Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Immobilisatie van levende Caenorhabditis elegans personen een Ultra-thin Polydimethylsiloxaan Microfluidic Chip met waterretentie

Published: March 19, 2019 doi: 10.3791/59008
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Radiation-Applied Biology Research, Takasaki Advanced Radiation Research Institute, National Institutes for Quantum and Radiological Science and Technology (QST-Takasaki)

Summary

Een reeks van immobilisatie methoden is vastgesteld dat de gerichte bestraling van levende Caenorhabditis elegans individuen met behulp van een onlangs ontwikkelde ultradunne Polydimethylsiloxaan microfluidic chip met waterretentie. Deze roman op de chip immobilisatie is ook geschikt voor imaging opmerkingen. De gedetailleerde behandeling en toepassingsvoorbeelden van de chip worden toegelicht.

Abstract

Straling wordt veel gebruikt voor biologische toepassingen en voor de ion-beam fokkerij, en onder deze methoden, microbeam bestraling vertegenwoordigt een krachtig instrument om radiosensitive sites in levende organismen te identificeren. Dit witboek beschrijft een aantal op-Spaander immobilisatie methoden ontwikkeld voor de gerichte microbeam doorstraling van levende individuen van Caenorhabditis elegans. Met name de behandeling van de Polydimethylsiloxaan (PDMS) microfluidic chips die we eerder ontwikkeld om te immobiliseren C. elegans individuen zonder de noodzaak voor verdoving wordt uitgelegd in detail. Deze chip, een worm blad, hierna is veerkrachtig om de kanalen van de microfluidic worden uitgebreid en de elasticiteit laat dieren voorzichtig worden gehuld. Ook, als gevolg van de capaciteit van de zelfstandige adsorptie van het PDMS, dieren kunnen worden afgesloten in de kanalen door die betrekking hebben op het oppervlak van de worm blad met een dunne dekking-film, waarin dieren niet in de kanalen voor behuizing duwde zijn. Door draaien de cover film over, kunnen we gemakkelijk de dieren verzamelen. Bovendien, het blad van de worm toont waterretentie en kan C. elegans personen onderworpen aan microscopische observatie gedurende lange perioden live omstandigheden. Bovendien, is het blad slechts 300 µm dik, waardoor zware ionen zoals koolstof ionen aan het passeren van het blad bijvoeging van de dieren, waardoor de ion deeltjes worden gedetecteerd en de toegepaste stralingsdosis te nauwkeurig worden gemeten. Omdat de selectie van de dekking films gebruikt voor bijvoeging van de dieren is erg belangrijk voor een succesvolle langdurige immobilisatie, we uitgevoerd van de selectie van de geschikte dekking films en toonde een aanbevolen één onder sommige films. Als een voorbeeld van de toepassing van de chip introduceerden we imaging observatie van gespierde activiteiten van dieren bijvoeging van het kanaal van de microfluidic van het blad van de worm, evenals dedoorstraling van microbeam. Deze voorbeelden geven aan dat de worm bladen hebben breidde de mogelijkheden voor biologische experimenten.

Introduction

Straling, met inbegrip van x-stralen, gamma stralen en zware-ion beam, wordt veel gebruikt voor biologische toepassingen zoals in diagnose en behandeling, en voor de ion-beam fokkerij. Talloze studies en technische ontwikkelingen zijn momenteel gericht op de gevolgen van straling1,2,3. Bestraling van de Microbeam is een krachtig instrument van identificatie van de radiosensitive sites in levende organismen4. De Takasaki geavanceerde straling Instituut voor nationale onderzoeksinstituten voor Quantum en radiologische wetenschap en technologie (QST-Takasaki) heeft het ontwikkelen van een technologie om te bestralen van afzonderlijke cellen onder microscopische observatie met behulp van zware-ion microbeams5, en heeft gevestigde methoden om te schakelen van gerichte microbeam bestraling van verschillende model dieren, zoals de nematode Caenorhabditis elegans4,6, zijderupsen7en Oryzias latipes (Japanese medaka)8. Gerichte microbeam bestraling van de nematode C. elegans kunt de effectieve knockdown voor specifieke regio's, zoals de ring van de zenuw in de hoofd regio, waardoor om de rollen van deze systemen in processen zoals motoriek te identificeren.

Een methode voor op de chip immobilisatie van C. elegans individuen zonder de noodzaak voor anesthesie is ontwikkeld om te voorzien in microbeam bestraling4. Bovendien, ter verbetering van microfluidic chips gebruikt in de vorige studie4, hebben we onlangs ontwikkeld spuitpoeders, ion-penetrable, Polydimethylsiloxaan (PDMS) microfluidic chips, hierna aangeduid als worm platen (Zie Tabel of Materials), voor immobilizing C. elegans individuen9. Deze omvatten van ultra dunne zachte platen (dikte = 300 µm; breedte = 15 mm; lengte = 15 mm) met meerdere kanalen voor (20 of 25) rechte microfluidic (diepte = 70 µm; breedte = 60 µm of 50 µm; lengte = 8 mm) aan het oppervlak (Figuur 1A-D). De microfluidic kanalen staan open en toestaan dat meerdere dieren tegelijk erin worden gevoegd (Figuur 1E). De bladen zijn veerkrachtig aan het toestaan van de microfluidic kanalen worden uitgebreid (met ~ 10%, Figuur 1F) en de elasticiteit kan dieren voorzichtig worden gehuld. Ook, als gevolg van de capaciteit van de zelfstandige adsorptie van het PDMS, dieren kunnen worden afgesloten in de kanalen door die betrekking hebben op het oppervlak van de worm blad met een dunne dekking-film, waarin dieren niet in de kanalen voor behuizing duwde zijn. Door draaien de cover film over, kunnen we gemakkelijk de dieren verzamelen.

De kanalen doen de wormen niet kwetsen wanneer ze zijn worden omsloten door of wanneer ze verzameld worden. Bovendien, de bladen zijn gemaakt van PDMS, die in wezen hydrofobe, maar vasthouden van water kan worden bereikt door het meegeven van hydrophilicity aan het materiaal. De waterretentie en de dikte zijn gunstige kenmerken van de bladen van de worm. De waterretentie capaciteit voorkomt uitdroging van de dieren na langdurige immobilisatie en kan op lange termijn observaties uit te voeren.

Bovendien, zoals eerder is beschreven9, zijn de bladen slechts 300 µm dik, waardoor zware ionen zoals koolstof ionen (met een bereik van ongeveer 1 mm in water) passeren het blad bijvoeging van de dieren. Hierdoor is de ion deeltjes worden gedetecteerd en de toegepaste stralingsdosis te nauwkeurig worden gemeten. Bovendien is de worm bladen kunnen worden hergebruikt en zijn dus zuinig. Met de methode van de conventionele injectie, de dieren omsloten zijn soms dood en ze kunnen niet worden genomen uit het kanaal; hun eieren kunnen ook verstopt de kanalen. Dit maakt de chip onbruikbaar. Chips zijn, dus in principe wegwerp en de kosten-baten verhouding is slecht.

In het huidige document, we beschrijven in detail een aantal methoden voor het op de chip immobilisatie van levende C. elegans individuen met behulp van worm sheets. We geëvalueerd via motoriek testen van dieren 3 h na immobilisatie op de chip, de film geschikt dekking. Daarnaast, toonden we de voorbeelden van op-Spaander immobilisatie voor zowel imaging opmerkingen en microbeam bestraling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. de stammen en onderhoud

  1. Selecteer een geschikte stam van C. elegans en Escherichia coli (voedsel) afhankelijk van het doel van het experiment.
    Opmerking: In het huidige document, wild-type N210C. elegans (Figuur 2)wordt in het algemeen, en HBR4:goeIs3 [pmyo-3::GCamP3.35::unc-54 - 3' utr, unc-119(+)] V11 wordt alleen gebruikt voor imaging-assay. E. coli OP50 werd gebruikt als voedsel voor C. elegans. Sommige mutanten met abnormale lichaamsvorm, zoals de unc-119(e2498) III -mutant met een opgerolde vorm (Figuur 2,B), ook kunnen worden omgeven door de kanalen van de rechte microfluidic (Figuur 2C).
  2. Handhaven van de C. elegans bij 20 ° C op 6 cm petrischalen met 10 mL nematode groeimedium (NGM) verspreid met overnachting-bebroede (37 ° C) E. coli zoals eerder beschreven van10. Indien mogelijk, synchroniseren de ontwikkelingsstadia van C. elegans uit het werkgebied van het embryo.
  3. Gebruik goed gevoed volwassen dieren, ongeveer 3-4 dagen na het uitkomen met een breedte van ongeveer 50-60 µm, die optimaal geschikt zijn voor de grootte van de microfluidic kanalen in de bladen van de worm.

2. selectie van de bufferoplossing voor op de chip immobilisatie

  1. Gebruik voor bevochtigbaar worm bladen, een bufferoplossing afhankelijk van het doel van de experimenten.
    Opmerking: Geschikte bufferoplossingen voor op de chip immobilisatie op PDMS microfluidic chips zijn gedefinieerd eerder9 en de volgende bufferoplossingen bleken te hebben geen effect op de motiliteit van de dieren na immobilisatie: S basale buffer oplossing (5.85 g NaCl, 1 mL van cholesterol (5 mg/mL in ethanol), 50 mL van de 1 M pH 6.0 kalium fosfaat, H2O tot 1 L; gesteriliseerd met autoclaaf)10 met een grote hoeveelheid NaCl, M9 fosfaatbuffer (5 g NaCl , KH2PO43 g 6 g nb2HPO4, 1 mL van de 1 M MgSO4, H2O tot 1 L; gesteriliseerd met autoclaaf)10, wassen bufferoplossing (5 mL 1 M pH 6.0 kalium fosfaat, 1 mL CaCl, 1 M2, 1 mL van de 1 M MgSO4, 0,5 g pf gelatine, H2O tot 1 L; gesteriliseerd met autoclaaf)12 met gelatine , en ultrazuiver water9. Wassen-bufferoplossing wordt meestal gebruikt in de huidige papier, en S basale bufferoplossing wordt alleen gebruikt voor de evaluatie van de op de chip immobilisatie met verschillende cover films in de sectie 3.
  2. Voor conventionele microfluidic chips zonder bevochtigbaarheid, gebruiken een bufferoplossing wassen, die levert de meest doeltreffende middelen voor het behoud van vocht in de kanalen van de microfluidic van de chip en dus voorkomt dat drogen van C. elegans individuen ( ongeacht de spuitbaarheid van de microfluidic-chips).

3. selectie van geschikte dekking film voor op de chip immobilisatie

  1. Verschillende cover films als volgt voorbereiden. Gebaseerd op het gebruiksgemak, knip het volgende transparant, biocompatibel cover films naar een geschikte grootte (d.w.z., breedte van 10-15 mm en een lengte van 30-50 mm): 130-170 µm dik cover glas 125 µm dik polyester (PET) film en ~ 130 µm dik polystyreen (PS) film.
  2. Voeren 3 h op de chip immobilisatie met verschillende cover films als volgt. Gebaseerd op stappen 4.1-4.6, omsluiten ≥10 volwassen dieren (3,5 dagen na het uitkomen) in het blad van de worm gebruik van elke omslag film, respectievelijk gewassen, en laat gedurende 3 uur.
  3. Voor vergelijkingsdoeleinden, toestaan 3 h van het vrije verkeer als volgt. Plaats ≥10 gewassen volwassen dieren op een plaat van de 3,5 cm met 3 mL verse NGM, dek af met een deksel en laat gedurende 3 uur.
  4. Verzamel dieren onmiddellijk na 3 uur voor op de chip immobilisatie volgens stappen 5.1-5.3. Verwijder de folie van de cover van het blad van de worm en voeg een druppel bufferoplossing aan elk dier. Dieren die zwemmen in de druppel met behulp van een platina-picker halen en deze overbrengen naar een 3,5 cm plaat met 3 mL verse NGM zonder voedsel (assay plaat).
  5. Verzamel dieren na 3 uur van vrij verkeer. Een daling van de bufferoplossing toevoegen aan elk dier. Dieren die zwemmen in de druppel op de plaat NGM halen en deze overbrengen naar een assay plaat met behulp van een platina-picker.
  6. Evalueren van de effecten van dekking film op motiliteit (motoriek assay).
    1. Minstens 5 min na overdracht aan de assay plaat, graaf ' body bochten (omschreven als het aantal bochten in de regio anterior lichaam 20-s tussenpozen) handmatig onder een Microscoop13.
    2. Verrichten motoriek assays vijfmaal onafhankelijk voor elk cover-film.
      Opmerking: In de experimenten in de representatieve resultaten weergegeven, 10 dieren werden geëvalueerd voor elk experiment waarin meerdere dieren werden ingesloten gelijktijdig, vergeleken met slechts vijf dieren geteld in de vorige studie13.
    3. Bereken het gemiddelde aantal lichaam bochten voor de 10 dieren in elke groep voor elk experiment. Dan de gemiddelden uit vijf onafhankelijke experimenten om de effects van immobilisatie op de chip. Het analyseren van de gegevens statistisch met behulp van een one-way variantieanalyse (ANOVA) test in een spreadsheet-software op betekenis niveaus van 0.01 en 0,05.
      Opmerking: Op basis van deze experimenten, een film van de cover PS met hoge zuurstof permeabiliteit was geschikt wordt geacht (Zie de representatieve resultaten). Deze PS films zijn opgenomen in de bladen van de worm. PET film, die lage zuurstof permeabiliteit heeft, was niet geschikt geacht, omdat de dieren de neiging te verstikken als bedekt met het tijdens langdurige immobilisatie op de bladen van de worm. Het is ook belangrijk dat de cover-film niet tijdens een reeks procedures breekt; glas covers waren daarom ook ongeschikt (Zie de representatieve resultaten).

4. on-chip immobilisatie

Opmerking: Wegwerpbare, steriele handschoenen moeten gedragen worden om verontreiniging van de worm bladen te vermijden.

  1. Leg een dun transparant vel zoals een PS of glas cover film die geen autofluorescence, voor gebruik als een onder dekking film, op de experimentele Bureau of de microscopische fase heeft. Leg een vel van de worm zachtjes op de onderkant cover film met vlakke pincet.
    Opmerking: Naast de worm bladen met 60 µm-wide microfluidic kanalen (geschikt voor volwassenen 3-4 dagen na het uitkomen), bladen met 50 µm-brede kanalen (geschikt voor jonge volwassenen 3 dagen na het uitkomen en mutanten met kleine body in volwassen stadium) kunnen ook worden ingezet. Selecteer een geschikt blad op basis van de grootte van de dieren moet worden gebruikt.
  2. Het verzamelen van dieren, pick-up een individuele volwassen C. elegans uit de cultuur-plaat onder een stereomicroscoop met behulp van een platina-picker. Herhaal dit proces desgewenst van meerdere dieren.
  3. Wassen van dieren om te verwijderen van voedsel (bacteriën).
    1. Plaats ten minste drie druppels (5 µL druppels) van de bufferoplossing op het oppervlak van een 6 cm niet-behandelde (waterafstotend) petrischaal.
    2. Overbrengen van de dieren naar een droplet met behulp van een platina-picker en laten verwijderen van voedsel door te zwemmen. Wassen ze tweemaal in twee afzonderlijke druppels, en spoel de dieren in een andere druppel.
      Opmerking: Het is nodig om deze procedure te kunnen uit te voeren snel vóór de uitvoering van alle experimenten praktijk.
  4. Drop 2-3 µL van de bufferoplossing op het oppervlak van een vel van de worm. De gewassen dieren uit de druppel op de petrischaal halen en deze overbrengen naar de druppel op het blad van de worm.
  5. Omsluiten dieren in microfluidic kanalen als volgt. Plaats een PS cover film over het blad van de worm gebruik van platte pincet en druk zachtjes op over de kanalen van de ene kant van het blad naar de andere om vochtigheid (zoals eerder beschreven4,,9).
    Opmerking: Dieren zijn willekeurig bijgevoegd in de kanalen. Druppels met dieren zijn verspreid over het vel van de worm door die betrekking hebben op het blad, wat resulteert in druppels sterk wordt uitgebreid over meerdere kanalen. Elk dier kan worden ingesloten in om het even wie van deze kanalen. Het belangrijke punt met betrekking tot het gebruik van de worm sheet voor immobilisatie op de chip is dat meerdere kanalen beschikbaar over een groot gebied zijn.
  6. Onmiddellijk na het omsluiten de dieren van de microfluidic kanalen, bevestigen dat zij leven door te controleren voor de beweging van het hoofd onder een microscoop (bijvoorbeeld 1 x of 2 x vergroting).
  7. Opnemen van dier positie, op hetzelfde moment als het uitvoeren van stap 4.6 en rekening met het volgende op een speciaal vel papier (aanvullende bestand 1): nummer van het kanaal waarin het dier is ingesloten; positie van elk dier in het kanaal (links/centrum/rechts); en richting van het hoofd.
  8. Tekent u een pijl ter gelegenheid van de positie van elk dier in het kanaal, met de richting van de pijl die overeenkomt met het hoofd van het dier.
    Opmerking: De kanaalnummers (bijvoorbeeld 1, 5, 10, 15, 20, 25) zijn gegraveerd op het oppervlak van het blad van de worm in de buurt van de linker- en rechterrand van de microfluidic kanalen (Figuur 1B). Deze informatie op de speciale vel kunt dieren bevinden zich snel, waardoor het proces efficiënter te maken, en helpt ook om te voorkomen dat straling lekken tijdens opeenvolgende stappen.

5. verzameling van dieren uit een worm-blad

  1. Onmiddellijk na immobilisatie, de cover-film van het blad van de worm gebruik van platte pincet te verwijderen.
  2. Drop van 10-15 µL bufferoplossing op de kanalen van de microfluidic bijvoeging van de dieren en observeren de dieren gaan zwemmen in de druppels onder een stereomicroscoop.
    Opmerking: De dieren beginnen zwemmen in de nieuwe droplet op hun eigen zonder enige extra druk, help of druk. Alleen het neerzetten van een buffer op de top van hen is genoeg om hen uit het kanaal te zwemmen. Een dier kan mogelijk niet om te zwemmen in een droplet als het is vitaal beschadigd door de bestraling in stap 7,9 of door het proces van de immobilisatie in stappen 4.2-4.5, maar dit zeldzaam is. Bovendien, als het dier verbonden met de cover film blijft wanneer het wordt verwijderd, voeg de druppels op de cover-film in plaats van in de kanalen.
  3. De dieren zwemmen in de druppel met behulp van een platina-picker halen en leg ze op een plaat assay.

6. de toepassing van worm bladen voor imaging-opmerkingen

Opmerking: Worm bladen kunnen veel worden gebruikt in microscopisch kleine opmerkingen. De chip kan behouden water en heeft geen invloed op de beweeglijkheid van C. elegans individuen na 3 uur op de chip immobilisatie9. Bovendien heeft de chip zelf geen autofluorescence, makend het geschikt voor gebruik in fluorescentie imaging tests. Hieronder vindt u een voorbeeldtoepassing voor fluorescentie imaging assay.

  1. Selecteer een fluorescentie Microscoop en monteren van een digitale camera of digitale videocamera op de Microscoop naar capture afbeeldingen of video's, respectievelijk (Figuur 3A).
    Opmerking: De afstand (WD) van de werken van Microscoop is meer dan 0,2 mm afhankelijk van objectief specificatie (Zie Figuur 3B, C). De specificatie van de fluorescentie Microscoop systeem gebruikt in dit document wordt weergegeven in de Tabel van materialen. De specificatie is echter niet beperkt tot onze voorbeeld want het hangt af van het doel van de observatie of / en gebruikers.
  2. Selecteer een fluorescerende stam van C. elegans en onderhouden zoals beschreven in sectie 1.
    Opmerking: Als er moet observeren de lichaam-muur spiercontractie (Zie representatieve resultaten), gebruik van jonge volwassen HBR411C. elegans, waarin een verslaggever gen wordt gebruikt om uit te drukken de calcium-indicator GCaMP3.35 in alle lichaam-muur spiercellen. Het is belangrijk om het gebruik van jonge volwassenen (≤3 dagen na het uitkomen) die dunner dan de breedte van de microfluidic kanalen (50 of 60 µm) van het blad van de worm zijn. De kleine mate van goedkeuring betekent dat de dieren licht buigen kunnen, waardoor het kan observeren de spiercontractie en de uitbreiding tijdens het crawlen, met behulp van een calcium-ion-indicator.
  3. Behuizing van dieren volgens de procedure van de immobilisatie in sectie 4 uitvoeren.
  4. Fluorescerende vlekken van dieren (bijvoorbeeldgroene TL proteïne-geëtiketteerden stammen) met behulp van een fluorescentie Microscoop observeren en fotograferen met een digitale camera gemonteerd op de Microscoop.
    Opmerking: Volg de eerder vastgestelde methoden14,15,16, sinds de Microscoop observatie methoden (met inbegrip van fluorescentie observatie) en hangt af van de specificatie van het systeem van de Microscoop het doel van de observatie.
  5. Afbeelding calcium-ion golfvoortplanting met behulp van video acquisitie te observeren dynamische activiteiten, zoals de lichaam-muur spiercontractie en de uitbreiding in de HBR4 wormen (Video 1).

7. toepassing van worm bladen voor bestraling van de microbeam

Opmerking: De collimating microbeam bestraling systeem5 kunt gebruiken verschillende zware-ion deeltjes versneld uit het azimutale verschillende veld cyclotron geïnstalleerd op de Takasaki Ion Accelerators voor geavanceerde straling toepassing (TIARA) faciliteit van QST-Takasaki (Figuur 4A). Er is een automatische podium voor bestraling onder de lichtbundel afslag (Figuur 4B). De procedure voor zware-ion microbeam doorstraling van C. elegans met behulp van dit systeem is als volgt.

  1. Zoek het blad van de worm bijvoeging van meerdere dieren op een aluminium frame op maat gemaakt voor de microbeam-doorstralingsinstallatie en zet deze dan op de automatische podium voor bestraling (Figuur 4C).
  2. De bestraling monster (d.w.z., dieren die zijn ingesloten in een blad van de worm op een frame), verhogen tot direct onder (~ 2 mm) de bundel afsluiten op basis van het beeld van de monitor van een Microscoop gelegen onder de automatische fase (Figuur 4D).
  3. Zoek na de verticale positionering, elk dier te richten met de bestraling van de microbeam met behulp van de op maat gemaakte software voor gerichte bestraling van dieren en celculturen. Om te zoeken van elk dier omsloten door het microfluidic kanaal, verwijzen naar de specifieke blad beschreven in stap 4.7-4.8 (Zie aanvullende bestand 1) en bevestig het kanaalnummer in de buurt van de linker- en rechterrand van de kanalen.
  4. Controle van de automatische fase in X en Y Routebeschrijving naar positie de dieren net onder de balk sluiten met behulp van een afstandsbediening systeem en een lasermuis bediend met de software van de bestraling.
  5. Ruwweg tune de bestraling gebied door te kijken naar de projectie van de Microscoop vindt u onder de automatische fase van het monster en de cursor verplaatsen naar de positie van de bestraling van het dier worden gericht.
  6. Na ruwe positionering, afsluiten en sluit de bestraling kamer en naar de aangrenzende controlekamer om te voorkomen dat het bestralen van de exploitanten.
  7. Stel het gewenste aantal ion deeltjes voor één bestraling procedure, overeenkomt met de bestraling van een bepaalde regio van het dier, met behulp van de console gekoppeld aan een ion-teller-systeem.
    Opmerking: Deze bestaat uit een kunststof scintillator en een photoelectron multiplier in het collimating microbeam bestraling systeem.
  8. Verfijnen van de bestraling-controlekamer, de positie van de dieren die op basis van het beeld van de monitor van de Microscoop gelegen onder de automatische etappe, die het hetzelfde beeld geprojecteerd op de monitor op de bestraling kamer (Figuur 4E is).
  9. Richten dedoorstraling van microbeam door te klikken op de knop van de bestraling van de software voor bestraling.
    Opmerking: In het voorbeeld in Figuur 4F, we richten de farynx hoofd regio en bestralen met het juiste aantal microbeam koolstof ionen. Omdat het aantal deeltjes van de ion passeren van het monster wordt geteld met behulp van een ion-teller systeem gekoppeld aan de console en de software van de bestraling, is de bestraling gestopt na levering van het gewenste aantal ion deeltjes.
  10. Elk dier opgenomen op de toegewijde blad zoeken en uitvoeren van gerichte bestraling aan elk dier. Herhaal stap 7,8 en 7,9 totdat alle dieren hebben bestraald.
  11. Onmiddellijk na de bestraling, voer de bestraling kamer en de automatische bestraling fase lager. Het monster op de op maat gemaakte frame bevindt zich in het werkgebied automatisch te verwijderen.
  12. De dieren verzamelen zoals beschreven in stappen 5.1-5.3.
  13. Gedrags-en/of moleculaire analyses uitvoeren als nodig voor het evalueren van de effecten van de gerichte bestraling, afhankelijk van het doel van de studie.
    Opmerking: De bepaling van de motoriek beschreven in stap 3.6 is een effectieve methode voor de evaluatie van de gevolgen van bestraling op de motiliteit4,9.

8. behandeling van worm bladen voor herhaald gebruik

Opmerking: Worm bladen kunnen worden gebruikt herhaaldelijk ten minste 10 keer9 met geen nadelige gevolgen voor de dieren als gereinigd en gesteriliseerd goed na gebruik als volgt.

  1. Reiniging
    1. Plaats van de gebruikte worm vel op een 6 cm petrischaal en ongeveer 100 µL van gesteriliseerde ultrazuiver water op het hele vel neerzetten.
    2. Peddel het water op het oppervlak van het blad via vingers gehandschoende te wassen vuil zoals stof, bacteriële voedsel en geen eieren gelegd in de kanalen.
    3. Veeg het vocht uit het blad van de worm grondig met behulp van wegwerp doekjes.
  2. Sterilisatie
    1. Injecteren van ongeveer 5 mL ethanol 70% in de petrischaal met de worm blad en het oppervlak van het blad met gehandschoende vingers te wassen de vuil peddelen.
  3. Drogen
    1. Verwijderen van de chips uit de petrischaal gevuld met 70% ethanol en laat drogen.
  4. Opslag
    1. Na het drogen, het blad van de worm plaats op een steriele petrischaal en bedekken. Vellen kunnen ook worden opgeslagen op een steriele petrischaal gevuld met 70% ethanol.
      Opmerking: Het is beter om te vervreemden van de cover films na gebruik, maar als ze opnieuw worden gebruikt, schoon hen zoals gedaan voor het blad van de worm. Echter als plooien op de film cover ontwikkelen na gebruik zal het niet langer voldoen aan de chip, waardoor uitdroging van de dieren, en daarom moet worden vervangen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Actieve C. elegans individuen kunnen worden geïmmobiliseerd met succes met behulp van een ultra-dunne, bevochtigbaar PDMS, microfluidic chip (worm vel). We onderzochten de geschiktheid van verschillende cover films voor het afdichten van de worm blad, zoals beschreven in sectie 3 protocol. Om de afdichting effecten van de cover-films, wij vastbesloten de motiliteit van dieren 3 h na op-Spaander immobilisatie gebruik cover glas (dikte: 130-170 µm), PET-film (dikte: 125 µm), en PS film (dikte: ~ 130 µm), respectievelijk. Zoals afgebeeld in Figuur 5, was er geen significant verschil in de motiliteit (lichaam bochten) tussen controledieren toegestaan zich vrij te bewegen voor 3 h en dieren die zijn ingesloten in het blad van de worm met PS-film. Motility was daarentegen aanzienlijk verminderd bij dieren onder een glas cover ingesloten. Sommige dieren leek te hebben uitgedroogd, suggereren dat het glas cover de druppel afgestoten, het voorkomen van een nauwe zegel en waardoor de dieren gedeeltelijk uitdrogen, wat resulteert in verminderde beweeglijkheid. De beweeglijkheid van dieren ingesloten met behulp van een PET-film was ook sterk gedaald; Hoewel geen drogen werd waargenomen, de beweeglijkheid van de dieren de neiging om te verkleinen uniform, suggereren dat de lage zuurstof transmissiesnelheid (~ 30 mL / [24 h·m²· MPa]), die is ongeveer 100 keer lager is dan die van PS, veroorzaakt de dieren te verstikken. Deze resultaten suggereren dat PS dekking films moeten worden gebruikt voor het insluiten van dieren in het blad van de worm.

Wij ook de worm blad techniek voor imaging-opmerkingen en voor het uitvoeren van de land / regiospecifieke microbeam bestraling toegepast. Op de chip immobilisatie met behulp van een worm vel met waterretentie en geen autofluorescence was geschikt voor microscopische waarneming onder live voorwaarden. Bijvoorbeeld, wij de techniek toegepast op de HBR4 stam11 van C. elegans, waarin een verslaggever-gen de calcium-indicator GCaMP3.35 in alle lichaam-muur spiercellen uitgedrukt. We hebben vastgesteld de activiteiten van alle lichaam-muur spiercellen in jonge volwassen dieren op ≤3 dagen na broedeieren in worm bladen met 50 µm-wide microfluidic kanalen, waardoor dat de dieren ruimte om te buigen iets. De signaalsterkte van de GCaMP3.35 in de HBR4-stam komt overeen met de samentrekking van de spiercellen van de lichaam-muur. De Ca2 + golfvoortplanting overeenkomt met de spieractiviteit was duidelijk waargenomen (Video 1). Bovendien, we bevestigd dat de worm blad had geen autofluorescence, zoals getoond in de laatste fase (laatste ~ 10 s) voor Video 1. Op deze manier, het gebrek aan behoefte verdoving toegestaan de fysiologische activiteiten van de spiercellen tot live voorwaarden in acht worden genomen.

Bovendien, pasten we het blad van de worm voor land / regiospecifieke microbeam doorstraling van C. elegans individuen. De verschillende kanalen van de rechte microfluidic op de worm vel toegestaan meerdere dieren tegelijk worden geïmmobiliseerd zonder de noodzaak voor anesthesie, waardoor sequentiële bestraling van ≥20 dieren (genoeg voor een groep-assay) in een korte tijd (30 min. voor 20 individuen).

Figure 1
Figuur 1 : Schematische van een worm vel. (A) overzicht van het blad van een worm met de munt van een Amerikaans 1 cent voor schaal. De worm blad was 300 µm dik, 15 mm breed en 15 mm lang. (B) de oppervlakte van de worm blad bevatte 25 rechte microfluidic kanalen (diepte = 70 µm; breedte = 60 µm; lengte = 8 mm). (C) Schematische voorstelling van de monsters uit de film onder dekking, het blad van de worm, en de film van de dekking. (D) het blad van de worm is een zachte, ultra dun blad gemaakt van PDMS, en door te knijpen met platte pincet kan worden gebogen. (E) voorbeeld van meerdere dieren omsloten door meerdere kanalen. ()F) uitbreiding van een kanaal van de microfluidic door te drukken met een platina-picker. De elasticiteit van het kanaal kan dieren voorzichtig worden gehuld. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2 : Lichaam vorm van C. elegans. (A) Wild-type (N2) C. elegans op een NGM plaat. (B) een unc-119 mutant met abnormale vorm op een NGM plaat. (C) de unc-119 mutanten omsloten door de kanalen van de microfluidic van het blad van de worm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3 : Schema van Microscoop observatie van live C. elegans individuen ingesloten in het blad van de worm. (A) schema van de stereomicroscoop systeem voor imaging-opmerkingen. (B) Schematische voorstelling van Microscoop observatie van de worm sheet omsluitende live C. elegans individuen. (C) aanzicht van de worm sheet omsluitende live C. elegans individuen in het werkgebied van de Microscoop geplaatst. W.D. geeft de afstand van de werken van Microscoop. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4 : Schematische voorstelling van het collimating microbeam systeem op QST-Takasaki en gerichte microbeam bestraling procedure voor live C. elegans individuen. (A) overzicht van de collimating microbeam bestraling systeem5, die verschillende zware-ion deeltjes uit de azimutale verschillende veld cyclotron geïnstalleerd op de TIARA van QST-Takasaki versneld kunt gebruiken. (B) overzicht van de bundel-uitgang en de automatische podium voor bestraling. (C) genieten van de instelling op de automatische fase van het collimating microbeam systeem. (D) verticale positionering van de bestraling steekproef uitgevoerd in de kamer van de bestraling. (E) "fine-tuning"-van bestraling gebied uitgevoerd in de controlekamer van de bestraling. (F) gerichte microbeam bestraling van levende C. elegans. De keelholte werd geklikt-op als de gerichte positie en bestraald door de bestraling-knop te drukken. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 5
Figuur 5 : Beweeglijkheid van C. elegans na op-Spaander immobilisatie met cover glas, polyesterfolie (PET) en polystyreen (PS) film. Staven geven gemiddelde lichaam bochten van dieren 3 h na op-Spaander immobilisatie of na vrij verkeer gedurende 3 uur op een NGM plaat (control). Tien dieren werden onderzocht en lichaam bochten waren gemiddeld onder elke groep. Ten slotte, gegevens uit vijf onafhankelijke experimenten werden gemiddeld voor elke groep. Foutbalken vertegenwoordigen de standaardfout van het gemiddelde van de vijf onafhankelijke experimenten. Alle gegevens zijn geanalyseerd met behulp van one-way ANOVA op de 0,05 (*) of significantieniveau van 0,01 (*). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Video 1
Video 1: voorbeelden van imaging waarnemingen van gespierde activiteiten in C. elegans omsloten door een worm vel. Calcium-ion golfvoortplanting overeenkomt met de samentrekking van de spiercellen van de lichaam-muur tijdens kruipen in HBR4 C. elegans individuen ingesloten in een blad van de worm. De laatste ~ 10 s werden waargenomen onder heldere-veld verlichting. Gelieve Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)

Supplementary Figure 1
Aanvullende bestand 1: voorbeeld van toegewijde vel papier (versie van de bestraling van de microbeam). Hiermee tekent u een pijl om aan te geven van de positie van elk dier in het kanaal. De richting van de pijl komt overeen met het hoofd. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Op de chip immobilisatie van C. elegans live omstandigheden met behulp van een bevochtigbaar PDMS microfluidic chip kunt efficiënt gerichte microbeam dedoorstraling van meerdere dieren. Het gemak van behandeling en functies om te voorkomen dat het drogen maken dit systeem geschikt voor toepassingen in microbeam bestraling, maar ook in verschillende gedrags testen. Deze worm bladen hebben al zijn gecommercialiseerd en kunnen gemakkelijk worden verkregen. Conventionele microfluidic chips, zoals olfactorische chips, worden geassocieerd met problemen zoals verstoppingen van dieren en broedeieren in de kanalen van de gesloten microfluidic waardoor het moeilijk is om te verzamelen van de dieren, en dus deze chips hebben doorgaans wegwerp, waardoor verhoging van de kosten. In tegenstelling, zijn de kanalen van de microfluidic in het huidige blad van de worm open, waardoor het makkelijker om te verzamelen van de dieren. Deze worm bladen kunnen daarom worden gebruikt herhaaldelijk, waardoor ze zuiniger.

Recente technologische innovaties in PDMS microfluidic chips hebben aangetoond een stijgende trend in de structurele complexiteit en multifunctionaliteit16,18,19,20,21, 22,23. Wij zijn echter van mening dat het belangrijk is dat het systeem eenvoudig en makkelijk te gebruiken. Inderdaad, in tegenstelling tot het gebruik van conventionele grote microfluidic chips19,20,21,22,23 waarvoor de bevestiging van een vacuümpomp, de geringe omvang en eenvoudige ontwerp van de worm bladen toe dat procedures te gemakkelijk worden uitgevoerd binnen een beperkte ruimte.

De water retentie prestaties van de worm bladen kan op lange termijn observaties uit te voeren. Verder staat de dikte van het blad ion deeltjes passeren de monsters, waardoor de gerichte bestraling worden toegepast om te leven van C. elegans individuen met een precieze aantal ion deeltjes. Deze voordelen van de worm bladen hebben breidde de mogelijkheden voor biologische experimenten.

Wij zijn van mening dat het belangrijk voor biologen ontwikkeling van nieuwe apparatuur en methoden ter verbetering van de efficiëntie van hun experimenten en analyses is. De worm lakens en microbeam bestraling software met dit doel voor ogen hebben ontwikkeld, en hebben het potentieel om bij te dragen aan het succes van toekomstige innovatieve experimenten buiten hun oorspronkelijke doelstellingen.

Tot de beste van onze kennis is onze fractie de eerste om deze technologie wereldwijd te ontwikkelen. Echter zal het gestandaardiseerde gebruik ervan in de toekomst vergemakkelijken de toepassing van gerichte microbeam bestraling aan dieren onder live voorwaarden, waardoor om de rollen van specifieke cellen/weefsels in interne processen te identificeren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

De auteurs bedanken Dr. Atsushi Higashitani voor vriendelijk advies met betrekking tot de behandeling van C. elegans en Drs. Yuya Hattori, Yuichiro Yokota en Yasuhiko Kobayashi voor waardevolle discussies. De auteurs bedanken de Caenorhabditis genetische Center voor het verstrekken van stammen van C. elegans en E. coli. Wij danken de bemanning van het cyclotron van TIARA op QST-Takasaki voor hun vriendelijke hulp met de bestraling experimenten. Wij danken Dr. Susan Furness voor het bewerken van een ontwerp van dit manuscript. Deze studie werd deels gesteund door KAKENHI (Grant nummers JP15K11921 en JP18K18839) van JSPS aan M.S.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C. elegans wild-type strain Caenorhabditis Genetics Center (CGC) , Minnesota, USA N2 Wild-type C. elegans strain generally used in this study
C. elegans unc-119(e2498) III mutant strain Caenorhabditis Genetics Center (CGC) , Minnesota, USA CB4845 C. elegans strain only employed as an example of mutants with abnormal body shape 
C. elegans transgenic strain HBR4 Caenorhabditis Genetics Center (CGC) , Minnesota, USA HBR4 The genotype of this transgenic C. elegans strain is HBR4:goeIs3[pmyo-3::GCamP3.35:: unc-54–3’utr, unc-119(+)]V. This strain was only employed for imaging observation.
E. coli strain Caenorhabditis Genetics Center (CGC) , Minnesota, USA OP50 E. coli strain used as food for C. elegans
Worm Sheet IR (50/60) Biocosm, Inc., Hyogo, Japan BCM17-0001 Microfluidic chip with 25 straight 50/60-µm width channels used in all experiments and observation in this paper 
Worm Sheet 60 Biocosm, Inc., Hyogo, Japan BCM18-0001 Microfluidic chip with 20 straight 60 µm-width channels. This is sitable for adults 3-5 days after hatching at 20°C. 
Worm Sheet 50 Biocosm, Inc., Hyogo, Japan BCM18-0002 Microfluidic chip with 20 straight 50 µm-width channels. This is sitable for youg adults ~3 days after hatching at 20°C. 
MICRO COVER GLASS MATSUNAMI GLASS IND. LTD. C030401 Cover glass (thickness: 130-170 µm) used in locomotion assays in Protocol 3
Polystyrene Film Biocosm, Inc., Hyogo, Japan BCM18-0001/ BCM18-0002 Bundled items of Worm Sheets. PS filim (thickness: ~130 µm) used in locomotion assays in Protocol 3.
Polyester Film Lumirror TORAY INDUSTRIES, INC., Tokyo, Japan Lumirror T60 (t 125 µm) PET filim (thickness: 125 µm) used in locomotion assays in Protocol 3
IWAKI 60 mm/non-treated dish AGC Techno Glass Co., Ltd., Shizuoka, Japan). 1010-060 Non-treated dish used in incuvation of C. elegans in Protocol 1
IWAKI 35 mm/non-treated dish AGC Techno Glass Co., Ltd., Shizuoka, Japan). 1010-035 Non-treated dish used in locomotion assays in Protocol 3
Milli-Q Merck, France Ultrapure water
Kimwipe S-200 Nippon Paper Crecia Co., Ltd., Tokyo, Japan 62020 120 mm x 215 mm; 200 sheets/ box
WormStuff Worm Pick Genesee Scientific Corporation, CA, USA) 59-AWP Platina picker specilized for picking up C. elegans
Research Stereo Microscope System OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Japan SZX16 Micriscope used in all experiments and observation in this paper
Motorized Focus Stand for SZX16 OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Japan SZX2-ILLB This was used for bright field observation in Protocol 3-8.
Objective Lens (×1) OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Japan SDFPLAPO1×PF NA: 0.15; W.D.: 60 mm. This lends was used for bright field observation in Protocol 3-8.
Objective Lens (×2) OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Japan SDFPLAPO2XPFC NA: 0.3; W.D.: 20 mm. This  lends was used for imaging observations.
Mercury Light Source OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Japan U-LH100HG The broad emission spectrum enables a range of fluorescence imaging experiments to be conducted using all common fluorophores.
SZX16 Fluorescent filter unit (High performance for YFP) OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Japan SZX2-FYFPHQ Ex: 490-500 nm; Em: 510-560. This was used for imaging observation of HBR4 strain.
Digital Camera High Speed EXILIM CASIO COMPUTER Co., Ltd, Tokyo, Japan EX-F1 Figure 1B, 1E, 1F, Figure 2A-C, and Video 1 were obtained by using this digital camera.
Office 2013 Microsoft Co. Ltd, Redmond, WA, USA EXCEL Software used for statistical analyses

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Funayama, T., Hamada, N., Sakashita, T., Kobayashi, Y. Heavy-Ion microbeams-development and applications in biological studies. IEEE Transactions on Plasma Science. 36 (4), 1432-1440 (2008).
  2. Tanaka, A., Shikazono, N., Hase, Y. Studies on biological effects of ion beams on lethality, molecular nature of mutation, mutation rate, and spectrum of mutation phenotype for mutation breeding in higher plants. Journal of Radiation Research. 51 (3), 223-233 (2010).
  3. Ghita, M., Fernandez-Palomo, C., Fukunaga, H., Fredericia, P. M., Schettino, G., Bräuer-Krisch, E., Butterworth, K. T., McMahon, S. J., Prise, K. M. Microbeam evolution: from single cell irradiation to pre-clinical studies. International Journal of Radiation Biology. 94 (8), 708-718 (2018).
  4. Suzuki, M., Hattori, Y., Sakashita, T., Yokota, Y., Kobayashi, Y., Funayama, T. Region-specific irradiation system with heavy-ion microbeam for active individuals of Caenorhabditis elegans. Journal of Radiation Research. 58 (6), 881-886 (2017).
  5. Funayama, T., Wada, S., Yokota, Y., Fukamoto, K., Sakashita, T., Taguchi, M., Kakizaki, T., Hamada, N., Suzuki, M., Furusawa, Y., Watanabe, H., Kiguchi, K., Kobayashi, Y. Heavy-ion microbeam system at JAEA-Takasaki for microbeam biology. Journal of Radiation Research. 49 (1), 71-82 (2008).
  6. Sugimoto, T., Dazai, K., Sakashita, T., Funayama, T., Wada, S., Hamada, N., Kakizaki, T., Kobayashi, Y., Higashitani, A. Cell cycle arrest and apoptosis in Caenorhabditis elegans germline cells following heavy-ion microbeam irradiation. International Journal of Radiation Biology. 82 (1), 31-38 (2006).
  7. Fukamoto, K., Shirai, K., Sakata, T., Sakashita, T., Funayama, T., Hamada, N., Wada, S., Kakizaki, T., Shimura, S., Kobayashi, Y., Kiguchi, K. Development of the irradiation method for the first instar silkworm larvae using locally targeted heavy-ion microbeam. Journal of Radiation Research. 48 (3), 247-253 (2007).
  8. Yasuda, T., Kamahori, M., Nagata, K., Watanabe-Asaka, T., Suzuki, M., Funayama, T., Mitani, H., Oda, S. Abscopal activation of microglia in embryonic fish brain following targeted irradiation with heavy-ion microbeam. International Journal of Molecular Sciences. 18 (7), 1-15 (2017).
  9. Suzuki, M., Sakashita, T., Hattori, Y., Yokota, Y., Kobayashi, Y., Funayama, T. Development of ultra-thin chips for immobilization of Caenorhabditis elegans in microfluidic channels during irradiation and selection of buffer solution to prevent dehydration. Journal of Neuroscience Methods. 306, Aug 1 32-37 (2018).
  10. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
  11. Schwarz, J., Spies, J. P., Bringmann, H. Reduced muscle contraction and a relaxed posture during sleep-like Lethargus. Worm. 1 (1), 12-14 (2012).
  12. Saeki, S., Yamamoto, M., Iino, Y. Plasticity of chemotaxis revealed by paired presentation of a chemoattractant and starvation in the nematode Caenorhabditis elegans. Experimental Biology. 204, Pt 10 1757-1764 (2001).
  13. Sawin, E. R., Ranganathan, R., Horvitz, H. R. C. elegans locomotory rate is modulated by the environment through a dopaminergic pathway and by experience through a serotonergic pathway. Neuron. 26 (3), 619-631 (2000).
  14. Momma, K., Homma, T., Isaka, R., Sudevan, S., Higashitan, A. Heat-induced calcium leakage causes mitochondrial damage in Caenorhabditis elegans body-wall muscles. Genetics. 206 (4), 1985-1994 (2017).
  15. Kerr, R. A. Imaging the activity of neurons and muscles. WormBook. 2, 1-13 (2006).
  16. Aubry, G., Lu, H. A perspective on optical developments in microfluidic platforms for Caenorhabditis elegans research. Biomicrofluidics. 8, 011301 (2014).
  17. Lumirror Catalog. TORAY. , Available from: https://www.toray.jp/films/en/products/pdf/lumirror.pdf (2018).
  18. Otobe, K., Itou, K., Mizukubo, T. Micro-moulded substrates for the analysis of structure-dependent behaviour of nematodes. Nematology. 6 (1), 73-77 (2004).
  19. Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nature Methods. 4 (9), 727-731 (2007).
  20. Hulme, S. E., Shevkoplyas, S. S., Apfeld, J., Fontana, W., Whitesides, G. M. A microfabricated array of clamps for immobilizing and imaging C. elegans. Lab on a Chip. 7 (11), 1515-1523 (2007).
  21. Lockery, S. R., Lawton, K. J., Doll, J. C., Faumont, S., Coulthard, S. M., Thiele, T. R., Chronis, N., McCormick, K. E., Goodman, M. B., Pruitt, B. L. Artificial dirt: Microfluidic substrates for nematode neurobiology and behavior. Journal of Neurophysiology. 99 (6), 3136-3143 (2008).
  22. Gilleland, C. L., Rohde, C. B., Zeng, F., Yanik, M. F. Microfluidic immobilization of physiologically active Caenorhabditis elegans. Nature Protocols. 5 (12), 1888-1902 (2010).
  23. Fehlauer, H., Nekimken, A. L., Kim, A. A., Pruitt, B. L., Goodman, M. B., Krieg, M. Using a microfluidics device for mechanical stimulation and high resolution imaging of C. elegans. Journal of Visualized Experiments. (132), e56530 (2018).

Tags

Bioengineering kwestie 145 C. elegans bestraling van de microbeam op de chip immobilisatie PDMS microfluidic chip worm blad bevochtigbaarheid
Immobilisatie van levende <em>Caenorhabditis elegans</em> personen een Ultra-thin Polydimethylsiloxaan Microfluidic Chip met waterretentie
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Suzuki, M., Sakashita, T., Funayama, … More

Suzuki, M., Sakashita, T., Funayama, T. Immobilization of Live Caenorhabditis elegans Individuals Using an Ultra-thin Polydimethylsiloxane Microfluidic Chip with Water Retention. J. Vis. Exp. (145), e59008, doi:10.3791/59008 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter