Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Immobilisering av Live Caenorhabditis elegans individer med en Ultra-thin Polydimethylsiloxane Microfluidic brikke med vann oppbevaring

Published: March 19, 2019 doi: 10.3791/59008
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Radiation-Applied Biology Research, Takasaki Advanced Radiation Research Institute, National Institutes for Quantum and Radiological Science and Technology (QST-Takasaki)

Summary

En rekke immobilisering metoder er etablert for å tillate den målrettede bestråling av live Caenorhabditis elegans personer som bruker en nylig utviklet ultra-spinkle polydimethylsiloxane microfluidic chip med vann oppbevaring. Denne romanen på prosessoren immobilisering er også tilstrekkelig for imaging observasjoner. Detaljert behandling og programmet eksempler av brikken er forklart.

Abstract

Stråling er mye brukt for biologiske programmer og ion-beam avl, og blant disse metodene, microbeam bestråling representerer en kraftig måte å identifisere radiosensitive områder i levende organismer. Dette dokumentet beskriver en rekke på prosessoren immobilisering metoder utviklet for målrettet microbeam bestråling av levende individer av Caenorhabditis elegans. Spesielt behandling av polydimethylsiloxane (PDMS) microfluidic brikker som vi utviklet for å nakkens C. elegans enkeltpersoner uten behov for anestesi er forklart i detalj. Denne brikken, referert til som en orm ark, er resilient å tillate microfluidic kanalene skal utvides, og elastisitet tillater dyr å være innhyllet forsiktig. Også, på grunn av selvtillit adsorpsjon kapasiteten til PDMS, dyr kan tettes kanalene av dekker overflaten av ormen en tynn dekke film, der dyr ikke er trykket inn kanalene for kabinett. Ved å dreie dekselet film over, kan vi enkelt samle dyrene. Videre ormen arket viser vannretensjon og tillater C. elegans individer utsettes for mikroskopiske observasjon i lange perioder under bor forhold. I tillegg er arket bare 300 µm tykk, slik at tunge ioner som karbon ioner gjennom arket omsluttende dyrene, slik at ion partikler kan oppdages og brukte stråling dosen skal måles nøyaktig. Utvalg av dekselet filmene brukes for omsluttende dyrene er svært viktig for vellykket langvarig immobilisering, vi gjennomført valg av egnet dekke filmene og viste en anbefalt blant noen filmer. Eksempel søknad av chip introdusert vi tenkelig observasjon av muskel aktiviteter av dyr omsluttende mikrovæskekanalen orm arket, i tillegg til microbeam-bestråling. Disse eksemplene viser at ormen arkene har sterkt utvidet mulighetene for biologiske forsøk.

Introduction

Stråling, inkludert røntgenstråler, gammastråling og tunge-ion stråle, er mye brukt for biologiske applikasjoner som kreftdiagnostikk og behandling og ion-beam avl. Tallrike studier og teknologiske er for tiden fokusere på effekter av stråling1,2,3. Microbeam bestråling er en kraftig måte å identifisere radiosensitive områder i levende organismer4. Den Takasaki avansert stråling Research Institute av nasjonale institutter for Quantum og radiologiske vitenskap og teknologi (QST-Takasaki) har utviklet en teknologien å irradiate enkeltceller under mikroskopisk observasjon med tunge-ion microbeams5, og har etablert metoder for å aktivere målrettet microbeam bestråling av flere modell dyr, som Rundormer Caenorhabditis elegans4,6, silkeormer7og Oryzias latipes (japansk medaka)8. Målrettet microbeam bestråling av Rundormer C. elegans kan effektiv knockdown av bestemte områder, for eksempel nerve ringen i regionen hodet, dermed bidra til å identifisere roller av disse systemene i prosesser som bevegelse.

En metode for på prosessoren immobilisering av C. elegans individer uten behov for anestesi er utviklet for å tillate microbeam bestråling4. I tillegg for å forbedre microfluidic brikker i den tidligere studien4, har vi nylig utviklet vannbløtbart, ion-penetrable, polydimethylsiloxane (PDMS) microfluidic chips, kalles ormen ark (se Tabell for materiale), for immobilizing C. elegans enkeltpersoner9. Dette omfatter ultratynne myk ark (tykkelse = 300 µm; bredde = 15 mm; lengde = 15 mm) med flere (20 eller 25) rett microfluidic kanaler (dybde = 70 µm; bredde = 60 µm eller 50 µm; lengde = 8 mm) på overflaten (figur 1A-D). Microfluidic kanaler er åpne og la flere dyr å stå i dem samtidig (figur 1E). Arkene er resilient å tillate microfluidic kanalene skal utvides (med ~ 10%, figur 1F) og elastisitet gjør dyr til være omsluttet forsiktig. Også, på grunn av selvtillit adsorpsjon kapasiteten til PDMS, dyr kan tettes kanalene av dekker overflaten av ormen en tynn dekke film, der dyr ikke er trykket inn kanalene for kabinett. Ved å dreie dekselet film over, kan vi enkelt samle dyrene.

De gjør ikke vondt ormer når de står eller når de er samlet. Videre arkene er laget av PDMS, som er i hovedsak hydrofobe, men vannretensjon kan oppnås ved å formidle hydrophilicity til materialet. Vannretensjon og tykkelse er gunstige egenskaper av ormen ark. Vannretensjon kapasiteten forhindrer dehydrering av dyrene etter langvarig immobilisering og gjør det mulig langsiktige observasjoner utføres.

