هنا، نقدم بروتوكول مفصل للكشف عن وقياس مستويات البروتين أثناء تكوين الجمجمة والوجه / مسببات الأمراض عن طريق التلطيخ المناعي باستخدام أنسجة الجمجمة والوجه الماوس كأمثلة. وبالإضافة إلى ذلك، فإننا نصف طريقة لإعداد واستئصال التبريد من الأنسجة الصلبة undecalcified من الفئران الشباب لتلطيخ المناعة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
إعداد الأنسجة وتلطيخ المناعة من أنسجة الفئران القحفية والعظام غير الصائق
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
يوفر تلطيخ مناعة الأنسجة اكتشافًا محددًا للغاية وموثوقًا به للبروتينات ذات الأهمية داخل نسيج معين. هنا نقوم بوصف بروتوكول كامل وبسيط للكشف عن التعبير عن البروتين أثناء تكوين الجمجمة والوجه / مسببات الأمراض باستخدام أنسجة الجمجمة والوجه الماوس كأمثلة. ويتألف البروتوكول من إعداد الأنسجة وتشريحها بالتبريد بالتبريد، والفلورة المناعية غير المباشرة، والحصول على الصور، والقياس الكمي. وبالإضافة إلى ذلك، يتم وصف طريقة لإعداد واستئصال الأنسجة الصلبة غير الصائرة للبقع المناعي، وذلك باستخدام أنسجة الوجه القحفي والعظام الطويلة كأمثلة. هذه الأساليب هي المفتاح لتحديد التعبير البروتين والتغيرات المورفولوجية / التشريحية في الأنسجة المختلفة أثناء تكوين الجمجمة والوجه / مسببات الأمراض. كما أنها تنطبق على الأنسجة الأخرى مع التعديلات المناسبة. المعرفة بالأنسجة وجودة عالية من الأقسام أمر بالغ الأهمية لاستخلاص النتائج العلمية من النتائج التجريبية. وتشمل القيود المحتملة لهذه المنهجية، على سبيل المثال لا الحصر، خصوصية الأجسام المضادة وصعوبات التحديد الكمي، التي تناقش هنا أيضاً.
المقدمة
الوجه هو جزء رئيسي من الهوية البشرية، ويتكون من عدة أنواع مختلفة من الأنسجة، مثل ظهارة، العضلات، العظام، الغضروف، الأسنان. هذه الأنسجة مشتقة من جميع الطبقات الجرثومية الثلاث: ectoderm، endoderm، وmesoderm1،2. لنمط وتطوير الأنسجة القحفية الوجهية بشكل صحيح، يجب أن يكون انتشار الخلايا والوفاة والتمايز منسقاً ومنظماً بشكل كبير من خلال مسارات إشارة محددة، مثل مسارات Wnt وFgf وHh وBMP3و4 ،5. العيوب في انتشار أو البقاء على قيد الحياة أو تمايز الخلايا سوف تؤدي إلى تشوهات في الوجه القحفي، والتي هي من بين العيوب الخلقية الخلقي....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
وقد أجريت جميع تجارب الماوس وفقا للمبادئ التوجيهية لجامعة ميشيغان التي تغطي الرعاية الإنسانية واستخدام الحيوانات في البحوث. تمت الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية المستخدمة في هذه الدراسة من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها (IACUC) في جامعة ميشيغان (البروتوكول #PRO00007715).
1. إعداد الأنسجة
-
إعداد الأنسجة الجنينية
- إعداد طبق واحد 10 سم والعديد من الأطباق 3.5 سم التي تحتوي على الفوسفات المخزنة المالحة (PBS)، ولوحة ثقافة 12 جيدا تحتوي على 2 مل 4٪ بارافورماليد (PFA) في PBS في كل بئر لكل فأر حامل. ضع جميع أطباق بيتري وطبق على الجليد.
ملاحظة: التعامل مع 4٪ PFA في غطاء محر....
- إعداد طبق واحد 10 سم والعديد من الأطباق 3.5 سم التي تحتوي على الفوسفات المخزنة المالحة (PBS)، ولوحة ثقافة 12 جيدا تحتوي على 2 مل 4٪ بارافورماليد (PFA) في PBS في كل بئر لكل فأر حامل. ضع جميع أطباق بيتري وطبق على الجليد.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
أقسام الأنسجة القحفية الجنينية
بعد الخطوات المذكورة أعلاه، تم تشريح الرؤوس من السيطرة(P0-Cre)أو متحولة (تنشيط بشكل تأسيسي Bmpr1a في خلايا القمم العصبية، P0-Cre؛ caBmpr1a)الأجنة في اليوم الجنيني (E) 16.5 أو 18.5. بعد تحديد في 4٪ PFA لمدة 4 ساعة، تم تضمين العينات في OCT وcryosectioned coronally. وكانت المقاطع الناتجة ملطخة بالأجسام المضادة ضد pSmad1/5/9 (عوامل الإشارة إلى المصب BMP) أو Ki67 (علامة انتشار الخلايا) دون استرجاع مستضد وفقا للبروتوكول. كما ه.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
هنا نقدم بروتوكول مفصل لإعداد رأس الماوس وأنسجة العظام غير الصائق، واستئصال التبريد لتلطيخ المناعة من انتشار الخلايا، وموت الخلايا، وعلامات إشارات BMP. كما نقوم بتفصيل استراتيجية الحصول على البيانات الكمية من الصور المناعية الفلورية. ويمكن أيضا أن تنطبق هذه الأساليب على الأنسجة الأخرى مع التعديلات المناسبة.
تختلف ظروف إعداد الأنسجة حسب حجم ونوع الأنسجة. عادة ما يحتاج وقت التثبيت والحماية بالتبريد إلى عدة ساعات إلى ليلة وضحاها. بعد التثبيت، يمكن أيضا أن تكون جزءا لا يتجزأ من الأنسجة في البارافي.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
وقد دعم هذا العمل المعاهد الوطنية للصحة (R01DE020843 إلى Y.M.)، والرابطة الدولية للموارد المالية، ومنحة في المعونة من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (31500788 إلى J.Y.).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| شريط لاصق | Leica | # 39475214 | |
| Alexa fluor 488-Goa المضاد للأرانب الجسم المضاد الثانوي | Invitrogen | A-11034 | |
| Antifade Mountant مع DAPI | Invitrogen | P36931 | |
| ألبومين مصل الأبقار | Sigma | A2153 | |
| Coverslips | Fisher Brand | 12-545-E | |
| Cryostat | Leica | CM1850 | |
| EDTA | Sigma | E6758 | |
| مجهر مضان | أوليمبوس | BX51 | |
| الجيلاتين | سيجما | G1890 | |
| في الموقع ؛ طقم الكشف عن موت الخلايا | Millipore | S7165 | |
| شرائح المجهر | فيشر براند | 12-550-15 | |
| OCT مركب | فيشر للرعاية الصحية | 23-730-571 | |
| بارافورمالدهيد (PFA) | Sigma | P6148 ؛ | |
| محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) | Sigma | P4417 | |
| بولي إيثيلين جلايكول ؛ ثلاثي أوكتيل فينيل الأثير | سيجما | T9284 | تريتون X-100 |
| بروتيناز K | Invitrogen | AM2542 | |
| أرنب مضاد للأجسام المضادة Ki67 | تقنية إشارات الخلية | 9129 | الكثير #:3 ؛ RRID: AB_2687446 |
| أرنب المضادة للجسم المضاد | لتقنية إشارات الخلية | 13820 | Lot #:3 ؛ RRID: AB_2493181 |
| سترات الصوديوم | سيجما | 1613859 | |
| السكروز | سيجما | S9378 | |
| تريس | سيجما | 10708976001 |
المراجع
- Trinh, L. eA., Fraser, S. E. Imaging the cell and molecular dynamics of craniofacial development: challenges and new opportunities in imaging developmental tissue patterning. Current Topics in Developmental Biology. 115, 599-629 (2015).
- Marcucio, R., et al.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
