Summary
כאן אנו מציגים שיטה יעילה כדי לחקור את הפעילות האנטיפיברוטית של תאים בעלי מזון מסטרומה האנושית מתוך הגוף הפנימי שהתקבלו מן החבל הטבור כולו בעקבות אינדוקציה של פגיעה בריאה על ידי הזרקה אנדוקנה של ליאומיצין ב C57BL /6 עכברים. פרוטוקול זה ניתן להרחיב בקלות לבדיקה טרום קלינית של therapeutics אחרים.
Abstract
פיברוזיס ריאתי הוא סימן ההיכר של מספר מחלות ריאות האדם עם אטיולוגיה שונים. מאז הטיפולים הנוכחיים הם מוגבלים למדי, מודלים העכבר להמשיך להיות כלי חיוני לפיתוח אסטרטגיות אנטיפיברוטית חדשה. כאן אנו מספקים שיטה יעילה כדי לחקור בפעילות vivo antifibrotic של התאים האדם סטרומה mesenchymal שהתקבלו מחוט הטבור השלם (huc-MSC) בתוך החליש ליאומיצין פציעה ריאה. C57BL/6 עכברים לקבל הזרקה אנדוקנה הנשימה יחיד של ליאומיצין (1.5 U/ק"ג משקל הגוף) ואחריו עירוי כפול של hUC-MSC (2.5 x 105) לתוך הווריד האחורי, 24 h ו -7 ימים לאחר הממשל ליאומיצין. עם ההקרבה בימים 8, 14, או 21, שינויים דלקתיים ופיברוטית, תוכן קולגן, נוכחות hUC-MSC הסבר רקמת הריאה מנתחים. ההזרקה של ליאומיצין לתוך קנה הנשימה של העכבר מאפשר המיקוד הישיר של הריאות, המוביל לדלקת ריאות נרחבת פיברוזיס. הניהול הסיסטמתי של מנה כפולה של hUC-MSC תוצאות בתחילת blunting של פציעת הריאה ליאומיצין המושרה. באופן פנימי מוחדרת הווג-MSC לתוך הריאות העכבר, שם הן מפעילות את פעילותם האנטי-דלקתית והאנטיפיברוטית. לסיכום, פרוטוקול זה הוחל בהצלחה עבור בדיקות טרום קליני של hUC-MSC במודל עכבר ניסיוני של פיברוזיס ריאתי האדם. עם זאת, טכניקה זו יכולה להיות מורחבת בקלות הן כדי ללמוד את ההשפעה של חומרים שונים בעלי הקנה מנוהל באופן שונה על הפתופסולוגיה של הריאות וכלה לאמת טיפולים מערכתית אנטי דלקתיות ואנטיפיברוטית חדשה.
Introduction
פיברוזיס ריאתי הוא תהליך פתולוגי מתקדם המאופיין על ידי הפקדת מוגזמת של רכיבי מטריקס המתכלים, בעיקר סוג אני קולגן, בריאות interstitium, המוביל לתפקוד ריאות לקויי. זהו סימן ההיכר של מחלות ריאה אנושית עם אטיולוגיה שונה ומייצגת גורם התחזיות הקליני המסכן. מאז הטיפולים הנוכחיים הם מוגבלים למדי1, מודלים העכבר להמשיך להיות כלי חיוני הן עבור חקירה נוספת של מנגנוני פתוגניים המשפיעים על התחלתה ואת ההתקדמות של המחלה לפיתוח אנטיפיברוטיקה חדשה אסטרטגיות2,3.
עד כה, המינהל של ליאומיצין היה המודל הנפוץ ביותר של פיברוזיס הריאות המושרה בניסויים4. לצד מספר שיטות מרובות (כולל לעירוי, תוך הצפק, תת עורית ושאיפה), הליאומיצין באופן תדיר או בזריקות האנדוקנה, הופיעו כמסלולים הנפוצים ביותר4,5. השיטה שאנו מתארים להלן פותחה כדי למנוע את ההשפעה הרותח של ליאומיצין על רירית הקנה. למעשה, על ידי העברת הקנה ומדמיין אותו באמצעות מיקרוסקופ הפעלה, ניתן להשיג את החוסר של הנפח כולו של הפתרון ליאומיצין ישירות לתוך נתיב האוויר התחתון ללא כל נשפך בנתיב האוויר העליון. כאשר המומחיות והמכשור הכירורגי הנדרשים זמינים, שיטה זו מאפשרת בטיחות, חזקה, השראה האינדוקציה של דלקת ריאות פיברוזיס, כפי שדווח להלן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל טיפול בעלי חיים והליכים ניסיוניים אושרו על ידי משרד הבריאות האיטלקי (הרשאה נ. 456/2016-PR) והתבצע בהתאם למוסכמות הצהרת הלסינקי.
1. עכברים
- לאחר רכישת אותם, לאפשר לעכברים כדי התאקלם לפחות 7 ימים לפני הזריקה.
הערה: עכברים שוכנו במתקן לבעלי חיים בתנאים ללא פתוגן, שמרו תחת טמפרטורה ולחות מתמדת על מחזור של 12 מעלות אור/כהה, וניתנה להם גישה חופשית למים ולמזון כרוב סטנדרטי. - השתמש נקבה C57BL/6 עכברים ולהזריק להם 12 עד 16 שבועות של גיל.
2. הזרקת אנדוקנה אל הליאומיצין
- הכנה ליאומיצין
התראה: מבוסס על המערכת ההרמוניה הגלובלית של סיווג והתוויות של כימיקלים, ליאומיצין מסווג כסיכון בריאותי GHS08.- . הכן ליאומיצין תחת כיסוי כימי
- כדי להשיג את הריכוז הרצוי העבודה (0.05 U/100 μL), השהה מחדש 15 U של ליאופליאומיצין סולפט ב 30 מ ל של תמיסת מלח סטרילי.
- בזהירות לערבב את המדגם על ידי היפוך הצינור כדי למנוע היווצרות קריש.
- התווית כראוי את השפופרת עם תאריך של השעיה, לאחסן אותו ב 4 ° c, ולהשתמש בתוכן שלה בתוך 24 h.
- לפני ההחדרה, התמיסה הליאומיצין לטמפרטורת החדר מעורפלת.
הערה: בניסוי זה, מנה אחת של 1.5 U/ק"ג משקל הגוף של ליאומיצין היה שימוש כדי לגרום לפציעה בריאה ב C57BL/6 עכברים. אף על פי כן, למתח לכל עכבר יש רגישות שונה ליאומיצין6,7. טיטור של ליאומיצין צריך להתבצע כדי לקבוע את המינון האופטימלי בלחץ העכבר המשמש את הניסויים.
- רדמה
- להכין הרדמה על ידי המסת 0.2 g של 2, 2, 2-tribromoethanol ב 9 מ ל של תמיסת מלח סטרילי ו 1 מ ל של אתנול מוחלט (בריכוז עובד של 20 מ"ג/mL).
- מערבבים ביסודיות על ידי היפוך הצינור כדי למנוע היווצרות קריש.
- סמן את השפופרת כראוי עם תאריך ההכנה, אחסן אותה ב-4 ° c בחשיכה, והשתמש בה תוך 3 ימים.
- לסמם את העכברים עם הזרקה התוך הצפק של 250 μL של הפתרון triרומטוזיס oאתנול (במינון הסופי של 200 מ"ג/ק"ג משקל הגוף) לכל עכבר, באמצעות מזרק 1 מ ל ו-26 המחט G.
הערה: עם מינון זה, העכברים הם מודעים לפחות 20 דקות. במידת הצורך, התאימו את המינון בהתאם לתגובת העכבר, בהתייעצות עם הוטרינר. - לנטר את הנשימה של העכבר. קצב הנשימה יהיה מעט איטי. אחרי כמה דקות, לצבוט אחד הרגליים העכבר כדי לבדוק את העדר של רפלקס הדוושה.
- הזרקת אנדוקנה
- שמירה על תנאים אספטי במהלך כל ההליך. השתמשו בכלים ובחומרים כירורגיים סטריליים, לבשו כפפות סטריליות והימנעו ממגע עם משטח לא סטרילי.
- שכבו את העכבר מורדם על גבו על פלטפורמת כירורגית ולהחזיק אותו במקום על ידי תיקון בעדינות הרגליים שלה עם רצועות הסרט ניתוח.
הערה: הקלטה עדינה של רגלי העכבר מומלץ להימנע מפני העכבר הזזה מפלטפורמה כירורגית במהלך הסיבוב שלה (שלב 2.3.10). - מניחים את העכבר על השטיח מחומם כדי לשמור על טמפרטורת הרקטום יציב ב 37 ° c במהלך ההתערבות. למדוד את הטמפרטורה פי הטבעת על ידי לווין רקטלי.
- בעדינות להאריך את צוואר העכבר על ידי הצבת "כרית", למשל, גליל כותנה שיניים, מתחת לאזור הצוואר הצווארי שלה.
- גלח בעדינות את הגרון. עם סכין גילוח
- להסיר את השיער מהאזור כירורגי עם אלכוהול לחטא את העור העכבר מספר פעמים עם 1% povidone-פתרון יוד.
- לצבוט את העור עם זוג מלקחיים אנטומיים ולעשות חתך קצר בהתכתבות של השריר שריר הלשון העכבר, באמצעות זוג מטופלים הטבעת, מעוקל מספריים קהה.
הערה: חתך העור הוא כ 0.5 ס מ אורך. החלק העור המתאים אשר מוסר הוא קטן כל כך שהוא ייצור שום מתח בצוואר העכבר. - לעצור את הדימום עם מקלות צמר גפן.
- לנקות אותו בעדינות. מרקמות שמנות ואחרות
- לסובב את הפלטפורמה כירורגית כדי לכוון את העכבר עם ראשה לעבר המפעיל.
הערה: מיקום זה מאפשר למפעיל, במהלך הזריקה, כדי להטות את המזרק כך שהוא עוקב אחר הנתיב הטבעי של קנה הנשימה ישר לריאות. - מניחים את העכבר תחת מיקרוסקופ הפעלה כדי לעזור עם ההדמיה של קנה הנשימה. כוונן את התאורה והגדר את ההגדלה (בין 1 ל-1.2), פוקוס וחדות. קנה הנשימה ניתן להבדיל בקלות כמו צינור שקוף לבן, ואת טבעות הקנה הם גלויים בבירור.
- לערבב את הפתרון ליאומיצין על ידי ליטוף בעדינות, ו לשף 100 μL לתוך מזרק 0.5 mL עם מחט 25 גרם, הימנעות היווצרות בועה.
- לאחר קנה הנשימה בבירור דמיינו, ניקוב בזהירות עם קצה המחט בזווית של 30 ° (איור 1A).
- לאט להחדיר 100 μL של ליאומיצין או סטרילי מלוחים (בקרת רכב) ישירות לתוך לומן של קנה הנשימה. המתן כמה שניות עד הנפח כולו מטייל במורד המחט, ולאחר מכן להסיר אותו מקנה הנשימה.
- להתבונן כמה שניות של דום נשימה, אשר מתרחשת כאשר המחט מוכנס כראוי לתוך קנה הנשימה, כך העכבר יהיה מיד לשאוף את כל הנפח של הנוזל.
- אם העכבר אינו שאיפת הנוזל, בזהירות לפקח על נשימתו ולהתאים את תנוחת המחט. אם העכבר מפסיק לנשום, מיד להסיר את המחט ולאפשר לעכבר לחדש נשימה כרגיל לפני החדרת אותו מחדש.
- להשליך בביטחה את המזרק והמחט לאחר הזריקה.
- סגרו את הfascia התת עורית ואת פצע העור עם תפר הנספג 5-0.
הערה: כאשר לא לגמרי נספג מחדש, להסיר תפרים 7-10 ימים לאחר הניתוח.
- התאוששות מבעלי חיים
- מניחים את העכבר מוזרק בצד שלה על משטח חימום להתאוששות.
- לנטר את הנשימה של העכבר ולהתבונן בעכבר עד שהוא מתחיל לנוע ולשוב שכיבה ומודעות מלאה.
- ברגע שהוא אישר כי העכבר במצב טוב, להחזיר אותו לכלוב המקורי. אל תחזיר אותו לחברה של בעלי חיים אחרים עד שהוא התאושש לחלוטין.
- כדי להבטיח כאבים ממושכת ולהימנע כל שרידי כאב שלאחר התערבותית, ניהול תת-עורי בופרנורפין (במינון הסופי של 0.05 מ"ג/ק"ג משקל הגוף) לעכבר כל 12 h פוסט הזרקת אנדוקנה.
- בחנו את העכברים 24 שעות לאחר הזרקת קנה הנשימה האנדוליאומיצין ועשו זאת פעמיים ביום. נטר את העכברים למצוקה נשימתית, לירידה במשקל, לחריגות התנהגות ולכל סימן של תחלואה.
3. וריד הזנב של תאי הטבור האנושי מסוניים
- הכנה לתאים
הערה: הבידוד, האפיון והטיפוח של תאי סטרומה של מסצ'ימצ'אל מתוך חבל הטבור האנושי המתואר בעבר,8,9,10. ה-hUC-MSC צריכה להיות מניפולציות ומוחדרת באופן מידי; לכן, בצע את כל השלבים תחת מכסה סטרילי.- הרחיבו את ה-hUC-MSC ב75 ס מ2 בקבוקי תרבות לפסקאות מוקדמות (1 – 3 מקסימום).
הערה: ה-hUC-MSC צריך להיות 70% ביום העירוי שלהם לעכברים. - שטוף את התאים עם 10 מ ל של תמיסת מלח מתכלה סטרילית (PBS) בטמפרטורת החדר.
- מוסיפים 2 מ ל טריפסין ומודקות את התאים ב-37 ° c לערך 1 דקות, עד שהם מתחילים להתנתק.
- לנטרל את טריפסין על ידי הוספת 8 מ ל של hUC-MSC בינוני מלא המכיל 10% סרום עוברי העובר (FBS).
- לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה ב 350 x g עבור 10 דקות.
- השהה את הגלולה בתמיסת מלח סטרילית וספור את התאים באמצעות תא בורקר. הכן את התא ההשעיה עבור אינפוזיה על ידי דילול התאים לריכוז הסופי של 2.5 x 105 ב 200 μl של תמיסת מלח סטרילי לכל עכבר. הכינו השעיה תא עודף כדי להבטיח כי יש נפח מספיק עבור החדרת כל העכברים.
- השאר את התאים בקרח לפני העירוי. להחדיר בתוך כמה שעות, כמתואר בסעיף 3.3.
- הרחיבו את ה-hUC-MSC ב75 ס מ2 בקבוקי תרבות לפסקאות מוקדמות (1 – 3 מקסימום).
- רדמה
הערה: כדי למזער את הסיכון של פגיעה בווריד הזנב של העכבר במהלך ההזרקה אסור להזיז את העכבר. לכן הרדמה העדיפו על פני הרחקה עכבר פשוט.- . בחדר האינדוקציה של 4%
- לנטר את הנשימה של העכבר. קצב הנשימה יהיה מעט איטי. לאחר כמה דקות, לצבוט אחד הרגליים העכבר כדי לבדוק את ההרדמה הנכונה.
- אינפוזיה
- ברגע שהחוסר הכרה אושר, מניחים את העכבר מתחת למכסה סטרילי עבור העירוי הוורידי של ה-c.
- שמירה על הרדמה כללית במהלך הניסוי באמצעות מסכת פנים עם זרימה רציפה של 1.5% isofלוריאן.
- כדי לקדם שיער ולאפשר זריקה קלה יותר, להשרות את זנב העכבר במים חמים עבור 2 דקות.
- מערבבים את ההשעיה התא על ידי ליטוף בעדינות כדי לוודא כי התאים אינם יוצרים גושים. משף 200 μL לתוך מזרק 1 mL עם מחט של 26 גרם, הימנעות היווצרות בועה.
- החזק את זנב העכבר בקצה ויישר אותו בעדינות.
- לאתר את הווריד הצדדי של זנב העכבר; בעדינות לגרד אותו עם אזמל ולנגב אותו עם 70% אתנול.
הערה: גירוד בעדינות של הזנב מבוצע כדי להסיר את השיער, מה שהופך את האתר של הזרקה חלקה ומנקה. - החל מהחלק המרוחק של הזנב, להכניס את המחט לתוך הווריד בזווית 15 ° לאט להחדיר 200 μL של hUC-MSC או מלוחים סטרילי (בקרת רכב) (איור 1B).
- מעקב אחר עירוי העירוי המצליח על-ידי הנוזל הנכנס לווריד ללא התנגדות ומחסור בהפרעות. המתן מספר שניות עד שנפח כולו מגיע למטה המחט, ולאחר מכן להסיר אותו מן הווריד.
- כדי למנוע דימום, ללחוץ בקצרה על פצע הכניסה עם גזה סטרילית.
- להשליך בבטחה את המזרק. ואת המחט לאחר העירוי
- התאוששות מבעלי חיים
- הניחו את העכבר הרווי על צידו על משטח חימום להתאוששות.
- לנטר את הנשימה של העכבר ולהתבונן בעכבר עד שהוא מתחיל לנוע ולשוב שכיבה ומודעות מלאה.
- ברגע שהוא אישר כי העכבר במצב טוב, להחזיר אותו לכלוב המקורי. אל תחזיר אותו לחברה של בעלי חיים אחרים עד שהוא התאושש לחלוטין.
- בחנו את העכברים למשך 24 שעות אחרי עירוי הזנב ובכל יום אחר, כדי לעקוב אחר מצבם הבריאותי ולזהות כל סימן סבל או פתולוגי מוקדם יותר.
4. לחקור ולעבד איברים
- להקריב את העכברים בימים 8, 14, או 21 לאחר המינהל ליאומיצין (איור 1C) על ידי מנת יתר של הרדמה להזרקה.
- בלו את קנה הנשימה ואת הריאות. ולשטוף אותם מיד בערוץ הקירור
- הצמד להקפיא את הריאות הימנית בחנקן נוזלי ואחסן אותם ב-80 ° c עבור ניתוח מולקולרי הבא10.
- מנפח את הריאות השמאלית עם 4% פאראמפורמלדהיד ולתקן אותם ב 10% פתרון פורמלין באגירה נייטרלית עבור 24 שעות; אז, מייבשים אותם בסדרת אלכוהול מדורגים, לנקות אותם xylene ולהטביע אותם בתוך פרפין10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
פגיעה בריאה המושרה על ידי הזרקה אנדוקנה הנשימה יחיד של 1.5 U/ק"ג משקל הגוף של ליאומיצין סולפט ב 100 μL של תמיסת מלח סטרילי. שליטה בעלי חיים קיבל הזרקה אנדוקנה. של נפח שווה של תמיסת מלח שתי יריות של hUC-MSC (2.5 x 105 ב 200 μl של תמיסת מלח סטרילי) הוחדרת לתוך הווריד זנב העכבר, 24 h ו -7 ימים לאחר הממשל ליאומיצין. שליטה בעלי חיים קיבל עירוי ורידי של נפח שווה של תמיסת מלח סטרילית. עכברים הוקרבו בשביל לחקור את הריאות ועיבוד רקמות בימים 8, 14, ו -21 לאחר הממשל ליאומיצין (איור 1).
הדגמנו כי הפרעה ישירה של ליאומיצין לתוך קנה הנשימה העכבר מותר דיפוזיה מהירה למטה לריאות, וכתוצאה מכך דלקת נרחבת, פיברוזיס מתקדמת, עיוות של האדריכלות הרגילה שלהם, בעקביות עם לימודים קודמים 11. שינויים בריאות histopathological העריכו על ידי המטאוקסילין-אאוזין (H & E) ו picrosirius מכתים אדום10, ו פיברוזיס אושרה על ידי הידרוקסיקו תוכן מוגבר והתצהיר קולגן (איור 2). שינויים דלקתיים ברקמה העריכו על ידי מערכת הניקוד היסטולוגית מבוסס על חדירה דלקתית סביב bronchioles, bronchi, כלי דם, ו דלקת ריאות ביניים הבחין המטאוקסילין-אאוזין ויטראז ' מקטעים ריאה10. בעקבות הזרקת ליאומיצין, הציון אשקרופט של סעיפים ריאה בהדרגה עלה מערך ממוצע של 1.5 ביום 8 לערך ממוצע של 4.5 ביום 14 ו של 6.5 ביום 2110. העירוי הכפול של hUC-MSC לתוך וריד הזנב של העכבר במידה רבה ליאומיצין המושרה פציעה ריאה, עם הפחתה משמעותית, אם כי לא להשלים את הטיפול, הן חדירה דלקתית והיקף פיברוזיס בכל נקודת זמן ( איור 2). חיסוני עם נוגדנים מסוימים10 הראה כי החדרת huc-MSC במהירות וביעילות הגיע לריאות העכבר, למרות רק כמה תאים זוהו, עם מספר קטן מיום 8 עד יום 21 (איור 3). כפי שדווח12, נתונים אלה מצביעים על פריקה מהירה של התאים מהאתר של פציעה, למרות ההשפעה שלהם הגנה ממושכת. אימונוהיסטוכימיה (IHC) כתמים של ה-hUC-MSC בוצע, גם בדגימות הטיפול בתמיסת מלח, אך לא ניתן היה לזהות תא, בהינתן העדר מחסור דלקתי במשיכת hUC-MSC.
איור 1: סכימטי של הפרוטוקול הניסיוני. (א) עכברים קיבלו הזרקה בודדת אנדוקנה (אי-אי) של 1.5 U/ק"ג משקל הגוף של ליאומיצין כדי לגרום לפציעה בריאה (יום 0). (ב) אינפוזיה כפולה (עירוי) של 2.5 x 105 האנושי mesenchymal מסטרומה תאים שהתקבלו מחבל הטבור השלם (huc-MSC) בוצעה 24 h (יום 1) ו -7 ימים (יום 7) לאחר הממשל ליאומיצין. (ג) ציר זמן של זריקות ורגעים של הקרבה מוצג כאן. קבוצות עכברים הוקרבו בימים 8, 14, ו -21 לאחר המינהל הליאומיצין (כלומר, 24 שעות, 7 ימים ו -14 ימים לאחר עירוי ה-hUC-MSC השני, בהתאמה). . הדמות הזאת השתנתה ממורצ'יני אל 10. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: hUC-MSC להוריד ליאומיצין המושרה דלקת ריאות פיברוזיס. (A and B) הנציגה תמונות מיקרוסקופיים (הגדלה 10x) של המטאוקסילין-אאוזין (H & E) ו picrosirius כתמים אדומים של קטעי הריאות שהתקבלו מ C57BL/6 עכברים, 21 ימים לאחר הזרקת אנדוקנה של תמיסת מלח סטרילי (מלוחים) או ליאומיצין (ליאומיצין), ה האחרון גם ואחריו עירוי עירוי של hUC-MSC (ליאומיצין + hUC-MSC) או תמיסת מלח סטרילית (ליאומיצין + מלוחים). הבקרה התמיסת מלח הוכיחה. את ארכיטקטורת הריאה הנורמלית מחלחל דלקתי נרחב נצפו 21 ימים לאחר הפציעה הליאומיצין, עם עיוות חמור של ארכיטקטורת הריאות והיווצרות foci. שינויים שליאומיצין המושרה היו החליש באופן משמעותי על ידי הטיפול hUC-MSC אבל לא על ידי תמיסת מלח. (ג) תוכן הידרוקסיליין בימים 8, 14, ו -21 בריאות של C57BL/6 עכברים שקיבלו את הטיפולים הנ ל. התוצאות הן ממוצע ± SD (n = 8 לכל קבוצה), המבוטא כאחוז של הערך המתקבל מידי העכברים שטופלו מלוחים אנדוקנה, ומייצגים שלושה ניסויים עצמאיים. *P < 0.05, * *P < 0.01, לעומת עכברים שטופלו ליאומיצין. (ד) Col1A1 רמות ביטוי של העכבר ב-mrna הריאה המתקבל בימים 8, 14, ו 21 מ C57BL/6 עכברים שקיבלו את הטיפולים הנ ל. התוצאות הן ממוצע ± SD (n = 5 לכל קבוצה) והוא נציג של שלושה ניסויים עצמאיים שבוצעו בטרילקאט. *P < 0.05, * *P < 0.01, לעומת עכברים שטופלו ליאומיצין. . הדמות הזאת השתנתה ממורצ'יני אל 10. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: זיהוי של hUC-MSC ברקמת הריאה. (A and B) מייצגים תמונות מיקרוסקופיים (200x ו-400x הגדלה, בהתאמה) של ההכתמים עם נוגדן anti-hla-1 של מקטעי הריאות שהתקבלו מ C57BL/6 עכברים קבלת אנדוקנה ליאומיצין ואחריו ורידי . הוסי-MSC החיצים האדומים מצביעים. על הכתמים החיוביים של הויג-MSC (ג) מוערך האדם המשוער על ידי תגובת שרשרת פולימראז כמותית בזמן אמת (PCR) הטיפול ב-mrna השלם שחולצו מ-HUC-msc מתורבת לפני אינפוזיה (הרווי huc-msc) או מרקמת הריאה בימים 8, 14, ו 21 של C57BL/6 עכברים קבלת אנדוקנה ליאומיצין ולאחר מכן ורידי hUC-MSC (ליאומיצין + hUC-MSC). התוצאות הן ממוצע ± SD (n = 5 לכל קבוצה) והוא נציג של שלושה ניסויים עצמאיים שבוצעו בטרילקאט. של הערה, ניתן לספק את מקור התמליל האנושי בפרוטוקול ניסיוני זה באופן בלעדי של ה-hUC-MSC הפנימי. . הדמות הזאת השתנתה ממורצ'יני אל 10. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הממשלה הקיימת מהווה מסלול מועדף לאספקת סוכנים אקגניים לריאות. מאז מספר שנים, הזרקה ישירה של ליאומיצין לתוך קנה הנשימה כבר בשימוש נרחב כדי לגרום פיברוזיס הריאות13 ו, לאחרונה, יותר מתקדם, טכניקות לא פולשני פותחו כדי להשיג את זה14,15 ,16.
השיטה המתוארת כאן מספקת יתרונות משמעותיים במספר מגבלות פוטנציאליות. הזרקה של קנה הנשימה דורש התערבות כירורגית, לשאת איתו את הפוטנציאל לסיבוכים הנגרמים על ידי ההליך עצמו, יחד עם הצורך הרגעה בעלי חיים עמוקים. לכן, יש צורך בהכנה ובאימון טובים לשכלול ההליך. חוץ מזה, כדי למזער את סבלם של העכבר, זה הכרחי להגדיר את המינון המתאים של הרדמה על פי הלחץ על העכבר ועל התגובה האישית כדי לשמור על התבוננות קפדנית של מצב ההרדמה בעלי חיים. עם זאת, ראינו שיעור נמוך מאוד של תמותה והתאוששות אופטימלית של בעלי חיים מפני הרדמה. ניתן להשתמש בקטמין ובקסילטין להרדמה, כמו גם לטריברואואתנול. עם זאת, בעכברים, המינון האפקטיבי של קטמין ו xylazine קרוב למינון קטלני; כך, הם יכולים בקלות לגרום לדום נשימה. לעומת זאת, מינון triרומטוזיס יכול להיות מותאם בקלות והוא, כך, סוכן הרדמה עדיף. בעקבות הזרקת האנדוקנה של ליאומיצין לתוך קנה הנשימה, לא שמנו לב לתופעות לוואי. העכברים היו חופשיים מחום ולא סימנים של דלקת או זיהום נצפו סביב קנה הנשימה ואת פצע העור. לכן, לא היה צורך בטיפול אנטיביוטי מניעה. יתר על כן, השימוש במיקרוסקופ הפעלה מבטיח ביטחון גבוה של הצלחה בכך שהוא מאפשר למפעיל לפקח במדויק את המיקום הנכון של המחט לתוך קנה הנשימה של העכבר לפני החוסר, ובכך למזער את הסיכון להזיק לו.
ההזרקה אנדוציקנה של ליאומיצין תוצאות בתגובה דלקתית ופיברוטית חזקה בשתי הריאות ניתן לראות כשיטה איתנה כדי ליצור מודלים העכבר הניסיוני של האדם מחלות ריאה ביניים (הלדיס). עם זאת, כפי שתועד בעבר7, התגובה פיברוטיק לליאומיצין בעכברים הוא מאמץ תלוי ומגדר-ו הקשורות לגיל. לכן, הוא קריטי להצלחת הפרוטוקול למצוא את המינון הנסבל של ליאומיצין בכל הגדרה ניסויית. עכברים נקבה שימשו במחקר זה, כי העניין העיקרי במחקר זה היה ביניים מחלת ריאה הקשורים בטרשת מערכתית, אשר היא מחלה שכיחה במידה רבה אצל נקבות למבוגרים צעירים. עכברים בני שלושה עד ארבעה חודשים נבחרו משום שזה הגיל שבו הם פשוט להיכנס לשלב המבוגר (עכברים להשיג בגרות מינית ב 8-12 שבועות של גיל)17. לפיכך, הם נחשבים לעכברים מבוגרים צעירים ועדיפים על בעלי חיים צעירים יותר, כיוון פיברוזיס של הריאות אינו נפוץ באנשים צעירים מאוד. הם עדיפים גם על בעלי חיים מבוגרים יותר מאז המחקרים הקודמים18 הוכיחו כי עכברים בגילאי הציגו שינויים הפנוטיפים הריאה הפיצוץ, המוביל רגישות מוגברת לקלקול ו פיברוזיס לאחר פציעה בריאה, אשר יכול לייצג הטיה אפשרית במודל הניסיוני המוצג כאן.
וריד הזנב הוא דרך פשוטה, אמינה, ולא פולשנית כדי להבטיח משלוח מהיר ואפקטיבי של תרופות לדם. ניתן לבצע זאת בקלות באמצעות ציוד רפואי פשוט, הכשרה ידנית קצרה ועלויות מופחתות.
הפרוטוקול הנסיוני המתואר כאן, שונה ממחקרים שפורסמו בעבר,19,20,21, קיים בעירוי כפול של 2.5 x 105 huc-MSC כדי לשפר את התא הנכנס לתוך העכבר ריאות והשפעתם הטיפולית. למעשה, כיוון שההליך אינו טראומתי, ניתן לחזור על עצמו באותה חיה, אך תקופה של 7 ימים בין שתי זריקות רצופות מומלצת, על מנת לאפשר את הפיצוי של פצעי הvasal סופו של דבר. כמו-כן, השתמשנו באינהלציה של שאיפת הC57BL/6 במהלך התהליך, כדי למנוע פגיעה בעורק הזנב במקרה של תנועות בעלי חיים פתאומיות.
לסיכום, פרוטוקול זה הוחל בהצלחה כדי לגרום ביעילות פיברוזיס ריאתי ב C57BL/6 עכברים ולאמת את ההשפעה vivo antifibrotic של HUC-MSC. שיטה זו יכולה לשמש גם לניהול תרופות או סוכנים אחרים מאשר ליאומיצין לתוך דרכי הנשימה, כדי לייצר מודלים שונים של מחלת ריאות ניסיוני.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
עבודה זו נתמכת על ידי מענק RF-2011-02352331 מ Ministero איטלקית דלה הצדעה (כדי ארמנדו גבריאלי).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6 mice | Charles River | Jax Mice Stock n. 000664 | |
| 2,2,2-Tribromoethanol (Avertin) | Sigma-Aldrich | T48402 | |
| Barraquer Micro Needle Holder | Lawton | 62-3755 | |
| Bleomycin sulfate | Sigma-Aldrich | B1141000 | |
| Bürker chamber | Brand | 718905 | |
| Culture Flasks | EuroClone | ET7076 | |
| Disposable razors | Unigloves | 4080 | |
| Dissecting Forceps | Aesculap Surgical Instruments | BD311R | |
| DPBS | Gibco | 14190-144 | |
| Heating pad | 2Biological Instruments | 557023 | |
| Isoflurane Vet | Merial Italia | N01AB06 | |
| Operating Microscope | Carl Zeiss | Model OPM 16 | |
| TrypLE Select Enzyme | Gibco | 12563-029 | |
| Vannas Micro Scissors | Aesculap Surgical Instruments | OC498R | |
| Vicryl Plus 4/0 Absorbable Suture, FS-2 needle 19 mm | Ethicon | VCP392ZH |
References
- Iudici, M., et al. Where are we going in the management of interstitial lung disease in patients with systemic sclerosis? Autoimmunity Reviews. 14 (7), 575-578 (2015).
- Moore, B. B., Hogaboam, C. M.
- Mouratis, M. A., Aidinis, V. Modeling pulmonary fibrosis with bleomycin. Current Opinion in Pulmonary Medicine. 17 (5), 355-361 (2011).
- Moeller, A., Ask, K., Warburton, D., Gauldie, J., Kolb, M. The bleomycin animal model: a useful tool to investigate treatment options for idiopathic pulmonary fibrosis? International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 40 (3), 362-382 (2008).
- Moore, B. B., et al. Animal models of fibrotic lung disease. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 49 (2), 167-179 (2013).
- Schrier, D. J., Kunkel, R. G., Phan, S. H. The role of strain variation in murine bleomycin-induced pulmonary fibrosis. American Review of Respiratory Disease. 127 (1), 63-66 (1983).
- Phan, S. H., Kunkel, S. L. Lung cytokine production in bleomycin-induced pulmonary fibrosis. Experimental Lung Research. 18 (1), 29-43 (1992).
- Capelli, C., et al. Minimally manipulated whole human umbilical cord is a rich source of clinical-grade human mesenchymal stromal cells expanded in human platelet lysate. Cytotherapy. 13 (7), 786-801 (2011).
- Beeravolu, N., et al. Isolation and Characterization of Mesenchymal Stromal Cells from Human Umbilical Cord and Fetal Placenta. Journal of Visualized Experiments. (122), e55224 (2017).
- Moroncini, G., et al. Mesenchymal stromal cells from human umbilical cord prevent the development of lung fibrosis in immunocompetent mice. PLoS One. 13 (6), e0196048 (2018).
- Shahzeidi, S., Jeffery, P. K., Laurent, G. J., McAnulty, R. J. Increased type I procollagen mRNA transcripts in the lungs of mice during the development of bleomycin-induced fibrosis. European Respiratory Journal. 7 (11), 1938-1943 (1994).
- Lee, R. H., et al. Intravenous hMSCs improve myocardial infarction in mice because cells embolized in lung are activated to secrete the anti-inflammatory protein TSG-6. Cell Stem Cell. 5 (1), 54-63 (2009).
- Scotton, C. J., Chambers, R. C. Bleomycin revisited: towards a more representative model of IPF? American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 299 (4), L439-L441 (2010).
- Cai, Y., Kimura, S. Noninvasive intratracheal intubation to study the pathology and physiology of mouse lung. Journal of Visualized Experiments. (81), e50601 (2013).
- Thomas, J. L., et al. Endotracheal intubation in mice via direct laryngoscopy using an otoscope. Journal of Visualized Experiments. (86), e50269 (2014).
- Vandivort, T. C., An, D., Parks, W. C. An Improved Method for Rapid Intubation of the Trachea in Mice. Journal of Visualized Experiments. (108), e53771 (2016).
- Dutta, S., Sengupta, P. Men and mice: Relating their ages. Life Sciences. 152, 244-248 (2016).
- Sueblinvong, V., et al. Predisposition for disrepair in the aged lung. American Journal of Medical Sciences. 344 (1), 41-51 (2012).
- Moodley, Y., et al. Human umbilical cord mesenchymal stem cells reduce fibrosis of bleomycin-induced lung injury. American Journal of Pathology. 175 (1), 303-313 (2009).
- How, C. K., et al. Induced pluripotent stem cells mediate the release of interferon gamma-induced protein 10 and alleviate bleomycin-induced lung inflammation and fibrosis. Shock. 39 (3), 261-270 (2013).
- Lee, R. H., et al. TSG-6 as a biomarker to predict efficacy of human mesenchymal stem/progenitor cells (hMSCs) in modulating sterile inflammation in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (47), 16766-16771 (2014).
