אינדוקציה של פגיעה בריאות העכבר על ידי הזרקת אנדוקנה של ליאומיצין

סיכום

כאן אנו מציגים שיטה יעילה כדי לחקור את הפעילות האנטיפיברוטית של תאים בעלי מזון מסטרומה האנושית מתוך הגוף הפנימי שהתקבלו מן החבל הטבור כולו בעקבות אינדוקציה של פגיעה בריאה על ידי הזרקה אנדוקנה של ליאומיצין ב C57BL /6 עכברים. פרוטוקול זה ניתן להרחיב בקלות לבדיקה טרום קלינית של therapeutics אחרים.

תקציר

פיברוזיס ריאתי הוא סימן ההיכר של מספר מחלות ריאות האדם עם אטיולוגיה שונים. מאז הטיפולים הנוכחיים הם מוגבלים למדי, מודלים העכבר להמשיך להיות כלי חיוני לפיתוח אסטרטגיות אנטיפיברוטית חדשה. כאן אנו מספקים שיטה יעילה כדי לחקור בפעילות vivo antifibrotic של התאים האדם סטרומה mesenchymal שהתקבלו מחוט הטבור השלם (huc-MSC) בתוך החליש ליאומיצין פציעה ריאה. C57BL/6 עכברים לקבל הזרקה אנדוקנה הנשימה יחיד של ליאומיצין (1.5 U/ק"ג משקל הגוף) ואחריו עירוי כפול של hUC-MSC (2.5 x 10⁵) לתוך הווריד האחורי, 24 h ו -7 ימים לאחר הממשל ליאומיצין. עם ההקרבה בימים 8, 14, או 21, שינויים דלקתיים ופיברוטית, תוכן קולגן, נוכחות hUC-MSC הסבר רקמת הריאה מנתחים. ההזרקה של ליאומיצין לתוך קנה הנשימה של העכבר מאפשר המיקוד הישיר של הריאות, המוביל לדלקת ריאות נרחבת פיברוזיס. הניהול הסיסטמתי של מנה כפולה של hUC-MSC תוצאות בתחילת blunting של פציעת הריאה ליאומיצין המושרה. באופן פנימי מוחדרת הווג-MSC לתוך הריאות העכבר, שם הן מפעילות את פעילותם האנטי-דלקתית והאנטיפיברוטית. לסיכום, פרוטוקול זה הוחל בהצלחה עבור בדיקות טרום קליני של hUC-MSC במודל עכבר ניסיוני של פיברוזיס ריאתי האדם. עם זאת, טכניקה זו יכולה להיות מורחבת בקלות הן כדי ללמוד את ההשפעה של חומרים שונים בעלי הקנה מנוהל באופן שונה על הפתופסולוגיה של הריאות וכלה לאמת טיפולים מערכתית אנטי דלקתיות ואנטיפיברוטית חדשה.

מבוא

פיברוזיס ריאתי הוא תהליך פתולוגי מתקדם המאופיין על ידי הפקדת מוגזמת של רכיבי מטריקס המתכלים, בעיקר סוג אני קולגן, בריאות interstitium, המוביל לתפקוד ריאות לקויי. זהו סימן ההיכר של מחלות ריאה אנושית עם אטיולוגיה שונה ומייצגת גורם התחזיות הקליני המסכן. מאז הטיפולים הנוכחיים הם מוגבלים למדי¹, מודלים העכבר להמשיך להיות כלי חיוני הן עבור חקירה נוספת של מנגנוני פתוגניים המשפיעים על התחלתה ואת ההתקדמות של המחלה לפיתוח אנטיפיברוטיקה חדשה אסטרטגיות^2,3.

עד כה, המינהל של ליאומיצין היה המודל הנפוץ ביותר של פיברוזיס הריאות המושרה בניסויים⁴. לצד מספר שיטות מרובות (כולל לעירוי, תוך הצפק, תת עורית ושאיפה), הליאומיצין באופן תדיר או בזריקות האנדוקנה, הופיעו כמסלולים הנפוצים ביותר^4,5. השיטה שאנו מתארים להלן פותחה כדי למנוע את ההשפעה הרותח של ליאומיצין על רירית הקנה. למעשה, על ידי העברת הקנה ומדמיין אותו באמצעות מיקרוסקופ הפעלה, ניתן להשיג את החוסר של הנפח כולו של הפתרון ליאומיצין ישירות לתוך נתיב האוויר התחתון ללא כל נשפך בנתיב האוויר העליון. כאשר המומחיות והמכשור הכירורגי הנדרשים זמינים, שיטה זו מאפשרת בטיחות, חזקה, השראה האינדוקציה של דלקת ריאות פיברוזיס, כפי שדווח להלן.

