Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

מדידה רגישה מאוד של חדירות הפקאוליות בעכברים עם פלואורואסעין איזוטיקריאט-פוליסוכרוז 70

Published: August 9, 2019 doi: 10.3791/59064
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Nephrology, Medical Faculty, Heinrich-Heine-University

Summary

בעכברים המשתמשים במעקב. רגיש ולא רדיואקטיבי שיטה זו מאפשרת ניתוחי שתן חוזרים ונשנים עם כמויות שתן קטנות.

Abstract

אובדן אלבומין בשתן (אלבומין) צופה תוצאות לב וכלי דם. בתנאים פיזיולוגיים, כמויות קטנות של אלבומין מסוננים על ידי הפקעית ונספג מחדש במערכת הכרישים עד למגבלת הספיגה. לפיכך, מגדילה מוקדמת של סינון האלבומין הפתולוגי עלול להיות חסר על ידי ניתוח אלבומין. לכן, השימוש במשדרים כדי לבדוק את הפרסלקטיביות מופיע כיתרון. מעקב אחר התווית fluorescocyanate (FITC)-פוליסוקרוז (כלומר, FITC-Ficoll) ניתן להשתמש כדי ללמוד את המנתקטיביות. מולקולות FITC-polyסוכות מסוננים בחופשיות על ידי הפקעית, אך לא נספג מחדש במערכת הכרישים. בעכברים וחולדות, FITC-polysucrose נחקר במודלים של חדירות הפקפיות באמצעות הליכים מורכבים מבחינה טכנית (כלומר, מדידות רדיואקטיביות, כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים [הכדאיות], סינון ג'ל). יש לנו שינוי והקלה בפרוטוקול FITC-polysucrose מבוססי מעקב כדי לבדוק עליות מוקדם וקטן בחדירות הפקליות כדי FITC-polysucrose 70 (גודל אלבומין) בעכברים. שיטה זו מאפשרת ניתוחי שתן חוזרים עם אמצעי השתן הקטנים (5 μL). פרוטוקול זה מכיל מידע על כיצד מעקב FITC-polysucrose 70 מוחל באופן הפנים והשתן נאסף באמצעות קטטר השתן פשוטה. שתן מנותח באמצעות קורא צלחת פלואורסצנטית מנורמל לסמן ריכוז שתן (קריאטינין), ובכך להימנע הליכים מורכבים מבחינה טכנית.

Introduction

פגמים פונקציונליים או מבניים בתוך המכשול סינון פקייתי להגדיל את חדירות הפקתית לאלבומין, וכתוצאה מכך הזיהוי של אלבומין בשתן (אלבומין). אלבומין מנבא תוצאות לב וכלי דם והוא סמן חשוב לפציעה בלתי מסומנת1. אפילו רמות נמוכות של אלבומין, שוכב בטווח הנורמלי, משויכים לסיכון לב וכלי דם מוגבר1.

בתנאים פיסיולוגיים, אלבומין מסונן דרך הגלובולוס וכמעט לחלוטין נספג מחדש במערכת הכרישים2,3. בעכברים, הגילוי של אלבומין בשתן מבוצע בדרך כלל על ידי שיטת חיסוני מקושרת של האנזים (אליסה) מתוך 24 שעות של איסוף שתן. אם שתן של 24 שעות בתוך אוסף שתן או שתן ספוט משמש, הבדלים קטנים ריכוזי אלבומין עלול להחמיץ עקב בעיות רגישות. רוב החוקרים, לכן, להשתמש במודלים בעלי חיים שבו אלבומין הנגרמת על ידי פגיעת כליות חזקה עקב רעלים, סמים, ניתוח כליות.

לפיכך, מציאת שיטה רגישה לגילוי שינויים קטנים וארעיים בחדירות הפקפיות, חשובה מאוד לתחום. Rippe ואח ' הציגו מודל חולדה כדי לבחון חדירות פקפיות על ידי החלת מעקב התווית fluorescently כלומר FITC-polysucrose 70 (כלומר, FITC-Ficoll 70), בגודל של אלבומין4. יישום המעקב מאפשר בדיקה של שינויים לטווח קצר בחדירות הפקליות (בתוך דקות) והוא רגיש מאוד4. שני מחקרים השתמשו בשיטת המעקב. בעכברים5,6 למרות היתרונות שלה, שיטה זו, למרבה הצער, יש חסרונות: זה מבחינה טכנית מאוד מורכב, רדיואקטיבי, פולשנית. ניתוח נוסף של השתן מתבצע רק על ידי שימוש בסינון ג'ל או הוצאת מידות5,6.

בתוך הנייר הזה, אנו מציגים חלופה חלופית, רגיש, לא רדיואקטיבי, ומהירה שיטה למדוד חדירות הפקפיות בעכברים באמצעות פלואורוסקופים התווית FITC-polysucrose 70. על ידי החדרת קטטר ההמרה, השתן אוסף הוא פחות פולשנית מאשר ניקוב שלפוחית השתן, דלקת כריתת גרון, ויישום קטטר suprapubic, ומאפשר איסוף שתן לפחות כל 30 דקות. ניתוח שתן מבוצע מכמויות קטנות (5μL) באמצעות קורא לוחית פלורסנט. ריכוזי המעקב בשתן מנורמלות לריכוזי קריאטינין בשתן באמצעות שיטת קריאטינין אנזימטית.

לכן, שיטה זו הרומן מציע כלי רגיש כדי ללמוד פציעה מוקדמת פקפיות עם חדירות מוגברת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

החקירות נערכו בהתאם להנחיות המפורטות במדריך לטיפול ולשימוש בבעלי חיים מעבדתיים (מכוני הבריאות הלאומיים של ארה"ב No. 85-23, תוקן 1996). כל ניסויי בעלי החיים בוצעו בהתאם לאישורים המוסדיים הרלוונטיים (ממשלת מדינת המדינה לנדסברג מספר 84-02.04.2012. A397).

1. הכנת מכשירים, פתרונות וציוד

  1. מהווים מחדש FITC-polysucrose 70 עם 0.9% נתרן כלוריד סטרילי (הנאל) לריכוז הסופי של 10 מ"ג/mL (כלומר, 100 mg ב 10 מ ל של נאל).
  2. Dialyze FITC-פוליסוקרוז 70 פתרון כדי להסיר מולקולות FITC חינם לילה ב 4 ° צ' (משקל מולקולרי לגזור [MWCO] ב 10,000). השתמש 1 L של 0.9% הנאסה סטרילי ל 10 מ ל של FITC-פוליסוקרוז 70 תחת ערבוב קבוע. . הגנה מפני אור מחלקים את הדיליזד FITC-פוליסוכרוז 70 ומאחסנים אותו ב-20 ° c.
  3. עבור FITC-polysucrose 70 בולוס, להוסיף 4 μL של 10 מ"ג/mL FITC-polysucrose 70 פתרון ל 996 μL של 0.9% (הריכוז הסופי של FITC-polysucrose 70:40 μg/mL).
  4. עבור פתרון אינפוזיה באמצעות שיווי משקל, הוסף 20 μL של 10 מ"ג/mL FITC-poly, 70 הפתרון ל-9.98 mL של 0.9% מניב הנאלים סטרילי לריכוז הסופי של 20 μg/mL.
  5. עבור הפתרון הניסיוני, להוסיף תרופות או חומרים לפתרון אינפוזיה (למשל, עבור אנגיוטנסין II [אנג ii] [100 ng/kg/min] עבור 25 גרם עכבר, להוסיף 3 μl של אנג השני של פתרון 1 מ"מ).
  6. לניתוח, הכינו מכונת גילוח אחת, שתי מלחציים כירורגיים, זוג מספריים כירורגיים, שתי מלקחיים, שתי מלקחיים משובחים, זוג מספריים עדינים ומטליות. הכינו שרשורי משי 2 10 ס מ (4-0 עד 6-0) להליכי הארכה.
  7. למיקום של צנתר הורידים המרכזי, להכין מזרק 10 מ ל עם מחט G 21. מניחים את קצה המחט בצנתר באורך 30 ס מ (עם קוטר פנימי [ID] של 0.58 מ"מ). לחבר את קטטר 0.58 מ"מ ל קטטר 10 ס מ (עם מזהה של 0.28 מ"מ). חותכים את הקצה של המלוכסן קטן יותר כדי ליצור טיפ חד הציג לתוך הווריד העורק.
  8. הכינו את ההרדמה (כלומר, קטמין הרדמה בתוך הצפק, 100 מ"ג/ק"ג של משקל הגוף, ו xylazine, 5 מ"ג/ק"ג של משקל הגוף).
  9. הכינו 22 G אנגיוקטטר על ידי מחיקת המחט וסימון קטטר 1 ס מ מהקצה. מחממים את משטח החימום עד 37 ° c.
  10. הכן מכשיר ללחץ דם ושנה את קרום מדידת לחץ הדם במידת הצורך.

2. שלב ההכנה

  1. קטטר השתן
    הערה: סעיף 2.1 עוקב אחר הפרוטוקול כפי שמתואר על ידי רייס ואח '7. איור 1 ומשלים איור 1 להראות את המיקום של קטטר השתן בעכברים נקבה.
    1. לגרד את העכבר עם קטמין/xylazine (ראה שלב 1.8). תשתמש במבחן הבוהן. כדי לאשר הרדמה נכונה כדי לשמור על הרדמה, לחזור על ההרדמה (למשל, עם חצי המינון) לאחר 60 min. הרדמה נכונה הוא אישר אם הבוהן צביטה הבדיקה אינה תוצאה נסיגה רפלקס.
      הערה: עכברים FVB הנשי משמשים בפרוטוקול זה.
    2. הצב את העכבר בתוך שכיבה מקדימה על משטח חימום 37 ° c. הדקו את הבטן התחתונה ומצאו את השופכה האוסטיץ (למשל, תחת מיקרוסקופ).
    3. השתמש בחלק פלסטיק של הצנתר של 22 G אנגיוצנתר ולשמן אותו עם xylocaine gel. הציגו אותו בזהירות 3 מ"מ בתוך האואסטיום ומקבילים לציר המרוחק (איור 1A).
    4. הפוך את החלק העליון של הצנתר הקטטר 180 ° על-ידי שמירה על הקצה בתוך האוסטאל ostium ושמירה על ציר השופכה (איור 1B).
    5. הצג את הקטטר 7 מ"מ עוד יותר לתוך העכבר כך שהוא ממוקם בתוך שלפוחית השתן (איור 1C). אל תכפה את הקטטר. מעבר להתנגדות תקן את המיקום של הקטטר מההתחלה אם ההתנגדות הוא הרגיש. שימו לב כי אם המיקום של קטטר השתן נכון, השתן עשוי להופיע כבר בתוך הקטטר.
    6. מניחים צינור 1.5 mL חום מעל החלק העליון של הקטטר לאסוף את השתן. החל 1 מ ל של 0.9% תת-עורי לשפר את ייצור השתן.
  2. קטטר ורידי מרכזי
    1. לגלח את הצוואר של העכבר ולמקם אותו שכיבה עם הראש לכיוון המנתח. הרחב את ראש העכבר באמצעות קלטת.
    2. לחטא את הצוואר עם 70% איזופנול. הפוך את חתך העור הקטן (5 מ"מ) מתחת לקו הלסת, באמצעות טוויצר וזוג מספריים. חותכים את העור כ 1 ס מ לכיוון עצם החזה עד אמצע עצם החזה.
    3. מנתחים בזהירות את העור בצד ימין של הצוואר, באמצעות זוג מספריים. לעשות חתך מלבני של העור בצד ימין של העכבר כדי לחשוף את הרקמה הרך של הצוואר. . תשתמש בזוג מספריים וטוויצר לתקן את מדפים העור עם שני מלחציים.
      הערה: וריד הצוואר רץ לאורך הצד השמאלי של בלוטת התריס או מכוסה מעט על ידי האונה הימנית של בלוטת התריס. לאחר שלב זה, להשתמש במיקרוסקופ לניתוח.
    4. בזהירות לחשוף את הווריד העורק על ידי הכנה קהה, באמצעות קצה של הטוויצר המשובח. הימנע מפגיעה בענפי הווריד.
      הערה: ייתכן שיהיה צורך להסיר רקמות באמצעות מספריים עדינים. להיזהר בעת שימוש במספריים להסיר את הרקמה כפי שהוא מגביר את הסיכון של דימום.
    5. מקום וסגור ליגטורה עם חוט משי (4-0 עד 6-0) בחלק המרוחק של הווריד הגלוי של העורק (לכיוון הראש של העכבר). לשים מתח על הקשירה על ידי תיקון חוט המשי עם קלטת כדי להבטיח מתח קל על וריד הצוואר. הכינו ליגטורה סביב החלק הטוב. ביותר של עורק הצוואר
    6. למלא את הקטטר עם פתרון אינפוזיה equilibration (ראה שלב 1.4) ולתקן את הקטטר עם הקלטת, כך הקטטר מיישר את וריד הצוואר. שליטה על בועות כדי למנוע תסחיף אוויר.
    7. הרם את וריד הצוואר עם מלקחיים עדינים באתר הכניסה (אתר הכניסה הוא 1 – 2 מ"מ מתחת לקשירה). יישר את הצינורות במקביל. לעורק הצוואר נקב את וריד הצוואר, כיוון לומן, והכנס בערך 2 – 4 מ"מ, מקבילים לציר עורק הצוואר. הימנע מתנועות מרעננות.
    8. . תסגור את הקשירה כדי לתקן את הצנתר שליטה על התכווצות הקשירה על ידי הצגת בזהירות דרך המיקרוסקופ. לשים מטלית לחה על האתר של הניתוח.
  3. מדידת לחץ דם
    1. מניחים את הזנב בתחתית הזנב של העכבר כאשר העכבר מניח בתוך שכיבה. הפעל את המידות וחזור עליהן 10x לכל נקודת זמן. לבנות ממוצע מן המידות.
    2. להתאים את המיקום של הזנב-חפתים אם מדידות לחץ דם לא נראה נכון ונתונים שווא מיוצרים.

3. שלב השיווציה

  1. שינוי צינור השתן לפני ששלב האקוויליציה מתחיל ומניחים אותו על הקרח.
  2. להציג מזרק 10 מ ל מלא בפתרון הפאזה FITC בשלב (ראה שלב 1.4) עם המחט 21 G ואת קטטר גדול (עם מזהה של 0.58 מ"מ) ומניחים אותו לתוך משאבת המזרק.
  3. מקפלים ספוגית ולשים אותו סביב קטטר כלי קטן (עם מזהה של 0.28 מ"מ) כי הוא הציג לתוך וריד הצוואר. . הנח את הצנתר בתוך הדגימה לבטל את זרימת הדם הרטרוגרדי. או את תסחיף האוויר לחבר המחט 27 G עם מזרק 1 מ"ל מלא עם בולוס FITC לסוף קטטר כלי קטן.
  4. פתח את התפס והחל את בולוס ה-FITC (100 μL). סגרו את המלחציים שוב וחברו את הצנתר הגדול יותר עם הקטטר הקטן יותר. הפעל את משאבת המזרק עם 0.008 mL/min (0.480 mL/h). המשך העירוי עבור 60 דקות.

4. השלב הניסיוני

הערה: בשלב זה, את השפעת התרופות על הפרקטיביות הגלומפרוטיביות ניתן לחקור.

  1. לשנות את צינור השתן (נקודת זמן 0 דקות) אחר 1.5 mL אחר צינור חום. לשים דגימה סביב קטטר כלי קטן ולסגור מהדק כפי שמצוין בשלב 3.3.
  2. נתקו את הקטטר הגדול. מצנתר כלי-הקיבול הקטן לשנות את הזרקים לפתרונות הפאזה הניסיונית (ראה שלב 1.5). תנו למשאבת האינפוזיה לפעול כך שהקטטר הגדול יתמלא בתמיסה האקוויליציה.
  3. חברו מחדש את הקטטרים תוך הימנעות מתסחיף אוויר ופתח מחדש את המלחציים. הפעל את משאבת המזרק ב 0.008 mL/min.
  4. המשך להפעיל את משאבת המזרק עבור 60 דקות ולאסוף את השתן בתוך צינור השתן לאחר מכן (שתן 60 דקות). . הניחו את צינור השתן על הקרח
  5. להקריב את העכבר על ידי פריקה צוואר הרחם במהלך ההרדמה. לפני הסילוק העכבר הוא נצפתה 5 דקות כדי להבטיח שהוא מת.

5. ניתוח שתן

  1. מדידה פלואורסצנטית
    1. להפשיר את בריכת השתן ולדלל אותו 1:10 עם מלוחים באגירה פוספט (PBS).
      הערה: בריכת השתן היא בריכה של שתן שנאסף מעכברים בריאים באוסף של 12-24 שעות על השתן בכלוב מטבולית.
    2. הכן סטנדרטים למדידה הקרינה הפלואורסצנטית. לקחת 10 חום 1.5 mL ולתייג אותם ריק (1:10 בריכת שתן מדולל) ואת הבאים FITC-polysucrose 70 ריכוזי (0.625, 1.25, 2.5, 5, 10, 20, 40, 80, ו-160 μg/mL).
    3. Pipet 246 μL של בריכת שתן מדולל לתוך צינור חום 1.5 mL ולהוסיף 4 μL של FITC-polysucrose 70 מלאי ריכוז (ראה שלב 1.1) כדי לקבל ריכוז סופי של 160 μg/mL FITC-polysucrose 70. Pipet 100 μL של בריכת השתן מדולל לתוך כל הצינורות האחרים.
    4. לדלל 1:2 על ידי pipetting 100 μL של 160 μg/mL FITC-פוליסוקרוז 70 לתוך שפופרת μg/mL ב80 ולהמשיך עם ריכוזים אחרים. להבטיח תערובת נכונה של ריכוזי מדולל (למשל, על ידי הרכבת השפופרת לפני שתמשיך).
    5. לדלל את דגימת שתן העכבר (0 דקות, 60 דקות) 1:10 עם בריכת השתן מדולל.
    6. פיפטה 5 μL של כל תקן FITC-polysucrose 70 הריכוז של דגימות שתן העכבר כמו טריליטים בצלחת שחור 384-באר. צנטריפוגה את הצלחת ב 1,000 x g עבור 15 s כדי למנוע בועות.
    7. לנתח את הצלחת 384-טוב בקורא צלחת. לבצע עירור ב 496 ננומטר ולמדוד את הזריחה ב 525 nm.
  2. מדידת קריאטינין
    1. בצע את הוראות היצרן. בקצרה, הכנת תקני קריאטינין על ידי דילול 10 μL של הפתרון הסטנדרטי 100 mM קריאטינין עם 990 μL של מאגר שיטת קריאטינין כדי להכין פתרון 1 מ"מ סטנדרטי.
    2. הוסף 0, 2, 4, 6, 8, ו 10 μL של פתרון סטנדרטי קריאטינין 1 מ"מ לתוך צלחת 96-באר כדי ליצור 0, 2, 4, 6, 8, ו 10 nmol/טוב סטנדרטים, בהתאמה. הוסף מאגר שיטת קריאטינין לכל באר כדי להביא את אמצעי האחסון ל 50 μL.
    3. להכין את תערובות התגובה על ידי הוספת 42 – 44 μL של מאגר שיטת קריאטינין, 2 μL של שילוב של יצורים, 2 μL של יצורים, 2 μL של מיקס אנזים קריאטינין, ו 2 μL של לווין קריאטינין. עבור ריק, להשתמש 44 μL של מאגר שיטת קריאטינין, 2 μL של יצורים, 2 μL של מיקס אנזימים של קריאטינין, ו 1 – 2 μL של לווין קריאטינין.
    4. הוסף 50 μL של שילוב התגובה המתאים לכל טוב בצלחת 96-באר ו דגירה אותו עבור 60 דקות על שייקר אופקי ב 37 ° c. להגן על צלחת מפני אור במהלך הדגירה. למדוד את ספיגת ב 570 ננומטר על קורא צלחת.
    5. חישוב ריכוזי קריאטינין על ידי הפחתת הערך הריק מכל הקריאות. התוצאה תהיה הננו מיקרואולס/microomליטר היחידה. להכפיל את הריכוז של קריאטינין על ידי המשקל המולקולרי של קריאטינין (113.12 ng/nmol) כדי לקבל את היחידה ננוגרם/מיקרוליטר.

6. ניתוח נתונים

  1. לחשב את FITC-polysucrose 70 בריכוז שתן מהעיקול הרגיל.
  2. הפניה ל-FITC-polysucrose 70 ריכוזי השתן לריכוזי קריאטינין בדגימת השתן הייצוגית.
  3. להפנות את השתן 60 דקות דגימות לשתן 0 דקות דגימות של פקדים ועכברים מטופלים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כפי שמתואר באיור 2, השיטה לבדיקת חדירות הפקפיות בעכברים מובנית בשלושה שלבים. השלב הראשון נקרא שלב ההכנה, שבו קטטר השתן ואת קטטר הורידים המרכזי ממוקמים. השלב השני נקרא שלב השיווציה, החל בהזרקה בעירוי של FITC-polysucrose 70 ואחריו אינפוזיה רציפה של FITC-polyסוכות 70 עבור 60 דקות. השלב האחרון נקרא. השלב הניסיוני בשלב זה, העירוי של FITC-polysucrose 70 ממשיך, תרופות או חומרים אחרים ניתן לבחון להשפיע על חדירות הפקפיות. השתן נאסף בסוף כל שלב.

כדי לחקור חדירות פקפיות בתוך מודל מעקב זה, חיוני למקום קטטר השתן כראוי ומבלי לפגוע רירית. המיקום של קטטר השתן לתוך שלפוחית שתן של העכבר הנשי מוצג באיור 1. הקטטר ממוקם 3 מ"מ לתוך ostium השופכה, במקביל לציר הגולגולת (איור 1A). הקטטר הוא הפך 180 ° לכיוון הזנב של העכבר (איור 1B) והציג 7 מ"מ יותר לתוך שלפוחית השתן, במקביל לעמוד השדרה murine (איור 1b, D).

כמתואר לעיל, שיטות קודמות כדי לבדוק חדירות הפקפיות בעכברים השתמשו בבדיקות כדי לטהר את האותות fitc-polysucrose 70 מדגימות שתן5,6. כמו שיטה זו משתמשת מדידה הזריחה ללא טיהור קודם של מעקב, PBS, שתן העכבר, ו-FITC-polysucrose 70 בשתן העכבר נותחו. איור 3A מראה את הסריקה הפלואורסצנטית של PBS עם שיא של זריחה ב 325 ננומטר, אשר נראה השפעה של הפלאש עירור ב 290 nm. הסריקה הפלואורסצנטית של שתן עכבר מקורי מראה מקסימום פלואורסצנטית ב 395 ננומטר (איור 3B). FITC-polysucrose 70 מומס בשתן העכבר מציג מקסימום פלואורסצנטית ב 525 nm (איור 3C, D). איור 3C מראה כי שתן העכבר אינו מפריע את המדידה הפלואורסצנטית של fitc-polysucrose 70 בשתן העכבר. הגדלת ריכוזים של FITC-polysucrose 70 להראות עוצמת קרינה מוגברת (איור 3E).

כדי להוכיח כי שיטה זו מסוגלת לזהות הבדלים חדירות הפקפיות, אנג II הוחל בשלב ניסיוני של המודל. אנג II הגדילה את החדירות הפקאוליות בעכברים 60 דקות לאחר מינהל רציף במינונים שאינם רלוונטיים ללחץ דם (איור 4A, B). הגידול בחדירות הפקאוליות בשל אנג השני יכול להיות חסום על ידי חוסם אנג ' ה II-הקולטן (ARB), כלומר candesartan (איור 4A). כשלון אנג השני ירד חדירות הפקאוליות (איור 4a). לחץ הדם נמדד באמצעות שיטת הזנב ולא הראה הבדלים משמעותיים בין הקבוצות (איור 4B). פוליסוכרוז 70-ו-FITC-פוליסוקרוז 70-בעלי חיים בעלי משרת בעלי חיים מטופלים עבור FITC-polyסוכות 70-ו-אנג השני התייחסו לחיות (איור 4C).

Figure 1
איור 1: הצבת צנתר השתן בעכברים נקבה. מבט לרוחב של הבטן העכבר. (א) צנתר מסומן ומשמן הציג 3 מ"מ לתוך השופכה החיצוני של העכבר הנשי. ציר הגולגולת של השופכה מוקרב עם הקטטר. המתח הזהיר על הבטן התחתונה עם האצבע הימנית השמאלית מקלה על המבוא של הקטטר לתוך ostium חיצוני השופכה. (ב) הקטטר הפך 180 ° לכיוון הזנב של העכבר. הקצה של הקטטר נשאר 3 מ"מ בתוך ostium חיצוני השופכה. (ג) הצנתר הציג כעת 7 מ"מ יותר לתוך שלפוחית השתן. הכיוון של הקטטר מיושר עם עמוד השדרה murine. (ד) השקפה גמדית של הבטן של העכבר. הקטטר ממוקם 10 מ"מ לתוך העכבר. (ה) שתן מופיע עם הכנסה נכונה לתוך שלפוחית השתן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: איור סכמטי של ההליכים הניסיוניים על ציר זמן. לאחר נרקוזיס של העכבר, קטטר השתן ממוקם. צנתר הורידים המרכזי מושתל והשתן הבסיסי מתקבל (0 דקות). לאחר מכן, FITC-polysucrose 70 בולוס מוחל באמצעות קטטר הורידים המרכזי ועירוי מתמשך של FITC-polyסוכות 70 מופעל. השלב המפוקפק עבור FITC-polysucrose 70 נמשך 60 דקות. השתן נאסף לאחר השלב לימוד (0 דקות) ולפני השלב ניסיוני מתחיל. בשלב זה ניתן ליישם תרופות או חומרים אחרים (כמו אנגיוטנסין II). בסוף השלב הניסיוני, השתן מתקבל לניתוח (60 דקות). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: הזריחה של PBS ושתן העכבר עם ובלי FITC-polysucrose 70. (A) בתדירות זריחה סריקה (עירור של 290 ננומטר, פליטה של 325-700 nm) של PBS מראה אות ב 325 nm, אשר נראה השפעה של הבזק עירור ב 290 nm. (ב) לסרוק את התדר של העכבר מקורית שתן (בריכת שתן מדולל ב 1:10 ו 1:20), יש אות עם מקסימום ב 395 nm, כנראה נגרמת על ידי חלבון השתן autoפלואורסצנטית. (ג) שתן העכבר המכיל fitc-polysucrose 70 (40 μg/mL) מראה שיא האות ב 525 nm שאינה מפריעה למדידה של השתן האוטומטי. (ד) הגדלה של מעלה fitc-polyסוכות 70 השיא הזריחה בהתאם גל הפליטה. ריכוזים שונים של FITC-polysucrose 70 (1.25, 2.5, 5, 10, 20, ו40 μg/mL) מוצגים. (ה) הגדלת הריכוזים של fitc-polysucrose 70 מראים עלייה של עוצמת הקרינה הפלואורסצנטית של 525 ננומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: אנגיוטנסין ii (אנג ii) מגביר חדירות פקפיות. (א) Ang II מגביר באופן משמעותי את חדירות הפקפיות בעכברים, נמדד על ידי fitc-polysucrose 70 זיהוי בשתן של עכברים (ממוצע + SEM; n = 5; p < 0.004, נבדק על ידי מבחן קרוקאל-ווליס). FITC-polysucrose 70 ריכוזים בשתן הופנה לריכוזים של קריאטינין שתן. העמודות הלבנות (0 דקות) מייצגות את FITC-polysucrose 70 רמות לפני תחילת הגירוי של אנג II, העמודות השחורות (60 דקות) לייצג FITC-polyסוכות 70 רמות 60 דקות לאחר תחילת הגירוי אנג II, ואת העמודות האפורות (120 דקות או + 60 דקות) לאחר נוסף 60 דקות של גירוי אנג II או 60 דקות של כשלון אנג II. (ב) לחץ דם סיסטולי היה מפוקח על ידי שיטת הזנב (ממוצע + SEM). אין הבדלים משמעותיים בלחץ הדם בין השליטה לבין קבוצות שטופלו אנג II. (ג) פוליסוכרוז 70 ו-fitc-פוליסוקרוז 70 אינם משנים באופן משמעותי חדירות הפקפיות בעכברים. אנג II מגביר חדירות פקאוליות בעכברים באופן משמעותי (ממוצע + SEM; n = 7, p < 0.005). דמות זו השתנתה מקונאיסהאוזן ואח '8. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Supplemental Figure 1
משלימה איור 1: דיאגרמה סכמטית של הצבת קטטר השתן בעכברים נקבה. מבט לרוחב של הבטן העכבר. (א) צנתר מסומן ומשמן הציג 3 מ"מ לתוך השופכה החיצוני של העכבר הנשי. ציר הגולגולת של השופכה מוקרב עם הקטטר. המתח הזהיר על הבטן התחתונה עם האצבע הימנית השמאלית מקלה על המבוא של הקטטר לתוך ostium חיצוני השופכה. (ב) הקטטר הפך 180 ° לכיוון הזנב של העכבר. הקצה של הקטטר נשאר 3 מ"מ בתוך ostium חיצוני השופכה. (ג) הצנתר הציג כעת 7 מ"מ יותר לתוך שלפוחית השתן. הכיוון של הקטטר מיושר עם עמוד השדרה murine. (ד) השקפה גמדית של הבטן של העכבר. הקטטר הוא הציג 3 מ"מ לתוך ostium חיצוני השופכה של עכבר נקבה. (ה) לאחר הקטטר הוא הפך 180 °, זה הציג 7 מ"מ יותר לתוך שלפוחית השתן של העכבר. הכיוון של הקטטר מיושר עם עמוד השדרה murine. איור זה השתנה מרייס ואח '7. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

השיטה המוצגת מאפשרת לחוקר לבדוק חדירות הפקפיות בעכברים באופן רגיש מאוד באמצעות מכשיר מעקב. עם שיטה זו, עליות לטווח קצר בחדירות הפקפיות ניתן לאבחן באמצעות כמויות קטנות בלבד של שתן. הצעדים הקריטיים ביותר עבור מאסטרינג בהצלחה טכניקה זו הם 1) לפתח מומחיות ידנית בניתוח העכבר, במיוחד בצינורית של וריד מרכזי, 2) הצבת קטטר השתן מבלי לפגוע רירית, ו 3) מומחיות ידנית בטיפול 384-ובכן צלחות עם כמויות קטנות של דגימות.

כאשר הצבת צנתר הורידים המרכזי, חיוני כי הקטטר לא לחדור את הווריד העורק. כדי למנוע חדירה, אנו ממליצים לשים מתח על וריד הצוואר עם ליגטורה (ראה שלב 2.2.7) ולהרים את וריד הצוואר עם מלקחיים עדינים כדי להאריך את לומן הווריד של העורק. כדי לשמור על אתר הכניסה קטן, לנסות להימנע תנועות ברוטו תוך החדרת קטטר ותמיד להבטיח את התצוגה הטובה ביותר של השדה כירורגי על ידי הסרת רקמות נוספות. הצעד הקריטי ביותר במיקום של קטטר השתן הוא ההכנסה הסופית לתוך שלפוחית השתן. אם ההתנגדות מורגשת, אנו ממליצים להתחיל שוב מההתחלה כדי לא לגרום לעקבות שווא ולפגיעה ברירית. סיבוב קטטר, שימון, תנועות עדין, כמו גם הכשרה, לעזור במקרים קשים7.

FITC-polysucrose 70 הינה מתויג בעזרת פלואור, מסועף, פולימר מקושר ומוחצות של סוכרוז ואפילורוט9. היא מתנהגת בתמיסה כמולקולה כדוריים עם צורה כדורית ובעלת צורה נמוכה של סימטריה, אך עם היעדר מולקולרי9. כמו מולקולות אחרות של סוכות, FITC-polysucrose 70 מסונן על ידי הגלובולוס ולא נספג מחדש במערכת הכרישים4. כדי להימנע בחינם מולקולות fitc באינפוזיה, אנו דיאליזה הפתרון fitc-polyסוכות 70 לפני היישום לעכברים. ניתן לאחסן דיאליזה fitc-פוליסוקרוז 70 מולקולות ב-20 ° c במשך חודשים. כמו FITC-polysucrose 70 מיושם באופן מהותי בפרוטוקולים זה ואחרים, זה חיוני כי הדם לא מזהם את דגימות השתן. לכן, קטטר השתן צריך להיות ממוקם עם הזהירות וחומרים נוגד קרישה בתוך הניסוי יש להימנע. העקומה הסטנדרטית עבור FITC-polysucrose 70 מומס בבריכת שתן העכבר כדי לקבל את התוצאות המדויקות ביותר. עקב הבדלים ריכוז בשתן בנקודות זמן ניסיוני שונות בין קבוצות, FITC-polysucrose 70 ריכוזי צריך להיות מופנה סמן בשתן המשקף ריכוז שתן (למשל, קריאטינין). הפרעות של FITC-polyסוכות 70 פלואורסצנטית עם מדידה של קריאטינין בתוך שיטת אנזימטית הוא סביר.

את הניתוח של מ70 הקרינה הפלואורסצנטית FITC-polyסוכות יש לבצע בשחור 384-טוב צלחות כמו שתן קטן כרכים של 5 μL ניתן למדוד צלחות אלה. אנחנו לא ממליצים לעשות שימוש חוזר בבארות בתוך הצלחות 384-היטב, גם לאחר שטיפת הצלחות, כאשר הקרינה הפלואורסצנטית עדיין מדידה. כמו בועות להפריע לקריאה הזריחה, לוחיות צריך להיות centrifuged לפני הניתוח. לחילופין, בועות ניתן להשמיד באופן ידני עם קצה של פיפטה.

השימוש של poly, ורדים כדי לבחון את הפרסלקטיביות permselectivity תוארה כמעט 40 שנים לפני10. שכותרתו באופן מסווג polysucrose נחקר במחקרים פציעה בלתי מעשית כמעט אך ורק חולדות בשנים האחרונות4,11,12,13,14,15 ,16,17,18,19,20. זו עשויה להיות סיבות אנטומית עקב הליכים כירורגיים קל יותר חולדות מאשר עכברים. בחולדות, כריתת השופכה משמשת להשגת דגימות שתן4,5,9,12,13,14,21. כדי לנתח דגימות פלזמה ושתן, הבדיקות מותחות כרומטוגרפית בגודל ביצועים גבוהים4,5,9,12,13,14 ,21. בנוסף, שיעור סינון פקתית (gfr) נמדד על ידי רדיואקטיבי 51Cr-ethylenediamine חומצה (edta)4,5,9,12,13 ,14,21. שני מחקרים קודמים החילו fitc-polysucrose 70 בעכברים5,6. בעכברים, צנתר השתן של suprapubic מוכנס לתוך שלפוחית השתן6,20. בדיקות השתן והפלזמה חשופים לסינון ג'ל לפני הניתוח של הקרינה הפלואורסצנטית FITC-polysucrose 70. דומה כמו חולדות, gfr נותח באמצעות רדיואקטיביות6,20. הפרסום השני בנוגע ליישום של FITC-polysucrose 70 בעכברים משתמש במודל של חדירות הצפק ולכן, לא לנתח את שתן העכבר עבור FITC-polysucrose 70 זריחה22. השיטה המוצגת, לכן, שונתה כדי להקל על דגימת שתן וניתוח. דגימות שתן ניתן להשיג בקלות דרך קטטר השתן לא פולשני. בדיקת שתן עבור FITC-polyסוכות 70 פלואורסצנטית מבוצע ללא כל ביצועים הקודם בגודל גבוה הדרה כרומטוגרפיה או סינון ג'ל. על ידי הפניה FITC-polysucrose 70 פלואורסצנטית לתוך העכבר קריאטינין שתן, המדידה של GFR עם שיטת קרינה רדיואקטיבית אינו נדרש.

מגביר את לחץ הדם לשפר חדירות הפקפיות. לכן, ניטור לחץ הדם חיוני תוך חקירת חדירות הפקפיות. לחץ דם מדויק ביותר מדידות בעכברים מבוצעים באמצעות קטטר העורקים המרכזית23 הזקוקים המלחה של הקטטר כדי למנוע קרישה. הייתה לנו בעיה עם המטוריה אחרי. המלחה במינון נמוך ומיקום קטטר לכן, החלטנו לבצע את טכניקת הזנב כדי למדוד לחץ דם, אשר אינו פולשני ולא צריך המלחה. בהתאם לעומק ההרדמה, לחץ הדם מעקב עם שיטת הזנב הוא לפעמים מאתגר. ממברנות לחץ דם צריך להיבדק מראש ואת המיקום של העכבר צריך להיות ממוטבת לפני הקלטת לחץ דם.

בנוסף לאתגרים במדידת לחץ דם, טכניקה זו מוגבלת גם על ידי הפקת יחידות שרירותיות של FITC-polysucrose 70. עד כה, טכניקה זו נחקרה רק בבעלי חיים, ולכן, הרלוונטיות שלה למסנן הפקולי האנושי עדיין אינה ידועה. מרווחי זמן כדי לחקור עליות חדירות הפקפיות תלוי בייצור שתן העכבר. לכן, עליות לטווח קצר מאוד בחדירות הפקליות (בדקות) ניתן להחמיץ בשל היעדר ייצור שתן של העכבר. בפרוטוקול זה, FITC-polysucrose 70 הוא מנורמל קריאטינין שתן, אשר מוסר מהדם בעיקר באמצעות סינון פקפיות, אבל גם על ידי הפרשה הכרישים האבוביות. פעולה זו תציג שגיאה בעת הערכת חדירות הפקפיות באמצעות שיטה זו, הפחתת הסיווג החלקי הנמדד של polysucrose24.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

המחברים מודים לכריסטינה שוואנדט, בלנקה Duvnjak, ו ניקולא Kuhr עבור הסיוע הטכני היוצא דופן שלהם ד ר. דניס סון על עזרתו עם הסריקה הפלואורסצנטית. מחקר זה היה נתמך על ידי מענק של הגרמני Forschsgeמייסמייססביס2 (DFG) SFB 612 TP B18 כדי L.C.R. ו L.S. לפאנדר לא היה כל תפקיד בעיצוב הלמידה, איסוף נתונים וניתוח, החלטה לפרסם או הכנת כתב היד.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Motic SMZ168 BL Motic SMZ168BL microscope for mouse surgery
KL1500LCD Pulch and Lorenz microscopy 150500 light for mouse surgery
Microfederschere Braun, Aesculap FD100R fine scissors
Durotip Feine Scheren Braun, Aesculap BC210R for neck cut
Anatomische Pinzette Braun, Aesculap BD215R for surgery 
Präparierklemme Aesculap BJ008R for surgery 
Seraflex Serag Wiessner IC108000 silk thread
Ketamine 10% Medistar anesthesia
Rompun (Xylazin) 2% Bayer anesthesia
Fine Bore Polythene Tubing ID 0.28mm OD 0.61mm Portex 800/100/100 Catheter
Fine Bore Polythene Tubing ID 0.58mm OD 0.96mm Portex 800/100/200 Catheter
Harvard apparatus 11 Plus Harvard Apparatus 70-2209 syringe pump
BD Insyte Autoguard BD 381823  urinary catheter
Multimode Detector DTX 880 Beckman Coulter plate reader
384 well microtiterplate Nunc 262260 384 well platte
Creatinine Assay Kit Sigma-Aldrich MAK080 to measure creatinine concentration
96 well plate Nunc 260836 for creatinine assay 
FITC-labeled polysuccrose 70 TBD Consultancy FP70 FITC-ficoll
Angiotensin II Sigma-Aldrich A9525 used to test glomerular permeability
BP-98A Softron for blood pressure measurement
OTS 40.3040 Medite 01-4005-00 heating plate for mouse surgery
Instillagel 6mL Farco-Pharma GmbH for urinary catheter
Exacta Aesculap GT415 shaver

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chronic Kidney Disease Prognosis Consortium,, et al. Association of estimated glomerular filtration rate and albuminuria with all-cause and cardiovascular mortality in general population cohorts: a collaborative meta-analysis. Lancet. 375 (9731), 2073-2081 (2010).
  2. Mori, K. P., et al. Increase of Total Nephron Albumin Filtration and Reabsorption in Diabetic Nephropathy. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (1), 278-289 (2017).
  3. Amsellem, S., et al. Cubilin is essential for albumin reabsorption in the renal proximal tubule. Journal of the American Society of Nephrology. 21 (11), 1859-1867 (2010).
  4. Axelsson, J., Rippe, A., Oberg, C. M., Rippe, B. Rapid, dynamic changes in glomerular permeability to macromolecules during systemic angiotensin II (ANG II) infusion in rats. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 303 (6), F790-F799 (2012).
  5. Grande, G., et al. Unaltered size selectivity of the glomerular filtration barrier in caveolin-1 knockout mice. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 297 (2), F257-F262 (2009).
  6. Jeansson, M., Haraldsson, B. Glomerular size and charge selectivity in the mouse after exposure to glucosaminoglycan-degrading enzymes. Journal of the American Society of Nephrology. 14 (7), 1756-1765 (2003).
  7. Reis, L. O., et al. Anatomical features of the urethra and urinary bladder catheterization in female mice and rats. An essential translational tool. Acta Cirurgica Brasileira. 26, 106-110 (2011).
  8. Konigshausen, E., et al. Angiotensin II increases glomerular permeability by beta-arrestin mediated nephrin endocytosis. Scientific Reports. 6, 39513 (2016).
  9. Venturoli, D., Rippe, B. Ficoll and dextran vs. globular proteins as probes for testing glomerular permselectivity: effects of molecular size, shape, charge, and deformability. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 288 (4), F605-F613 (2005).
  10. Bohrer, M. P., Deen, W. M., Robertson, C. R., Troy, J. L., Brenner, B. M. Influence of molecular configuration on the passage of macromolecules across the glomerular capillary wall. The Journal of General Physiology. 74 (5), 583-593 (1979).
  11. Dolinina, J., Rippe, A., Bentzer, P., Oberg, C. M. Glomerular hyperpermeability after acute unilateral ureteral obstruction: Effects of Tempol, NOS-, RhoA- and Rac-1-inhibition. American Journal of Physiology-Renal Physiology. , (2018).
  12. Dolinina, J., Sverrisson, K., Rippe, A., Oberg, C. M., Rippe, B. Nitric oxide synthase inhibition causes acute increases in glomerular permeability in vivo, dependent upon reactive oxygen species. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 311 (5), F984-F990 (2016).
  13. Sverrisson, K., Axelsson, J., Rippe, A., Asgeirsson, D., Rippe, B. Acute reactive oxygen species (ROS)-dependent effects of IL-1beta, TNF-alpha, and IL-6 on the glomerular filtration barrier (GFB) in vivo. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 309 (9), F800-F806 (2015).
  14. Sverrisson, K., Axelsson, J., Rippe, A., Asgeirsson, D., Rippe, B. Dynamic, size-selective effects of protamine sulfate and hyaluronidase on the rat glomerular filtration barrier in vivo. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 307 (10), F1136-F1143 (2014).
  15. Sverrisson, K., et al. Extracellular fetal hemoglobin induces increases in glomerular permeability: inhibition with alpha1-microglobulin and tempol. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 306 (4), F442-F448 (2014).
  16. Axelsson, J., Mahmutovic, I., Rippe, A., Rippe, B. Loss of size selectivity of the glomerular filtration barrier in rats following laparotomy and muscle trauma. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 297 (3), F577-F582 (2009).
  17. Axelsson, J., Rippe, A., Rippe, B. Transient and sustained increases in glomerular permeability following ANP infusion in rats. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 300 (1), F24-F30 (2011).
  18. Axelsson, J., Rippe, A., Rippe, B. Acute hyperglycemia induces rapid, reversible increases in glomerular permeability in nondiabetic rats. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 298 (6), F1306-F1312 (2010).
  19. Axelsson, J., Rippe, A., Venturoli, D., Sward, P., Rippe, B. Effects of early endotoxemia and dextran-induced anaphylaxis on the size selectivity of the glomerular filtration barrier in rats. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 296 (2), F242-F248 (2009).
  20. Andersson, M., Nilsson, U., Hjalmarsson, C., Haraldsson, B., Nystrom, J. S. Mild renal ischemia-reperfusion reduces charge and size selectivity of the glomerular barrier. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 292 (6), F1802-F1809 (2007).
  21. Dolinina, J., Rippe, A., Bentzer, P., Oberg, C. M. Glomerular hyperpermeability after acute unilateral ureteral obstruction: effects of Tempol, NOS, RhoA, and Rac-1 inhibition. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 315 (3), F445-F453 (2018).
  22. Rosengren, B. I., et al. Transvascular protein transport in mice lacking endothelial caveolae. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 291 (3), H1371-H1377 (2006).
  23. Whitesall, S. E., Hoff, J. B., Vollmer, A. P., D'Alecy, L. G. Comparison of simultaneous measurement of mouse systolic arterial blood pressure by radiotelemetry and tail-cuff methods. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 286 (6), H2408-H2415 (2004).
  24. Eisner, C., et al. Major contribution of tubular secretion to creatinine clearance in mice. Kidney International. 77 (6), 519-526 (2010).

Tags

רפואה סוגיה 150 חדירות פקאביליות פוליסוכרוז מעקב אלבומין קטטר השתן של העכבר צנתר מרכז ורידי של העכבר הסרעפת חותך פקעית
מדידה רגישה מאוד של חדירות הפקאוליות בעכברים עם פלואורואסעין איזוטיקריאט-פוליסוכרוז 70
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Königshausen, E., Potthoff, S.… More

Königshausen, E., Potthoff, S. A., Woznowski, M., Stegbauer, J., Rump, L. C., Sellin, L. Highly Sensitive Measurement of Glomerular Permeability in Mice with Fluorescein Isothiocyanate-polysucrose 70. J. Vis. Exp. (150), e59064, doi:10.3791/59064 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter