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Developmental Biology

ऊतक तैयारी और माउस Craniofacial ऊतकों और undecalified हड्डी के इम्यूनोस्टेनिंग

Published: May 10, 2019 doi: 10.3791/59113
Automatic Translation
*1,2, *2, 2
1The State Key Laboratory Breeding Base of Basic Science of Stomatology (Hubei-MOST) & Key Laboratory for Oral Biomedicine of Ministry of Education, School and Hospital of Stomatology, Wuhan University, 2Department of Biologic and Materials Sciences, School of Dentistry, University of Michigan
* These authors contributed equally

Summary

यहाँ, हम उदाहरण के रूप में माउस craniofacial ऊतकों का उपयोग करके craniofacial morphogenesis/pathogenesis के दौरान प्रोटीन के स्तर का पता लगाने और मात्रा निर्धारित करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। इसके अलावा, हम प्रतिरक्षा के लिए युवा चूहों से undecalified कठोर ऊतकों की तैयारी और cryosectioning के लिए एक विधि का वर्णन.

Abstract

ऊतक इम्यूनोस्टेनिंग किसी दिए गए ऊतक के भीतर ब्याज के प्रोटीन का अत्यधिक विशिष्ट और विश्वसनीय पता लगाने प्रदान करता है। यहाँ हम उदाहरण के रूप में माउस craniofacial ऊतकों का उपयोग craniofacial morphogenesis/pathogenesis के दौरान प्रोटीन अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए एक पूर्ण और सरल प्रोटोकॉल का वर्णन. प्रोटोकॉल की तैयारी और ऊतकों के cryosectioning के होते हैं, अप्रत्यक्ष इम्यूनोफ्लोरेसेंस, छवि अधिग्रहण, और परिमाणीकरण. इसके अलावा, इम्यूनोस्टेनिंग के लिए undecalified कठोर ऊतकों की तैयारी और क्रायोसेक्शनिंग के लिए एक विधि का वर्णन किया गया है, उदाहरण के रूप में craniofacial ऊतकों और लंबी हड्डियों का उपयोग कर। उन विधियों को प्रोटीन अभिव्यक्ति और craniofacial morphogenesis/pathogenesis के दौरान विभिन्न ऊतकों में आकृतिक /परमाणु परिवर्तन निर्धारित करने के लिए महत्वपूर्ण हैं। वे भी उचित संशोधनों के साथ अन्य ऊतकों के लिए लागू होते हैं. ऊतक विज्ञान और वर्गों के उच्च गुणवत्ता का ज्ञान प्रयोगात्मक परिणामों से वैज्ञानिक निष्कर्ष आकर्षित करने के लिए महत्वपूर्ण हैं. इस पद्धति की संभावित सीमाओं में शामिल हैं, लेकिन एंटीबॉडी की विशिष्टता और परिमाणीकरण की कठिनाइयों तक ही सीमित नहीं हैं, जिन पर यहां भी चर्चा की गई है।

Introduction

चेहरा मानव पहचान का एक महत्वपूर्ण हिस्सा है, और इस तरह के उपकला, मांसपेशियों, हड्डी, उपास्थि, दांत के रूप में ऊतकों के कई अलग अलग प्रकार से बना है। वे ऊतक सभी तीन रोगाणु परतों से प्राप्त होते हैं: बहिर्चर्म, अंत:चर्म, तथा मध्यजनस्तर1,2. उचित पैटर्न और craniofacial ऊतकों के विकास के लिए, सेल प्रसार, मौत और भेदभाव अत्यधिक समन्वित और विशिष्ट संकेतन रास्ते द्वारा विनियमित होने की जरूरत है, जैसे Wnt, Fgf, Hh और Bmp रास्ते3,4 ,5. कोशिकाओं के प्रसार, अस्तित्व या भेदभाव में दोष craniofacial विकृतियों के लिए नेतृत्व करेंगे, जो सबसे अक्सर होने वाली जन्मजात जन्म दोष के बीच में हैं. ट्रांसजेनिक चूहे कपालीय रूपजनन तथा रोगजनन1,2,3,4,5के तंत्र ों का अध्ययन करने के लिए उपयोगी साधन हैं . विकास और रोगजनन के दौरान कपालीय संरचनाओं में परिवर्तन को समझना महत्वपूर्ण विकासात्मक सिद्धांतों के साथ-साथ कपालात्मक विकृतियोंकेतंत्र को स्पष्ट करने में मदद करेगा1 ,2,3 ,4,5.

विशिष्ट एंटीबॉडी वाले पूरे माउंट या अनुभागीय ऊतकों का दाग ब्याज 6के प्रोटीन के स्थानिक वितरण का निर्धारण करने के लिए एक अमूल्य तकनीक है . औपचारिक रूप से, ऊतक इम्यूनोस्टेनिंग या तो इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (आईएचसी) या इम्यूनोफ्लोरेसेंस (आईएफ) पर भरोसा कर सकते हैं। IHC द्वारा 3,3'-Diaminobenzidine (DAB) के रूप में एक क्रोमोजेनिक सब्सट्रेट के साथ उत्पन्न अपारदर्शी प्रतिक्रिया उत्पाद के साथ तुलना में, यदि फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी द्वारा दिखाई फ्लोरोसेंट संयुग्मी का उपयोग शामिल है। इसलिए, IF स्पष्ट रूप से पृष्ठभूमि शोर से सकारात्मक कोशिकाओं में अंतर कर सकते हैं, और छवियों मात्रात्मक विश्लेषण किया जा करने के लिए अनुमति देता है और इस तरह ImageJ और एडोब फोटोशॉप7,8के रूप में सॉफ्टवेयर द्वारा एक सरल फैशन में बढ़ाया. पूरे माउंट धुंधला दृष्टिकोण ऊतक के छोटे ब्लॉकों पर काम करता है (कम से कम 5 मिमी मोटी), जो वर्गों9से पुनर्निर्माण के लिए आवश्यकता के बिना प्रोटीन के स्थान के बारे में तीन आयामी जानकारी प्रदान कर सकते हैं/ . हालांकि, ऊतक वर्गों के साथ तुलना में, पूरे माउंट इम्यूनोस्टेनिंग समय लेने वाला है और एंटीबॉडी समाधान की बड़ी मात्रा की आवश्यकता है। नहीं सभी एंटीबॉडी बुनियादी पूरे माउंट दृष्टिकोण के साथ संगत कर रहे हैं. इसके अलावा, एंटीबॉडी के अपूर्ण प्रवेश असमान धुंधला या झूठी नकारात्मक धुंधला में परिणाम होगा. यहाँ हम अनुभागीय ऊतकों पर प्रोटीन/एंटीजन के इम्यूनोफ्लोरेसेंस का पता लगाने पर ध्यान केंद्रित करेंगे। कठोर ऊतकों (जैसे, सिर, दांत, लंबी हड्डी) के लिए, विकास/रोगजनकता के दौरान कैल्शियम जमा करने से नमूना को अनुभाग में मुश्किल हो जाता है और इम्यूनोस्टेनिंग उपचार11,12 केदौरान आसानी से कुल्ला किया जाता है। वर्तमान में उपलब्ध अधिकांश प्रोटोकॉल अनुभागीकरण को आसान बनाने के लिए एम्बेड करने से पहले कठोर ऊतकों को निष्क्रिय कर देते हैं, जो समय लगता है और यदि गलत तरीके से 11,12को संभाला जाए तो नमूनों की आकृति विज्ञान और प्रतिजनों को नष्ट कर सकता है. मुद्दों पर काबू पाने के लिए, हम decalification के बिना कठिन ऊतकों के cryosectioning के लिए एक दृष्टिकोण अनुकूलित, उनकी आकृति विज्ञान और संकेत प्रोटीन के वितरण के बेहतर दृश्य के लिए अग्रणी.

यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल बीएमपी ट्रांसजेनिक चूहों के craniofacial ऊतकों में morphometric और हिस्टोलॉजिकल परिवर्तन निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है. विशेष रूप से, प्रोटोकॉल में शामिल हैं (1) कटाई और विच्छेदन सिर के ऊतकों, (2) अनुभाग और प्रयोगात्मक मार्करों के इम्यूनोस्टेनिंग (Ki67, pSmad1/5/9) TUNEL धुंधला के साथ, (3) फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग वर्गों इमेजिंग, और अंत में (4) विश्लेषण और परिणामों की मात्रा निर्धारित. बिना गणना के कठोर ऊतकों को तैयार करने और क्रायोसेक्शन के प्रोटोकॉल का भीवर्णन 13है . उन तरीकों craniofacial ऊतकों के लिए अनुकूलित कर रहे हैं. वे भी उचित संशोधनों के साथ नमूनों की विभिन्न उम्र से अन्य ऊतकों के लिए लागू होते हैं.

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Protocol

सभी माउस प्रयोगों मानवीय देखभाल और अनुसंधान में जानवरों के उपयोग को कवर मिशिगन विश्वविद्यालय के दिशा निर्देशों के अनुसार किया गया. इस अध्ययन में प्रयुक्त सभी पशु प्रक्रियाओं को मिशिगन विश्वविद्यालय (प्रोटोकॉल #PRO00007715) में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित किया गया था।

1. ऊतक तैयारी

  1. भ्रूण ऊतकों की तैयारी
    1. एक 10 सेमी पकवान और कई 3.5 सेमी व्यंजन जिसमें फॉस्फेट बफर्ड नमकीन (पीबीएस) युक्त तैयार करें, और प्रत्येक गर्भवती माउस के लिए प्रत्येक कुएं में पीबीएस में 2 एमएल 4% पैराफॉर्मेल्डिहाइड (पीएफए) युक्त एक 12-वेल कल्चर प्लेट। सभी पेट्री व्यंजन और बर्फ पर थाली रखें.
      नोट: एक धूआं हुड में 4% पीएफए संभाल.
    2. गर्भवती चूहों से भ्रूणों को बर्फ-ठंडा पीबीएस में बल औरकैंची से अलग करें जैसा कि पहले 14 वर्णित किया गया था।
      1. संक्षेप में, सीओ2के साथ एक गर्भवती माउस ethanize , forceps के साथ पेट के केंद्र के नीचे त्वचा हड़पने के लिए और त्वचा के माध्यम से ही कटौती, तो धीरे त्वचा पर खींच यह अंतर्निहित पेट की मांसपेशियों की दीवार से अलग करने के लिए.
      2. इसके बाद, त्वचा चीरा की एक ही पंक्ति के बाद पेट की गुहा में कटौती. भ्रूण की एक स्ट्रिंग वाले गर्भाशय को निकालें और गर्भाशय की दीवार को धीरे से काट कर भ्रूण को हटा दें। जर्दी थैली और एमनियन जैसे अतिरिक्त भ्रूण ऊतकों को हटा दिया जाएगा।
      3. प्रत्येक भ्रूण से सिर को काटकर अलग किया जाता है।
    3. एक 12 अच्छी तरह से एक प्लास्टिक हस्तांतरण pipette या forceps के साथ 4% पीएफए युक्त थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से प्रत्येक सिर स्थानांतरण. 4 डिग्री पीएफए में 4 डिग्री सेल्सियस पर नमूनों को ठीक करें 4 डिग्री सेल्सियस के लिए पीबीएस में 12 एच के लिए कोमल मिलाते हुए के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर।
      नोट: भ्रूण दिन 16.5 (E16.5) से छोटे भ्रूण के लिए, अलगाव के बाद सीधे 4% पीएफए के साथ भ्रूण सिर तय. E16.5 या बाद में भ्रूण के लिए, सिर से त्वचा और वसा ऊतक को त्यागना और निर्धारण से पहले बर्फ ठंड पीबीएस में कई बार कुल्ला करने के लिए हटा दें।
    4. क्रायोप्रोट सिर.
      1. एक नया 12 अच्छी तरह से एक प्लास्टिक हस्तांतरण pipette या forceps का उपयोग कर PBS में 30% sucrose के 2 एमएल युक्त एक नया 12 अच्छी तरह से थाली में प्रत्येक सिर स्थानांतरण. 4 डिग्री सेल्सियस पर धीरे से उत्तेजित जब तक सिर पकवान के नीचे करने के लिए डूब जाता है।
    5. एम्बेड सिर.
      1. इष्टतम काटने तापमान (OCT) यौगिक युक्त एक मोल्ड में cryoprotected सिर स्थानांतरण। कई मिनट के लिए OCT में बराबर के नमूने. स्थान और संदंश के साथ नमूनों की दिशा समायोजित करें.
      2. फ्रीज करने के लिए सूखी बर्फ पर मोल्ड रखें। -80 डिग्री सेल्सियस पर एक प्लास्टिक की थैली में जिसके परिणामस्वरूप cryomolds स्टोर cryosectioning के लिए तैयार जब तक.
        नोट: नमूनों की छंटनी पक्ष embedding मोल्ड के नीचे का सामना करना होगा.
  2. प्रसवोत्तर अनिर्दित कठोर ऊतकों की तैयारी
    1. सीओ2के साथ 3 सप्ताह या 3 महीने पुराने माउस पर यूथेनाइज़ करें। त्वचा और वसा ऊतकों को निकालें। चूहे से सिर या लंबी हड्डियों को काटकर अलग किया जाता है।
    2. 1-1-1-4 के चरणों में वर्णित चूहों के सिर अथवा लंबी हड्डी को ठीक और क्रायोप्रोट करें.
    3. कदम 1.1.5 के रूप में एक समान तरीके से 8% जिलेटिन में एम्बेड. क्रायोसेक्शनिंग तक -80 डिग्री सेल्सियस पर एक प्लास्टिक की थैली में क्रायोमल्ड्स रखें।
      नोट: यहाँ Decalification आवश्यक नहीं है. 8% जिलेटिन तैयार करने के लिए, 8 ग्राम जिलेटिन को 100 एमएल पीबीएस के साथ मिलाएं और माइक्रोवेव का उपयोग करके उबालें। ध्यान रखें कि मिश्रण पर आसानी से फोड़े.

2. क्रायोसेक्शनिंग

  1. OCT या -25 डिग्री सेल्सियस में एम्बेडेड नरम ऊतकों के लिए -18 डिग्री सेल्सियस के लिए cryostat तापमान सेट करें और जिलेटिन में एम्बेडेड undecalified कठोर ऊतकों के लिए कम। क्रायओस्टैट कक्ष में नमूने लगभग 30 मिनट के लिए रखें ताकि क्रायोस्टैट तापमान को बराबर किया जा सके।
  2. क्रायोमोल्ड से ब्लॉक को निष्कासित करें। एक OCT ड्रॉप के साथ बढ़ते के माध्यम से नमूना चक (ऊतक धारक) पर ब्लॉक फ्रीज. चक (ऑपरेटर का सामना करना पड़) से नमूना दूर की छंटनी पक्ष रखें।
  3. क्रायोस्टैट ऑब्जेक्ट होल्डर पर ब्लॉक-माउंटेड चक लोड करें। नमूना के सापेक्ष ब्लेड 3 डिग्री-5 डिग्री के कोण बनाने के लिए ब्लेड धारक को समायोजित करें।
  4. लेपित माइक्रोस्कोप स्लाइड पर 10 डिग्री मीटर वर्गों लीजिए। आरटी पर पूरी तरह से सूखी वर्गों, तो उन्हें -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।

3. हिस्टोलॉजिकल दाग और सूक्ष्म इमेजिंग

  1. इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला
    1. -80 डिग्री सेल्सियस से बाहर की स्लाइड्स पर जानिए। एयरड्री सेक्शन के लिए आरटी पर स्लाइड रखें। 0.1% PBST में स्लाइड कुल्ला (0.1% पॉलीथीन ग्लाइकोल tert-octylphenyl ईथर PBS में; सामग्री की तालिकादेखें ) तीन बार के लिए 5 मिनट प्रत्येक OCT बाहर धोने के लिए और permeabilize वर्गों.
    2. वैकल्पिक रूप से, एंटीजन पुनर्प्राप्ति (वैकल्पिक) करें.
      1. स्टीमर या पानी के स्नान के साथ धुंधला पकवान में 95-100 डिग्री सेल्सियस के लिए प्रीहीट साइट्रेट बफर (10 एमएम सोडियम साइट्रेट पीएच 6)। साइट्रेट बफर में स्लाइड विसर्जित, 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
      2. स्टीमर या पानी के स्नान से आरटी तक दागदार पकवान को निकाल लें। 20 मिनट याउससे अधिक समयतक आरटी पर स्लाइड को शांत करें।
        नोट: विकल्प के रूप में, गर्मी प्रेरित प्रतिजन रिट्रीवल के लिए Tris-EDTA बफर (10 एमएम Tris आधार, 1mM EDTA, 0.05% Tween 20, पीएच 9.0) या EDTA बफर (1 एमएम EDTA, 0.05% ट्वीन 20, पीएच 8.0) का उपयोग करें। गर्म स्टीमर के अलावा, गर्मी प्रेरित प्रतिजन पुनर्प्राप्ति के लिए एक प्रेशर कुकर, माइक्रोवेव, या पानी के स्नान का उपयोग करें। ट्रिप्सिन या पेप्सिन का उपयोग करके एक एंजाइम-प्रेरित प्रतिजन पुनर्प्राप्ति एक अन्य विकल्प है। हानिकारक वर्गों से बचने के लिए एंजाइमी पुनः प्राप्ति की एकाग्रता और उपचार समय का अनुकूलन। प्रत्येक एंटीबॉडी/एंटीजन संयोजन के लिए प्रतिजन पुनर्प्राप्ति विधि का अनुकूलन करें।
    3. 30 मिनट के लिए आरटी पर 200 डिग्री एल के साथ प्रत्येक स्लाइड को अवरुद्ध समाधान (5% गधा सीरम 0.1% PBST में पतला) के साथ इनक्यूबेट करें, फिर कुल्ला के बिना अवरुद्ध समाधान को हटा दें।
    4. प्राथमिक एंटीबॉडी या एंटीबॉडी के 100 $L के साथ प्रत्येक स्लाइड को आर टी या ओ/एन पर 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 एच के लिए समाधान को अवरुद्ध करने में पतला किया गया है। आरटी में प्रत्येक 10 मिनट के लिए तीन बार पीबीएस के साथ स्लाइड कुल्ला।
    5. प्रत्येक स्लाइड को 10 मिनट के लिए आरटी पर 1 h के लिए समाधान को अवरुद्ध करने में पतला माध्यमिक एंटीबॉडी के 100 $L के साथ इनक्यूबेट करें. RT. RT पर प्रत्येक 10 मिनट के लिए तीन बार स्लाइड्स को प्रकाश से सुरक्षित करें.
    6. स्लाइड्स पर क्लिक करें.
      1. स्लाइड पर डीएपीआई (4', 6-डायमिडिनो-2-फेनिलिनोल) के साथ एंटी-फैड माध्यम की दो बूँदें जोड़ें। फिर एक कवरस्लिप के साथ कवर करें।
      2. छवि के लिए तैयार जब तक अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।
        नोट: एक विकल्प के रूप में, DAPI या Hoechst 33324 डाई के साथ नाभिक लेबल पहले आरटी पर पीबीएस में 1:2,000 पतला, तो ग्लिसरोल के साथ माउंट.
  2. टर्मिनल deoxynucleotidyl transferase dUTP निक अंत लेबलिंग (TUNEL) धुंधला.
    नोट: 3'-hydroxyl टर्मिनी (3'OH डीएनए टर्मिनी) के साथ डबल-स्लेड डीएनए कोशिका में apoptosis के दौरान फार्म का होगा। यहाँ, हम एक प्रोटोकॉल है कि लेबल मुक्त 3'OH डीएनए termini digoxigenin-nucleotide टर्मिनल deoxynucleotilitil transferase (TdT) के साथ लेबल डीएनए टुकड़े के माध्यम से situ में एक वाणिज्यिक किट का उपयोग विशिष्ट धुंधला द्वारा प्रदान करते हैं (सामग्री की तालिका देखें ).
    1. वैकल्पिक रूप से, प्राथमिक और Alexa Fluor-488 के साथ दाग वर्गों TUNEL धुंधला करने से पहले माध्यमिक एंटीबॉडी लेबल. पीबीएस में स्लाइड्स को 10 मिनट के लिए तीन बार कुल्ला करें।
      नोट: यह कदम एक ही स्लाइड में एक प्रोटीन और TUNEL के एक डबल धुंधला के लिए वैकल्पिक है.
    2. आरटी. कुल्ला स्लाइड पर 5 मिनट के लिए 10 एमएम ट्राइस पीएच 7.5 और 5 एमएम EDTA में 100 डिग्री सेल्सियस K (10 डिग्री सेल्सियस/एमएल) के साथ प्रत्येक स्लाइड को इनक्यूबेट करें।
      नोट: प्रत्येक ऊतक प्रकार के लिए ऊष्मायन समय और प्रोटीनाज कश्मीर के तापमान को समायोजित करें। भ्रूण के 10 डिग्री वर्गों के लिए 4% पीएफए में तय, आरटी में 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट। प्रोटीनासे के उपयोग की विधि के अलावा, आवश्यकतानुसार वैकल्पिक उपचारों का उपयोग करें, जिनमें (1) ताजा तैयार 0.1% पॉलीथीन ग्लाइकोल टर्ट-ऑक्टिलफेनिल ईथर, 0.1% सोडियम साइट्रेट, 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट; (2) 0.25%-0.5% पेप्सिन एचसीएल (पीएच 2) या 0.25% ट्रिप्सिन, 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट; और (3) माइक्रोवेव विकिरण के साथ 0.1 एम साइट्रेट बफर (पीएच 6).
    3. प्रत्येक स्लाइड के लिए समाधान को अवरुद्ध करने के 200 डिग्री सेल्सियस (5% गधा सीरम 0.1% PBST में पतला) लागू करें, 30 मिनट के लिए आरटी पर इनक्यूबेट करें, कुल्ला के बिना अवरुद्ध समाधान को टैप करें।
    4. कम से कम 10 s. कुल्ला के बिना बफर बंद ठोकर के लिए आरटी पर प्रत्येक स्लाइड करने के लिए किट द्वारा आपूर्ति की समीक्षता बफर के 50 $L लागू करें।
    5. 3:7 के अनुपात में किट द्वारा आपूर्ति की प्रतिक्रिया बफर के साथ TdT एंजाइम मिश्रण द्वारा प्रतिक्रिया मिश्रण (काम शक्ति TdT एंजाइम) तैयार करें। प्रत्येक स्लाइड पर प्रतिक्रिया मिश्रण का 50 डिग्री सेल्सियस लागू करें, और 1 ज के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। बिना rinsing के बफर को टैप करें।
    6. प्रत्येक स्लाइड के लिए किट द्वारा आपूर्ति किए गए स्टॉप बफर (1:30 पतला डीएच2ओ) के 200 डिग्री सेल्सियस लागू करें, फिर 10 मिनट के लिए आरटी पर इनक्यूबेट करें। 10 मिनट प्रत्येक के लिए पीबीएस के साथ स्लाइड को तीन बार लें।
    7. Rhodamine एंटीबॉडी के साथ लेबल.
      1. प्रत्येक स्लाइड के लिए पूर्व-वार्म्ड (आरटी) एंटी-डिगोक्सीजेनिन संयुग्मी (रोडोमाइन) (1:1 अवरुद्ध समाधान में पतला) के 50 डिग्री एल लागू करें। अंधेरे में 30 मिनट के लिए आरटी में इनक्यूबेट।
      2. 10 मिनट प्रत्येक के लिए तीन बार पीबीएस के साथ स्लाइड कुल्ला. चरण 3.1.6 के रूप में स्लाइड्स माउंट करें.

4. इमेजिंग अधिग्रहण

  1. फ्लोरोसेंट के तहत छवियों की पृष्ठभूमि का मूल्यांकन करने के लिए संकेत लेबलिंग और नकारात्मक नियंत्रणों (प्राथमिक एंटीबॉडी, आइसोटाइप नियंत्रण, या ऊतकों को लक्ष्य प्रतिजन के लिए नकारात्मक छोड़ दें) की जांच करने के लिए सकारात्मक नियंत्रण (लक्ष्य प्रतिजन के लिए सकारात्मक ऊतक) का उपयोग करें माइक्रोस्कोप.
  2. नकारात्मक और सकारात्मक नियंत्रण के संकेत तीव्रता के आधार पर इमेजिंग के लिए उपकरण और कैमरा शर्तों (एक्सपोजर और अन्य सामान्य सेटिंग्स) सेट करें।
    नोट: ये स्थितियां (1) इमेजिंग के लिए उपयोग किए जाने वाले कैमरे और माइक्रोस्कोप, (2) एंटीबॉडी, और (3) प्रत्येक प्रयोग के लिए ऊतकों में भिन्न होती हैं। craniofacial ऊतकों के लिए इस्तेमाल किया सामान्य स्थितियों आईएसओ 200 एक जोखिम समय 1/100 s से लेकर 1 s करने के लिए एंटीबॉडी की गुणवत्ता और विशिष्टता पर निर्भर करते हैं। उपयुक्त आवर्धन नमूनों के आकार और प्रयोगों के उद्देश्य के आधार पर भिन्न होते हैं।
  3. पारंपरिक एपिफ्लोरेसी माइक्रोस्कोप या confocal माइक्रोस्कोप के साथ छवियों को प्राप्त. प्रत्येक रंग चैनल के लिए एक ही स्थिति में (संबंधित नियंत्रणों के उन सहित) प्राप्त चित्र. एक ही प्रारूप के साथ छवियों को बचाओ (tiff जानकारी को संरक्षित करने के लिए सबसे अच्छा है).

5. फ्लोरोसेंट क्वांटिफिकेशन

नोट: सांख्यिकीय विभिन्न समूहों के बीच धुंधला तुलना कई मामलों में अधिक जानकारीपूर्ण हो जाएगा. इम्यूनोफ्लोरेसी छवियों के साथ, संकेत घनत्व को मापने, सकारात्मक कोशिकाओं की गणना, या सकारात्मक क्षेत्रों की गणना करके प्रोटीन के सापेक्ष स्तर की मात्रा निर्धारित करें। सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए, जैविक रूप से स्वतंत्र नमूनों की न्यूनतम संख्या 3 है. एक विशिष्ट विधि प्रत्येक नमूने से कम से कम तीन वर्गों उत्पन्न और प्रत्येक अनुभाग में कम से कम तीन प्रतिनिधि क्षेत्रों के लिए छवियों को लेने के लिए है.

  1. ImageJ का उपयोग कर फ्लोरोसेंट तीव्रता का परिमाण
    1. सॉफ्टवेयर खोलें, और केवल क्षेत्र और एकीकृत घनत्व का चयन कर रहे हैं कि जाँच करने के लिए विश्लेषण और सेट माप का उपयोग करें। विश्लेषण किया जा करने के लिए छवियों को खोलने के लिए फ़ाइल का उपयोग करें और खोलें।
    2. दूर छोड़ दिया पर वर्ग या सर्कल आइकन या तो चयन करने के लिए टूलबार का उपयोग करें। चयन उपकरण का उपयोग करके छवि पर विश्लेषण किए जाने वाले क्षेत्र का चयन करें. परिणाम विंडो में चयनित क्षेत्र और एकीकृत घनत्व के readout प्राप्त करने के लिए विश्लेषण का उपयोग करें और उपाय करें। किसी ऐसे धनात्मक कक्ष के आगे वाले क्षेत्र का चयन करें जिसके पास पृष्ठभूमि को पढ़ने के लिए कोई फ्लोरोसेंट न हो.
    3. अन्य छवियों का विश्लेषण करने के लिए चरण 5.1.2 दोहराएँ. क्षेत्र समायोजित पहली छवि की है कि के साथ मैच के लिए विश्लेषण किया जा करने के लिए।
    4. परिणाम विंडो में सभी डेटा की प्रतिलिपि बनाएँ और विश्लेषण समाप्त होने पर स्प्रेडशीट में चिपकाएँ.
    5. सही फ्लोरोसेंट तीव्रता (सीटीसीएफ) को एकीकृत घनत्व के रूप में परिकलित करें - (पृष्ठभूमि रीडिंग के चयनित सेल एक्स माध्य फ्लोरोसेंट का क्षेत्र)। नमूनों के बीच सही कुल सेल फ्लोरोसेंट के अंतर की तुलना करें और एक ग्राफ बनाते हैं।
  2. ImageJ का उपयोग कर फ्लोरोसेंट छवियों के सकारात्मक सेल संख्या का परिमाण
    1. मैनुअल सेल गिनती.
      1. का प्रयोग करें ImageJ और Plugins और विश्लेषण सेल काउंटर प्लगइन स्थापित करने के लिए.
      2. विश्लेषण किया जा करने के लिए छवियों को खोलने के लिए फ़ाइल का उपयोग करें और खोलें। काउंटर विंडो और परिणाम विंडो को खोलने के लिए Plugins का उपयोग करें और विश्लेषण और सेल काउंटर.
        नोट: कक्ष काउंटर स्टैक पर काम नहीं करता है। गिनती ढेर के लिए, प्लगइन प्लॉट - एक्सिसप्रोफाइल, तो एक कण ट्रैकिंग उपकरण का उपयोग कर एक चलती रॉय की तीव्रता पर नजर रखने के लिए छवि का उपयोग करें और ढेर gt; प्लॉट ] एक्सिस प्रोफाइल। यह उपकरण या तो मैन्युअल या स्वचालित हो सकता है.
      3. गिनती शुरू करने के लिए काउंटर विंडो के नीचे बटन में से एक पर क्लिक करना. समाप्त होने तक गणना करने के लिए किसी कक्ष/ऑब्जेक्ट पर सीधे क्लिक करें.
      4. गणना विंडो में परिणाम बटन क्लिक करें. गिना गए कक्षों की कुल संख्या परिणाम विंडो में दिखाई जाएगी. परिणाम लॉग को स्प्रेडशीट के रूप में सहेजें और विश्लेषण करें.
    2. स्वचालित सेल गिनती.
      1. विश्लेषण किया जा करने के लिए छवियों को खोलने के लिए फ़ाइल का उपयोग करें और खोलें। आगे बढ़ने से पहले RGB छवि को धूसर स्केल छवि में कनवर्ट करें.
      2. छवि का उपयोग करें और सभी क्षेत्रों है कि गिना जा करने की आवश्यकता का चयन करने के लिए समायोजित करें ]
      3. का प्रयोग करें विश्लेषण करें और कणों का विश्लेषण कोशिकाओं की संख्या प्राप्त करने के लिए / एक विशिष्ट श्रेणी के भीतर कोशिकाओं /कणों की गणना करने के लिए 0-इन्फिनिटी के डिफ़ॉल्ट के बजाय वैध कण आकार (उदा., 100-इन्फिनिटी) की एक श्रृंखला सेट करें। परिणाम लॉग को स्प्रेडशीट के रूप में सहेजें और विश्लेषण करें.
        नोट:         छवि से अन्य जानकारी प्राप्त करने के लिए, क्षेत्र के अलावा, विश्लेषण करने के लिए जाएँ और माप सेट करें और आवश्यक जानकारी के बगल में बॉक्स का चयन करें।

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Representative Results

भ्रूण कपालीय ऊतक अनुभाग
उपरोक्त चरणों के बाद, सिर नियंत्रण से विच्छेदित किया गया (पी 0-Cre) या उत्परिवर्ती (संस्थित सक्रिय Bmpr1a तंत्रिका शिखर कोशिकाओं में, P0-Cre; caBmpr1a) भ्रूण दिन में भ्रूण (ई) 16.5 या 18.5. 4 एच के लिए 4% पीएफए में फिक्सिंग के बाद, नमूने OCT में एम्बेडेड थे और cryosectioned coronally. परिणामस्वरूप वर्गों pSmad1/5/9 (डाउनस्ट्रीम BMP संकेतन कारकों) या Ki67 (एक सेल प्रसार मार्कर) प्रोटोकॉल के अनुसार प्रतिजन पुनर्प्राप्ति के बिना के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ immunostained थे. जैसा कि दिखाया गया है, नियंत्रण भ्रूणों की ललाट अस्थियों में pSmad1/5/9 (चित्र 1A) और Ki67 (चित्र 1C) सकारात्मक थे। उत्परिवर्ती भ्रूणों में pSmad1/5/9 का स्तर बढ़ा दिया गया था (चित्र 1B), जबकि Ki67 के उन ललाट हड्डियों में कमी आई थी (चित्र 1D) . प्रोटोकॉल के अनुसार उन नमूनों में सेल की मृत्यु की भी जांच की गई। जैसा कि दिखाया गया है, नियंत्रण भ्रूणों की तुलना में उत्परिवर्ती भ्रूणों की ललाट अस्थियों में अधिक एपोटोटिक कोशिकाएं देखी गई (चित्र 1ई, थ्)

Undecalified craniofacial ऊतकों या लंबी हड्डी वर्गों
अनिर्दित कठोर ऊतकों के लिए उपरोक्त चरणों का अनुसरण करते हुए, 3 सप्ताह पुराने चूहों(पी0-क्रे; एमटीएमजी (मेम्ब्रेन-टमाटो और झिल्ली GFP) के सिर 4% पीएफए के साथ तय किए गए थे और 8% जिलेटिन में एम्बेडेड थे। कोरोनल क्रायोसेक्शन को पीबीएसटी के साथ धोया गया और डीपीआई के साथ एंटी-फैड माध्यम के साथ घुड़सवार किया गया। चित्र 2A ,B प्रदर्शित करता है कि जिलेटिन अनुभागीय ऊतकों से फ्लोरोसेंट संकेतों के साथ हस्तक्षेप नहीं करता है।

सिर और femora से 3 सप्ताह पुराने या 3 महीने पुराने चूहों की जांच करने के लिए कि क्या जिलेटिन एम्बेडेड undecalified ऊतकों IF के लिए अच्छा कर रहे हैं कार्यरत थे. पूरे सिर और femora संसाधित और प्रोटोकॉल के अनुसार काट दिया गया. इसके परिणामस्वरूप वर्गों का उपयोग SOX9 इम्यूनोस्टेनिंग (चित्र 3) या ओएसएक्स तथा E11/Podoplanin डबल इम्यूनोस्टेनिंग (चित्र 4) के लिए किया गया था . जैसा कि दिखाया गया है, अच्छी गुणवत्ता वर्गों 3 सप्ताह कठिन ऊतकों के अधिकांश से प्राप्त किए गए थे, femur के trabecular और cortical डिब्बों सहित (चित्र 3ए, बी, चित्र 4A-D), ललाट हड्डियों (चित्र 4E, च), छेदक (चित्र 3ई, एफ, चित्र 4I,J), नाक के ऊतकों ( चित्र3C,डी), और नाक-प्रीमैक्सिला सीवन और आसपास की हड्डियों सहित खोपड़ी ( चित्र4G, H ) सिर की. जबकि, 3 महीने पुराने नमूनों के साथ, अच्छी गुणवत्ता वर्गों केवल कुछ कठोर ऊतकों में प्राप्त किए गए थे, जिसमें फीमर के ट्रैबेकुलर डिब्बे शामिल हैं (चित्र 3 जी,एच, चित्रा 4K, L), नाक के ऊतकों ( चित्र3I , जे), और सिर की नाक-प्रीमैक्सिला सीवन और आसपास की हड्डियों (चित्र 4M, N) सहित खोपड़ी। जैसा कि चित्र 3में दर्शाया गया है , वृद्धि प्लेट के कोन्ड्रोसाइट्स में विशेष रूप से SOX9 धनात्मक कोशिकाओं का पता लगाया गया (चित्र 3ख) तथा फेमर से संयुक्त (चित्र 3ह) और नाक के पट (चित्र 3डी, जे) का पता लगाया गया था . 3 सप्ताह पुराने छेदक में, SOX9 mesenchymal कोशिकाओं में पाया गया था (चित्र 3 F) . OSX और E11 दोहरे दाग परिणामों से पता चला कि OSX osteoblasts में पाया गया था, जबकि E11 femur और सिर से हड्डियों के अस्थिकोशिकाओं में पाया गया था (चित्र 4B, डी, एच, एल, एन). 3 सप्ताह के छेदक में, OSX ओडोन्टोब्लास्ट्स में सकारात्मक था, जबकि E11 कूप mesenchymal कोशिकाओं में सकारात्मक था (चित्र 4J)। उन परिणामों से संकेत मिलता है कि जिलेटिन अच्छी तरह से संरक्षित प्रतिजन कार्यों के साथ एम्बेडेड undecalified हार्ड ऊतकों.

Figure 1
चित्र 1: pSmad1/5/9, Ki67 या TUNEL के परिणामों के उदाहरण नियंत्रण भ्रूण और बढ़ाया BMP गतिविधि के साथ उत्परिवर्ती भ्रूण में. संविधान सक्रिय Bmpr1a (caBmpr1a) चूहों तंत्रिका शिखर कोशिकाओं (एनसीसी) में बीएमपी संकेतन गतिविधि को बढ़ाने के लिए पी0-क्रे चूहों के साथ पार कर गया था। नियंत्रण के प्रमुखों (P0-Cre; caBmpr1a+ /) और उत्परिवर्ती (P0-Cre; caBmpr1afx/) भ्रूण E16.5 या E18.5 पर विभाजित किया गया, 4h के लिए 4% पीएफए के साथ तय किया गया, 1 दिन के लिए 30% सुक्रोज के साथ cryoprotected, OCT में एम्बेडेड, और -18 डिग्री सेल्सियस पर cryosectioned. ललाट हड्डी की धारा (आंख के साथ समान स्तर) pSmad1/5/9, Ki67, या TUNEL धुंधला के खिलाफ इम्यूनोडिटेक्शन के लिए इस्तेमाल किया गया. (ए , बी) pSmad1/5/9 (हरा) नियंत्रण के ललाट हड्डियों में दाग पैटर्न (ए) या उत्परिवर्ती (बी) E16.5 पर भ्रूण. (सी, डी) Ki67 (हरा) नियंत्रण के ललाट हड्डियों में दाग पैटर्न (सी) या उत्परिवर्ती (डी) E18.5 पर भ्रूण. (ई, एफ) TUNEL (लाल) नियंत्रण के ललाट हड्डियों में दाग पैटर्न (ई) या उत्परिवर्ती (एफ) E18.5 पर भ्रूण. Nuclei DAPI (नीले) के साथ दाग रहे थे. एफबी - ललाट हड्डी, बी ] मस्तिष्क. स्केल बार्स $ 100 डिग्री मी. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: mTmG रिपोर्टर के उदाहरण सिर में undecalified ऊतकों के परिणाम संकेत. 3 सप्ताह पुराने पी0-क्रे चूहों से झिल्ली-टमाटर और झिल्ली GFP(mTmG) रिपोर्टर के साथ सिर विच्छेदन किया गया, 4h के लिए 4% पीएफए के साथ तय किया गया, 2 दिनों के लिए 30% sucrose के साथ cryoprotected, 8% जिलेटिन में एम्बेडेड, और cryosectioned पर -25 डिग्री सेल्सियस. सिर वर्गों स्पष्ट रूप से GFP दिखाने के (हरी, Cre recombination सकारात्मक) और टमाटर (लाल, क्रे पुनर्संयोजन नकारात्मक) नाक की हड्डी और नाक के ऊतकों में संकेत(ए,बी). Nuclei DAPI (नीले) के साथ दाग रहे थे. एन बी ] नाक की हड्डी, एन ] नाक के ऊतकों, एन एस - नाक पट. स्केल बार $ 250 डिग्री मी. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: सिर और femora में undecalified ऊतकों के SOX9 इम्यूनोस्टेनिंग परिणाम के उदाहरण. सिर और femora 3 सप्ताह या 3 महीने पुराने चूहों से विच्छेदन किया गया, 4h के लिए 4% पीएफए के साथ तय, cryoprotected 30% sucrose के साथ 2 दिनों के लिए, 8% जिलेटिन में एम्बेडेड, और cryosectioned पर -25 डिग्री सेल्सियस. SOX9 (लाल) के खिलाफ इम्यूनोडिटेक्शन के लिए स्लाइड का उपयोग किया गया। न्यूक्ली डीएपीी (नीले)(बी, डी, एफ, एच, जे) के साथ दागा गया था। उन ऊतकों के आसन्न वर्गों Hematoxylin और Eosin (एच एंड ई) धुंधला(ए, सी, ई, जी,मैं) के लिए इस्तेमाल किया गया. ए और बी में तीर सिर विकास प्लेट और जी और एच,संधि उपास्थि में संकेत मिलता है। ए और जी में तीर trabecular हड्डियों और सी, डी, मैं, और जम्मू,नाक पट में संकेत मिलता है। डीएम - दंत mesenchyme, डे - दंत उपकला, एफएम - कूप mesenchyme. स्केल बार $ 50 डिग्री मी. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4: OSX और E11 के सिर और femora में undecalified ऊतकों के दोहरे इम्यूनोस्टेनिंग परिणाम के उदाहरण. सिर और femora 3 सप्ताह पुराने या 3 महीने पुराने चूहों से अलग किया गया, 4h के लिए 4% पीएफए के साथ तय, cryoprotected 30% 2 दिनों के लिए sucrose के साथ, 8% जिलेटिन में एम्बेडेड, और cryosectioned पर -25 डिग्री सेल्सियस. वर्गों OSX (लाल) और E11/Podoplanin (ग्रीन) के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ डबल इम्यूनोस्टेनिंग के लिए इस्तेमाल किया गया. न्यूक्ली डीएपीआई (नीले)(बी, डी, एफ, एच, जे, एल,एन) के साथ दागा गया था। उन ऊतकों के आसन्न वर्गों एच एंड ई धुंधला के लिए इस्तेमाल किया गया(ए, सी, ई, जी, मैं, कश्मीर,एम).। ए, बी, कश्मीर, और एल में तीर फीमर के ट्रैबेकुलर डिब्बों का संकेत देते हैं; सी और डी, femur के cortical डिब्बों; और ई और एफमें, ललाट हड्डियों. ए और बी में एरोहेड वृद्धि प्लेट को इंगित करते हैं। बीएम - अस्थि मज्जा, एन ] नाक के ऊतकों, डीएम - दंत mesenchyme, डे ] दंत उपकला, एफएम - कूप mesenchyme, एनपीएस - नाक premaxilla सीवन. ललाट की अस्थियाँ(इ, च) तथा नासा-प्रीमैक्सिला सीवन तथा आस-पास की अस्थियाँ (जी,ल्, छ) भी दिखाई जाती हैं। स्केल बार $ 50 डिग्री मी. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

यहाँ हम माउस सिर और undecalified हड्डी के ऊतकों की तैयारी के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं, और सेल प्रसार, सेल मौत, और BMP संकेत मार्करों के इम्यूनोस्टेनिंग के लिए cryosectioning. हम भी इम्यूनोफ्लोरेसेंट छवियों से मात्रात्मक डेटा प्राप्त करने के लिए रणनीति विस्तार. उन तरीकों को भी उचित संशोधनों के साथ अन्य ऊतकों के लिए लागू किया जा सकता है.

ऊतक तैयार करने के लिए शर्तें आकार और ऊतकों के प्रकार से बदलती हैं। निर्धारण और cryoprotection समय आमतौर पर रात भर के लिए कई घंटे की जरूरत है. निर्धारण के बाद, ऊतक भी पैराफिन में एम्बेडेड और एक microtome16के साथ काट दिया जा सकता है. हालांकि दोनों पैराफिन और OCT इम्यूनोस्टेनिंग के लिए अच्छी तरह से काम करते हैं, उनके बीच कुछ मतभेद हैं। पैराफिन ब्लॉक आरटी में कई वर्षों के लिए रखा जा सकता है, जबकि OCT ब्लॉक -80 डिग्री सेल्सियस पर 1 वर्ष के लिए कर रहे हैं। पैराफिन ऊतक आकारिकी को बरकरार रखता है, जबकि ओसीटी एम्बेडिंग के दौरान बने बर्फ क्रिस्टल ऊतक संरचनाओं को नकारात्मक रूप से प्रभावित कर सकते हैं। पैराफिन कभी-कभी एंटीजन के मुखौटे का प्रतीक होता है, जबकि ओसीटी एंजाइम गतिविधियों और प्रतिजन एपिटोप को संरक्षित करता है। इसलिए, एंटीबॉडी के अधिकांश के लिए एंटीजन पुनर्प्राप्ति की कोई जरूरत नहीं है अगर केवल 4 एच या उससे कम के लिए 4% पीएफए में तय किया जाता है और ओसीटी में एम्बेडेड होता है। यह है, तथापि, अभी भी एंटीजन पुनर्प्राप्ति द्वारा बेहतर परिणाम प्राप्त करने के लिए संभव है, अगर सकारात्मक नियंत्रण cryosections में अच्छा धुंधला परिणाम नहीं दिखाया.

दोनों Hoechst डाई और DAPI परमाणु काउंटर दाग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. वे समानताएं हैं, के रूप में दोनों (1) यूवी उत्तेजित कर रहे हैं, मामूली नाली बाध्यकारी रसायनों कुल डीएनए सामग्री के लिए आनुपातिक संकेतों का उत्सर्जन करने के लिए, और (2) एक लंबे जोखिम के बाद फोटो ब्लीचिंग के अधीन हैं. हालांकि, Hoechst रंगों आम तौर पर उनके उच्च पारगम्यता के कारण लाइव कोशिकाओं में डीएनए सामग्री धुंधला करने के लिए उपयोग किया जाता है. DAPI आम तौर पर अपनी कम झिल्ली पारगम्यता के कारण निश्चित कोशिकाओं में डीएनए धुंधला करने के लिए प्रयोग किया जाता है. इसके अलावा, DAPI Hoechst की तुलना में एक मजबूत और अधिक स्थिर संकेत उत्पन्न करता है.

उचित नियंत्रण IF के लिए आवश्यक हैं. हर नए एंटीबॉडी की विशिष्टता पश्चिमी धब्बा विश्लेषण द्वारा पुष्टि की जानी चाहिए, यदि लागू हो. एक विशेष प्राथमिक एंटीबॉडी के इष्टतम काम एकाग्रता सीरियल कमजोर पड़ने के उपयोग के माध्यम से निर्धारित किया जाना चाहिए. एक सकारात्मक नियंत्रण (ऊतक या कोशिका जो प्रोटीन/एंटीजन को व्यक्त करने के लिए साबित हो जाता है) को आईएफ प्रक्रिया और एंटीबॉडी की विशिष्टता की जांच करने के लिए शामिल किया जाना चाहिए। एक नकारात्मक नियंत्रण भी शामिल किया जाना चाहिए, उदाहरण के लिए, प्राथमिक एंटीबॉडी की अनुपस्थिति, या प्राथमिक एंटीबॉडी के लिए एक ही प्रजाति से सामान्य आईजीजी के प्रतिस्थापन, या ऊतकों लक्ष्य प्रतिजन के लिए नकारात्मक. जब तस्वीरें ले, माध्यमिक एंटीबॉडी (पृष्ठभूमि नियंत्रण) के बिना नमूना स्वतंत्र रूप से प्रत्येक चैनल के साथ जांच की जानी चाहिए संकेत लाभ की सीमा निर्धारित करने और अंतिम इमेजिंग के लिए अनुकूलित करने के लिए ऑफसेट. एकाधिक लेबलों का पता लगाने के लिए, पृष्ठभूमि नियंत्रण और एकल लेबल नियंत्रण वर्णक्रमीय ओवरलैप कलाकृतियों से बचने के लिए तैयार रहने की आवश्यकता है. एकाधिक-लेबल नमूने की छवि प्राप्त करने के लिए उपयोग किए जाने वाले सभी चैनलों को स्वतंत्र पृष्ठभूमि सुधार के अधीन होना चाहिए, क्योंकि प्रत्येक चैनल में ऑटोफ्लोरोसेंट का स्तर काफी भिन्न होता है.

हम भी जिलेटिन में एम्बेडेड undecalified कठोर ऊतकों की तैयारी और cryosectioning के लिए प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं. OCT एम्बेडेड decalcified कठिन ऊतकों के लिए, हार्ड ऊतक वर्गों के अधिकांश इम्यूनोस्टेनिंग प्रक्रियाओं के दौरान स्लाइड चश्मे से अलग किया जाएगा, क्योंकि स्लाइड पर उनके कम आसंजन चरित्र के. cryosectioning की सुविधा के लिए डिज़ाइन चिपकने वाला टेप अच्छी गुणवत्ता वर्गों उत्पन्न करने में मदद करता है. लेकिन, उन वर्गों को आसानी से क्षतिग्रस्त कर रहे हैं जब टेप बंद छीलने है. जिलेटिन एम्बेडेड ऊतकों के लिए, अच्छी गुणवत्ता वाले वर्गों को उत्पन्न करने के लिए टेप-स्थानांतरण प्रणाली की कोई आवश्यकता नहीं है। एक embedding माध्यम के रूप में, जिलेटिन नमूना अच्छी तरह से घुसपैठ कर सकते हैं, हालांकि यह OCT. Gelatin के साथ तुलना में एक कम चिपचिपापन है मस्तिष्क ऊतक17,18 और कोशिकाओं के ultrathin वर्गों के रूप में अन्य हिस्टोलॉजिकल अनुप्रयोगों में इस्तेमाल किया गया है प्रतिरक्षा के लिए रसायनविज्ञान 19| यहाँ, जिलेटिन undecalified हड्डी एम्बेड करने के लिए इस्तेमाल किया गया था, जो ब्लॉक OCT से cryosection करने के लिए आसान उत्पन्न करता है. जिलेटिन एम्बेडेड undecalified हार्ड ऊतकों के अच्छे वर्गों पाने के लिए कई छोटे सुझाव हैं। महत्वपूर्ण कदम OCT के बजाय जिलेटिन के साथ एम्बेड करने के लिए है. बेहतर प्रवेश पाने के लिए, नमूने नीचे करने के लिए सिंक के बाद एक और दिन 30% sucrose में नमूने रखने के लिए। तापमान को सामान्य से कम -25 डिग्री सेल्सियस पर सेट करना समान रूप से महत्वपूर्ण है। एक अल्ट्रा तेज ब्लेड आवश्यक नहीं है। हालांकि एक कम क्रायो तापमान (-25 डिग्री सेल्सियस) OCT एम्बेडेड undecalified कठिन ऊतकों के cryosectioning के लिए कुछ सुधार करता है, यह अभी भी ऊतक संरचनाओं का एक अच्छा अखंडता प्राप्त करने के लिए मुश्किल है. जैसा कि चित्र 2, चित्र 3, और चित्र 4में दिखाया गया है , इम्युनोस्टेनिंग के लिए लागू अच्छी गुणवत्ता वाले अनुभाग जिलेटिन एम्बेडेड कठोर ऊतकों से प्राप्त किए गए थे (उदाहरण के लिए, ट्रैबेकुलर हड्डियों, कॉर्टिकल हड्डियों, खोपड़ी हड्डियों, नाक के ऊतकों, और छेदक)। उन परिणामों ने साबित कर दिया कि जिलेटिन embedding काफी कठिन ऊतक वर्गों के नमूना अखंडता में सुधार, लेकिन यह भी चश्मे स्लाइड करने के लिए वर्गों के आसंजन को बढ़ाता है. इसके अलावा, जिलेटिन प्रतिजन कार्यों को बरकरार रखता है, और फ्लोरोसेंट संकेतों और इम्यूनोस्टेनिंग के साथ संगतता दर्शाती है। हालांकि, इस तकनीक केवल अप करने के लिए अच्छी तरह से काम करता है 3 महीने पुराने नमूने. इस विधि के संभावित सुधार हैं (1) नमूनों को अन्य भागों से अलग करने के लिए नमूने को विभाजित करना ताकि ऊतक की संरचना को सरल बनाया जा सके (दांतों के मामले में, मैन्डिबल या मैक्सिला को पूरे सिर के बजाय विभाजित और तय किया जाना चाहिए) और (2) cryoprotection से पहले केवल 2-3 दिनों के लिए ऊतकों decalcify करने के लिए 10% EDTA का उपयोग करने के लिए. decalcification के इस कम समय इम्यूनोस्टेनिंग परिणामों से समझौता नहीं करेगा। एक और चिंता का विषय यह है कि, एक गैर जलीय embedding मीडिया के रूप में, जिलेटिन आसानी से स्लाइड से हटाया नहीं जा सकता है, जो धुंधला तरीकों के आधार पर उच्च पृष्ठभूमि के लिए नेतृत्व कर सकते हैं (जैसे, एच एंड ई धुंधला).

इम्यूनोस्टेनिंग परिणाम ों की मात्रा निर्धारित करना आसान नहीं है, इसलिए आमतौर पर उनका उपयोग अर्द्ध-मात्रात्मक रूप से किया जाता है। craniofacial ऊतकों के इम्यूनोस्टेनिंग के परिमाणीकरण की कठिनाइयों और सीमाओं में शामिल हैं, लेकिन निम्नलिखित तक ही सीमित नहीं हैं: (1) कपालात्मक ऊतकों की संरचना की जटिलता के कारण गणना किए जाने वाले क्षेत्र को परिभाषित करना मुश्किल है; (2) इम्यूनोस्टेनिंग की गैर रेखीय प्रकृति के कारण लेबल किए गए क्षेत्र या लेबल वाली कोशिकाओं को परिभाषित करना मुश्किल है; (3) संकेत के गतिशील रेंज के लिए सीमित जानकारी है; (4) यह छवि अधिग्रहण के दौरान फ्लोरोसेंट संकेत की लुप्त होती के कारण छवियों या समूहों के बीच संकेतों की तीव्रता की तुलना करने के लिए मुश्किल है; और (5) संकेत पृष्ठभूमि एंटीबॉडी, स्लाइड, और नमूनों के बीच काफी बदल सकता है. परिमाणीकरण परिणामों की विश्वसनीयता बढ़ाने के लिए, प्रयोग सावधानी से और कड़ाई से प्रदर्शन किया जाना चाहिए. सभी नमूनों को एक ही शर्तों के तहत संसाधित किया जाना चाहिए। इम्यूनोस्टेनिंग के दौरान, सिग्नल पृष्ठभूमि का मूल्यांकन करने और सिग्नल के लिए सकारात्मक क्षेत्र या कोशिकाओं को परिभाषित करने के लिए विभिन्न नियंत्रणों की आवश्यकता होती है। क्षेत्र को स्पष्ट रूप से दिखाने के लिए ठोस और प्रतिनिधि छवियों को लें और अच्छे कंट्रास्ट के साथ कक्षों को गिना और लेबल किया गया है। इसके अलावा, छवि अधिग्रहण के दौरान, कैमरा सेटिंग और उपकरण सेटिंग लगातार रखा जाना चाहिए.

एक साथ लिया, हम माउस craniofacial ऊतकों पर इम्यूनोफ्लोरेसेंस के लिए एक सरल मानक प्रोटोकॉल पेश करते हैं, विशेष रूप से undecalified कठिन ऊतकों के लिए. कपालीय ऊतकों का इम्यूनोस्टेनिंग विश्लेषण न केवल विकास के दौरान रूपजनन के तंत्र को समझने में मदद करेगा, बल्कि रोगजनन के दौरान होने वाले परिवर्तनों को भी स्पष्ट करेगा। इसके अलावा, इम्यूनोस्टेनिंग का उपयोग सेल प्रसार, सेल मौत, और बीएमपी सिग्नलिंग मार्ग के अलावा अन्य संकेतन मार्ग लिगंड, रिसेप्टर्स, या अन्य फेनोटाइपिक मार्करों की अभिव्यक्ति पैटर्न का अध्ययन करने के लिए भी किया जा सकता है। हालांकि, एक इम्यूनोस्टेनिंग प्रयोग के महत्वपूर्ण चरणों को विशिष्ट धुंधला और कम से कम गैर-विशिष्ट पृष्ठभूमि संकेतों को प्राप्त करने के लिए प्रत्येक एंटीजन/एंटीबॉडी या ऊतक के लिए उचित रूप से संशोधित किया जाना चाहिए।

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Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

यह काम स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों (R01DE020843 से Y.M.), अंतर्राष्ट्रीय FOP एसोसिएशन (Y.M.) द्वारा समर्थित किया गया था, और चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (31500788 से J.Y.) से सहायता अनुदान.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adhesive tape Leica #39475214
Alexa fluor 488-goat anti-Rabbit secondary antibody Invitrogen A-11034
Antifade Mountant with DAPI Invitrogen P36931
Bovine serum albumin Sigma A2153
Coverslips Fisher Brand 12-545-E
Cryostat Leica CM1850
EDTA Sigma E6758
Fluorescence microscope Olympus BX51
Gelatin Sigma G1890
In Situ Cell Death Detection Kit Millipore S7165
Microscope slides Fisher Brand 12-550-15
OCT Compound Fisher Healthcare 23-730-571
Paraformaldehyde (PFA) Sigma P6148 
Phosphate buffered saline (PBS) Sigma P4417
Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether Sigma T9284 Triton X-100
Proteinase K Invitrogen AM2542
Rabbit anti-Ki67 antibody Cell Signaling Technology 9129 Lot#:3; RRID:AB_2687446
Rabbit anti-pSmad1/5/9 antibody Cell Signaling Technology 13820 Lot#:3; RRID:AB_2493181
Sodium citrate Sigma 1613859
Sucrose Sigma S9378
Tris Sigma 10708976001

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References

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Yang, J., Pan, H., Mishina, Y.… More

Yang, J., Pan, H., Mishina, Y. Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Craniofacial Tissues and Undecalcified Bone. J. Vis. Exp. (147), e59113, doi:10.3791/59113 (2019).

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