פרוטוקול

כל טיפול בעלי חיים והליכים ניסיוניים אושרו על ידי משרד הבריאות האיטלקי (הרשאה נ. 456/2016-PR) והתבצע בהתאם למוסכמות הצהרת הלסינקי.

1. עכברים

1. לאחר רכישת אותם, לאפשר לעכברים כדי התאקלם לפחות 7 ימים לפני הזריקה.
   הערה: עכברים שוכנו במתקן לבעלי חיים בתנאים ללא פתוגן, שמרו תחת טמפרטורה ולחות מתמדת על מחזור של 12 מעלות אור/כהה, וניתנה להם גישה חופשית למים ולמזון כרוב סטנדרטי.
2. השתמש נקבה C57BL/6 עכברים ולהזריק להם 12 עד 16 שבועות של גיל.

2. הזרקת אנדוקנה אל הליאומיצין

1. הכנה ליאומיצין
   התראה: מבוסס על המערכת ההרמוניה הגלובלית של סיווג והתוויות של כימיקלים, ליאומיצין מסווג כסיכון בריאותי GHS08.
   1. . הכן ליאומיצין תחת כיסוי כימי
   2. כדי להשיג את הריכוז הרצוי העבודה (0.05 U/100 μL), השהה מחדש 15 U של ליאופליאומיצין סולפט ב 30 מ ל של תמיסת מלח סטרילי.
   3. בזהירות לערבב את המדגם על ידי היפוך הצינור כדי למנוע היווצרות קריש.
   4. התווית כראוי את השפופרת עם תאריך של השעיה, לאחסן אותו ב 4 ° c, ולהשתמש בתוכן שלה בתוך 24 h.
   5. לפני ההחדרה, התמיסה הליאומיצין לטמפרטורת החדר מעורפלת.
      הערה: בניסוי זה, מנה אחת של 1.5 U/ק"ג משקל הגוף של ליאומיצין היה שימוש כדי לגרום לפציעה בריאה ב C57BL/6 עכברים. אף על פי כן, למתח לכל עכבר יש רגישות שונה ליאומיצין^6,7. טיטור של ליאומיצין צריך להתבצע כדי לקבוע את המינון האופטימלי בלחץ העכבר המשמש את הניסויים.
2. רדמה
   1. להכין הרדמה על ידי המסת 0.2 g של 2, 2, 2-tribromoethanol ב 9 מ ל של תמיסת מלח סטרילי ו 1 מ ל של אתנול מוחלט (בריכוז עובד של 20 מ"ג/mL).
   2. מערבבים ביסודיות על ידי היפוך הצינור כדי למנוע היווצרות קריש.
   3. סמן את השפופרת כראוי עם תאריך ההכנה, אחסן אותה ב-4 ° c בחשיכה, והשתמש בה תוך 3 ימים.
   4. לסמם את העכברים עם הזרקה התוך הצפק של 250 μL של הפתרון triרומטוזיס oאתנול (במינון הסופי של 200 מ"ג/ק"ג משקל הגוף) לכל עכבר, באמצעות מזרק 1 מ ל ו-26 המחט G.
      הערה: עם מינון זה, העכברים הם מודעים לפחות 20 דקות. במידת הצורך, התאימו את המינון בהתאם לתגובת העכבר, בהתייעצות עם הוטרינר.
   5. לנטר את הנשימה של העכבר. קצב הנשימה יהיה מעט איטי. אחרי כמה דקות, לצבוט אחד הרגליים העכבר כדי לבדוק את העדר של רפלקס הדוושה.
3. הזרקת אנדוקנה
   1. שמירה על תנאים אספטי במהלך כל ההליך. השתמשו בכלים ובחומרים כירורגיים סטריליים, לבשו כפפות סטריליות והימנעו ממגע עם משטח לא סטרילי.
   2. שכבו את העכבר מורדם על גבו על פלטפורמת כירורגית ולהחזיק אותו במקום על ידי תיקון בעדינות הרגליים שלה עם רצועות הסרט ניתוח.
      הערה: הקלטה עדינה של רגלי העכבר מומלץ להימנע מפני העכבר הזזה מפלטפורמה כירורגית במהלך הסיבוב שלה (שלב 2.3.10).
   3. מניחים את העכבר על השטיח מחומם כדי לשמור על טמפרטורת הרקטום יציב ב 37 ° c במהלך ההתערבות. למדוד את הטמפרטורה פי הטבעת על ידי לווין רקטלי.
