלסטינית-nic. הרשות הפלסטינית-Nic סופג אור ~ 405 ננומטר ויפלטו בטווח דומה חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) או אלקסה 4885. הרשות הפלסטינית-Nic ריכוזים חורגים ~ 1 מ מ, מאפיין זה קרינה פלואורסצנטית יכול לעשות את זה מאתגר בו-זמנית להמחיש מבנים עצביים. כדי להמתיק את זה, זה קריטי כדי להיות מסוגל לשלוט בקלות את הזרימה של הרשות הפלסטינית-Nic מ פיפטה זלוף. מעת לעת, הזרימה הרשות הפלסטינית-Nic הופסק כדי לאפשר מולקולות פלורסנט לנטרל את זה משם. זה מותר מחדש הדמיה של הנוירון לבדיקת המיקום ספוט של קרן uncaging. מגבלה פוטנציאליים הרביעי להזכיר כרוכה בשימוש של 405 ננומטר אור עבור פוטוליזה. באורכי גל קצרים יותר כגון 405 ננומטר נוטים יותר הפיזור ברקמות מורכבות כגון פרוסה המוח. לפיכך, נתון ההבזקה, משך, uncaging amplitudes התגובה וקינטיקה דעיכה באופן שונה מושפעת העומק של המוקד uncaging בתוך הפרוסה. מסקנות על היבטים ביולוגיים nAChRs צריך לקחת זה הקונה חשובים בחשבון.
זו טכניקה פלאש פוטוליזה לייזר מקומי לאחרונה שימש לחשוף פרטים חדשים אודות נוירוביולוגיה nAChR. לדוגמה, חשיפה כרונית ניקוטין מגבירה את perisomatic ואת nAChR דנדריטים פונקציה habenula המדיאלי נוירונים5. היא שימשה גם כדי לסייע בהמחשת, בפעם הראשונה, כי אזור הטגמנטום הגחוני גלוטמט נוירונים להביע nAChRs תפקודית שלהם perisomatic, תאים דנדריטים הסלולר6. ישנם שרבים הפוטנציאל בעתיד שימושים של טכניקה זו, וכל הגישה יכול לחול על סוגים אחרים של הנוירון מפתח הידועות nAChRs אקספרס, כגון נוירונים בקליפת המוח כפירמידה31 או interneurons של קליפת המוח32סטריאטום33 , ההיפוקמפוס19. טכניקה זו יכול גם להיות משולב עם הגן פרמקולוגיה ו/או nAChR עריכה34 כדי להתאים לשפה קולטן ספציפי יחוברו אל תאים עצביים שונים. הגישה עשוי להיות מותאם בקלות תרכובות אחרות קומרין כלואים, לרבות אך לא רק, אלה שפותחו במקביל עם הרשות הפלסטינית-Nic5. לבסוף, הרשות הפלסטינית-Nic פלאש פוטוליזה אולי יום אחד לשמש חיה ער/מתנהג ללמוד הפעולה של ניקוטין פרדיגמות הרומן פרמקולוגיה התנהגותית.
Disclosures
D.L.W. משמש כיועץ בשכר של ברוקר ננו פלורסצנטיות מיקרוסקופ.
Acknowledgments
המחברים תודה מעבדה חברי החוקרים העיקרי מערבי הבאים: ריאן Drenan, ד ג'יימס Surmeier, יבגניה Kozorovitskiy ו קבלן אניס. עבודה זו נתמכה על ידי אותנו במכון הלאומי של בריאות (NIH) (מענקים DA035942 ו- DA040626 כדי R.M.D.), חברת פארמה קרן (מלגת אל תיתן) ו HHMI.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instruments, Consumables, and Miscellaneous Chemicals | |||
| Multiclamp 700B | Molecular Devices Corp. | Patch clamp amplifier | |
| Pneumatic Picopump | World Precision Instruments | PV820 | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument Co | P-97 | |
| Temperature Controller | Warner Instruments | TC-324C | |
| Vibrating blade microtome | Leica Biosystems | VT1200S | |
| Ultrafree-MC Centrifugal Filter | MilliporeSigma | UFC30GV0S | internal solution filter |
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B150F-4 | patch and local application pipette |
| (-)-Nicotine hydrogen tartrate salt | Glentham | GL9693 | nicotine salt |
| 7-carboxymethylamino-4-methyl coumarin | Janelia Research Campus | PA-Nic by-product | |
| 1-[7-[bis(carboxymethyl)- amino]coumarin-4-yl]methyl-nicotine | Janelia Research Campus | PA-Nic | |
| Euthasol (Pentobarbital Sodium and Phenytoin Sodium) | Virbac | ANADA #200-071 | |
| Alexa FluorTM 488 Hydrazide | ThermoFisher | A10436 | green fill dye |
| Alexa FluorTM 568 Hydrazide | ThermoFisher | A10437 | red fill dye |
| 6-carboxy-AF594 (Alexa Fluor 594) | Janelia Research Campus | red fill dye | |
| QX 314 chloride | Tocris | 2313 | voltage-gated sodium channel blocker |
| Power Meter | ThorLabs | S120C | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals for Solutions | |||
| N-Methyl-D-glucamine | Sigma | M2004 | |
| Potassium chloride | Sigma | P3911 | |
| Sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma | S9638 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S6014 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G5767 | |
| (+)-Sodium L-ascorbate | Sigma | A4034 | |
| Thiourea | Sigma | T8656 | |
| Sodium pyruvate | Sigma | P2256 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma | 230391 | |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma | 223506 | |
| Sodium chloride | Sigma | S9625 | |
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid | Sigma | E3889 | |
| Adenosine 5′-triphosphate magnesium salt | Sigma | A9187 | |
| Guanosine 5′-triphosphate sodium salt hydrate | Sigma | G8877 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Components of 2-Photon Microscope | |||
| Ultima Laser Scanner for Olympus BX51 Microscope | Bruker Nano, Inc. | imaging software and galvos | |
| Imaging X-Y galvanometers | Cambridge Technology | ||
| Mai Tai HP1040 | Spectra-Physics | Tuneable IR laser | |
| Pockels cell M350-80-02-BK with M302RM Driver | Conoptics, Inc. | for IR laser attenuation | |
| Integrating Sphere Photodiode Power Sensor | Thorlabs, Inc | laser power pick-off photodiode | |
| Uncaging X-Y galvanometers | Cambridge Technology | ||
| Helios 2-Line Laser Launch | Bruker Nano, Inc. | uncaging laser components | |
| OBIS LX/LS 405 nm (100 mW) | Coherent, Inc. | ||
| OBIS LX/LS 473 nm (75 mW) | Coherent, Inc. | ||
| Point-Photoactivation / Fiber Input Module for Limo Sidecar - Uncaging | Bruker Nano, Inc. | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Upright Microscope | Olympus | BX51WIF | Upright microscope chasis |
| Objective: Olympus M Plan FL 10x; NA 0.3 WD 11 mm | Olympus | 10x objective | |
| Objective: Olympus M Plan Fluorite 60x/1.0 WD=2mm NIR | Olympus | 60x water-dipping objective | |
| X-Cite 110, four-LED LLG coupled epi-fluorescence light source | Excelitas Technologies | LED Light Source | |
| Epi-Fluorescence Filter: ET-GFP (FITC/CY2) for Epi-Turret | Chroma Technologies | LED Filter for blue light excitation | |
| Epi-Fluorescence Filter: ET-DsRed (TRITC/CY3) for Epi-Turret | Chroma Technologies | LED Filter for green light excitation | |
| B&W CCD camera; Watec, 0.5 in B/W CCD | Watec Co., LTD. | CCD camera for patch clamp recording | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| External Detectors - Dual Reflected Emission - Olympus Upright (Multi-Alkali, GaAsP) | Bruker Nano, Inc. | ||
| Multi-alkali side-on PMT | Hamamatsu | R3896 | red channel PMT |
| 595/50m | Chroma Technologies | red channel emission filter | |
| 565lpxr | Chroma Technologies | dichroic beam splitter | |
| GaAsP end-on PMT | Hamamatsu | 7422PA-40 | green channel PMT |
| 525/70m | Chroma Technologies | green channel emission filter | |
| High-Speed Shutter for Hamamatsu H7422 PMT | Vincent Associates / Bruker | 517329 | PMT shutter mount |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dodt Gradient Contrast Transmission Detection Module | Bruker Nano, Inc. | ||
| Multi-alkali side-on PMT | Hamamatsu | R3896 | Dodt PMT |
References
- Zhang, C., et al. Cholinergic tone in ventral tegmental area: Functional organization and behavioral implications. Neurochemistry International. 114, 127-133 (2018).
- Sarter, M., Parikh, V., Howe, W. M. Phasic acetylcholine release and the volume transmission hypothesis: time to move on. Nature Reviews Neuroscience. 10 (5), 383-390 (2009).
- Coyle, J. T., Price, D. L., DeLong, M. R. Alzheimer's disease: a disorder of cortical cholinergic innervation. Science. 219 (4589), 1184-1190 (1983).
- Katz, B., Thesleff, S. A study of the desensitization produced by acetylcholine at the motor end-plate. Journal of Physiology. 138 (1), 63-80 (1957).
- Banala, S., et al. Photoactivatable drugs for nicotinic optopharmacology. Nature Methods. 15 (5), 347-350 (2018).
- Yan, Y., et al. Nicotinic Cholinergic Receptors in VTA Glutamate Neurons Modulate Excitatory Transmission. Cell Reports. 23 (8), 2236-2244 (2018).
- Engle, S. E., Shih, P. Y., McIntosh, J. M., Drenan, R. M. α4α6β2* nicotinic acetylcholine receptor activation on ventral tegmental area dopamine neurons is sufficient to stimulate a depolarizing conductance and enhance surface AMPA receptor function. Molecular Pharmacology. 84 (3), 393-406 (2013).
- Engle, S. E., Broderick, H. J., Drenan, R. M. Local application of drugs to study nicotinic acetylcholine receptor function in mouse brain slices. Journal of Visualized Experiments. (68), (2012).
- Ren, J., et al. Habenula "cholinergic" neurons co-release glutamate and acetylcholine and activate postsynaptic neurons via distinct transmission modes. Neuron. 69 (3), 445-452 (2011).
- Koppensteiner, P., Melani, R., Ninan, I. A Cooperative Mechanism Involving Ca(2+)-Permeable AMPA Receptors and Retrograde Activation of GABAB Receptors in Interpeduncular Nucleus Plasticity. Cell Reports. 20 (5), 1111-1122 (2017).
- Zhang, J., et al. Presynaptic Excitation via GABAB Receptors in Habenula Cholinergic Neurons Regulates Fear Memory Expression. Cell. 166 (3), 716-728 (2016).
- Chen, E., et al. Altered Baseline and Nicotine-Mediated Behavioral and Cholinergic Profiles in ChAT-Cre Mouse Lines. The Journal of Neuroscience. 38 (9), 2177-2188 (2018).
- Nagy, P. M., Aubert, I. Overexpression of the vesicular acetylcholine transporter increased acetylcholine release in the hippocampus. Neuroscience. 218, 1-11 (2012).
- Ting, J. T., Feng, G. Recombineering strategies for developing next generation BAC transgenic tools for optogenetics and beyond. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 8, 111 (2014).
- Crittenden, J. R., Lacey, C. J., Lee, T., Bowden, H. A., Graybiel, A. M. Severe drug-induced repetitive behaviors and striatal overexpression of VAChT in ChAT-ChR2-EYFP BAC transgenic mice. Frontiers in Neural Circuits. 8, 57 (2014).
- Kolisnyk, B., et al. ChAT-ChR2-EYFP mice have enhanced motor endurance but show deficits in attention and several additional cognitive domains. The Journal of Neuroscience. 33 (25), 10427-10438 (2013).
- Nagy, P. M., Aubert, I. Overexpression of the vesicular acetylcholine transporter enhances dendritic complexity of adult-born hippocampal neurons and improves acquisition of spatial memory during aging. Neurobiology of Aging. 36 (5), 1881-1889 (2015).
- Denk, W. Two-photon scanning photochemical microscopy: mapping ligand-gated ion channel distributions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (14), 6629-6633 (1994).
- Khiroug, L., Giniatullin, R., Klein, R. C., Fayuk, D., Yakel, J. L. Functional mapping and Ca2+ regulation of nicotinic acetylcholine receptor channels in rat hippocampal CA1 neurons. The Journal of Neuroscience. 23 (27), 9024-9031 (2003).
- Filevich, O., Salierno, M., Etchenique, R. A caged nicotine with nanosecond range kinetics and visible light sensitivity. Journal of Inorganic Biochemistry. 104 (12), 1248-1251 (2010).
- Tochitsky, I., et al. Optochemical control of genetically engineered neuronal nicotinic acetylcholine receptors. Nature Chemistry. 4 (2), 105-111 (2012).
- Wokosin, D. L., Squirrell, J. M., Eliceiri, K. W., White, J. G. Optical workstation with concurrent, independent multiphoton imaging and experimental laser microbeam capabilities. Review of Scientific Instruments. 74 (1), 193-201 (2003).
- Plotkin, J. L., Day, M., Surmeier, D. J. Synaptically driven state transitions in distal dendrites of striatal spiny neurons. Nature Neuroscience. 14 (7), 881-888 (2011).
- Galtieri, D. J., Estep, C. M., Wokosin, D. L., Traynelis, S., Surmeier, D. J. Pedunculopontine glutamatergic neurons control spike patterning in substantia nigra dopaminergic neurons. Elife. 6, (2017).
- Yasuda, R., et al. Imaging calcium concentration dynamics in small neuronal compartments. Science STKE. (219), pl5 (2004).
- Inoue, S., Spring, K. Video microscopy: The fundamentals. , 2 edn, Plenum Press. 163-186 (1997).
- Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences. Nature Biotechnology. 21 (11), 1369-1377 (2003).
- Maravall, M., Mainen, Z. F., Sabatini, B. L., Svoboda, K. Estimating intracellular calcium concentrations and buffering without wavelength ratioing. Biophysical Journal. 78 (5), 2655-2667 (2000).
- Wathey, J. C., Nass, M. M., Lester, H. A. Numerical reconstruction of the quantal event at nicotinic synapses. Biophysical Journal. 27 (1), 145-164 (1979).
- Shih, P. Y., et al. Differential expression and function of nicotinic acetylcholine receptors in subdivisions of medial habenula. The Journal of Neuroscience. 34 (29), 9789-9802 (2014).
- Verhoog, M. B., et al. Layer-specific cholinergic control of human and mouse cortical synaptic plasticity. Nature Communications. 7, 12826 (2016).
- Koukouli, F., et al. Nicotine reverses hypofrontality in animal models of addiction and schizophrenia. Nature Medicine. 23 (3), 347-354 (2017).
- Xiao, C., et al. Chronic nicotine selectively enhances α4β2* nicotinic acetylcholine receptors in the nigrostriatal dopamine pathway. The Journal of Neuroscience. 29 (40), 12428-12439 (2009).
- Peng, C., et al. Gene Editing Vectors for Studying Nicotinic Acetylcholine Receptors in Cholinergic Transmission. European Journal of Neuroscience. , (2018).