Dessuten, som beskrevet tidligere9, er arkene bare 300 µm tykk, slik at tunge ioner som karbon ioner (med en rekke ca 1 mm i vann) gjennom arket omsluttende dyrene. Dette gir ion partikler kan oppdages og brukte stråling dosen skal måles nøyaktig. Videre ormen arkene kan gjenbrukes og er dermed økonomisk. Med metoden konvensjonelle injeksjon dyrene vedlagt er noen ganger død og de kan ikke tas ut av kanalen. egg kan også tette kanalene. Dette gjør chip ubrukelig. Chips er derfor i utgangspunktet disponibel og det kost-nytte-forholdet er dårlig.

I dagens papir, vi beskrive i detalj en rekke metoder for på prosessoren immobilisering av live C. elegans personer som bruker ormen ark. Gjennom bevegelse analyser av dyr 3t etter på prosessoren immobilisering vurdert vi egnet dekke filmen. I tillegg viste vi eksempler på på prosessoren immobiliseringsløsninger til både tenkelig observasjoner og microbeam bestråling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. stammer og vedlikehold

  1. Velg en passende stamme av C. elegans og Escherichia coli (mat) avhengig av formålet av eksperimentet.
    Merk: I dagens papir, vill-type N210C. elegans (figur 2A) er vanligvis brukt, og HBR4:goeIs3 [pmyo-3::GCamP3.35::unc-54 - 3 utr, unc-119(+)] V11 er bare ansatt for imaging analysen. E. coli OP50 ble brukt som mat for C. elegans. Noen mutanter med unormal kroppsform, som unc-119(e2498) III mutant med en sammenrullede form (figur 2B), kan også stå i rett microfluidic kanaler (figur 2C).
  2. Opprettholde C. elegans ved 20 ° C på 6 cm Petri retter som inneholder 10 mL av Rundormer vekst medium (NGM) spres med overnatting-ruges (37 ° C) E. coli som beskrevet tidligere10. Hvis mulig, synkronisere utviklingsstadier C. elegans fra embryo scenen.
  3. Bruke velfødde voksen dyr, ca 3-4 dager etter klekking med en bredde på ca 50-60 µm, slik som er optimalt tilpasset størrelsen på microfluidic kanalene i ormen arkene.

2. valg av buffer løsning på prosessoren Dyna for

  1. For vannbløtbart ormen ark, kan du bruke noen buffer løsning avhengig av formålet av eksperimenter.
    Merk: Egnet buffer løsninger for på prosessoren immobilisering på PDMS microfluidic chips er definert tidligere9 og følgende buffer løsninger ble vist å har ingen innvirkning på motilitet av dyrene etter immobilisering: S basale buffer løsning (5,85 g NaCl, 1 mL av kolesterol (5 mg/mL i etanol), 50 mL 1 M pH 6.0 kalium fosfat, H2O til 1 L; steriliseres med autoklavering)10 inneholder en stor mengde NaCl, M9 fosfat buffer løsning (5 g av NaCl , 3 g av KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 1 mL 1 M MgSO4, H2O til 1 L; steriliseres med autoklavering)10, vask buffer løsning (5 mL 1 M pH 6.0 kalium fosfat, 1 mL av 1 M CaCl2, 1 mL 1 M MgSO4, 0,5 g pf gelatin, H2O til 1 L; steriliseres med autoklavering)12 som inneholder gelatin , og ultrapure vann9. I dagens papir, vaske buffer løsning brukes vanligvis og S basale buffer løsning brukes bare for evaluering på prosessoren immobilisering med forskjellige cover filmer i inndelingen 3.
  2. Konvensjonelle microfluidic chips uten wettability, bruke en vask buffer løsning, som er den mest effektive opprettholde fuktighet i microfluidic kanaler av chip og dermed hindrer tørking av C. elegans enkeltpersoner ( Uansett wettability microfluidic sjetonger).

3. valg av egnet dekke film på prosessoren Dyna for

  1. Forberede forskjellige cover filmer som følger. Basert på enkel håndtering, kuttet følgende gjennomsiktig, biokompatible dekke filmer til en passende størrelse (dvs, 10-15 mm bredde og lengde på 30-50 mm): 130-170 µm tykke coveret glass, 125 µm tykk polyester (PET) film og ~ 130 µm tykk polystyren (PS) film.
  2. Utføre 3t på prosessoren immobilisering med forskjellige cover filmer som følger. Basert på trinn 4.1-4.6, setter ≥10 vasket voksen dyr (3,5 dager etter klekking) i ormen arket med hver dekke film, henholdsvis, og la for 3 h.
  3. For sammenligning, tillate 3t fri bevegelse som følger. Sted ≥10 vasket voksen dyr på en 3,5 cm plate inneholder 3 mL frisk NGM, dekk med et lokk og la for 3 h.
  4. Samle dyr umiddelbart etter 3 h på prosessoren immobilisering etter trinn 5.1-5.3. Fjerne dekselet filmen fra ormen arket og legge en dråpe buffer løsning til hvert dyr. Plukke opp dyr svømme i slippverktøyet bruker en platina picker og overføre dem til en 3,5 cm plate inneholder 3 mL frisk NGM uten mat (analysen plate).
  5. Samle dyr etter 3 h med fri bevegelighet. Legg en dråpe buffer løsning til hvert dyr. Plukk opp dyr svømme i slippverktøyet på NGM plate og overføre dem til en analysen tallerken med en platina picker.
  6. Evaluere effekten av dekke film på motilitet (bevegelse analysen).
    1. Minst 5 min etter overføring av analysen platen, antall ' kropp svinger (definert som antall svinger i regionen fremre kroppen med 20-s mellomrom) manuelt under et mikroskop13.
    2. Utføre bevegelse analyser fem ganger uavhengig for hver dekke film.
      Merk: I eksperimentene vises i representant resultatene, 10 dyr ble vurdert for hvert eksperiment der flere dyr var vedlagt samtidig, sammenlignet med bare fem dyr telles i den tidligere studie13.
    3. Beregne gjennomsnittlig antall kroppen svinger for 10 dyrene i hver gruppe for hvert eksperiment. Deretter gjennomsnittlige verdiene fra fem uavhengige eksperimenter for å evaluere effects av på prosessoren immobilisering. Analysere dataene statistisk med en enveis analyse av varians (ANOVA) test i et regnearkprogram på betydning 0,01 og 0,05.
      Merk: Basert på disse eksperimentene, en PS dekke film med høy oksygen gjennomtrengelighet ble ansett egnet (se representant resultatene). Disse PS film tas med ormen arkene. PET filmen, som har lav oksygen gjennomtrengelighet, var ikke anses egnet fordi dyrene tendens til å kvele hvis dekket med det under langvarig immobilisering på ormen arkene. Det er også viktig at dekselet filmen ikke bryte under en rekke prosedyrer; glass dekker ble derfor også uegnet (se representant resultatene).

4. på prosessoren immobilisering

Merk: Disponibel, sterile hansker bør brukes for å unngå forurensende ormen arkene.

  1. Plass en tynn gjennomsiktig ark som en PS eller glass dekke film som har ingen autofluorescence, som en bunnen dekke film, eksperimentelle pulten eller mikroskopiske scenen. Plass en orm ark forsiktig på bunnen dekke filmen bruker flat pinsett.
    Merk: I tillegg til ormen ark med 60 µm hele microfluidic kanaler (egnet for voksne 3-4 dager etter klekking), ark med 50 µm hele kanaler (egnet for unge voksne 3 dager etter klekking og mutanter med liten kropp i voksne stadiet) kan også anvendes. Velg en passende ark basert på størrelsen av dyrene skal brukes.
  2. For å samle dyr, plukke opp en enkelt voksen C. elegans fra kultur plate under en stereomicroscope ved hjelp av en platina picker. Gjenta prosessen hvis det trengs flere dyr.
  3. Vask dyrene å fjerne mat (bakterier).
    1. Plass minst tre dråper (5 µL dråper) i buffer løsning på overflaten av en 6 cm ikke-behandlet (vannavstøtende) bensin fat.
    2. Overføre dyrene til et slippverktøy bruker en platina picker og tillate dem å fjerne noe mat ved å svømme. Vask dem to ganger i to separate dråper, og skyll dyrene i en dråpe.
      Merk: Det er nødvendig å praksis denne fremgangsmåten for å utføre det raskt før du utfører noen eksperimenter.
  4. Slipp 2-3 µL av buffer løsning på overflaten av en orm ark. Plukk opp vasket dyrene fra droplet på Petriskål og overføre dem til slippverktøyet på ormen ark.
  5. Sett dyr microfluidic kanaler som følger. Plasser en PS dekke film over ormen arket med flat pinsett og trykk forsiktig over kanalene fra den ene enden av arket til den andre å opprettholde fuktighet (som beskrevet tidligere4,9).
    Merk: Dyr står tilfeldig i kanalene. Dråpestørrelse inneholder dyr er spredt over ormen arket ved å dekke arket, som resulterer i dråper blir mye utvidet over flere kanaler. Hvert dyr kan settes i en av disse kanalene. Det viktige poenget om bruk av ormen arket på prosessoren Dyna for er at flere kanaler er tilgjengelig over et stort område.
  6. Umiddelbart etter omsluttende dyrene i microfluidic kanaler, bekrefte at de er i live ved å merke av for bevegelse av hodet under et mikroskop (f.eks 1 x eller 2 x forstørrelse).
  7. Registrere dyrets posisjon, samtidig som utfører trinn 4.6 og Legg merke til følgende på en dedikert ark (supplerende fil 1): antall kanalen der står dyr; plasseringen av hvert dyr i kanalen (venstre, senter og høyre); og retning av hodet.
  8. Tegn en pil for å markere plasseringen av hvert dyr i kanalen, med retning av pilen tilsvarer at dyret.
    Merk: Kanalnumrene (f.eks, 1, 5, 10, 15, 20, 25) er gravert på overflaten av ormen arket nær venstre og høyre microfluidic kanaler (figur 1B). Denne informasjonen om dedikert arket gjør dyr plasseres raskt, noe som gjør prosessen mer effektiv, og hjelper for å forhindre stråling lekkasje under påfølgende trinnene.

5. samling av dyr fra en orm ark

  1. Umiddelbart etter immobilisering, fjerne dekselet filmen fra ormen ark ved hjelp av flat pinsett.
  2. Slippe 10-15 µL buffer løsning på microfluidic kanalene omsluttende dyrene og observere dyrene begynner å svømme i dråper under en stereomicroscope.
    Merk: Dyrene Begynn å svømme i nye slippverktøyet på sin egen uten ytterligere press, hjelp eller push. Bare slippe noen buffer oppå er nok til å gjøre dem svømme ut av kanalen. Et dyr ikke kan svømme i et slippverktøy hvis det har blitt svært skadet ved bestråling i trinn 7.9 eller immobilisering prosessen i trinn 4,2-4.5, men dette er sjelden. I tillegg hvis dyret fortsatt festet til dekselet filmen når den fjernes, legge dråpene på dekselet filmen i stedet for i kanalene.
  3. Plukk opp dyr svømme i slippverktøyet bruker en platina picker og plassere dem på en analysen plate.

6. Bruk av ormen ark for imaging observasjoner

Merk: Ormen ark kan bli mye brukt i mikroskopiske observasjoner. Brikken kan beholde vann og påvirker ikke motilitet av C. elegans personer etter 3 h på prosessoren immobilisering9. I tillegg har flis selv ingen autofluorescence, og er egnet for bruk i fluorescens imaging analyser. Et eksempelprogram for fluorescens tenkelig analysen er angitt nedenfor.

  1. Velg fluorescens mikroskop og montere et digitalt kamera eller digitalt videokamera på mikroskopet ta bilder eller videoer, henholdsvis (Figur 3A).
    Merk: Arbeidsavstand (WD) av mikroskopet er mer enn 0.2 mm avhengig av linsen spesifikasjon (se Figur 3B, C). Spesifikasjon av fluorescens mikroskop systemet brukes i dette papiret vises i Tabellen for materiale. Spesifikasjonen er imidlertid ikke begrenset til vårt eksempel fordi det avhenger av formålet med observasjon eller / og brukere.
  2. Velg fluorescerende belastning C. elegans og vedlikehold som beskrevet i del 1.
    Merk: Hvis det er nødvendig å observere kroppen-vegg muskel sammentrekning (se representant resultater), bruke ung voksen HBR411C. elegans, der en reporter genet brukes å uttrykke indikatoren kalsium GCaMP3.35 i alle kropp-vegg muskelceller. Det er viktig å bruke unge voksne (≤3 dager etter klekking) som er tynnere enn bredden på microfluidic kanaler (50 eller 60 µm) for ormen arket. Liten grad klaring betyr at dyr kan bøye litt, gjør det mulig å observere muskel sammentrekning og filtypen under kravlesøk, bruker en kalsium ion indikator.
  3. Utføre dyr etter immobilisering fremgangsmåten i del 4 av kabinettet.
  4. Observere fluorescerende flekker av dyr (f.eksgrønt fluorescerende protein-merket stammer) bruker fluorescens mikroskop, og ta bilder med et digitalt kamera montert på mikroskopet.
    Merk: Følg de tidligere etablerte metoder14,15,16, siden mikroskop observasjon metoder (inkludert fluorescens observasjon) og spesifikasjon av mikroskopet systemet avhenger Formålet med observasjon.
  5. Bildet kalsium-ion bølgeutbredelse bruker video oppkjøpet for å observere dynamisk aktiviteter, som kroppen-vegg muskel sammentrekning og filtypen i HBR4 ormer (Video 1).

7. Bruk av ormen ark for microbeam bestråling

Merk: Collomating microbeam bestråling system5 kan bruke flere tunge-ion partikler akselerert fra den azimuthally varierende feltet cyclotron installert på Takasaki Ion akseleratorer for avansert stråling program (TIARA) anlegg av QST-Takasaki (Figur 4A). Det er en automatisk scene for bestråling under strålen exit (Figur 4B). Prosedyren for tunge-ion microbeam bestråling av C. elegans bruke dette systemet er som følger.

  1. Finn ormen arket sette flere dyr på aluminiumsramme skreddersydd for microbeam-bestråling anlegget og sette den på automatisk scenen for bestråling (Figur 4C).
  2. Heve bestråling prøven (dvs., dyr i et ORM-ark på en ramme) til umiddelbart under (~ 2 mm) bjelken ut basert på bildet på skjermen fra et mikroskop ligger under automatisk scenen (Figur 4D).
  3. Når Vertikal plassering, finner du hvert dyr mål med det microbeam irradiation ved hjelp av skreddersydd programvare for målrettet bestråling av dyr og cellekulturer. Du finner hvert dyr i mikrovæskekanalen, se dedikert arket beskrives i trinn 4,7-4,8 (se utfyllende fil 1) og bekrefte kanalnummeret nær venstre og høyre kanaler.
  4. Kontrollere automatisk scenen i X og Y retninger å plassere dyrene like under strålen avslutte med en fjernkontroll system og en lasermus drives med bestråling programvaren.
  5. Omtrent melodi bestråling området ved å se anslaget fra mikroskopet plassert under automatisk scenen i eksemplet og flytte markøren til bestråling plasseringen av dyret bli målrettet.
  6. Etter grov posisjonering, Avslutt og Lukk bestråling rommet og flytte til tilstøtende kontrollrommet for å unngå irradiating operatørene.
  7. Angir ønsket antall ion partikler en bestråling inngrepet, tilsvarer bestråling av et bestemt område av dyret, bruker konsollen koblet til et ion-counter-system.
    Merk: Dette består av en plast scintillator og noe photoelectron i collomating microbeam bestråling systemet.
  8. Finjustere plasseringen av dyrene basert på bildet på skjermen fra mikroskopet ligger under automatisk scenen, som er det samme bildet projiseres på skjermen i bestråling rommet (Figur 4E) fra rommet bestråling-kontroll.
  9. Målrette microbeam bestråling ved å klikke knappen bestråling av programvaren for bestråling.
    Merk: I eksemplet i Figur 4Fvi målrette pharynx i regionen hodet og irradiate med riktig antall microbeam karbon ioner. Fordi antall ion partikler passerer prøven telles med et ion-counter system knyttet til konsollen og bestråling programvaren, er irradiation stoppet etter levering av ønsket antall ion partikler.
  10. Finn hvert dyr registrert på dedikert ark og utføre målrettet bestråling til hvert dyr. Gjenta trinn 7,8 og 7.9 til alle dyr har blitt irradiated.
  11. Umiddelbart etter bestråling, angi bestråling rommet og lavere automatisk bestråling scenen. Fjerne prøven på skreddersydde rammen på automatisk scenen.
  12. Samle dyrene som beskrevet i trinnene 5.1-5.3.
  13. Utføre opptreden og/eller molekylær analyser som trengtes for å evaluere effekten av de målrettede bestråling, avhengig av formålet av studien.
    Merk: Bevegelse analysen beskrevet i trinn 3.6 er en effektiv metode for å vurdere effekten av bestråling på motilitet4,9.

8. behandling av ormen ark for gjentatt bruk

Merk: Ormen ark kan brukes gjentatte ganger minst 10 ganger9 uten bivirkninger på dyrene hvis rengjøres og steriliseres riktig etter bruk som følger.

  1. Rengjøring
    1. Plasser brukte ormen arket på en 6 cm Petriskål og slipp 100 µL sterilisert ultrapure vann på hele arket.
    2. Padle vannet på overflaten av arket ved hjelp hansker fingre for å vaske av smuss som støv, bakteriell mat og noen egg lagt i kanalene.
    3. Tørk fuktighet av ormen arket grundig bruke engangs kluter.
  2. Sterilisering
    1. Injisere ca 5 mL av 70% etanol i Petriskål som inneholder ormen arket og padle overflaten av arket bruker hansker fingrene til å vaske skitten.
  3. Tørking
    1. Fjerne flisen fra Petriskål fylt med 70% etanol og la tørke naturlig.
  4. Lagring
    1. Etter tørking, plassere ormen arket på et sterilt Petriskål og dekke det. Ark kan også lagres på et sterilt Petriskål fylt med 70% etanol.
      Merk: Det er bedre å avhende dekke filmene etter bruk, men hvis de skal være re-anvendt, rengjøre dem som ormen arket. Men hvis kaster på dekke film etter bruk vil det ikke lenger følge til chip, som fører til dehydrering av dyrene, og den bør derfor byttes.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Aktive C. elegans enkeltpersoner kan bli immobilisert vellykket bruker en ultratynn og vannbløtbart PDMS, microfluidic chip (orm ark). Vi undersøkt hensiktsmessigheten av forskjellige cover filmer for tetting ormen arket, som beskrevet i del 3-protokollen. For å evaluere tetting effekten av dekselet filmene, vi bestemt motilitet i dyr 3t etter på prosessoren immobilisering bruke cover glass (tykkelse: 130-170 µm), PET film (tykkelse: 125 µm), og PS film (tykkelse: ~ 130 µm), henholdsvis. Som vist i figur 5, var det ingen signifikant forskjell i motilitet (kroppen svinger) mellom kontrollen dyr lov til å flytte fritt for 3t og dyr i ormen arket med PS film. Derimot ble motilitet betydelig redusert i dyr lukket under et dekke glass. Noen dyr syntes å ha tørket ut, antyder at dekket glasset frastøtt slippverktøyet, forhindrer en tett forsegling og tillater dyr til delvis tørke ut, noe som resulterer i redusert motilitet. Motilitet av dyr omsluttet med en PET film var også betydelig redusert; Selv om ingen tørking ble observert, dyr motilitet tendens til å redusere jevnt, tyder på at overføringshastigheten oksygen (~ 30 mL / [24 h·m²· MPa]), som er 100 ganger lavere enn av PS, forårsaket dyrene å kvele. Disse resultatene tyder som PS dekker filmer skal brukes til å omslutte dyr i ormen arket.

Vi har også brukt ormen ark teknikken for imaging observasjoner og utføre områdespesifikk microbeam bestråling. På prosessoren immobilisering bruker en orm ark med vann oppbevaring og ingen autofluorescence var egnet for mikroskopiske observasjon under bor forhold. For eksempel brukt vi teknikken HBR4 belastning11 av C. elegans, der en reporter genet uttrykt indikatoren kalsium GCaMP3.35 i alle kropp-vegg muskelceller. Vi observerte aktiviteter alle kropp-vegg muskelcellene i ung voksen dyr ≤3 dager etter klekking i ormen ark med 50 µm hele microfluidic kanaler, som tillot dyrene plass for å bøye litt. GCaMP3.35 signalet intensiteten i HBR4 belastningen tilsvarer sammentrekning av kroppen-vegg muskelceller. Av Ca2 + bølgeutbredelse tilsvarer muskelaktivitet ble tydelig observert (Video 1). I tillegg vi bekreftet at ormen arket hadde ingen autofluorescence som vist i den siste etappen (vare ~ 10 s) Video1. På denne måten tillatt mangel på behovet for anestesi fysiologiske aktiviteter muskelceller følges under bor forhold.

Videre har brukt vi ormen arket ved områdespesifikk microbeam bestråling av C. elegans individer. Flere rett microfluidic kanalene på ormen arket tillatt flere dyr å bli immobilisert samtidig, uten behov for anestesi, dermed gir sekvensiell bestråling av ≥20 dyr (nok for en gruppe analysen) på kort tid (30 min for 20 individer).

Figure 1
Figur 1 : Skjematisk av ormen arket. (A) oversikt av ormen arket med en amerikansk 1 cent mynt for skala. Ormen arket var 300 µm tykk, 15 mm bred og 15 mm lang. (B) overflaten av ormen arket finnes 25 rett microfluidic kanaler (dybde = 70 µm; bredde = 60 µm; lengde = 8 mm). (C) skjematisk av prøvene bestående av bunnen dekke film, ormen arket og dekke filmen. (D) ormen arket er en myk, ultra-tynne ark laget av PDMS, og kan være bøyd av knipe med flat pinsett. (E) eksempel på flere dyr i flere kanaler. (F) utvidelse av en mikrovæskekanalen ved å trykke med en platina picker. Elastisitet av kanalen gjør dyr til være omsluttet forsiktig. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 : Body skjemaet C.elegans. (A) vill-type (N2) C. elegans på en NGM plate. (B) en unc-119 mutant med unormal form på en NGM plate. (C) unc-119 mutanter i microfluidic kanalene av ormen arket. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 : Skjematisk av mikroskopet observasjon av live C. elegans individer i ormen arket. (A) skjematisk av stereomicroscope system for imaging observasjoner. (B) skjematisk av mikroskopet observasjon av ormen ark omsluttende live C. elegans individer. (C) inndelingsvisning av ormen ark omsluttende live C. elegans personer plassert på scenen mikroskop. W.D. angir arbeidsavstand av mikroskopet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4 : Skjematisk av collomating microbeam system på QST-Takasaki og målrettet microbeam bestråling fremgangsmåte for live C. elegans individer. (A) oversikt over collomating microbeam bestråling system5, som kan bruke flere tunge-ion partikler akselerert fra den azimuthally varierende feltet cyclotron installert på TIARA av QST-Takasaki. (B) oversikt over avkjørselen stråle og automatisk scenen for bestråling. (C) prøve innstillingen automatisk scenen av collomating microbeam. (D) Vertikal plassering av bestråling utvalget gjennomført på bestråling rommet. (E) finjustering av bestråling gjennomført i bestråling-kontrollen room. (F) målrettet microbeam bestråling av live C. elegans. Pharynx var klikkede som målrettet posisjon og bestrålt ved å trykke knappen bestråling. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5 : Motilitet av C. elegans etter på prosessoren immobilisering cover glass, polyester (PET) film og polystyren (PS) filmen. Stolper angir gjennomsnittlig bøyer av dyr 3t etter på prosessoren immobilisering eller fri bevegelighet for 3 h på en NGM plate (kontroll). Ti dyr ble undersøkt og kroppen svinger var gjennomsnitt mellom hver gruppe. Til slutt, data fra fem uavhengige eksperimenter var gjennomsnitt for hver gruppe. Feilfelt representerer standard feil av gjsnitt fem uavhengige eksperimenter. Alle data ble analysert bruker enveis ANOVA på 0,05 (*) eller 0,01 (*) signifikansnivået. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Video 1
Video 1: eksempler på tenkelig observasjoner av muskel aktiviteter i C. elegans i et ORM-ark. Kalsium-ion bølgeutbredelse tilsvarer sammentrekning av kroppen-vegg muskelceller under kravlesøk i HBR4 C. elegans personer i et ORM-ark. De siste ~ 10 s ble observert under lyse-feltet belysning. Vennligst klikk her å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)

Supplementary Figure 1
Supplerende fil 1: eksempel på dedikerte ark (microbeam bestråling versjon). Tegn en pil som angir plasseringen av hvert dyr i kanalen. Retning av pilen tilsvarer hodet. Klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

På prosessoren immobilisering C. elegans under bor forhold med en vannbløtbart PDMS microfluidic brikke muliggjør effektiv målrettet microbeam bestråling av flere dyr. Enkel håndtering og funksjoner for å hindre tørking gjør dette systemet egnet for programmer ikke bare i microbeam bestråling, men også i flere atferdsmessige analyser. Disse ormen ark har allerede blitt kommersialisert og oppnås enkelt. Konvensjonelle microfluidic chips, for eksempel olfactory brikker, er forbundet med problemer inkludert tilstopping og egg i lukkede microfluidic kanaler gjør det vanskelig å samle dyrene, og dermed slike brikker har tendens til å være disponibel, og dermed øke kostnadene. Microfluidic kanalene i gjeldende ormen ark er åpen, gjør det enklere å samle dyrene. Disse ormen ark kan derfor brukes flere ganger, noe som gjør dem mer økonomisk.

Siste teknologiske nyvinningene i PDMS microfluidic chips har vist en stigende trend strukturelle kompleksitet og multifunksjonalitet16,18,19,20,21, 22,23. Vi tror imidlertid at det er viktig å gjøre systemet enkelt og brukervennlig. Faktisk, i motsetning til bruk av konvensjonelle store microfluidic chips19,20,21,22,23 som krever feste en vakuumpumpe, liten størrelse og enkle utformingen av ormen arkene prosedyrer gjennomføres lett i en begrenset plass.

Vann oppbevaring ytelsen til ormen arkene kan langsiktige observasjoner utføres. I tillegg kan tykkelsen på arket ion partikler passerer prøvene, dermed muliggjør målrettet bestråling brukes for å leve C. elegans individer med et nøyaktig antall ion partikler. Disse fordelene av ormen ark har sterkt utvidet mulighetene for biologiske forsøk.

Vi tror at det er viktig for biologer å utvikle nytt utstyr og metoder for å forbedre effektiviteten av sine eksperimenter og analyser. Ormen ark og microbeam bestråling programvare har blitt utviklet med sikte på dette, og har potensial til å bidra til suksess for senere nyskapende eksperimenter utover deres opprinnelige mål.

Til best av vår kunnskap er vår gruppe først å utvikle denne teknologi over hele verden. Men vil bruken standardisert i fremtiden lette anvendelsen av målrettet microbeam bestråling dyr under bor forhold, dermed bidra til å identifisere rollene til bestemte celler/vev i interne prosesser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne takker Dr. Atsushi Higashitani for snill råd om behandling av C. elegans og Dr. Yuya Hattori, Yuichiro Yokota og Yasuhiko Kobayashi for verdifulle diskusjoner. Forfatterne takker Caenorhabditis genetisk Center for å gi stammer av C. elegans og E. coli. Vi takker mannskapet på cyclotron av TIARA på QST-Takasaki for deres type hjelp med bestråling eksperimenter. Vi takker Dr. Susan Furness for å redigere et utkast av dette manuskriptet. Denne studien ble støttet i en del av KAKENHI (Grant tall JP15K11921 og JP18K18839) fra JSP til M.S.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C. elegans wild-type strain Caenorhabditis Genetics Center (CGC) , Minnesota, USA N2 Wild-type C. elegans strain generally used in this study
C. elegans unc-119(e2498) III mutant strain Caenorhabditis Genetics Center (CGC) , Minnesota, USA CB4845 C. elegans strain only employed as an example of mutants with abnormal body shape 
C. elegans transgenic strain HBR4 Caenorhabditis Genetics Center (CGC) , Minnesota, USA HBR4 The genotype of this transgenic C. elegans strain is HBR4:goeIs3[pmyo-3::GCamP3.35:: unc-54–3’utr, unc-119(+)]V. This strain was only employed for imaging observation.
E. coli strain Caenorhabditis Genetics Center (CGC) , Minnesota, USA OP50 E. coli strain used as food for C. elegans
Worm Sheet IR (50/60) Biocosm, Inc., Hyogo, Japan BCM17-0001 Microfluidic chip with 25 straight 50/60-µm width channels used in all experiments and observation in this paper 
Worm Sheet 60 Biocosm, Inc., Hyogo, Japan BCM18-0001 Microfluidic chip with 20 straight 60 µm-width channels. This is sitable for adults 3-5 days after hatching at 20°C. 
Worm Sheet 50 Biocosm, Inc., Hyogo, Japan BCM18-0002 Microfluidic chip with 20 straight 50 µm-width channels. This is sitable for youg adults ~3 days after hatching at 20°C. 
MICRO COVER GLASS MATSUNAMI GLASS IND. LTD. C030401 Cover glass (thickness: 130-170 µm) used in locomotion assays in Protocol 3
Polystyrene Film Biocosm, Inc., Hyogo, Japan BCM18-0001/ BCM18-0002 Bundled items of Worm Sheets. PS filim (thickness: ~130 µm) used in locomotion assays in Protocol 3.
Polyester Film Lumirror TORAY INDUSTRIES, INC., Tokyo, Japan Lumirror T60 (t 125 µm) PET filim (thickness: 125 µm) used in locomotion assays in Protocol 3
IWAKI 60 mm/non-treated dish AGC Techno Glass Co., Ltd., Shizuoka, Japan). 1010-060 Non-treated dish used in incuvation of C. elegans in Protocol 1
IWAKI 35 mm/non-treated dish AGC Techno Glass Co., Ltd., Shizuoka, Japan). 1010-035 Non-treated dish used in locomotion assays in Protocol 3
Milli-Q Merck, France Ultrapure water
Kimwipe S-200 Nippon Paper Crecia Co., Ltd., Tokyo, Japan 62020 120 mm x 215 mm; 200 sheets/ box
WormStuff Worm Pick Genesee Scientific Corporation, CA, USA) 59-AWP Platina picker specilized for picking up C. elegans
Research Stereo Microscope System OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Japan SZX16 Micriscope used in all experiments and observation in this paper
Motorized Focus Stand for SZX16 OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Japan SZX2-ILLB This was used for bright field observation in Protocol 3-8.
Objective Lens (×1) OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Japan SDFPLAPO1×PF NA: 0.15; W.D.: 60 mm. This lends was used for bright field observation in Protocol 3-8.
Objective Lens (×2) OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Japan SDFPLAPO2XPFC NA: 0.3; W.D.: 20 mm. This  lends was used for imaging observations.
Mercury Light Source OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Japan U-LH100HG The broad emission spectrum enables a range of fluorescence imaging experiments to be conducted using all common fluorophores.
SZX16 Fluorescent filter unit (High performance for YFP) OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Japan SZX2-FYFPHQ Ex: 490-500 nm; Em: 510-560. This was used for imaging observation of HBR4 strain.
Digital Camera High Speed EXILIM CASIO COMPUTER Co., Ltd, Tokyo, Japan EX-F1 Figure 1B, 1E, 1F, Figure 2A-C, and Video 1 were obtained by using this digital camera.
Office 2013 Microsoft Co. Ltd, Redmond, WA, USA EXCEL Software used for statistical analyses

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Funayama, T., Hamada, N., Sakashita, T., Kobayashi, Y. Heavy-Ion microbeams-development and applications in biological studies. IEEE Transactions on Plasma Science. 36 (4), 1432-1440 (2008).
  2. Tanaka, A., Shikazono, N., Hase, Y. Studies on biological effects of ion beams on lethality, molecular nature of mutation, mutation rate, and spectrum of mutation phenotype for mutation breeding in higher plants. Journal of Radiation Research. 51 (3), 223-233 (2010).
  3. Ghita, M., Fernandez-Palomo, C., Fukunaga, H., Fredericia, P. M., Schettino, G., Bräuer-Krisch, E., Butterworth, K. T., McMahon, S. J., Prise, K. M. Microbeam evolution: from single cell irradiation to pre-clinical studies. International Journal of Radiation Biology. 94 (8), 708-718 (2018).
  4. Suzuki, M., Hattori, Y., Sakashita, T., Yokota, Y., Kobayashi, Y., Funayama, T. Region-specific irradiation system with heavy-ion microbeam for active individuals of Caenorhabditis elegans. Journal of Radiation Research. 58 (6), 881-886 (2017).
  5. Funayama, T., Wada, S., Yokota, Y., Fukamoto, K., Sakashita, T., Taguchi, M., Kakizaki, T., Hamada, N., Suzuki, M., Furusawa, Y., Watanabe, H., Kiguchi, K., Kobayashi, Y. Heavy-ion microbeam system at JAEA-Takasaki for microbeam biology. Journal of Radiation Research. 49 (1), 71-82 (2008).
  6. Sugimoto, T., Dazai, K., Sakashita, T., Funayama, T., Wada, S., Hamada, N., Kakizaki, T., Kobayashi, Y., Higashitani, A. Cell cycle arrest and apoptosis in Caenorhabditis elegans germline cells following heavy-ion microbeam irradiation. International Journal of Radiation Biology. 82 (1), 31-38 (2006).
  7. Fukamoto, K., Shirai, K., Sakata, T., Sakashita, T., Funayama, T., Hamada, N., Wada, S., Kakizaki, T., Shimura, S., Kobayashi, Y., Kiguchi, K. Development of the irradiation method for the first instar silkworm larvae using locally targeted heavy-ion microbeam. Journal of Radiation Research. 48 (3), 247-253 (2007).
  8. Yasuda, T., Kamahori, M., Nagata, K., Watanabe-Asaka, T., Suzuki, M., Funayama, T., Mitani, H., Oda, S. Abscopal activation of microglia in embryonic fish brain following targeted irradiation with heavy-ion microbeam. International Journal of Molecular Sciences. 18 (7), 1-15 (2017).
  9. Suzuki, M., Sakashita, T., Hattori, Y., Yokota, Y., Kobayashi, Y., Funayama, T. Development of ultra-thin chips for immobilization of Caenorhabditis elegans in microfluidic channels during irradiation and selection of buffer solution to prevent dehydration. Journal of Neuroscience Methods. 306, Aug 1 32-37 (2018).
  10. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
  11. Schwarz, J., Spies, J. P., Bringmann, H. Reduced muscle contraction and a relaxed posture during sleep-like Lethargus. Worm. 1 (1), 12-14 (2012).
  12. Saeki, S., Yamamoto, M., Iino, Y. Plasticity of chemotaxis revealed by paired presentation of a chemoattractant and starvation in the nematode Caenorhabditis elegans. Experimental Biology. 204, Pt 10 1757-1764 (2001).
  13. Sawin, E. R., Ranganathan, R., Horvitz, H. R. C. elegans locomotory rate is modulated by the environment through a dopaminergic pathway and by experience through a serotonergic pathway. Neuron. 26 (3), 619-631 (2000).
  14. Momma, K., Homma, T., Isaka, R., Sudevan, S., Higashitan, A. Heat-induced calcium leakage causes mitochondrial damage in Caenorhabditis elegans body-wall muscles. Genetics. 206 (4), 1985-1994 (2017).
  15. Kerr, R. A. Imaging the activity of neurons and muscles. WormBook. 2, 1-13 (2006).
  16. Aubry, G., Lu, H. A perspective on optical developments in microfluidic platforms for Caenorhabditis elegans research. Biomicrofluidics. 8, 011301 (2014).
  17. Lumirror Catalog. TORAY. , Available from: https://www.toray.jp/films/en/products/pdf/lumirror.pdf (2018).
  18. Otobe, K., Itou, K., Mizukubo, T. Micro-moulded substrates for the analysis of structure-dependent behaviour of nematodes. Nematology. 6 (1), 73-77 (2004).
  19. Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nature Methods. 4 (9), 727-731 (2007).
  20. Hulme, S. E., Shevkoplyas, S. S., Apfeld, J., Fontana, W., Whitesides, G. M. A microfabricated array of clamps for immobilizing and imaging C. elegans. Lab on a Chip. 7 (11), 1515-1523 (2007).
  21. Lockery, S. R., Lawton, K. J., Doll, J. C., Faumont, S., Coulthard, S. M., Thiele, T. R., Chronis, N., McCormick, K. E., Goodman, M. B., Pruitt, B. L. Artificial dirt: Microfluidic substrates for nematode neurobiology and behavior. Journal of Neurophysiology. 99 (6), 3136-3143 (2008).
  22. Gilleland, C. L., Rohde, C. B., Zeng, F., Yanik, M. F. Microfluidic immobilization of physiologically active Caenorhabditis elegans. Nature Protocols. 5 (12), 1888-1902 (2010).
  23. Fehlauer, H., Nekimken, A. L., Kim, A. A., Pruitt, B. L., Goodman, M. B., Krieg, M. Using a microfluidics device for mechanical stimulation and high resolution imaging of C. elegans. Journal of Visualized Experiments. (132), e56530 (2018).

Tags

Bioteknologi problemet 145 C. elegans microbeam bestråling på prosessoren immobilisering PDMS microfluidic chip ormen ark wettability
Immobilisering av Live <em>Caenorhabditis elegans</em> individer med en Ultra-thin Polydimethylsiloxane Microfluidic brikke med vann oppbevaring
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Suzuki, M., Sakashita, T., Funayama, … More

Suzuki, M., Sakashita, T., Funayama, T. Immobilization of Live Caenorhabditis elegans Individuals Using an Ultra-thin Polydimethylsiloxane Microfluidic Chip with Water Retention. J. Vis. Exp. (145), e59008, doi:10.3791/59008 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter