Summary
Her præsenterer vi en protokol til at teste glomerulær permeabilitet i mus ved hjælp af en meget følsom, ikke-radioaktiv Tracer. Denne metode giver mulighed for gentagne urinanalyser med små urin volumener.
Abstract
Tabet af albumin i urinen (albuminuri) forudsiger kardiovaskulære udfald. Under fysiologiske forhold filtreres små mængder albumin af glomerulus og reabsorberes i det rørformede system indtil Absorptionsgrænsen nås. Tidlige stigninger i patologisk albumin filtrering kan således gå glip af ved at analysere albuminuria. Derfor er brugen af røbestoffer til at teste glomerulær permselektivitet synes fordelagtig. Fluorescently mærket Tracer fluorescein isothiocyanat (FITC)-polysakkarose (dvs., FITC-Ficoll), kan anvendes til at studere glomerulær permselektivitet. FITC-polysaccharosemolekyler filtreres frit af glomerulus, men ikke reabsorberes i det rørformede system. Hos mus og rotter er FITC-polysakkarose blevet undersøgt i modeller af glomerulær permeabilitet ved hjælp af teknisk komplekse procedurer (dvs. radioaktive målinger, højtydende væskekromatografi [HPLC], gel-filtrering). Vi har modificeret og lettet en FITC-polysakkarose Tracer-baserede protokol til at teste tidlige og små stigninger i glomerulær permeabilitet til FITC-polysakkarose 70 (størrelse af albumin) i mus. Denne metode muliggør gentagne urinanalyser med små urin volumener (5 μL). Denne protokol indeholder oplysninger om, hvordan Tracer FITC-polysaccharose 70 påføres intravenøst, og urin opsamles via et simpelt urin kateter. Urinen analyseres via en fluorescens plade læser og normaliseret til en urin koncentrations markør (kreatinin), hvorved man undgår teknisk komplekse procedurer.
Introduction
Funktionelle eller strukturelle defekter inden for den glomerulære filtrerings barriere øger glomerulær permeabilitet til albumin, hvilket resulterer i påvisning af albumin i urinen (albuminuri). Albuminuria forudsiger hjerte-kar-udfald og er en vigtig markør for glomerulær skade1. Selv lave niveauer af albuminuri, liggende inden for normalområdet, er forbundet med en øget kardiovaskulær risiko1.
Under fysiologiske forhold filtreres albumin gennem glomerulus og er næsten fuldstændigt genabsorberet i det rørformede system2,3. I mus udføres påvisning af albumin i urinen sædvanligvis af en albumin enzym forbundet immunosorbent assay (ELISA) fra 24 timers urinopsamling. Hvis der anvendes urin fra en urinopsamling eller spot urin på 24 timer, kan små forskelle i albumin koncentrationer gå tabt på grund af analyse følsomheds problemer. De fleste forskere bruger derfor dyremodeller, hvor albuminuri induceres af robust nyreskade på grund af toksiner, narkotika og nyre kirurgi.
Derfor er konstateringen af en følsom metode til påvisning af små og forbigående ændringer i glomerulær permeabilitet meget vigtig for marken. Rippe et al. har præsenteret en rotte model til at teste glomerulær permeabilitet ved at anvende en fluorescently mærket Tracer, nemlig FITC-polysaccharose 70 (dvs., FITC-Ficoll 70), på størrelse med albumin4. Den Tracer ansøgning tillader afprøvning af kortsigtede ændringer i glomerulær permeabilitet (inden for minutter) og er meget følsom4. To undersøgelser har brugt Tracer-metoden i mus5,6. På trods af sine fordele, denne metode, desværre, har ulemper: det er teknisk meget komplekst, radioaktivt, og invasiv. Yderligere analyse af urinen opnås kun ved hjælp af gel filtrering eller størrelses udelukkelse HPLC5,6.
Inden for dette papir præsenterer vi en alternativ, følsom, ikke-radioaktiv og hurtig metode til at måle glomerulær permeabilitet i mus ved hjælp af fluorescently mærket FITC-polysaccharose 70. Ved at introducere et transuretral kateter er urin indsamlingen mindre invasiv end blære punktering, urethrotomi og suprapubisk kateter applikation, og giver mulighed for opsamling af urin mindst hver 30 min. urinanalyse udføres fra små mængder (5μl) ved hjælp af en fluorescerende plade læser. Spor koncentrationerne i urinen normaliseret til kreatinin koncentrationer i urinen ved hjælp af en enzymatisk kreatinin-analyse.
Derfor, denne nye metode tilbyder et følsomt værktøj til at studere tidlig glomerulær skade med øget glomerulær permeabilitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Undersøgelserne blev gennemført i henhold til de retningslinjer, der er skitseret i vejledningen for pleje og anvendelse af forsøgsdyr (US National Institutes of Health publikation nr. 85-23, revideret 1996). Alle dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med de relevante institutionelle godkendelser (delstatsregeringen Landesamt für natur, Umwelt und Verbraucherschutz [LANUV] referencenummer 84-02.04.2012. A397).
1. forberedelse af instrumenter, løsninger og udstyr
- FITC-polysaccharose 70 rekonstruere med 0,9% steril natriumchlorid (NaCl) til en endelig koncentration på 10 mg/mL (dvs. 100 mg i 10 mL NaCl).
- Dialyze FITC-polysaccharose 70 opløsning til at fjerne frie FITC molekyler natten over ved 4 °C (molekylvægt cut-off [MWCO] ved 10.000). Brug 1 L af 0,9% steril NaCl pr. 10 mL FITC-polysaccharose 70 under konstant omrøring. Beskyt mod lys. Aliquot det dialyserede FITC-polysaccharose 70 og opbevar det ved-20 °C.
- For FITC-polysaccharose 70-bolte tilsættes 4 μL 10 mg/mL FITC-polysaccharose 70 opløsning til 996 μL 0,9% NaCl (den endelige koncentration af FITC-polysakkarose 70:40 μg/mL).
- For ækvibrations infusionsopløsningen tilsættes 20 μL af en 10 mg/mL FITC-polysaccharose 70 opløsning til 9,98 mL 0,9% steril NaCl, hvilket giver en endelig koncentration på 20 μg/mL.
- For den eksperimentelle opløsning tilsættes stoffer eller stoffer til infusionsvæsken (f. eks. for angiotensin II [Ang II] [100 ng/kg/min] for en 25 g mus tilsættes 3 μL Ang II af en 1 mM opløsning).
- Til operationen, forberede en shaver, to kirurgiske klemmer, et par af kirurgisk saks, to pincet, to fine pincet, et par fine saks, og svaberprøver. Forbered 2 10 cm silketråde (4-0 til 6-0) til ligations procedurer.
- Til anbringelse af et centralt venekateter, Forbered en 10 mL sprøjte med en 21 G nål. Spidsen af nålen placeres i et 30 cm langt kateter (med en indvendig diameter [ID] på 0,58 mm). 0,58 mm kateteret til et 10 cm kateter (med et ID på 0,28 mm). Skær spidsen af det mindre kateter skrå for at skabe en skarp spids, der introduceres i den jugulære vene.
- Forbered anæstesi (dvs. intraperitoneal anæstesi ketamin, 100 mg/kg legemsvægt, og xylazine, 5 mg/kg legemsvægt).
- Forbered en 22 G angiocatheter ved at kassere nålen og markere kateteret 1 cm fra spidsen. Forvarmning af varmepuden til 37 °C.
- Forbered et blodtryks apparat og Skift blodtryk-måle membranen om nødvendigt.
2. forberedelsesfasen
- Urin kateter
Bemærk: afsnit 2,1 følger protokollen som beskrevet af Reis et al.7. Figur 1 og supplerende figur 1 viser placeringen af et urin kateter i hunmus.- Anæstetize musen med ketamin/xylazine (Se trin 1,8). Brug toe-Pinch Test for at bekræfte korrekt anæstesi. For at opretholde anæstesi, gentage anæstesi (f. eks, med halvdelen af dosis) efter 60 min. korrekt anæstesi er bekræftet, hvis toe pinch test ikke resulterer i refleks aftrækning.
Bemærk: kvindelige FVB-mus anvendes i denne protokol. - Placer musen i dorsale recumbency på en 37 °C varmepude. Stram underlivet og Find urethral ostium (f. eks. under et mikroskop).
- Brug plastik delen af kateteret på et 22 G angiocatheter, og smør det med Xylocaine gel. Indfør den forsigtigt 3 mm i urethral ostium, mens den distale urethrale akse er parallelt (figur 1a).
- Drej toppen af angiokatheter 180 ° ved at holde spidsen inde i urethral ostium og opretholde urinrørens akse (figur 1b).
- Indfør kateteret 7 mm længere ind i musen, så det placeres i blæren (figur 1c). Du må ikke tvinge kateteret ud over modstand. Korriger katetrets position fra begyndelsen, hvis der mærkes modstand. Vær opmærksom på, at hvis positionen af urin kateteret er korrekt, kan urin allerede vises inden for kateteret.
- Placer et 1,5 mL brunt rør over toppen af angiocatheter for at indsamle urinen. Påfør 1 mL 0,9% NaCl subkutant for at øge urinproduktionen.
- Anæstetize musen med ketamin/xylazine (Se trin 1,8). Brug toe-Pinch Test for at bekræfte korrekt anæstesi. For at opretholde anæstesi, gentage anæstesi (f. eks, med halvdelen af dosis) efter 60 min. korrekt anæstesi er bekræftet, hvis toe pinch test ikke resulterer i refleks aftrækning.
- Det centrale venøse kateter
- Barberer halsen af musen og placere den i recumbency med hovedet mod kirurgen. Hyperextend hovedet af musen med et bånd.
- Desinficer halsen med 70% isopropanol. Lav en lille hud indsnit (5 mm) underkæbe linjen, ved hjælp af en pincet og et par saks. Skær huden ca. 1 cm i retning af brystbenet, indtil midten af brystbenet er nået.
- Forsigtigt dissekere huden på højre side af halsen, ved hjælp af et par saks. Lav en rektangulær indsnit af huden til højre side af musen for at udsætte det bløde væv i halsen. Brug et par saks og en TWEEZER. Fastgør hudflapper med to klemmer.
Bemærk: den jugulære vene løber langs den venstre side af skjoldbruskkirtlen eller er lidt dækket af den højre lap i skjoldbruskkirtlen. Efter dette trin, brug et mikroskop til kirurgi. - Forsigtigt udsætte den jugulære vene ved stump forberedelse, ved hjælp af spidsen af den fine TWEEZER. Undgå skader på vene grene.
Bemærk: det kan være nødvendigt at fjerne væv med fin saks. Vær forsigtig, når du bruger en saks til at fjerne væv, da det øger risikoen for blødning. - Placer og Luk en ligatur med en silketråd (4-0 til 6-0) ved den distale del af den synlige jugulære vene (mod spidsen af musen). Sæt spændinger på ligatur ved at fastgøre silke tråden med et bånd for at sikre en let spænding på den jugulære vene. Forbered en ligatur omkring den proksimale del af den jugulære vene.
- Fyld kateteret med ækvilibrering infusionsopløsningen (Se trin 1,4) og fastgør kateteret med et bånd, så kateteret justerer den jugulære vene. Kontrol for bobler for at undgå luft emboli.
- Løft den jugulære vene med fine pincet på indsætnings stedet (indsætnings stedet er 1 – 2 mm proksimal af ligatur). Justér slangen parallelt med den jugulære vene. Punktere den jugulære vene, sigter mod lumen, og indsætte i ca 2 – 4 mm, parallelt med aksen af den jugulære vene. Undgå rask bevægelser.
- Luk ligatur for at fastgøre kateteret. Kontrol for tæthed af ligatur ved omhyggeligt at se gennem mikroskop. Sæt en fugtig vatpind over operationsstedet.
- Måling af blodtryk
- Placer hale-manchet i bunden af muse halen, mens musen lægger i dorsale recumbency. Start målingerne, og Gentag dem 10x pr. tidspunkt. Byg et middel fra målingerne.
- Juster positionen af hale-manchet, hvis blodtryksmålinger ikke synes korrekt og falske data er produceret.
3. ækvibrations fase
- Skift urin opsamlingsrøret, før equilibrations fasen starter, og Placer den på is.
- Der indføres en 10 mL sprøjte fyldt med FITC ækvibrations fase opløsning (Se trin 1,4) med en 21 G nål og det større kateter (med et ID på 0,58 mm) og placeres i sprøjtepumpen.
- Fold en vatpind og læg den rundt om det lille fartøjs kateter (med et ID på 0,28 mm), der indføres i den jugulære vene. Læg kateteret inde i vatpind. Placer en klemme over vatpind til at afskaffe tilbage blodgennemstrømning eller luft emboli. Tilslut en 27 G nål med en 1 mL sprøjte fyldt med FITC-bolte til enden af det lille fartøjs kateter.
- Åbn klemmen og Påfør FITC-bolte (100 μL). Luk klemmen igen, og forbind det større kateter med det mindre kateter. Start sprøjtepumpen med 0,008 mL/min (0,480 mL/t). Fortsæt infusionen i 60 min.
4. eksperimentel fase
Bemærk: i denne fase kan virkningen af lægemidler på glomerulær permselektivitet undersøges.
- Skift urinrøret (tidspunkt 0 min) til et andet 1,5 mL brunt rør. Sæt en vatpind rundt om det lille fartøjs kateter, og Luk en klemme som angivet i trin 3,3.
- Frakobl det store kateter fra det lille fartøjs kateter. Skift sprøjterne til de eksperimentelle fase opløsninger (Se trin 1,5). Lad infusionspumpen køre, så det store kateter fyldes med ækvibrations opløsningen.
- Tilslut katetre igen, mens du undgår luft emboli og genåbne klemmen. Start sprøjtepumpen med 0,008 mL/min.
- Fortsæt med at køre sprøjtepumpen i 60 min og saml urinen i urinrøret derefter (urin 60 min). Placer urinrøret på is.
- Ofrer musen ved livmoderhals dislokation under anæstesi. Inden bortskaffelse observeres musen i 5 minutter for at sikre, at den er død.
5. urinanalyse
-
Måling af fluorescens
- Tø urin bassinet og fortyndet det 1:10 med fosfat-bufferet saltvand (PBS).
Bemærk: urin puljen er en pulje af urin, der er blevet indsamlet fra raske mus i en 12 – 24 h urinopsamling i en metabolisk bur. - Forbered standarder for fluorescens måling. Tag 10 brune 1,5 mL rør og mærk dem for blanke (1:10 fortyndet urin pulje) og følgende FITC-polysaccharose 70 koncentrationer (0,625, 1,25, 2,5, 5, 10, 20, 40, 80 og 160 μg/mL).
- Pipet 246 μL fortyndet urin pulje i et 1,5 mL brunt rør og tilsæt 4 μL af den FITC-polysaccharose 70 bestand koncentration (Se trin 1,1) for at få en endelig koncentration af 160 μg/mL FITC-polysaccharose 70. Pipet 100 μL af den fortyndede urin pulje i alle andre rør.
- 1:2 fortyndes ved pipettering 100 μL af det 160 μg/mL FITC-polysaccharose 70-rør til 80 μg/mL-røret og fortsættes med de øvrige koncentrationer. Sørg for korrekt blanding af de fortyndede koncentrationer (f. eks. ved at vortexning røret, før du fortsætter).
- Fortynde musens urinprøver (0 min, 60 min) 1:10 med fortyndet urin pulje.
- Der afpipetteres 5 μL af hver standard FITC-polysaccharose 70-koncentration og af muse urinprøverne som triplicater i en sort 384-brønd plade. Centrifuge pladen centrifugeres ved 1.000 x g i 15 s for at undgå bobler.
- Analysér 384-brønd pladen i en plade læser. Udfør excitation ved 496 nm og mål fluorescensen ved 525 nm.
- Tø urin bassinet og fortyndet det 1:10 med fosfat-bufferet saltvand (PBS).
-
Kreatinin-måling
- Følg producentens anvisninger. Kort sagt, Forbered kreatinin standarder ved at fortynde 10 μL af 100 mM kreatinin standardopløsning med 990 μL kreatinin assay buffer til at forberede en 1 mM standardopløsning.
- Der tilsættes 0, 2, 4, 6, 8 og 10 μL af 1 mM kreatinin-standardopløsningen til en 96-brønd plade for at generere henholdsvis 0, 2, 4, 6, 8 og 10 nmol/Well-standarder. Tilsæt kreatinin-analyse buffer til hver brønd for at bringe lydstyrken til 50 μL.
- Reaktions mikset forberedes ved tilsætning af 42 – 44 μL kreatinin-analyse buffer, 2 μL creatinase, 2 μL creatininase, 2 μL kreatinin-enzym blanding og 2 μL kreatinin-sonde. For blindprøven anvendes 44 μL kreatinin-analyse buffer, 2 μL creatinase, 2 μL kreatinin-enzym blanding og 1 – 2 μL kreatinin-sonde.
- Der tilsættes 50 μL af den relevante reaktionsblanding til hver brønd i 96-brønd pladen, og den inkubates i 60 min på en horisontal shaker ved 37 °C. Beskyt pladen mod lys under inkubationen. Absorbansen måles ved 570 nm på en plade læser.
- Kreatinin-koncentrationerne beregnes ved at trække den tomme værdi fra alle aflæsninger. Resultatet vil have enheden nanomoler/mikroliter. Multiplicere koncentrationen af kreatinin med molekylvægten af kreatinin (113,12 ng/nmol) at modtage enheden nanogrammer/mikroliter.
6. data analyse
- Beregn den FITC-polysakkarose 70 urin koncentrationen fra standardkurven.
- Reference FITC-polysaccharose 70 urin koncentrationer til kreatinin koncentrationer i den repræsentative urinprøve.
- Reference urinen 60 min prøver til urin 0 min prøver af kontrol og behandlede mus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Som afbildet i figur 2, er metoden til at teste glomerulær permeabilitet i mus opbygget i tre faser. Den første fase kaldes forberedelsesfasen, hvor et urin kateter og et centralt venekateter er placeret. Den anden fase kaldes ækvibrations fasen, begyndende med en intravenøs bolt indsprøjtning af FITC-polysaccharose 70 og efterfulgt af kontinuerlig infusion af FITC-polysaccharose 70 til 60 min. Den sidste fase kaldes den eksperimentelle fase. I denne fase fortsættes infusionen af FITC-polysakkarose 70, og lægemidler eller andre stoffer kan testes for påvirkning af glomerulær permeabilitet. Urin opsamles ved slutningen af hver fase.
For at undersøge glomerulær permeabilitet i denne Tracer model, er det vigtigt at placere en urin kateter korrekt og uden at beskadige slimhinden. Placeringen af et urin kateter i en kvindelig muse blære er påvist i figur 1. Kateteret anbringes 3 mm i urethral ostium parallelt med den kraniocaudale urethrale akse (figur 1a). Kateteret drejes 180 ° mod halen af musen (figur 1b) og indføres 7 mm længere ind i blæren, parallelt med murine rygsøjlen (figur 1c, D).
Som beskrevet ovenfor, tidligere metoder til at teste glomerulær permeabilitet i mus brugte HPLC til at rense FITC-polysakkarose 70 signaler fra urinprøver5,6. Da denne metode bruger fluorescens måling uden en tidligere rensning af Tracer, PBS, mus urin, og FITC-polysakkarose 70 i mus urin blev analyseret. Figur 3a viser fluorescens SKANNING af PBS med en fluorescens spids ved 325 nm, hvilket synes at være en effekt af excitation blitz ved 290 nm. Fluorescens scanning af naturlig mus urin viser et fluorescens maksimum ved 395 nm (figur 3b). FITC-polysakkarose 70 opløst i mus urin viser et fluorescens maksimum ved 525 nm (figur 3c, D). Figur 3c viser, at mus urin ikke forstyrrer fluorescens måling af FITC-polysakkarose 70 i mus urin. Stigende koncentrationer af FITC-polysakkarose 70 viser en øget fluorescens intensitet (figur 3E).
For at bevise, at denne metode er i stand til at påvise forskelle i glomerulær permeabilitet, blev Ang II anvendt i forsøgsfasen af modellen. Ang II øgede den glomerulære permeabilitet i mus 60 min efter en kontinuerlig administration i ikke-blodtryk-relevante doser (figur 4a, B). Stigningen i glomerulær permeabilitet på grund af Ang II kan blokeres af en Ang II-receptorblokker (ARB), nemlig candesartan (figur 4a). Ang II udskyllende nedsat glomerulær permeabilitet (figur 4a). Blodtrykket blev målt via hale-cuff-metoden og viste ikke signifikante forskelle mellem grupperne (figur 4b). Polysaccharose 70-og FITC-polysaccharose 70-inkrede dyr fungerer som kontrol for FITC-polysakkarose 70-og Ang II-behandlede dyr (figur 4c).
Figur 1: placering af et urin kateter i hunmus. Lateral visning af musen maven. A) det mærkede og smurte kateter indføres 3 mm i den udvendige urethral ostium af en kvindelig mus. Den kraniokaudale akse af urinrøret er parallelt med kateteret. Omhyggelig spænding på underlivet med den venstre pegefinger letter indførelsen af kateteret i den eksterne urethral ostium. B) kateteret drejes 180 ° mod musens hale. Spidsen af kateteret forbliver 3 mm inden for den eksterne urethral ostium. (C) kateteret er nu introduceret 7 mm længere ind i blæren. Retningen af kateteret er justeret med murine rygsøjlen. (D) ventral visning af musen maven. Kateteret er placeret 10 mm ind i musen. (E) urinen fremstår med en korrekt indføring i blæren. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: skematisk illustration af de eksperimentelle procedurer på en tidslinje. Efter narkose af musen, en urin kateter er placeret. Det centrale venekateter implanteres, og baseline urin opnås (0 min). Derefter påføres FITC-polysaccharose 70-bolte via det centrale venekateter, og der startes en kontinuerlig infusion af FITC-polysakkarose 70. Ækvibrations fasen for FITC-polysaccharose 70 varer 60 min. urin opsamles efter equilibrations fasen (0 min) og før forsøgsfasen påbegyndes. Inden for denne fase kan stoffer eller andre stoffer (som angiotensin II) anvendes. Ved afslutningen af forsøgsfasen opnås urin til analyse (60 min). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: fluorescens af PBS og mus urin med og uden FITC-polysakkarose 70. A) Fluorescens Frekvensscanning (excitation af 290 nm, emission af 325-700 nm) af PBS viser et signal ved 325 nm, hvilket synes at være en effekt af excitation blitz ved 290 nm. (B) i Frekvensscanning af mus Native urin (urin pulje fortyndet ved 1:10 og 1:20), der er et signal med et maksimum på 395 nm, sandsynligvis forårsaget af urinprotein autofluorescens. (C) mus urin indeholdende FITC-polysaccharose 70 (40 μg/ml) viser et signal peak ved 525 nm, der ikke forstyrrer målingen af urinen autofluorescens. D) forstørrelse af det FITC-polysakkarose 70 fluorescens spids, afhængigt af emissionsbølgelængden. Der vises forskellige koncentrationer af FITC-polysaccharose 70 (1,25, 2,5, 5, 10, 20 og 40 μg/mL). E) forøgelse af FITC-polysaccharose70-koncentrationerne viser en stigning i fluorescens intensitet ved emission af 525 nm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: ANGIOTENSIN II (Ang II) øger glomerulær permeabilitet. (A) Ang II øger den glomerulære permeabilitet i mus betydeligt, MÅLT ved FITC-polysaccharose 70 detektion i musene urin (gennemsnit + SEM; n = 5; p < 0,004, testet af kruved-Wallis-testen). FITC-polysakkarose 70 koncentrationer i urinen blev refereret til urin kreatinin koncentrationer. De hvide søjler (0 min) repræsenterer FITC-polysakkarose 70 niveauer før starten af Ang II stimulation, de sorte søjler (60 min) repræsenterer FITC-polysakkarose 70 niveauer 60 min efter starten af Ang II stimulation, og de grå søjler (120 min eller + 60 min) efter en yderligere 60 min af Ang II stimulation eller 60 min af Ang II washout. (B) systolisk blodtryk blev overvåget af hale-cuff-metoden (MEAN + SEM). Der blev ikke konstateret signifikante forskelle i blodtrykket mellem de kontrol-og Ang II-behandlede grupper. C) polysaccharose 70 og FITC-polysaccharose 70 ændrer ikke glomerulær permeabilitet hos mus signifikant. Ang II øger glomerulær permeabilitet i mus betydeligt (gennemsnit + SEM; n = 7, p < 0,005). Dette tal er blevet ændret fra Konigshausen et al.8. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende figur 1: skematisk diagram over placeringen af et urin kateter i hunmus. Lateral visning af musen maven. A) det mærkede og smurte kateter indføres 3 mm i den udvendige urethral ostium af en kvindelig mus. Den kraniokaudale akse af urinrøret er parallelt med kateteret. Omhyggelig spænding på underlivet med den venstre pegefinger letter indførelsen af kateteret i den eksterne urethral ostium. B) kateteret drejes 180 ° mod musens hale. Spidsen af kateteret forbliver 3 mm inden for den eksterne urethral ostium. (C) kateteret er nu introduceret 7 mm længere ind i blæren. Retningen af kateteret er justeret med murine rygsøjlen. (D) ventral visning af musen maven. Kateteret introduceres 3 mm i den eksterne urethral ostium af en kvindelig mus. (E) efter at kateteret er vendt 180 °, introduceres det 7 mm længere ind i muse blæren. Retningen af kateteret er justeret med murine rygsøjlen. Dette tal er blevet ændret fra Reis et al.7. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den præsenterede metode gør det muligt for investigator at teste glomerulær permeabilitet i mus på en meget følsom måde ved hjælp af en Tracer. Med denne metode, kortsigtede stigninger i glomerulær permeabilitet kan diagnosticeres ved hjælp af kun små mængder af urin. De mest kritiske trin for vellykket mastering denne teknik er 1) udvikling af manuel ekspertise i mus kirurgi, især i kanylen af en central vene, 2) placering af urin kateteret uden at skade slimhinden, og 3) manuel ekspertise i håndtering 384-brønd plader med små mængder af prøver.
Når det centrale venekateter placeres, er det vigtigt, at kateteret ikke trænger ind i den jugulære vene. For at undgå penetration anbefaler vi at sætte spændinger på den jugulære vene med en distale ligatur (Se trin 2.2.7) og at løfte den jugulære vene med fine pincet for at forlænge lumen af den jugulære vene. For at holde indsætnings stedet lille, så prøv at undgå brutto bevægelser, mens du indsætter kateteret og altid sikre den bedste visning af det kirurgiske felt ved at fjerne ekstra væv. Det mest kritiske trin i placeringen af urin kateteret er den endelige indsættelse i blæren. Hvis modstanden føles, anbefaler vi at starte forfra fra begyndelsen for ikke at forårsage falske spor og skade på slimhinden. Kateter rotation, smøring og blide bevægelser samt træning, hjælp i svære tilfælde7.
FITC-polysakkarose 70 er en fluorescently mærket, forgrenet og tværbundet polymer af saccharose og epichlorhydrin9. Det opfører sig i opløsning som et kugleformet molekyle med en kugleformet form og med en lav form asymmetri, men med en molekylær deformabilitet9. Ligesom andre saccharosemolekyler filtreres FITC-polysaccharose 70 af glomerulus og ikke reabsorberes i det rørformede system4. For at undgå frie FITC-molekyler i infusionen, dialyserede vi FITC-polysaccharose 70-opløsningen før påføring på musene. Det er muligt at opbevare dialyserede FITC-polysakkarose 70 molekyler ved-20 °C i månedsvis. Da FITC-polysakkarose 70 påføres intravenøst i denne og andre protokoller, er det vigtigt, at ingen blod forurener urinprøverne. Derfor skal urin kateteret placeres med forsigtighed, og antikoagulerende stoffer i forsøget bør undgås. Standardkurven for FITC-polysakkarose 70 opløses i mus urin pulje for at få de mest nøjagtige resultater. På grund af koncentrationsforskelle i urinen ved forskellige eksperimentelle tidspunkter og mellem grupper, skal FITC-polysakkarose 70 koncentrationer refereres til en markør i urinen, der afspejler urin koncentrationen (f. eks. kreatinin). Interferens af FITC-polysakkarose 70 fluorescens med måling af kreatinin i en enzymatisk analyse er usandsynlig.
Analysen af FITC-polysaccharose 70 fluorescens skal udføres i sorte 384-brønd plader, da små urin volumener på 5 μL kan måles i disse plader. Vi anbefaler ikke at genbruge de samme brønde inden for 384-brønd pladerne, selv efter vask af pladerne, da fluorescens stadig er målbar. Da bobler forstyrrer fluorescens aflæsning, skal pladerne centrifugeres før analyse. Alternativt kan bobler ødelægges manuelt med spidsen af en pipette.
Brugen af polysucroses til at teste glomerulær permselektivitet blev beskrevet næsten 40 år siden10. Fluorescently mærket polysakkarose er blevet undersøgt i glomerulær skade undersøgelser næsten udelukkende hos rotter i de seneste år4,11,12,13,14,15 ,16,17,18,19,20. Dette kan have anatomiske årsager på grund af lettere kirurgiske procedurer i rotter end i mus. Hos rotter anvendes urethrotomi til at opnå urinprøver4,5,9,12,13,14,21. For at analysere plasma og urinprøver, er sonder udsat for høj ydeevne størrelse udelukkelse kromatografi4,5,9,12,13,14 ,21. Desuden måles den glomerulære filtrationshastighed (GFR) med radioaktivt 51CR-ethylenediamin tetraeddikesyre (EDTA)4,5,9,12,13 ,14,21. To tidligere undersøgelser har påført FITC-polysaccharose 70 i mus5,6. I mus introduceres et suprapubisk urin kateter i blæren6,20. Urin-og plasma sonder udsættes for gel filtrering før analysen af FITC-polysaccharose 70 fluorescens. Lignende som hos rotter blev GFR analyseret via radioaktivitet6,20. Den anden publikation om anvendelse af FITC-polysaccharose 70 i mus bruger en model af peritonealdialyse permeabilitet og derfor ikke analysere mus urin til FITC-polysaccharose 70 fluorescens22. Den præsenterede metode blev derfor ændret for at lette urinprøvetagning og analyse. Urinprøver kan let opnås gennem et ikke-invasivt transuretral urin kateter. Urinanalyse for FITC-polysaccharose 70 fluorescens udføres uden nogen tidligere high-performance størrelses udelukkelse kromatografi eller gel filtrering. Ved at referere til FITC-polysaccharose 70 fluorescens til mus urin kreatinin, er måling af GFR med en radioaktiv analyse ikke nødvendig.
Stigninger i blodtrykket forbedre glomerulær permeabilitet. Derfor, blodtryk overvågning er afgørende, mens undersøge glomerulær permeabilitet. De mest nøjagtige blodtryksmålinger i mus udføres via et centralt arterielt kateter23 , der kræver heparinisering af kateteret for at forhindre koagulation. Vi har oplevet problemer med hæmaturi efter lavdosis heparinisering og urin kateter placering. Derfor besluttede vi at udføre hale-manchet teknik til at måle blodtrykket, som er noninvasiv og behøver ikke heparinization. Afhængig af dybden af anæstesi, blodtryk overvågning med hale-manchet metode er undertiden udfordrende. Blodtryk membraner skal kontrolleres på forhånd og placeringen af musen skal optimeres før blodtryk optagelse.
Ud over udfordringerne i blodtryks målingen er denne teknik også begrænset ved at producere vilkårlige enheder af FITC-polysakkarose 70. Indtil videre er denne teknik kun blevet undersøgt hos dyr, og derfor er dens relevans for det humane glomerulære filter stadig ukendt. Tidsintervaller til at undersøge stigninger i glomerulær permeabilitet afhænger af mus urinproduktion. Derfor, meget kortsigtede stigninger i glomerulær permeabilitet (i minutter) kan blive savnet på grund af manglende mus urinproduktion. I denne protokol, er FITC-polysaccharose 70 normaliseret til urin kreatinin, som fjernes fra blodet hovedsageligt via glomerulær filtration, men også ved proksimal tubulær sekretion. Dette vil introducere en fejl ved estimering af glomerulær permeabilitet ved hjælp af denne metode, hvilket reducerer den målte fraktioneret clearance af polysakkarose24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takker Christina Schwandt, Blanka Duvnjak, og Nicola Kuhr for deres ekstraordinære tekniske assistance og Dr. Dennis Sohn for hans hjælp med fluorescens scanningen. Denne forskning blev støttet af en bevilling af Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) SFB 612 TP B18 til L.C.R. og L.S. Funder havde ingen rolle i undersøgelsens design, dataindsamling og analyse, beslutning om at offentliggøre eller forberedelse af manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Motic SMZ168 BL | Motic | SMZ168BL | microscope for mouse surgery |
| KL1500LCD | Pulch and Lorenz microscopy | 150500 | light for mouse surgery |
| Microfederschere | Braun, Aesculap | FD100R | fine scissors |
| Durotip Feine Scheren | Braun, Aesculap | BC210R | for neck cut |
| Anatomische Pinzette | Braun, Aesculap | BD215R | for surgery |
| Präparierklemme | Aesculap | BJ008R | for surgery |
| Seraflex | Serag Wiessner | IC108000 | silk thread |
| Ketamine 10% | Medistar | anesthesia | |
| Rompun (Xylazin) 2% | Bayer | anesthesia | |
| Fine Bore Polythene Tubing ID 0.28mm OD 0.61mm | Portex | 800/100/100 | Catheter |
| Fine Bore Polythene Tubing ID 0.58mm OD 0.96mm | Portex | 800/100/200 | Catheter |
| Harvard apparatus 11 Plus | Harvard Apparatus | 70-2209 | syringe pump |
| BD Insyte Autoguard | BD | 381823 | urinary catheter |
| Multimode Detector DTX 880 | Beckman Coulter | plate reader | |
| 384 well microtiterplate | Nunc | 262260 | 384 well platte |
| Creatinine Assay Kit | Sigma-Aldrich | MAK080 | to measure creatinine concentration |
| 96 well plate | Nunc | 260836 | for creatinine assay |
| FITC-labeled polysuccrose 70 | TBD Consultancy | FP70 | FITC-ficoll |
| Angiotensin II | Sigma-Aldrich | A9525 | used to test glomerular permeability |
| BP-98A | Softron | for blood pressure measurement | |
| OTS 40.3040 | Medite | 01-4005-00 | heating plate for mouse surgery |
| Instillagel 6mL | Farco-Pharma GmbH | for urinary catheter | |
| Exacta | Aesculap | GT415 | shaver |
References
- Chronic Kidney Disease Prognosis Consortium,, et al. Association of estimated glomerular filtration rate and albuminuria with all-cause and cardiovascular mortality in general population cohorts: a collaborative meta-analysis. Lancet. 375 (9731), 2073-2081 (2010).
- Mori, K. P., et al. Increase of Total Nephron Albumin Filtration and Reabsorption in Diabetic Nephropathy. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (1), 278-289 (2017).
- Amsellem, S., et al. Cubilin is essential for albumin reabsorption in the renal proximal tubule. Journal of the American Society of Nephrology. 21 (11), 1859-1867 (2010).
- Axelsson, J., Rippe, A., Oberg, C. M., Rippe, B. Rapid, dynamic changes in glomerular permeability to macromolecules during systemic angiotensin II (ANG II) infusion in rats. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 303 (6), F790-F799 (2012).
- Grande, G., et al. Unaltered size selectivity of the glomerular filtration barrier in caveolin-1 knockout mice. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 297 (2), F257-F262 (2009).
- Jeansson, M., Haraldsson, B. Glomerular size and charge selectivity in the mouse after exposure to glucosaminoglycan-degrading enzymes. Journal of the American Society of Nephrology. 14 (7), 1756-1765 (2003).
- Reis, L. O., et al. Anatomical features of the urethra and urinary bladder catheterization in female mice and rats. An essential translational tool. Acta Cirurgica Brasileira. 26, 106-110 (2011).
- Konigshausen, E., et al. Angiotensin II increases glomerular permeability by beta-arrestin mediated nephrin endocytosis. Scientific Reports. 6, 39513 (2016).
- Venturoli, D., Rippe, B. Ficoll and dextran vs. globular proteins as probes for testing glomerular permselectivity: effects of molecular size, shape, charge, and deformability. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 288 (4), F605-F613 (2005).
- Bohrer, M. P., Deen, W. M., Robertson, C. R., Troy, J. L., Brenner, B. M. Influence of molecular configuration on the passage of macromolecules across the glomerular capillary wall. The Journal of General Physiology. 74 (5), 583-593 (1979).
- Dolinina, J., Rippe, A., Bentzer, P., Oberg, C. M. Glomerular hyperpermeability after acute unilateral ureteral obstruction: Effects of Tempol, NOS-, RhoA- and Rac-1-inhibition. American Journal of Physiology-Renal Physiology. , (2018).
- Dolinina, J., Sverrisson, K., Rippe, A., Oberg, C. M., Rippe, B. Nitric oxide synthase inhibition causes acute increases in glomerular permeability in vivo, dependent upon reactive oxygen species. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 311 (5), F984-F990 (2016).
- Sverrisson, K., Axelsson, J., Rippe, A., Asgeirsson, D., Rippe, B. Acute reactive oxygen species (ROS)-dependent effects of IL-1beta, TNF-alpha, and IL-6 on the glomerular filtration barrier (GFB) in vivo. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 309 (9), F800-F806 (2015).
- Sverrisson, K., Axelsson, J., Rippe, A., Asgeirsson, D., Rippe, B. Dynamic, size-selective effects of protamine sulfate and hyaluronidase on the rat glomerular filtration barrier in vivo. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 307 (10), F1136-F1143 (2014).
- Sverrisson, K., et al. Extracellular fetal hemoglobin induces increases in glomerular permeability: inhibition with alpha1-microglobulin and tempol. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 306 (4), F442-F448 (2014).
- Axelsson, J., Mahmutovic, I., Rippe, A., Rippe, B. Loss of size selectivity of the glomerular filtration barrier in rats following laparotomy and muscle trauma. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 297 (3), F577-F582 (2009).
- Axelsson, J., Rippe, A., Rippe, B. Transient and sustained increases in glomerular permeability following ANP infusion in rats. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 300 (1), F24-F30 (2011).
- Axelsson, J., Rippe, A., Rippe, B. Acute hyperglycemia induces rapid, reversible increases in glomerular permeability in nondiabetic rats. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 298 (6), F1306-F1312 (2010).
- Axelsson, J., Rippe, A., Venturoli, D., Sward, P., Rippe, B. Effects of early endotoxemia and dextran-induced anaphylaxis on the size selectivity of the glomerular filtration barrier in rats. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 296 (2), F242-F248 (2009).
- Andersson, M., Nilsson, U., Hjalmarsson, C., Haraldsson, B., Nystrom, J. S. Mild renal ischemia-reperfusion reduces charge and size selectivity of the glomerular barrier. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 292 (6), F1802-F1809 (2007).
- Dolinina, J., Rippe, A., Bentzer, P., Oberg, C. M. Glomerular hyperpermeability after acute unilateral ureteral obstruction: effects of Tempol, NOS, RhoA, and Rac-1 inhibition. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 315 (3), F445-F453 (2018).
- Rosengren, B. I., et al. Transvascular protein transport in mice lacking endothelial caveolae. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 291 (3), H1371-H1377 (2006).
- Whitesall, S. E., Hoff, J. B., Vollmer, A. P., D'Alecy, L. G. Comparison of simultaneous measurement of mouse systolic arterial blood pressure by radiotelemetry and tail-cuff methods. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 286 (6), H2408-H2415 (2004).
- Eisner, C., et al. Major contribution of tubular secretion to creatinine clearance in mice. Kidney International. 77 (6), 519-526 (2010).
