Summary
建立了一系列固定化方法, 允许使用最近开发的具有水保留的超薄聚二甲基硅氧烷微流体芯片对活的虫进行定向照射。这种新颖的片上固定也足以进行成像观测。详细说明了该芯片的处理和应用实例。
Abstract
辐射被广泛用于生物应用和离子束育种, 在这些方法中, 微束辐射是识别活生物体中放射性敏感位点的有力手段。本文介绍了为线虫活体个体的靶向微束照射而开发的一系列片上固定方法。值得注意的是, 我们以前开发的聚二甲基硅氧烷 (PDMS) 微流体芯片的治疗方法是在不需要麻醉的情况下固定线虫个体的。这种芯片, 被称为蠕虫片, 是弹性, 允许微流体通道被扩大, 弹性允许动物被轻轻包围。此外, 由于 PDMS 的自吸附能力, 动物可以通过用薄膜覆盖蠕虫片的表面, 在其中不被推入通道进行围护结构, 从而将动物密封在通道中。通过翻拍封面片, 我们可以很容易地收集动物。此外, 蠕虫片显示水的保留, 并允许线虫人在活的条件下进行长时间的微观观察。此外, 板材厚度仅为 300μm, 允许碳离子等重离子穿过封闭动物的片状物, 从而可检测离子粒子并准确测量所施加的辐射剂量。由于用于围住动物的封面膜的选择对成功的长期固定非常重要, 我们对合适的封面片进行了选择, 并在一些电影中展示了推荐的封面电影。作为芯片的应用实例, 我们介绍了动物包围蜗杆片微流体通道的肌肉活动的成像观测, 以及微束照射。这些例子表明, 蠕虫板极大地扩大了生物实验的可能性。
Introduction
辐射, 包括 x 射线、伽马射线和重离子束, 广泛用于生物应用, 如癌症诊断和治疗, 以及离子束育种。目前, 许多研究和技术发展的重点是辐射的影响1、2、3。微束照射是识别生物体中放射性敏感位点的有力手段 4.美国量子与放射科学与技术研究所 (QST-Takasaki) 高崎高级辐射研究所 (QST-Takasaki) 一直在开发一种利用重离子在显微镜下照射单个细胞的技术微束5, 并建立了方法, 使目标微束照射的几个模型动物, 如线虫线虫4,6, 蚕7和oryzias纬度(日本美达卡)8。线虫线虫的靶向微束照射可以有效地击倒特定区域, 如头部区域的神经环, 从而有助于确定这些系统在运动等过程中的作用。
开发了一种不需要麻醉的线虫人片上固定化的方法, 以允许微束照射 4.此外, 为了改进上一项研究4中使用的微流体芯片, 我们最近开发了可湿性、离子渗透、聚二甲基硅氧烷 (PDMS) 微流体芯片, 称为蠕虫片 (见材料表), 用于固定线虫人9。这些包括超薄软片 (厚度 = 300μm; 宽度 = 15 毫米; 长度 = 15 毫米), 表面有多个 (20 或 25) 直微流体通道 (深度 = 70μm; 宽度 = 60μm 或 50μm; 长度 = 8 mm) (图 1a-d)。微流体通道是开放的, 允许多个动物同时被封闭在其中 (图 1e)。这些薄片具有弹性, 可以扩大微流体通道 (约 10%,图 1f), 弹性允许动物轻轻包裹。此外, 由于 PDMS 的自吸附能力, 动物可以通过用薄膜覆盖蠕虫片的表面, 在其中不被推入通道进行围护结构, 从而将动物密封在通道中。通过翻拍封面片, 我们可以很容易地收集动物。
这些通道在被封闭或收集时不会伤害虫子。此外, 板材是由 PDMS, 这基本上是疏水, 但水的保持可以通过赋予亲水性的材料。水的保留性和厚度是蜗杆板的良好特性。保水能力可防止动物在长时间固定后脱水, 并可进行长期观察。
此外, 如前所述, 板材只有300μm 厚, 允许重离子, 如碳离子 (水的范围约为1毫米) 通过片状包围动物。这样就可以检测离子粒子, 准确测量所施加的辐射剂量。此外, 蠕虫板可以重复使用, 因此是经济的。用传统的注射方法, 封闭的动物有时会死亡, 不能被带出通道;他们的蛋也会堵塞频道。这使得芯片无法使用。因此, 芯片基本上是一次性的, 成本效益比率很低。
本文详细介绍了用蠕虫片对活体线虫进行片上固定化的一系列方法。通过对片上固定3小时后动物的运动, 对合适的覆盖膜进行了评价。此外, 我们还展示了用于成像观测和微束照射的片上固定化示例。
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Protocol
1. 应变和维护
- 根据实验目的, 选择合适的线虫和大肠杆菌(食品) 菌株。
注: 在本文件中, 一般使用野生型 N2-10c.线虫 (图 2a), hbr4:3:goeIs3[pmyo: Gcamp3.35: unc-54-3 ' utr, 无 119(+)]V11仅用于成像分析。大肠杆菌op50 被用作线虫的食物。一些体型异常的突变体, 如卷状的 119(e2498) iii 突变体 (图 2b), 也可以封闭在直的微流体通道中 (图 2c)。 - 如前所述, 在含有10毫升线虫生长介质 (ngm) 的6厘米 petri 培养皿上保持在20°c 时的线虫, 并在夜间孵育 (37°c)大肠杆菌中传播.如有可能, 使胚胎阶段的线虫发育阶段同步。
- 使用喂养良好的成年动物, 孵化后大约 3-4天, 宽度约为 50-60μm, 最适合蠕虫板中微流体通道的大小。
2. 片上固定缓冲液的选择
- 对于可湿性蠕虫板, 请根据实验目的使用任何缓冲液。
注: 以前已经定义了 PDMS 微流体芯片上的片上固定的合适缓冲溶液,以下缓冲溶液被证明对固定后动物的运动没有影响: s 基部缓冲液溶液 (气单丁基5.85 克, 胆固醇1毫升 (乙醇中 5 mgml), 1 m 磷酸6.0 钾的50毫升, H2o 至1升消毒)10含有大量的氯化钠、mL 磷酸盐缓冲液 (5 克氯化钠, 3 克 kh2po 4, 6 g na 2 hpo4, 1 毫升 1 mgso4, h2o 至 1l;清洗缓冲液 10, 洗涤缓冲液 (5 毫升 1 m ph 6.0 磷酸钾, 1 毫升1毫升的1毫升 CaCl 2, 1 ml 的1 m mgso 4, 0.5 g pf 明胶,h2o 至1升; 高压灭菌)12含有明胶和超纯水9。本文通常采用洗涤缓冲液, 而 S 基部缓冲液仅用于第3节中不同覆盖膜的片上固定评价。 - 对于没有润湿性的传统微流体芯片, 请使用洗涤缓冲液, 该溶液提供了保持芯片微流体通道水分的最有效手段, 从而防止线虫个体的干燥 (无论微流体芯片的润湿性如何)。
3. 选择合适的片上固定膜
- 准备不同的封面电影, 如下所示。基于易于操作, 将以下透明、生物相容性的盖膜切割成合适的尺寸 (即宽度为 10-15 mm, 长度为 30-50mm): 130-170μm 厚的盖板玻璃、125μm 厚的聚酯 (pet) 薄膜和 ~ 130μm 厚的聚苯乙烯 (ps)电影。
- 使用不同的封面片进行3小时的片上固定, 如下所示。根据步骤 4.1-4.6, 分别使用每个覆盖膜将≥10洗成人动物 (孵化后 3.5天), 并离开3小时。
- 为便于比较, 允许3小时的自由移动, 如下所示。地方≥10洗成动物在一个3.5 厘米的板含有3毫升新鲜的 NGM, 盖盖盖盖子, 并离开3小时。
- 根据步骤 5.1-5.3, 在芯片上固定3小时后立即收集动物。从蠕虫片中取出盖膜, 并向每个动物添加一滴缓冲液。用排板采摘器在液滴中游泳的动物, 并将它们转移到一个3.5 厘米长的盘子里, 里面含有3毫升新鲜的 NGM, 没有食物 (检测板)。
- 在自由移动3小时后收集动物。向每个动物添加一滴缓冲液。拿起在 NGM 板上的液滴中游泳的动物, 并使用铂皮采摘器将它们转移到检测板上。
- 评价覆盖膜对运动力的影响 (运动分析)。
- 转移到检测板后至少 5分钟, 在显微镜13下手动计数 "身体弯曲" (定义为前体区域在20秒间隔内的弯曲数)。
- 对每部封面膜进行五次独立的运动检测。
注: 在代表性结果中显示的实验中, 对每个同时封闭多个动物的实验评估了10只动物, 而在上一项研究13中只计算了5只动物。 - 计算每个实验每个组的10只动物的平均身体弯曲次数。然后从五个独立实验中平均值, 以评估片上固定化的效果。使用电子表格软件中的单向方差分析 (ANOVA) 测试对数据进行统计分析, 显著性水平为0.01 和0.05。
注: 在这些实验的基础上, 认为高氧渗透率的 PS 盖膜是合适的 (参见代表性结果)。这些 PS 薄膜包含在蠕虫片中。PET 薄膜, 具有低氧渗透性, 被认为是不合适的, 因为动物往往窒息, 如果覆盖在长期固定在蠕虫板上。同样重要的是, 封面电影在一系列程序中不会破裂;因此玻璃盖子也是不合适的 (参见代表性结果)。
4. 片上固定
注: 应佩戴一次性无菌手套, 以避免污染蠕虫板。
- 将没有自荧光的 PS 或玻璃覆盖膜等薄薄的透明片放在实验台或显微镜下的舞台上, 用作底膜。使用平板推拿轻轻地将蠕虫片轻轻地放在底盖膜上。
注: 除了具有60μm 宽微流体通道的蠕虫片 (适合孵化后3-4天的成人) 外, 还可以使用具有50μm 宽通道的蠕虫片 (适合孵化后3天的年轻成年人和成人阶段小身体的突变体)。根据要使用的动物的大小选择合适的工作表。 - 要收集动物, 用铂皮采摘器从立体显微镜下的培养板上取出一个个体的成年线虫。如果需要多个动物, 请重复此过程。
- 清洗动物以去除食物 (细菌)。
- 在6厘米未经处理 (防水) 的培养皿表面放置至少三个液滴 (5μl 滴)。
- 使用排板器将动物转移到液滴中, 让它们通过游泳去除任何食物。用两个单独的液滴清洗两次, 然后用另一个液滴冲洗动物。
注: 有必要练习此过程, 以便能够在进行任何实验之前快速执行此过程。
- 将2-3 微米的缓冲液滴入蜗杆板表面。从培养皿上的液滴中取出洗过的动物, 转移到虫板上的液滴。
- 将动物封闭在微流体通道中。使用平面推拿器将 ps 盖膜放在蜗片上, 然后轻轻按在通道上, 从片的一端到另一端, 以保持湿度 (如前面所述的 4,9)。
注: 动物随机封闭在通道中。含有动物的液滴通过覆盖工作表在蠕虫片上传播, 导致液滴在多个通道上广泛延伸。每一种动物都可以封闭在这些通道中的任何一个。关于使用芯片上固定化的蠕虫片的重要一点是, 在广泛的范围内可以使用多个通道。 - 在微流体通道中封闭动物后, 立即通过检查头部在显微镜下的运动 (例如, 1x 或2倍放大倍率) 来确认它们是活的。
- 记录动物的位置, 同时执行步骤 4.6, 并在一张专用的纸上注明以下内容 (补充文件 1): 动物封闭通道的数量;每只动物在通道中的位置 (左/中/右);和头部的方向。
- 画一个箭头来标记每个动物在通道中的位置, 箭头的方向与动物的头部相对应。
注: 通道号 (例如, 1、5、10、15、20、25) 刻在微流体通道左右的蠕虫片表面 (图 1b)。专用板材上的这些信息可以快速定位动物, 使过程更加高效, 还有助于防止后续步骤中的辐射泄漏。
5. 从蠕虫页上收集动物
- 固定后, 立即使用扁平的推子从蠕虫片中取出覆盖膜。
- 将10-15μl 缓冲液滴入包围动物的微流体通道上, 观察动物在立体显微镜下开始在液滴中游动。
注意: 动物开始在新的液滴游泳自己没有任何额外的压力, 帮助, 或推动。只要在上面掉一些缓冲就足以让它们游出海峡。如果动物在步骤7.9 中受到辐射的严重损害, 或者在第 4.2-4.5 步的固定过程中受到严重损害, 则可能无法在液滴中游泳, 尽管这种情况很少见。此外, 如果动物在取出时仍附着在封面膜上, 则将液滴添加到封面膜上, 而不是进入频道。 - 用排板采摘器将在液滴中游泳的动物取出, 并将它们放在检测板上。
6. 蠕虫片在成像观测中的应用
注: 蠕虫片可以广泛用于微观观察。该芯片可以保留水分, 不影响个体在芯片上固定3小时后的动力。此外, 芯片本身没有自荧光, 适用于荧光成像检测。下面给出了荧光成像分析的样本应用。
- 选择荧光显微镜, 并将数码相机或数码摄像机安装在显微镜上, 分别捕获图像或视频 (图 3a)。
注: 根据物镜规格的不同, 显微镜的工作距离 (wd) 超过 0.2 mm (参见图 3b, c)。本文所使用的荧光显微镜系统的规格见材料表. 但是, 该规范并不局限于我们的示例, 因为它取决于观察或用户的目的。 - 选择任何荧光菌株的线虫, 并保持如第1节所述。
注: 如果有必要观察体壁肌肉收缩 (见代表性结果), 使用年轻成人 HBR411 c.线虫, 其中一个记者基因是用来表达钙指标 GCaMP3.35 在所有身体壁肌肉细胞。重要的是要使用年轻的成年人 (≤孵化后 3天) 比微流体通道 (50 或 60μm) 的宽度的蠕虫。间隙较小意味着动物可以稍微弯曲, 从而可以使用钙离子指示器观察爬行过程中的肌肉收缩和伸展。 - 根据第4节的固定程序对动物进行围护结构。
- 使用荧光显微镜观察动物的荧光斑点 (例如, 绿色荧光蛋白标记菌株), 并使用安装在显微镜上的数码相机捕捉图像。
注: 遵循先前确定的方法14,15,16, 因为显微镜观察方法 (包括荧光观察) 和显微镜系统的规格取决于观察的目的。 - 图像钙离子波传播使用视频采集来观察动态活动, 如身体壁肌肉收缩和扩展在 HBR4 蠕虫 (视频 1)。
7. 蜗杆板在微束辐照中的应用
注: 准直微束辐照系统5可使用几个重离子粒子加速从偶氮变场回旋加速器安装在高崎离子加速器的高级辐射应用 (tiara) 设施QST-Takasaki (图 4a)。梁出口下有一个自动照射阶段 (图 4b)。该系统对线虫进行重离子微束辐照的步骤如下。
- 找到在为微梁辐照设施定制的铝框上包围多个动物的蜗杆板, 并将其设置在自动辐照阶段 (图 4c)。
- 将辐照样品 (即包裹在框架上的蠕虫片中的动物) 从位于自动阶段下的显微镜下的光束出口 (~ 2 毫米) 立即提升到光束出口下方 (图 4d)。
- 垂直定位后, 使用定制的软件对动物和细胞培养物进行有针对性的照射, 用微束照射定位每个动物。要定位包含在微流体通道中的每只动物, 请参阅步骤 4.7-4.8 中描述的专用片 (请参阅补充文件 1), 并确认通道左侧和右侧附近的通道号。
- 使用远程控制系统和使用辐照软件操作的激光鼠标, 控制 x 和 y 方向中的自动阶段, 将动物放置在光束出口下方。
- 通过从位于样品自动阶段下的显微镜观察投影, 并将光标移动到要瞄准的动物的辐照位置, 对辐射区域进行粗略调整。
- 粗略定位后, 离开并关闭照射室, 移动到相邻的控制室, 以避免对操作人员进行照射。
- 使用链接到离子计数器系统的控制台, 为一个辐照过程设置所需的离子粒子数, 对应于动物特定区域的辐照。
注: 这包括一个塑料闪烁器和一个光电子倍增器在准直微束辐照系统。 - 从辐照控制室, 根据位于自动阶段下的显微镜的显示器图像微调动物的位置, 这与辐射室监控器上投射的图像相同 (图 4e)。
- 通过单击软件的辐照按钮来瞄准微束辐照。
注: 在图 4f所示的示例中, 我们针对头部区域中的咽部, 并使用适当数量的微束碳离子进行辐照。由于通过样品的离子粒子数量是使用链接到控制台和辐照软件的离子计数器系统进行计数的, 因此在交付所需数量的离子粒子后, 将停止辐照。 - 找到专用片上记录的每一种动物, 对每只动物进行有针对性的辐射。重复步骤7.8 和 7.9, 直到所有动物都受到辐照。
- 照射后, 立即进入照射室, 降低自动照射阶段。删除位于自动舞台上的定制框架上的示例。
- 按照步骤 5.1-5.3 中的说明收集动物。
- 根据研究目的, 进行必要的行为和分子分析, 以评估目标辐射的效果。
注: 步骤3.6 中描述的运动分析是评估辐射对运动的影响 4,9的有效方法。
8. 虫板的反复使用处理
注: 蠕虫片可以重复使用至少10乘以9 , 没有对动物的不利影响, 如果正确清洗和消毒后, 如下所示。
-
清洗
- 将使用过的蠕虫片放在6厘米的培养皿上, 将约100μl 的灭菌超纯水滴到整个片上。
- 用戴手套的手指将床单表面的水倒进, 以洗掉灰尘、细菌食物和在渠道中放置的任何鸡蛋等污垢。
- 使用一次性擦拭彻底擦拭蠕虫片上的水分。
-
灭菌
- 将约5毫升的70% 乙醇注入含有虫板的培养皿中, 并用戴手套的手指将其表面划掉, 以洗掉污垢。
-
干燥
- 从充满70% 乙醇的培养皿中取出芯片, 并允许自然干燥。
-
存储
- 干燥后, 将蠕虫片放在无菌培养皿上并覆盖。板材也可以储存在一个无菌的培养皿中, 里面装满了70% 的乙醇。
注: 最好在使用后处理封面膜, 但如果要重新使用, 请按照对蠕虫片的要求进行清洁。然而, 如果使用后在封面膜上产生褶皱, 它将不再粘附在芯片上, 导致动物脱水, 因此应该更换。
- 干燥后, 将蠕虫片放在无菌培养皿上并覆盖。板材也可以储存在一个无菌的培养皿中, 里面装满了70% 的乙醇。
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Representative Results
活性的线虫个体可以使用超薄、可湿 PDMS、微流体芯片 (蜗杆片) 成功固定化。我们研究了不同盖膜密封蜗杆片的适用性, 如协议第3节所述。为了评估覆盖膜的密封效果, 我们分别使用盖板玻璃 (厚度: 130-170μm)、PET 薄膜 (厚度: 125μm) 和 PS 膜 (厚度约 130μm) 确定了片上固定3小时后动物的运动力。如图 5所示, 允许自由移动3小时的控制动物和用 ps 膜封闭在蠕虫片中的动物之间的运动 (身体弯曲) 没有显著差异。相比之下, 封闭在盖板玻璃下的动物的动力明显减少。一些动物似乎已经干涸, 这表明盖玻璃排斥液滴, 防止紧密密封, 并允许动物部分干涸, 导致动力降低。使用 PET 薄膜包裹的动物的运动力也显著降低;虽然没有观察到干燥, 但动物的运动力趋于均匀下降, 表明低氧传播率 (~ 30 mL/[24 h·m²·MPa]), 比 PS 低100倍左右, 导致动物窒息。这些结果表明, PS 覆盖膜应用于将动物包裹在蠕虫片中。
我们还将蜗杆技术应用于成像观测和进行区域特定的微束照射。片上固定使用的蜗杆板具有保水和无自荧光, 适用于活体条件下的显微观察。例如, 我们将该技术应用于线虫的 HBR4 菌株11 , 其中一个报告基因表达了所有体壁肌肉细胞中的钙指标 GCaMP3.35。我们观察了年轻成年动物在孵化后3天的所有体壁肌肉细胞的活动, 这些细胞在虫板上有50μm 宽的微流体通道, 使动物的空间稍有弯曲。HBR4 菌株中的 GCaMP3.35 信号强度对应于体壁肌肉细胞的收缩。与肌肉活动相对应的 Ca2 +波传播被清晰地观察到 (视频 1)。此外, 我们还证实了蠕虫片没有自荧光, 如视频 1的最后阶段 (最后一个 ~ 10秒) 所示。这样, 由于不需要麻醉, 可以在活体条件下观察肌肉细胞的生理活动。
此外, 我们还将蜗片应用于线虫个体的区域特异性微束照射。蠕虫片上的多个直的微流体通道允许多个动物同时固定, 无需麻醉, 从而允许在短时间内 (30分钟20分) 对≥20种动物进行连续照射 (足以进行一组检测)个人)。
图 1: 蠕虫页的示意图.(a) 一个蠕虫板的概述与美国1% 硬币为标度。蜗杆厚度为 300μm, 宽15毫米, 长15毫米。(b) 蜗杆页的表面含有25个直的微流体通道 (深度 = 70μm; 宽度 = 60 微米; 长度 = 8 毫米)。(c) 由底盖膜、蜗杆片和盖膜组成的样品示意图。(d) 蜗杆是由 PDMS 制成的柔软超薄薄板, 可通过平板推针弯曲。(e) 封闭在多个通道中的多种动物的例子。(f) 通过使用铂选择器推动扩展微流体通道。通道的弹性使动物被轻轻包围。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2:线虫的身体形态.(a) NGM 板上的野生 (n2)线虫。(b) NGM 板上形状异常的未 119突变体。(c) 封闭在蠕虫片微流体通道中的无 119突变体。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3: 蠕虫板所封闭的活线虫个体显微镜观察原理图.(a) 用于成像观测的立体显微镜系统示意图。(b) 包裹活线虫个体的蠕虫片的显微镜观察示意图. (c) 在显微镜舞台上放置的虫板的分段视图, 其中包围了活的线虫个体。w. d. 表示显微镜的工作距离。请点击这里查看此图的较大版本.
图 4: Qst-takasasaki 准直微束系统原理图和活线虫人的靶向微束辐照程序.(a) 准直微束辐照系统5的概述, 该系统可以使用从安装在 QST-Takasaki tiara 上的方位变场回旋加速器加速的几种重离子粒子。(b) 光束出口和辐照自动阶段概述。(c) 准直微梁系统自动阶段的样品设置。(d) 在辐照室进行的辐照样品的垂直定位。(e) 对辐照控制室内的照射区域进行微调。(f) 活线虫的靶向微束照射。咽部被点击为目标位置, 并通过按下辐照按钮进行照射。请点击这里查看此图的较大版本.
图 5: 使用盖板玻璃、聚酯 (pet) 薄膜和聚苯乙烯 (ps) 薄膜进行片上固定后的电.条形图表示动物在片上固定3小时后或在 NGM 板上自由运动3小时后的平均身体弯曲 (对照)。对10种动物进行了检查, 并对每组动物的身体弯曲进行了平均检查。最后, 对每组五个独立实验的数据进行了平均。误差条表示五个独立实验均值的标准误差。所有数据均采用单向方差分析, 在 0.05 (*) 或 0.01 (* *) 显著性水平上进行了分析。请点击这里查看此图的较大版本.
视频 1: 肌活动的影像学观察实例 在虫板上的线虫.在 HBR4线虫中, 与壁肌细胞在爬行过程中的收缩相对应的钙离子波传播。在明亮场光照下观察到最后 ~ 10秒。请点击这里观看此视频。(右键单击下载.
补充文件 1: 专用纸 (微束辐照版) 的示例.绘制一个箭头, 指示每个动物在通道中的位置。箭头的方向对应于头部。请点击此处下载此文件.
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Discussion
在带电条件下, 使用可湿性 PDMS 微流体芯片对线虫进行片上固定, 使多种动物能够有效地进行有针对性的微束照射。易于操作和防止干燥的特点使该系统不仅适用于微束照射, 而且适用于几种行为检测。这些蠕虫单已经商业化, 可以很容易地获得。传统的微流体芯片, 如嗅觉芯片, 与诸如在封闭的微流体通道中堵塞动物和鸡蛋等问题有关, 使它们难以采集动物, 因此, 这种芯片往往是一次性的, 因此,增加了成本。相比之下, 目前虫板中的微流体通道是开放的, 使收集动物变得更加容易。因此, 这些蠕虫片可以反复使用, 使其更经济。
pdms 微流体芯片的最新技术创新显示出结构复杂性和多功能的增加趋势 16、18、19、20、21、 22,23。然而, 我们认为, 重要的是要使系统简单和易于使用。事实上, 与使用传统的大型微流体芯片19,20,21,22, 23, 需要连接真空泵, 小尺寸蠕虫板的简单设计使程序能够在有限的空间内轻松执行。
蠕虫板的保水性能使人们能够进行长期观测。此外, 片状的厚度允许离子粒子通过样品, 从而使目标辐射能够应用于具有精确离子粒子数量的活线虫个体。蠕虫片的这些优点极大地扩大了生物实验的可能性。
我们认为, 生物学家必须开发新的设备和方法, 以提高其实验和分析的效率。蜗杆片和微束辐照软件的开发考虑到了这一目标, 并有可能为未来创新实验的成功做出贡献, 超越其最初的目标。
据我们所知, 我们的团队是全球第一个开发这项技术的公司。然而, 今后其标准化使用将有助于在活体条件下对动物进行有针对性的微束照射, 从而有助于确定特定细胞组织在内部过程中的作用。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者感谢 Atsushi Higashitani 博士就线虫和 Yuya hari 博士、Yasuhiko Yokota 和 Kobayashi 康彦的治疗提出的善意建议, 并进行了宝贵的讨论。作者感谢 Caenorhabditis 遗传中心提供了线虫和大肠杆菌菌株。我们感谢 QST-Takasaki 的 TIARA 回旋加速器的机组人员对辐照实验的善意帮助。我们感谢苏珊·弗尼斯博士编辑了这份手稿的草稿。这项研究得到了从 JPS 到 m. s. 的 KAKENHI (赠款号码 JAK15K11921 和 J18K1839) 的部分支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C. elegans wild-type strain | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) , Minnesota, USA | N2 | Wild-type C. elegans strain generally used in this study |
| C. elegans unc-119(e2498) III mutant strain | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) , Minnesota, USA | CB4845 | C. elegans strain only employed as an example of mutants with abnormal body shape |
| C. elegans transgenic strain HBR4 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) , Minnesota, USA | HBR4 | The genotype of this transgenic C. elegans strain is HBR4:goeIs3[pmyo-3::GCamP3.35:: unc-54–3’utr, unc-119(+)]V. This strain was only employed for imaging observation. |
| E. coli strain | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) , Minnesota, USA | OP50 | E. coli strain used as food for C. elegans |
| Worm Sheet IR (50/60) | Biocosm, Inc., Hyogo, Japan | BCM17-0001 | Microfluidic chip with 25 straight 50/60-µm width channels used in all experiments and observation in this paper |
| Worm Sheet 60 | Biocosm, Inc., Hyogo, Japan | BCM18-0001 | Microfluidic chip with 20 straight 60 µm-width channels. This is sitable for adults 3-5 days after hatching at 20°C. |
| Worm Sheet 50 | Biocosm, Inc., Hyogo, Japan | BCM18-0002 | Microfluidic chip with 20 straight 50 µm-width channels. This is sitable for youg adults ~3 days after hatching at 20°C. |
| MICRO COVER GLASS | MATSUNAMI GLASS IND. LTD. | C030401 | Cover glass (thickness: 130-170 µm) used in locomotion assays in Protocol 3 |
| Polystyrene Film | Biocosm, Inc., Hyogo, Japan | BCM18-0001/ BCM18-0002 | Bundled items of Worm Sheets. PS filim (thickness: ~130 µm) used in locomotion assays in Protocol 3. |
| Polyester Film Lumirror | TORAY INDUSTRIES, INC., Tokyo, Japan | Lumirror T60 (t 125 µm) | PET filim (thickness: 125 µm) used in locomotion assays in Protocol 3 |
| IWAKI 60 mm/non-treated dish | AGC Techno Glass Co., Ltd., Shizuoka, Japan). | 1010-060 | Non-treated dish used in incuvation of C. elegans in Protocol 1 |
| IWAKI 35 mm/non-treated dish | AGC Techno Glass Co., Ltd., Shizuoka, Japan). | 1010-035 | Non-treated dish used in locomotion assays in Protocol 3 |
| Milli-Q | Merck, France | Ultrapure water | |
| Kimwipe S-200 | Nippon Paper Crecia Co., Ltd., Tokyo, Japan | 62020 | 120 mm x 215 mm; 200 sheets/ box |
| WormStuff Worm Pick | Genesee Scientific Corporation, CA, USA) | 59-AWP | Platina picker specilized for picking up C. elegans |
| Research Stereo Microscope System | OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Japan | SZX16 | Micriscope used in all experiments and observation in this paper |
| Motorized Focus Stand for SZX16 | OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Japan | SZX2-ILLB | This was used for bright field observation in Protocol 3-8. |
| Objective Lens (×1) | OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Japan | SDFPLAPO1×PF | NA: 0.15; W.D.: 60 mm. This lends was used for bright field observation in Protocol 3-8. |
| Objective Lens (×2) | OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Japan | SDFPLAPO2XPFC | NA: 0.3; W.D.: 20 mm. This lends was used for imaging observations. |
| Mercury Light Source | OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Japan | U-LH100HG | The broad emission spectrum enables a range of fluorescence imaging experiments to be conducted using all common fluorophores. |
| SZX16 Fluorescent filter unit (High performance for YFP) | OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Japan | SZX2-FYFPHQ | Ex: 490-500 nm; Em: 510-560. This was used for imaging observation of HBR4 strain. |
| Digital Camera High Speed EXILIM | CASIO COMPUTER Co., Ltd, Tokyo, Japan | EX-F1 Figure 1B, 1E, 1F, Figure 2A-C, and Video 1 were obtained by using this digital camera. | |
| Office 2013 | Microsoft Co. Ltd, Redmond, WA, USA | EXCEL Software used for statistical analyses |
References
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