   4. בעדינות להאריך את צוואר העכבר על ידי הצבת "כרית", למשל, גליל כותנה שיניים, מתחת לאזור הצוואר הצווארי שלה.
   5. גלח בעדינות את הגרון. עם סכין גילוח
   6. להסיר את השיער מהאזור כירורגי עם אלכוהול לחטא את העור העכבר מספר פעמים עם 1% povidone-פתרון יוד.
   7. לצבוט את העור עם זוג מלקחיים אנטומיים ולעשות חתך קצר בהתכתבות של השריר שריר הלשון העכבר, באמצעות זוג מטופלים הטבעת, מעוקל מספריים קהה.
      הערה: חתך העור הוא כ 0.5 ס מ אורך. החלק העור המתאים אשר מוסר הוא קטן כל כך שהוא ייצור שום מתח בצוואר העכבר.
   8. לעצור את הדימום עם מקלות צמר גפן.
   9. לנקות אותו בעדינות. מרקמות שמנות ואחרות
   10. לסובב את הפלטפורמה כירורגית כדי לכוון את העכבר עם ראשה לעבר המפעיל.
       הערה: מיקום זה מאפשר למפעיל, במהלך הזריקה, כדי להטות את המזרק כך שהוא עוקב אחר הנתיב הטבעי של קנה הנשימה ישר לריאות.
   11. מניחים את העכבר תחת מיקרוסקופ הפעלה כדי לעזור עם ההדמיה של קנה הנשימה. כוונן את התאורה והגדר את ההגדלה (בין 1 ל-1.2), פוקוס וחדות. קנה הנשימה ניתן להבדיל בקלות כמו צינור שקוף לבן, ואת טבעות הקנה הם גלויים בבירור.
   12. לערבב את הפתרון ליאומיצין על ידי ליטוף בעדינות, ו לשף 100 μL לתוך מזרק 0.5 mL עם מחט 25 גרם, הימנעות היווצרות בועה.
   13. לאחר קנה הנשימה בבירור דמיינו, ניקוב בזהירות עם קצה המחט בזווית של 30 ° (איור 1A).
   14. לאט להחדיר 100 μL של ליאומיצין או סטרילי מלוחים (בקרת רכב) ישירות לתוך לומן של קנה הנשימה. המתן כמה שניות עד הנפח כולו מטייל במורד המחט, ולאחר מכן להסיר אותו מקנה הנשימה.
   15. להתבונן כמה שניות של דום נשימה, אשר מתרחשת כאשר המחט מוכנס כראוי לתוך קנה הנשימה, כך העכבר יהיה מיד לשאוף את כל הנפח של הנוזל.
   16. אם העכבר אינו שאיפת הנוזל, בזהירות לפקח על נשימתו ולהתאים את תנוחת המחט. אם העכבר מפסיק לנשום, מיד להסיר את המחט ולאפשר לעכבר לחדש נשימה כרגיל לפני החדרת אותו מחדש.
   17. להשליך בביטחה את המזרק והמחט לאחר הזריקה.
   18. סגרו את הfascia התת עורית ואת פצע העור עם תפר הנספג 5-0.
       הערה: כאשר לא לגמרי נספג מחדש, להסיר תפרים 7-10 ימים לאחר הניתוח.
4. התאוששות מבעלי חיים
   1. מניחים את העכבר מוזרק בצד שלה על משטח חימום להתאוששות.
   2. לנטר את הנשימה של העכבר ולהתבונן בעכבר עד שהוא מתחיל לנוע ולשוב שכיבה ומודעות מלאה.
   3. ברגע שהוא אישר כי העכבר במצב טוב, להחזיר אותו לכלוב המקורי. אל תחזיר אותו לחברה של בעלי חיים אחרים עד שהוא התאושש לחלוטין.
   4. כדי להבטיח כאבים ממושכת ולהימנע כל שרידי כאב שלאחר התערבותית, ניהול תת-עורי בופרנורפין (במינון הסופי של 0.05 מ"ג/ק"ג משקל הגוף) לעכבר כל 12 h פוסט הזרקת אנדוקנה.
   5. בחנו את העכברים 24 שעות לאחר הזרקת קנה הנשימה האנדוליאומיצין ועשו זאת פעמיים ביום. נטר את העכברים למצוקה נשימתית, לירידה במשקל, לחריגות התנהגות ולכל סימן של תחלואה.

3. וריד הזנב של תאי הטבור האנושי מסוניים

1. הכנה לתאים
   הערה: הבידוד, האפיון והטיפוח של תאי סטרומה של מסצ'ימצ'אל מתוך חבל הטבור האנושי המתואר בעבר,^8,9,10. ה-hUC-MSC צריכה להיות מניפולציות ומוחדרת באופן מידי; לכן, בצע את כל השלבים תחת מכסה סטרילי.
   1. הרחיבו את ה-hUC-MSC ב75 ס מ² בקבוקי תרבות לפסקאות מוקדמות (1 – 3 מקסימום).
      הערה: ה-hUC-MSC צריך להיות 70% ביום העירוי שלהם לעכברים.
   2. שטוף את התאים עם 10 מ ל של תמיסת מלח מתכלה סטרילית (PBS) בטמפרטורת החדר.
   3. מוסיפים 2 מ ל טריפסין ומודקות את התאים ב-37 ° c לערך 1 דקות, עד שהם מתחילים להתנתק.
   4. לנטרל את טריפסין על ידי הוספת 8 מ ל של hUC-MSC בינוני מלא המכיל 10% סרום עוברי העובר (FBS).
   5. לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה ב 350 x g עבור 10 דקות.
   6. השהה את הגלולה בתמיסת מלח סטרילית וספור את התאים באמצעות תא בורקר. הכן את התא ההשעיה עבור אינפוזיה על ידי דילול התאים לריכוז הסופי של 2.5 x 10⁵ ב 200 μl של תמיסת מלח סטרילי לכל עכבר. הכינו השעיה תא עודף כדי להבטיח כי יש נפח מספיק עבור החדרת כל העכברים.
   7. השאר את התאים בקרח לפני העירוי. להחדיר בתוך כמה שעות, כמתואר בסעיף 3.3.
2. רדמה
   הערה: כדי למזער את הסיכון של פגיעה בווריד הזנב של העכבר במהלך ההזרקה אסור להזיז את העכבר. לכן הרדמה העדיפו על פני הרחקה עכבר פשוט.
   1. . בחדר האינדוקציה של 4%
   2. לנטר את הנשימה של העכבר. קצב הנשימה יהיה מעט איטי. לאחר כמה דקות, לצבוט אחד הרגליים העכבר כדי לבדוק את ההרדמה הנכונה.
3. אינפוזיה
   1. ברגע שהחוסר הכרה אושר, מניחים את העכבר מתחת למכסה סטרילי עבור העירוי הוורידי של ה-c.
   2. שמירה על הרדמה כללית במהלך הניסוי באמצעות מסכת פנים עם זרימה רציפה של 1.5% isofלוריאן.
   3. כדי לקדם שיער ולאפשר זריקה קלה יותר, להשרות את זנב העכבר במים חמים עבור 2 דקות.
   4. מערבבים את ההשעיה התא על ידי ליטוף בעדינות כדי לוודא כי התאים אינם יוצרים גושים. משף 200 μL לתוך מזרק 1 mL עם מחט של 26 גרם, הימנעות היווצרות בועה.
   5. החזק את זנב העכבר בקצה ויישר אותו בעדינות.
   6. לאתר את הווריד הצדדי של זנב העכבר; בעדינות לגרד אותו עם אזמל ולנגב אותו עם 70% אתנול.
      הערה: גירוד בעדינות של הזנב מבוצע כדי להסיר את השיער, מה שהופך את האתר של הזרקה חלקה ומנקה.
   7. החל מהחלק המרוחק של הזנב, להכניס את המחט לתוך הווריד בזווית 15 ° לאט להחדיר 200 μL של hUC-MSC או מלוחים סטרילי (בקרת רכב) (איור 1B).
   8. מעקב אחר עירוי העירוי המצליח על-ידי הנוזל הנכנס לווריד ללא התנגדות ומחסור בהפרעות. המתן מספר שניות עד שנפח כולו מגיע למטה המחט, ולאחר מכן להסיר אותו מן הווריד.
   9. כדי למנוע דימום, ללחוץ בקצרה על פצע הכניסה עם גזה סטרילית.
   10. להשליך בבטחה את המזרק. ואת המחט לאחר העירוי
4. התאוששות מבעלי חיים
   1. הניחו את העכבר הרווי על צידו על משטח חימום להתאוששות.
   2. לנטר את הנשימה של העכבר ולהתבונן בעכבר עד שהוא מתחיל לנוע ולשוב שכיבה ומודעות מלאה.
   3. ברגע שהוא אישר כי העכבר במצב טוב, להחזיר אותו לכלוב המקורי. אל תחזיר אותו לחברה של בעלי חיים אחרים עד שהוא התאושש לחלוטין.
   4. בחנו את העכברים למשך 24 שעות אחרי עירוי הזנב ובכל יום אחר, כדי לעקוב אחר מצבם הבריאותי ולזהות כל סימן סבל או פתולוגי מוקדם יותר.

4. לחקור ולעבד איברים

1. להקריב את העכברים בימים 8, 14, או 21 לאחר המינהל ליאומיצין (איור 1C) על ידי מנת יתר של הרדמה להזרקה.
2. בלו את קנה הנשימה ואת הריאות. ולשטוף אותם מיד בערוץ הקירור
3. הצמד להקפיא את הריאות הימנית בחנקן נוזלי ואחסן אותם ב-80 ° c עבור ניתוח מולקולרי הבא¹⁰.
4. מנפח את הריאות השמאלית עם 4% פאראמפורמלדהיד ולתקן אותם ב 10% פתרון פורמלין באגירה נייטרלית עבור 24 שעות; אז, מייבשים אותם בסדרת אלכוהול מדורגים, לנקות אותם xylene ולהטביע אותם בתוך פרפין¹⁰.

תוצאות

פגיעה בריאה המושרה על ידי הזרקה אנדוקנה הנשימה יחיד של 1.5 U/ק"ג משקל הגוף של ליאומיצין סולפט ב 100 μL של תמיסת מלח סטרילי. שליטה בעלי חיים קיבל הזרקה אנדוקנה. של נפח שווה של תמיסת מלח שתי יריות של hUC-MSC (2.5 x 10⁵ ב 200 μl של תמיסת מלח סטרילי) הוחדרת לתוך הווריד זנב העכבר, 24 h ו -7 ימים לאחר הממשל ליאומיצין. שליטה בעלי חיים קיבל עירוי ורידי של נפח שווה של תמיסת מלח סטרילית. עכברים הוקרבו בשביל לחקור את הריאות ועיבוד רקמות בימים 8, 14, ו -21 לאחר הממשל ליאומיצין (

דיון

הממשלה הקיימת מהווה מסלול מועדף לאספקת סוכנים אקגניים לריאות. מאז מספר שנים, הזרקה ישירה של ליאומיצין לתוך קנה הנשימה כבר בשימוש נרחב כדי לגרום פיברוזיס הריאות¹³ ו, לאחרונה, יותר מתקדם, טכניקות לא פולשני פותחו כדי להשיג את זה^{14,15 ,16}.

השיטה המתוארת כאן מספקת יתרונות משמעותיים במספר מגבלות פוטנציאליות. הזרקה של קנה הנשימה דורש התערבות כירורגית, לשאת איתו את הפוטנציאל לסיבוכים ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
C57BL/6 עכברים	צ'ארלס ריבר	ג'קס עכברים מלאי מס' 000664
2,2,2-טריברומו-אתנול (אברטין)	סיגמא-אולדריץ'	T48402
Barraquer מחזיק מחט מיקרו	לוטון	62-3755
בלאומיצין סולפט	סיגמא-אולדריץ'	B1141000
Bü מותג rker chamber
צלוחיות תרבות	718905 EuroClone	ET7076
סכיני גילוח חד פעמיים	Unigloves	4080
מלקחיים לניתוח	מכשירים כירורגיים Aesculap	BD311R
DPBS	Gibco	14190-144
כרית חימום	2מכשירים ביולוגיים	557023
Isoflurane Vet	Merial Italia	N01AB06
מיקרוסקופ הפעלה	Carl Zeiss	דגם OPM 16
TrypLE Select Enzyme	Gibco	12563-029
Vannas מיקרו מספריים	Aesculap מכשירים כירורגיים	OC498R
Vicryl Plus 4/0 תפר נספג, מחט FS-2 19 מ"מ	Ethicon	VCP392ZH