Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Immobilisering av levande Caenorhabditis elegans individer med en supertunna Polydimetylsiloxan mikroflödessystem Chip med vätskeretention

Published: March 19, 2019 doi: 10.3791/59008
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Radiation-Applied Biology Research, Takasaki Advanced Radiation Research Institute, National Institutes for Quantum and Radiological Science and Technology (QST-Takasaki)

Summary

En serie av immobilisering metoder har fastställts för att möjliggöra riktade bestrålning av levande Caenorhabditis elegans individer med hjälp av en nyligen utvecklad ultratunn Polydimetylsiloxan mikroflödessystem chip med vätskeansamling. Denna roman på chip immobilisering är också lämplig för avbildning observationer. För detaljerad behandling och applikationsexempel av chip förklaras.

Abstract

Strålning används ofta för biologiska tillämpningar och för ion-beam avel, och bland dessa metoder, microbeam bestrålning representerar ett kraftfullt medel för att identifiera radiosensitive platser i levande organismer. Detta dokument beskriver en rad på chip immobilisering metoder utvecklats för den riktade microbeam bestrålningen av levande individer av Caenorhabditis elegans. Särskilt, behandling av Polydimetylsiloxan (PDMS) mikroflödessystem chips som vi tidigare utvecklat för att immobilisera C. elegans individer utan behov för anestesi förklaras i detalj. Detta chip, kallad en mask ark, är motståndskraftig att tillåta mikroflödessystem kanalerna utvidgas och elasticitet tillåter djur till inlindas försiktigt. Också, på grund av egen adsorption kapacitet PDMS, djur kan förseglas i kanalerna genom att täcka ytan av bladet mask med en tunn täcka film, där djur inte trycks in kanalerna för kapsling. Genom att vrida locket filmar över, kan vi enkelt samla djuren. Dessutom bladet mask visar vätskeretention och tillåter C. elegans individer att underkastas mikroskopisk observation under långa perioder levande villkor. Bladet är dessutom endast 300 µm tjockt, så att tunga joner såsom koljoner passera bladet omslutande djuren, vilket möjliggör ion partiklarna ska identifieras och tillämpad stråldosen till mätas noggrant. Eftersom val av omslag filmerna används för omslutande djuren är mycket viktig för framgångsrik långsiktig immobilisering, vi genomfört val av lämpligt skydd filmerna och visade en rekommenderade en bland några filmer. Exempelvis tillämpningen av chip infört vi tänkbar observation av muskulära aktiviteter av djur omslutande mikroflödessystem kanalen av bladet mask samt microbeam bestrålning. Dessa exempel visar att masken arken har kraftigt utökade möjligheter för biologiska experiment.

Introduction

Strålning, inklusive röntgen, gammastrålning och tunga-ion beam, används ofta för biologiska applikationer såsom cancerdiagnos och behandling och för ion-beam avel. Många studier och tekniska utvecklingen för närvarande inriktade på effekterna av strålning1,2,3. Microbeam bestrålning är ett kraftfullt medel för att identifiera radiosensitive platser i levande organismer4. Takasaki avancerad strålning institutet av nationella forskningsinstituten för Quantum och radiologiska vetenskap och teknik (QST-Takasaki) har utvecklat en teknik för att bestråla enskilda celler under mikroskopisk observation med tung-Jon microbeams5, och har etablerat metoder för att aktivera riktade microbeam bestrålning av flera modell djur, såsom Nematoden Caenorhabditis elegans4,6, silkesmaskar7och Oryzias latipes (japansk medaka)8. Riktade microbeam bestrålning av de nematoder C. elegans gör den effektiv Nedslagning av specifika områden, såsom nerv ringen i regionen huvud, vilket bidrar till att identifiera rollerna för dessa system i processer såsom locomotion.

En metod för på-chip immobilisering av C. elegans individer utan behov av anestesi har utvecklats för att möjliggöra microbeam bestrålning4. Dessutom förbättrar mikroflödessystem chip används i den tidigare studie4, har vi nyligen utvecklat hydrofila, ion-genomträngliga, Polydimetylsiloxan (PDMS) mikroflödessystem chips, kallad mask ark (se Tabell för material), för immobilisera C. elegans individer9. Dessa består av ultra-tunn mjuk ark (tjocklek = 300 µm; bredd = 15 mm; längd = 15 mm) med flera (20 eller 25) raka mikroflödessystem kanaler (djup = 70 µm; bredd = 60 µm eller 50 µm; längd = 8 mm) på ytan (figur 1A-D). Mikroflödessystem kanaler är öppna och tillåter flera djur ska bifogas i dem samtidigt (figur 1E). Arken är motståndskraftig att tillåta mikroflödessystem kanalerna utvidgas (med ~ 10%, figur 1F), och elasticiteten gör djur till inlindas försiktigt. Också, på grund av egen adsorption kapacitet PDMS, djur kan förseglas i kanalerna genom att täcka ytan av bladet mask med en tunn täcka film, där djur inte trycks in kanalerna för kapsling. Genom att vrida locket filmar över, kan vi enkelt samla djuren.

Kanalerna ont inte maskar när de är inneslutas eller när de samlas. Dessutom lakan är gjorda av PDMS, som är i huvudsak hydrofoba, utan vätskeretention kan uppnås med specialinriktade hydrophilicitet till materialet. Den vätskeansamling och tjocklek är gynnsamma egenskaper av masken täcker. Vatten-retention kapacitet förhindrar uttorkning av djuren efter långvarig immobilisering och möjliggör långsiktiga observationer skall utföras.

Dessutom, som tidigare beskrivits9, är täcker endast 300 µm tjockt, så att tunga joner såsom koljoner (med en räckvidd på ca 1 mm i vatten) för att passera genom bladet omslutande djuren. Detta tillåter ion partiklarna ska identifieras och tillämpad stråldosen till mätas noggrant. Dessutom mask arken kan återanvändas och är därmed ekonomisk. Med konventionella injektion metod, djuren innesluten är ibland döda och de inte kan tas ur i Engelska kanalen. deras ägg kan också täpper till kanalerna. Detta gör chip oanvändbar. Chips är därför i princip disponibel och kostnads-förhållandet är dålig.

I detta dokument, beskriver vi i detalj en rad metoder för på-chip immobilisering av levande C. elegans individer använda mask ark. Genom locomotion analyser av djur 3 h efter på-chip immobilisering utvärderat vi lämpligt skydd filmen. Dessutom visade vi exemplen på chip immobilisering för både avbildning observationer och microbeam bestrålning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. stammar och underhåll

  1. Välj en lämplig stam av C. elegans och Escherichia coli (mat) beroende på syftet med experimentet.
    Obs: I detta dokument, vildtyp N210C. elegans (figur 2A) används i allmänhet, och HBR4:goeIs3 [pmyo-3::GCamP3.35::unc-54 - 3' utr, unc-119(+)] V11 är bara anställd för imaging test. E. coli OP50 användes som mat för C. elegans. Vissa mutanter med onormal kroppsform, såsom unc-119(e2498) III mutant med en rullad form (figur 2B), kan också vara inneslutna i de raka mikroflödessystem kanalerna (figur 2C).
  2. Upprätthålla den C. elegans vid 20 ° C på 6 cm petriskålar innehållande 10 mL nematoder odlingsmedium (NGM) sprids med övernattning ruvade (37 ° C) E. coli som tidigare beskrivits10. Om möjligt, synkronisera utvecklingsstadierna i C. elegans från fosterstadiet.
  3. Använda välnärda vuxna djur, cirka 3-4 dagar efter kläckningen med en bredd av ca 50-60 µm, vilket är optimalt lämpade för storleken på mikroflödessystem kanalerna i masken lakan.

2. Val av buffertlösning för på-chip immobilisering

  1. För hydrofila mask ark, Använd någon buffertlösning beroende på syftet med experimenten.
    Obs: Lämpliga buffertlösningar för på-chip immobilisering på PDMS mikroflödessystem marker har definierat tidigare9 och följande buffertlösningar visade sig ha någon effekt på motiliteten av djuren efter immobilisering: S basala buffert lösningen (5,85 g NaCl, 1 mL av kolesterol (5 mg/mL i etanol), 50 mL 1 M pH 6.0 kaliumfosfat, H2O 1 l; steriliseras i autoklav)10 som innehåller en stor mängd NaCl, M9 fosfatbuffertlösning (5 g NaCl , 3 g KH2PO4, 6 g av Na2HPO4, 1 mL 1 M MgSO4, H2O 1 l; steriliseras i autoklav)10, tvättbuffertlösning (5 mL 1 M pH 6.0 kaliumfosfat, 1 mL 1 M CaCl2, 1 mL 1 M MgSO4, 0,5 g pf gelatin, H2O 1 l; steriliseras i autoklav)12 som innehåller gelatin , och ultrarent vatten9. Tvättbuffertlösning används vanligtvis i detta dokument, och S basala buffertlösning är bara anställd för utvärdering på chip immobilisering med annat omslag filmer i avsnittet 3.
  2. För konventionella mikroflödessystem chip utan Vätbarheten, använda en tvättbuffertlösning, som ger det mest effektiva sättet att underhålla fukt kanaler på mikroflödessystem chip och således förhindrar uttorkning av C. elegans individer ( oavsett Vätbarheten mikroflödessystem marker).

3. Val av lämpligt skydd film för på-chip immobilisering

  1. Förbereda olika omslag filmer enligt följande. Baserat på enkelt hantering, skär följande transparent, biokompatibla täcka filmerna till en lämplig storlek (dvs., bredd 10-15 mm och längd 30-50 mm): 130-170 µm tjockt lock glas (125 µm tjock polyester PET)-film och ~ 130 µm tjock polystyren (PS) film.
  2. Utför 3 h på chip immobilisering med annat omslag filmer enligt följande. Baserat på steg 4.1-4.6, bifoga ≥10 tvättas vuxna djur (3,5 dagar efter kläckningen) i bladet mask med varje omslag filmen, respektive, och lämna för 3 h.
  3. För jämförelser, tillåta 3 h fri rörlighet som följer. Plats ≥10 tvättas vuxna djur på en 3,5 cm tallrik innehållande 3 mL färsk NGM, täck med ett lock och låt verka i 3 h.
  4. Samla djur omedelbart efter 3 h på chip immobilisering enligt steg 5.1-5.3. Ta bort locket filmen från bladet mask och Lägg en droppe av fungera som buffertlösningen till varje djur. Plocka upp djur som simmar i droplet-programmet använder en platina-plockare och överföra dem till en 3,5 cm tallrik innehållande 3 mL färsk NGM utan mat (assay plattan).
  5. Samla djur efter 3 h fri rörlighet. Tillsätt en droppe buffertlösning till varje djur. Plocka upp djur som simmar i droplet-programmet på NGM plattan och överföra dem till ett test med en platina picker.
  6. Utvärdera effekterna av omslaget film på motilitet (locomotion assay).
    1. Minst 5 minuter efter överföring till assay plattan, count ' kropp kurvor (definieras som antalet böjar i regionen främre kroppen 20-s mellanrum) manuellt under ett Mikroskop13.
    2. Genomföra locomotion analyser fem gånger självständigt för varje omslag film.
      Obs: I de experiment som visas i de representativa resultat, utvärderades 10 djur för varje experiment där flera djur var inneslutna samtidigt, jämfört med endast fem djur räknas in i den tidigare studie13.
    3. Beräkna det genomsnittliga antalet kropp kurvor för 10 djur i varje grupp för varje experiment. Sedan genomsnittliga värden från fem oberoende experiment för att utvärdera verkan på chip immobilisering. Analysera data statistiskt med hjälp av en envägs variansanalys (ANOVA) test i ett kalkylprogram på betydelse 0,01 och 0,05.
      Obs: Baserat på dessa experiment, en PS täcka film med hög syrepermeabilitet ansågs lämplig (se de representativa resultat). Dessa PS filmer ingår med mask lakan. SÄLLSKAPSDJUR filmen, som har låg syrepermeabilitet, ansågs inte lämpliga eftersom djuren tenderade att kväva om täckt med det under långvarig immobilisering på masken arken. Det är också viktigt att täcka filmen inte bryter under en rad förfaranden. glas täcker var därför också olämpliga (se de representativa resultat).

4. on-chip immobilisering

Obs: Disponibel, sterila handskar bör bäras för att undvika kontaminering mask arken.

  1. Placera en tunn transparent plåt såsom en PS eller glas cover-film som har ingen autofluorescens, för användning som en nedre luckan film, på det experimentella skrivbordet eller mikroskopiska scenen. Placera en mask ark varsamt på nedre luckan filmen använder platta pincett.
    Obs: Utöver worm arken med 60 µm-wide mikroflödessystem kanaler (passar vuxna 3-4 dagar efter kläckningen), ark med 50 µm-wide kanaler (lämplig för unga vuxna 3 dagar efter kläckningen och mutanter med liten kropp i adult Stadium) kan också vara anställd. Välj en lämplig plåt baserat på storleken på de djur som ska användas.
  2. Samla in djur, plocka upp en enskild vuxen C. elegans från kultur plattan under ett stereomikroskop med en platina picker. Upprepa processen om flera djur behövs.
  3. Tvätta djur för att ta bort mat (bakterier).
    1. Placera minst tre droppar (5 µL droppar) buffertlösning på ytan av en 6 cm ej behandlade (vattenavvisande) petriskål.
    2. Överföra djuren till ett droplet-program använder en platina picker och tillåta dem att ta bort någon mat genom att simma. Tvätta dem två gånger i två separata droppar, och skölj sedan djuren i en annan droplet.
      Obs: Det är nödvändigt att öva detta förfarande för att kunna utföra det snabbt innan du utför några experiment.
  4. Droppa 2-3 µL buffertlösning på ytan av en mask blad. Plocka upp de tvättade djur från droplet-programmet på petriskål och överföra dem till droplet-programmet i bladet mask.
  5. Omsluta djur i ultrakalla kanaler som följer. Placera en PS täcka film över bladet mask använder platta pincett och tryck försiktigt över kanalerna från ena änden av arket till den andra att bibehålla fuktigheten (som beskrivs tidigare4,9).
    Obs: Djur är slumpmässigt inneslutna i kanalerna. Droppar som innehåller djuren sprids över hela bladet mask genom att täcka bladet, vilket resulterar i droppar förlängs ofta över flera kanaler. Varje djur kan vara inneslutna i någon av dessa kanaler. Den viktiga punkten angående användning av bladet mask för på-chip immobilisering är att flera kanaler är tillgängliga över ett stort område.
  6. Omedelbart efter omslutande djuren i ultrakalla kanaler, bekräfta att de är vid liv genom att kontrollera förflyttning av huvudet under ett mikroskop (t.ex. 1 x eller 2 x förstoring).
  7. Spela in djurets ställning, samtidigt som utför steg 4,6 och observera följande på en dedikerad pappersark (kompletterande fil 1): antal kanalen där djuret är bifogat; positionen för varje djur i kanalen (vänster/center/höger); och riktning av huvudet.
  8. Rita en pil för att markera positionen för varje djur i kanalen, med riktning mot pilen motsvarande djurets huvud.
    Obs: Kanalnummer (t.ex. 1, 5, 10, 15, 20, 25) är ingraverat på ytan av bladet mask nära vänstra och högra kanterna av mikrofabricerade kanaler (figur 1B). Informationen i bladet dedikerad tillåter djur ska placeras snabbt, vilket gör processen mer effektiv, och hjälper även till att förhindra läckage under efterföljande steg.

5. insamling av djur från en mask ark

  1. Omedelbart efter immobilisering, ta bort locket filmen från bladet mask använder platta pincett.
  2. Släpp 10-15 µL buffertlösning på mikroflödessystem kanalerna omslutande djuren och observera djuren börjar bada i dropparna under ett stereomikroskop.
    Obs: Djuren börja simma i nya droplet-programmet på egen hand utan någon ytterligare tryck, hjälp eller push. Bara släppa några buffert ovanpå dem är nog att göra dem simma ur kanal. Ett djur kan inte simma i en droplet-fil om den oerhört har skadats genom bestrålning i steg 7,9 eller immobilisering processen i steg 4.2-4.5, men detta är sällsynt. Dessutom om djuret sitter kvar att täcka filmen när den avlägsnas, tillsätt droppar på omslaget filmen istället för i kanalerna.
  3. Plocka upp de djur som simmar i droplet-programmet använder en platina-plockare och placera dem på en assay tallrik.

6. tillämpning av masken ark för avbildning observationer

Obs: Mask ark kan användas allmänt i mikroskopiska observationer. Chipet kan behålla vatten och påverkar inte motiliteten C. elegans individer efter 3 h på chip immobilisering9. Chipet själv har dessutom ingen autofluorescens, vilket gör den lämplig för användning i fluorescens imaging analyser. Nedan ges ett exempelprogram för fluorescens imaging assay.

  1. Välj ett fluorescens Mikroskop och montera en digitalkamera eller digital videokamera på mikroskopet ta bilder eller videor, respektive (figur 3A).
    Obs: Arbetsavstånd (WD) av Mikroskop är mer än 0,2 mm beroende på objektiv specifikation (se figur 3B, C). Specifikationen av fluorescens Mikroskop system som används i detta dokument visas i Tabell för material. Specifikationen är dock inte begränsad till vårt exempel eftersom det beror på syftet med observationen eller / och användare.
  2. Välj någon fluorescerande stam av C. elegans och underhåll som beskrivs i avsnitt 1.
    Obs: Om det är nödvändigt att följa kroppen-väggen muskulär sammandragning (se representativa resultat), använder unga vuxna HBR411C. elegans, där en reporter gen används för att uttrycka indikatorn kalcium GCaMP3.35 i alla kroppen-väggen muskelceller. Det är viktigt att använda unga vuxna (≤ 3 dagar efter kläckningen) som är tunnare än bredden på mikroflödessystem kanalerna (50 eller 60 µm) av bladet mask. Den små clearance innebär att djuren kan böjas något, gör det möjligt att iaktta en muskelsammandragning och utvidgning under genomsökning, använda en kalciumjon indikator.
  3. Genomföra inhägnad av djur enligt immobilisering förfarandet i avsnitt 4.
  4. Observera fluorescerande fläckar av djur (t.ex., grönt fluorescerande protein-märkt stammar) med fluorescens Mikroskop och fånga bilder med en digital kamera monterad på mikroskopet.
    Obs: Följ de tidigare etablerade metoder14,15,16, sedan de Mikroskop observationsmetoder (inklusive fluorescens observation) och specifikationen av mikroskopet systemet beror på Syftet med observationen.
  5. Bild kalciumjon vågutbredning använder video förvärv för att iaktta dynamisk verksamhet, såsom kroppen-väggen muskelsammandragning och förlängning i HBR4 maskar (Video 1).

7. tillämpning av masken ark för microbeam bestrålning

Obs: Den kollimerande microbeam bestrålning system5 kan använda flera tunga-Jon partiklar accelereras från den azimuthally varierande fält cyklotron installerat på den Takasaki Ion acceleratorer för avancerad strålning ansökan (TIARA) anläggning av QST-Takasaki (figur 4A). I området i närheten finns det en automatisk etapp för bestrålning under avfarten beam (figur 4B). Förfarandet för tunga-Jon microbeam bestrålning av C. elegans med detta system är följande.

  1. Leta upp bladet mask omslutande flera djur på en aluminiumram som är skräddarsydda för microbeam-bestrålningsanläggningen och ställa in den på automatisk scenen för bestrålning (figur 4C).
  2. Höja bestrålning provet (dvs, djur inneslutna i en mask ark på en ram), omedelbart under (~ 2 mm) strålen exit baserat på bildskärm bilden från Mikroskop ligger under automatisk scenen (figur 4D).
  3. Efter vertikala positionering, lokalisera varje djur till mål med microbeam bestrålning med skräddarsydda programvaran för riktade bestrålning av djur och cellkulturer. Leta upp varje djur inneslutna i ultrakalla kanalen, se bladet dedikerad beskrivs i steg 4,7-4,8 (se kompletterande fil 1) och bekräfta kanalnumret nära vänstra och högra kanterna av kanalerna.
  4. Kontrollera automatisk scenen i X och Y riktningar att placera djuren precis under balken avsluta med hjälp av en fjärrkontroll system och en lasermus drivs med programvaran bestrålning.
  5. Ungefär tune bestrålning området genom att titta på projektionen från mikroskopet ligger under automatisk scenen av provet och flytta markören till positionen bestrålning av djuret vara riktade.
  6. Efter grov positionering, avsluta och stänga bestrålning rummet och flytta till den intilliggande kontrollrummet för att undvika bestrålning operatörerna.
  7. Anger du önskat antal ion partiklar för en bestrålning förfarande, motsvarar bestrålning av en specifik region av djuret, med hjälp av konsolen länkade ett ion-counter system.
    Obs: Denna består av en plast scintillator och en multiplikator på fotoelektronen i kollimerande microbeam bestrålning systemet.
  8. Från bestrålning-kontrollrummet, finjustera positionen för djuren baserat på bildskärm bilden från mikroskopet ligger under automatisk scenen, vilket är samma bilden projiceras på skärmen i bestrålning rummet (figur 4E).
  9. Rikta microbeam bestrålning genom att klicka på knappen bestrålning av programvaran för bestrålning.
    Observera: I exemplet som visas i figur 4Fvi rikta svalget i regionen huvud och bestråla med lämpligt antal microbeam koljoner. Eftersom antalet ion partiklar passerar genom provet räknas använder ett ion-counter system kopplade till konsolen och programvaran bestrålning, stoppas bestrålning efter leverans av önskat antal ion partiklar.
  10. Leta upp varje djur som är registrerad på dedikerad bladet och utföra riktad strålbehandling varje djur. Upprepa steg 7,8 och 7,9 tills alla djur har bestrålats.
  11. Omedelbart efter bestrålning, ange bestrålning rummet och lägre automatisk bestrålning scenen. Ta bort provet på skräddarsydda ramen ligger på automatisk scenen.
  12. Samla in djur som beskrivs i steg 5.1-5.3.
  13. Genomföra beteendemässiga och/eller molekylära analyser som krävs för att utvärdera effekterna av riktade bestrålning, beroende på syftet med studien.
    Obs: Locomotion analysen beskrivs i steg 3,6 är en effektiv metod för att utvärdera effekterna av bestrålning på motilitet4,9.

8. behandling av masken ark för upprepad användning

Obs: Mask ark kan användas upprepade gånger minst 10 gånger9 med inga negativa effekter på djuren om rengöras och steriliseras ordentligt efter användning som följer.

  1. Rengöring
    1. Placera bladet används mask på en 6 cm petriskål och släppa ca 100 µL steriliserad ultrarent vatten på hela arket.
    2. Paddel vattnet på ytan av blad med handskar fingrar att tvätta bort smuts såsom damm, bakteriell mat och några ägg som i kanalerna.
    3. Torka fukten off mask arket noga med disponibla våtservetter.
  2. Sterilisering
    1. Injicera ca 5 mL 70% etanol i petriskål som mask diagrambladet och paddla ytan av bladet med behandskade fingrar för att tvätta bort smuts.
  3. Torkning
    1. Ta bort spånorna från petriskål fylld med 70% etanol och låt självtorka.
  4. Förvaring
    1. Efter torkning, placera bladet mask på en steril petriskål och täck den. Lakan kan också lagras på en steril petriskål fylld med 70% etanol.
      Obs: Det är bättre att kasta locket filmerna efter användning, men om de ska återanvändas, rengör dem som gjort för mask arket. Men om veck utvecklar på omslaget filmen efter användning kommer den inte längre följa chipet, som leder till uttorkning av djuren, och det bör därför ersättas.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Aktiva C. elegans individer kunde vara orörlig framgångsrikt använder en ultra-tunn, hydrofila PDMS, mikroflödessystem chip (mask plåt). Vi undersökt lämpligheten av olika omslag filmer för tätning av bladet mask, som beskrivs i protokollet avsnitt 3. Utvärdera tätning effekterna av omslaget filmerna, vi fastställt motiliteten djur 3 h efter på-chip immobilisering med täckglaset (tjocklek: 130-170 µm), PET-film (tjocklek: 125 µm), och PS film (tjocklek: ~ 130 µm), respektive. Som visas i figur 5, fanns det ingen signifikant skillnad i motilitet (kroppen böjar) mellan kontroll husdjur röra sig fritt för 3 h och djur inneslutna i bladet mask med PS film. Däremot reducerades signifikant motilitet i djur inneslutna under en skyddsglaset. Vissa djur föreföll har torkat ut, vilket tyder på att skyddsglaset stöts droplet-programmet, förhindra en nära tätning och djuren tillåts delvis torka ut, vilket resulterar i minskad motilitet. Motiliteten djur inneslutna med hjälp av en PET-film var också avsevärt minskat. även ingen torkning observerades, djurens motilitet tenderade att minska jämnt, tyder på att den låg syrehalt överföringshastigheten (~ 30 mL / [24 h·m²· MPa]), vilket är cirka 100 gånger lägre än som PS, orsakade djuren att kväva. Dessa resultat tyder som PS täcker filmer bör användas för att innesluta djur i bladet mask.

Vi har också tillämpas mask ark tekniken för avbildning observationer och att utföra regionspecifika microbeam bestrålning. På-chip immobilisering med en mask ark med vätskeretention och ingen autofluorescens var lämpliga för mikroskopisk observation levande villkor. Exempelvis tillämpas vi tekniken till HBR4 stam11 av C. elegans, där en reporter gen uttryckt kalcium indikatorn GCaMP3.35 i alla kroppen-väggen muskelceller. Vi observerade verksamheten i alla kroppen-väggen muskelceller hos unga vuxna djur på ≤ 3 dagar efter kläckning i masken ark med 50 µm-wide mikroflödessystem kanaler, som får djuren utrymme för att böja något. GCaMP3.35 signal intensiteten i HBR4 stam motsvarar sammandragning av kroppen-väggen muskelcellerna. Den Ca2 + vågutbredning motsvarar muskelaktivitet observerades tydligt (Video 1). Dessutom bekräftade vi att bladet masken hade ingen autofluorescens som visas i den sista etappen (sista ~ 10 s) av Video 1. På detta sätt får avsaknaden av behovet av anestesi muskelcellerna att observeras under levande förhållanden fysiologiska verksamhet.

Dessutom tillämpas vi bladet mask för region-specifika microbeam bestrålning av C. elegans individer. Flera raka mikroflödessystem kanalerna på bladet mask tillåtet flera djur att immobiliseras samtidigt, utan behov av anestesi, vilket möjliggör sekventiell bestrålning av ≥20 djur (tillräckligt för en grupp analys) på kort tid (30 min för 20 individer).

Figure 1
Figur 1 : Schematisk av en mask ark. (A) översikt över ett mask blad med en amerikansk 1-centsmyntet för skala. Bladet mask var 300 µm tjock, 15 mm bred och 15 mm lång. (B) ytan av bladet masken innehöll 25 raka mikroflödessystem kanaler (djup = 70 µm; bredd = 60 µm; längd = 8 mm). (C) Schematisk bild av de prover som består av nedre luckan filmen, bladet mask och täcka filmen. (D) bladet mask är en mjuk, ultra-tunn plåt tillverkad av PDMS, och kan böjas genom att nypa med en pincett av platta. (E) exempel på flera djur inneslutna i flera kanaler. ()F) utbyggnad av en mikroflödessystem kanal genom att trycka med en platina picker. Elasticiteten i kanalen tillåter djur till inlindas försiktigt. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2 : Body form av C. elegans. (A) Wild-type (N2) C. elegans på ett NGM tallrik. (B) en unc-119 mutant med onormal form på en NGM tallrik. (C) de unc-119 mutanter inneslutna i ultrakalla kanaler på bladet mask. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3 : Scheman över mikroskopet observation av levande C. elegans individer inneslutna i bladet mask. (A) Schematisk bild av stereomikroskopet systemet för avbildning observationer. (B) Schematisk bild av mikroskopet observation av masken plåt omslutande live C. elegans individer. (C) avsnittsvy av masken plåt omslutande live C. elegans individer placeras på Mikroskop scenen. W.D. anger arbetsavstånd av Mikroskop. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4 : Schematisk bild av kollimator microbeam systemet QST-Takasaki och riktade microbeam bestrålning förfarande för live C. elegans individer. (A) översikt av kollimerande microbeam bestrålning system5, som kan använda flera tunga-Jon partiklar accelereras från den azimuthally varierande fält cyklotron installerad på TIARA av QST-Takasaki. (B) översikt över avfarten beam och automatisk scenen för bestrålning. (C) prova inställningen på automatisk scenen kollimerande microbeam systemet. (D) vertikal placering av bestrålning provet utfördes i bestrålning rummet. (E) finjustering av bestrålning område utfördes i bestrålning-kontrollrummet. (F) riktade microbeam bestrålning av levande C. elegans. Svalget var klickade-on som riktade position och bestrålade genom att trycka knappen bestrålning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5 : Motilitet i C. elegans efter på-chip immobilisering med skyddsglaset, polyester (PET)-film och polystyren (PS) film. Staplarna visar genomsnittlig kropp böjar med djur 3 h efter på-chip immobilisering eller fri rörlighet för 3 h på en NGM tallrik (kontroll). Tio djur undersöktes och kropp kurvor var i genomsnitt mellan varje grupp. Slutligen, data från fem oberoende experiment var i genomsnitt för varje grupp. Felstaplar representera standardavvikelsen för medelvärdet av fem oberoende experiment. Alla data analyserades med envägs ANOVA på 0,05 (*) eller 0.01 (*) signifikansnivå. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Video 1
Video 1: exempel på tänkbar observationer av muskulära aktiviteter i C. elegans inneslutna i en mask ark. Kalcium-Jon vågutbredning motsvarar sammandragning av kroppen-väggen muskelceller vid crawlning hos HBR4 C. elegans individer inneslutna i en mask ark. De senaste ~ 10 s observerades under ljusa fält belysning. Vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ner.)

Supplementary Figure 1
Kompletterande fil 1: exempel på dedikerad pappersark (microbeam bestrålning version). Rita en pil för att ange positionen för varje djur i kanalen. I pilens riktning motsvarar huvudet. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

På-chip immobilisering av C. elegans levande villkor med en hydrofila PDMS mikroflödessystem chip möjliggör effektiv riktad microbeam bestrålning av flera djur. Förenklar hantering och funktioner för att förhindra uttorkning gör detta system lämpliga för applikationer inte bara i microbeam bestrålning, men också i flera behavioral analyser. Dessa mask ark har redan kommersialiserats och lätt kan erhållas. Konventionella mikroflödessystem chips, såsom lukt marker, är associerade med problem inklusive igensättning av djur och ägg i de stängda mikroflödessystem kanaler vilket gör det svårt att samla in djuren och därmed sådana marker har tenderat att vara disponibel, därmed öka kostnaden. Däremot är mikroflödessystem kanalerna i det aktuella mask arket öppna, vilket gör det enklare att samla in djuren. Dessa mask ark kan därför användas upprepade gånger, vilket gör dem mer ekonomiska.

Senaste tekniska innovationer i PDMS mikroflödessystem marker har visat en ökande trend i strukturella komplexitet och mångfunktionalitet16,18,19,20,21, 22,23. Vi anser dock att det är viktigt att göra systemet enkelt och lätt att använda. Faktiskt, i motsats till användningen av konventionella stora mikroflödessystem marker19,20,21,22,23 som kräver tillbehöret av en vakuumpump, liten storlek och enkel design av masken täcker tillåta förfaranden ska genomföras lätt inom ett begränsat utrymme.

Vatten retention prestanda av masken täcker möjliggör långsiktiga observationer skall utföras. Tjockleken på arket kan dessutom ion partiklar passera proverna, vilket möjliggör riktade bestrålning skall vidtas för att live C. elegans individer med ett exakt antal ion partiklar. Dessa fördelar av masken täcker har kraftigt utökade möjligheter för biologiska experiment.

Vi anser att det är viktigt för biologer utveckla ny utrustning och metoder för att förbättra effektiviteten i deras experiment och analyser. Masken täcker, och microbeam bestrålning programvara har utvecklats med detta syfte i åtanke och har potential att bidra till framgång för framtida innovativa experiment utöver sina ursprungliga mål.

Till bäst av vår kunskap är vår grupp de första att utveckla denna teknik över hela världen. Men kommer att dess standardiserade användning i framtiden underlätta tillämpningen av riktade microbeam bestrålning att levande djur, vilket bidrar till att identifiera rollerna för specifika cellerna eller vävnaderna i interna processer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Författarna tackar Dr. Atsushi Higashitani för slags råd angående behandling av C. elegans och Drs. Yuya Hattori, Yuichiro Yokota och Yasuhiko Kobayashi för värdefulla diskussioner. Författarna vill tacka de Caenorhabditis Genetic Center för att tillhandahålla stammar av C. elegans och E. coli. Vi tackar besättningen på cyclotronen av TIARA på QST-Takasaki för deras hjälp med den bestrålning experimenten. Vi tackar Dr. Susan Furness för redigering av ett utkast till detta manuskript. Denna studie stöddes delvis av KAKENHI (Grant nummer JP15K11921 och JP18K18839) från JSPS att M.S.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C. elegans wild-type strain Caenorhabditis Genetics Center (CGC) , Minnesota, USA N2 Wild-type C. elegans strain generally used in this study
C. elegans unc-119(e2498) III mutant strain Caenorhabditis Genetics Center (CGC) , Minnesota, USA CB4845 C. elegans strain only employed as an example of mutants with abnormal body shape 
C. elegans transgenic strain HBR4 Caenorhabditis Genetics Center (CGC) , Minnesota, USA HBR4 The genotype of this transgenic C. elegans strain is HBR4:goeIs3[pmyo-3::GCamP3.35:: unc-54–3’utr, unc-119(+)]V. This strain was only employed for imaging observation.
E. coli strain Caenorhabditis Genetics Center (CGC) , Minnesota, USA OP50 E. coli strain used as food for C. elegans
Worm Sheet IR (50/60) Biocosm, Inc., Hyogo, Japan BCM17-0001 Microfluidic chip with 25 straight 50/60-µm width channels used in all experiments and observation in this paper 
Worm Sheet 60 Biocosm, Inc., Hyogo, Japan BCM18-0001 Microfluidic chip with 20 straight 60 µm-width channels. This is sitable for adults 3-5 days after hatching at 20°C. 
Worm Sheet 50 Biocosm, Inc., Hyogo, Japan BCM18-0002 Microfluidic chip with 20 straight 50 µm-width channels. This is sitable for youg adults ~3 days after hatching at 20°C. 
MICRO COVER GLASS MATSUNAMI GLASS IND. LTD. C030401 Cover glass (thickness: 130-170 µm) used in locomotion assays in Protocol 3
Polystyrene Film Biocosm, Inc., Hyogo, Japan BCM18-0001/ BCM18-0002 Bundled items of Worm Sheets. PS filim (thickness: ~130 µm) used in locomotion assays in Protocol 3.
Polyester Film Lumirror TORAY INDUSTRIES, INC., Tokyo, Japan Lumirror T60 (t 125 µm) PET filim (thickness: 125 µm) used in locomotion assays in Protocol 3
IWAKI 60 mm/non-treated dish AGC Techno Glass Co., Ltd., Shizuoka, Japan). 1010-060 Non-treated dish used in incuvation of C. elegans in Protocol 1
IWAKI 35 mm/non-treated dish AGC Techno Glass Co., Ltd., Shizuoka, Japan). 1010-035 Non-treated dish used in locomotion assays in Protocol 3
Milli-Q Merck, France Ultrapure water
Kimwipe S-200 Nippon Paper Crecia Co., Ltd., Tokyo, Japan 62020 120 mm x 215 mm; 200 sheets/ box
WormStuff Worm Pick Genesee Scientific Corporation, CA, USA) 59-AWP Platina picker specilized for picking up C. elegans
Research Stereo Microscope System OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Japan SZX16 Micriscope used in all experiments and observation in this paper
Motorized Focus Stand for SZX16 OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Japan SZX2-ILLB This was used for bright field observation in Protocol 3-8.
Objective Lens (×1) OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Japan SDFPLAPO1×PF NA: 0.15; W.D.: 60 mm. This lends was used for bright field observation in Protocol 3-8.
Objective Lens (×2) OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Japan SDFPLAPO2XPFC NA: 0.3; W.D.: 20 mm. This  lends was used for imaging observations.
Mercury Light Source OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Japan U-LH100HG The broad emission spectrum enables a range of fluorescence imaging experiments to be conducted using all common fluorophores.
SZX16 Fluorescent filter unit (High performance for YFP) OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Japan SZX2-FYFPHQ Ex: 490-500 nm; Em: 510-560. This was used for imaging observation of HBR4 strain.
Digital Camera High Speed EXILIM CASIO COMPUTER Co., Ltd, Tokyo, Japan EX-F1 Figure 1B, 1E, 1F, Figure 2A-C, and Video 1 were obtained by using this digital camera.
Office 2013 Microsoft Co. Ltd, Redmond, WA, USA EXCEL Software used for statistical analyses

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Funayama, T., Hamada, N., Sakashita, T., Kobayashi, Y. Heavy-Ion microbeams-development and applications in biological studies. IEEE Transactions on Plasma Science. 36 (4), 1432-1440 (2008).
  2. Tanaka, A., Shikazono, N., Hase, Y. Studies on biological effects of ion beams on lethality, molecular nature of mutation, mutation rate, and spectrum of mutation phenotype for mutation breeding in higher plants. Journal of Radiation Research. 51 (3), 223-233 (2010).
  3. Ghita, M., Fernandez-Palomo, C., Fukunaga, H., Fredericia, P. M., Schettino, G., Bräuer-Krisch, E., Butterworth, K. T., McMahon, S. J., Prise, K. M. Microbeam evolution: from single cell irradiation to pre-clinical studies. International Journal of Radiation Biology. 94 (8), 708-718 (2018).
  4. Suzuki, M., Hattori, Y., Sakashita, T., Yokota, Y., Kobayashi, Y., Funayama, T. Region-specific irradiation system with heavy-ion microbeam for active individuals of Caenorhabditis elegans. Journal of Radiation Research. 58 (6), 881-886 (2017).
  5. Funayama, T., Wada, S., Yokota, Y., Fukamoto, K., Sakashita, T., Taguchi, M., Kakizaki, T., Hamada, N., Suzuki, M., Furusawa, Y., Watanabe, H., Kiguchi, K., Kobayashi, Y. Heavy-ion microbeam system at JAEA-Takasaki for microbeam biology. Journal of Radiation Research. 49 (1), 71-82 (2008).
  6. Sugimoto, T., Dazai, K., Sakashita, T., Funayama, T., Wada, S., Hamada, N., Kakizaki, T., Kobayashi, Y., Higashitani, A. Cell cycle arrest and apoptosis in Caenorhabditis elegans germline cells following heavy-ion microbeam irradiation. International Journal of Radiation Biology. 82 (1), 31-38 (2006).
  7. Fukamoto, K., Shirai, K., Sakata, T., Sakashita, T., Funayama, T., Hamada, N., Wada, S., Kakizaki, T., Shimura, S., Kobayashi, Y., Kiguchi, K. Development of the irradiation method for the first instar silkworm larvae using locally targeted heavy-ion microbeam. Journal of Radiation Research. 48 (3), 247-253 (2007).
  8. Yasuda, T., Kamahori, M., Nagata, K., Watanabe-Asaka, T., Suzuki, M., Funayama, T., Mitani, H., Oda, S. Abscopal activation of microglia in embryonic fish brain following targeted irradiation with heavy-ion microbeam. International Journal of Molecular Sciences. 18 (7), 1-15 (2017).
  9. Suzuki, M., Sakashita, T., Hattori, Y., Yokota, Y., Kobayashi, Y., Funayama, T. Development of ultra-thin chips for immobilization of Caenorhabditis elegans in microfluidic channels during irradiation and selection of buffer solution to prevent dehydration. Journal of Neuroscience Methods. 306, Aug 1 32-37 (2018).
  10. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
  11. Schwarz, J., Spies, J. P., Bringmann, H. Reduced muscle contraction and a relaxed posture during sleep-like Lethargus. Worm. 1 (1), 12-14 (2012).
  12. Saeki, S., Yamamoto, M., Iino, Y. Plasticity of chemotaxis revealed by paired presentation of a chemoattractant and starvation in the nematode Caenorhabditis elegans. Experimental Biology. 204, Pt 10 1757-1764 (2001).
  13. Sawin, E. R., Ranganathan, R., Horvitz, H. R. C. elegans locomotory rate is modulated by the environment through a dopaminergic pathway and by experience through a serotonergic pathway. Neuron. 26 (3), 619-631 (2000).
  14. Momma, K., Homma, T., Isaka, R., Sudevan, S., Higashitan, A. Heat-induced calcium leakage causes mitochondrial damage in Caenorhabditis elegans body-wall muscles. Genetics. 206 (4), 1985-1994 (2017).
  15. Kerr, R. A. Imaging the activity of neurons and muscles. WormBook. 2, 1-13 (2006).
  16. Aubry, G., Lu, H. A perspective on optical developments in microfluidic platforms for Caenorhabditis elegans research. Biomicrofluidics. 8, 011301 (2014).
  17. Lumirror Catalog. TORAY. , Available from: https://www.toray.jp/films/en/products/pdf/lumirror.pdf (2018).
  18. Otobe, K., Itou, K., Mizukubo, T. Micro-moulded substrates for the analysis of structure-dependent behaviour of nematodes. Nematology. 6 (1), 73-77 (2004).
  19. Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nature Methods. 4 (9), 727-731 (2007).
  20. Hulme, S. E., Shevkoplyas, S. S., Apfeld, J., Fontana, W., Whitesides, G. M. A microfabricated array of clamps for immobilizing and imaging C. elegans. Lab on a Chip. 7 (11), 1515-1523 (2007).
  21. Lockery, S. R., Lawton, K. J., Doll, J. C., Faumont, S., Coulthard, S. M., Thiele, T. R., Chronis, N., McCormick, K. E., Goodman, M. B., Pruitt, B. L. Artificial dirt: Microfluidic substrates for nematode neurobiology and behavior. Journal of Neurophysiology. 99 (6), 3136-3143 (2008).
  22. Gilleland, C. L., Rohde, C. B., Zeng, F., Yanik, M. F. Microfluidic immobilization of physiologically active Caenorhabditis elegans. Nature Protocols. 5 (12), 1888-1902 (2010).
  23. Fehlauer, H., Nekimken, A. L., Kim, A. A., Pruitt, B. L., Goodman, M. B., Krieg, M. Using a microfluidics device for mechanical stimulation and high resolution imaging of C. elegans. Journal of Visualized Experiments. (132), e56530 (2018).

Tags

Bioteknik fråga 145 C. elegans microbeam bestrålning på-chip immobilisering PDMS mikroflödessystem chip mask ark Vätbarheten
Immobilisering av levande <em>Caenorhabditis elegans</em> individer med en supertunna Polydimetylsiloxan mikroflödessystem Chip med vätskeretention
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Suzuki, M., Sakashita, T., Funayama, … More

Suzuki, M., Sakashita, T., Funayama, T. Immobilization of Live Caenorhabditis elegans Individuals Using an Ultra-thin Polydimethylsiloxane Microfluidic Chip with Water Retention. J. Vis. Exp. (145), e59008, doi:10.3791/59008 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter