Summary
Aqui, nós apresentamos um protocolo detalhado para detectar e quantificar níveis da proteína durante a morfogênese/patogénese craniofacial pela imunocoloração usando tecidos craniofacial do rato como exemplos. Além, nós descrevemos um método para a preparação e o criossecção de tecidos duros secçóes dos ratos novos para a imunocoloração.
Abstract
A imunocoloração tecidual fornece detecção altamente específica e confiável de proteínas de interesse dentro de um determinado tecido. Aqui nós descrevemos um protocolo completo e simples para detectar a expressão da proteína durante a morfogênese/patogénese craniofacial usando tecidos craniofacial do rato como exemplos. O protocolo consiste na preparação e criseccionamento de tecidos, imunofluorescência indireta, aquisição de imagem e quantificação. Além, um método para a preparação e criossecção de tecidos duros secçóes para a imunocoloração é descrito, usando os tecidos craniofacial e os ossos longos como exemplos. Esses métodos são fundamentais para determinar a expressão protéica e as alterações morfológicas/anatômicas em vários tecidos durante a morfogênese/patogênese craniofacial. Eles também são aplicáveis a outros tecidos com modificações apropriadas. O conhecimento da histologia e da alta qualidade das seções é crítico para extrair conclusões científicas dos resultados experimentais. As potenciais limitações desta metodologia incluem, mas não se limitam à especificidade dos anticorpos e dificuldades de quantificação, que também são discutidas aqui.
Introduction
O rosto é uma parte fundamental da identidade humana, e é composto de vários tipos diferentes de tecidos, tais como epitélio, músculo, osso, cartilagem, dente. Esses tecidos são derivados de todas as três camadas germinativas: ectoderma, endoderma e mesoderma1,2. Para padronização adequada e desenvolvimento de tecidos craniofaciais, proliferação celular, morte e diferenciação precisam ser altamente coordenados e regulados por vias de sinalização específicas, tais como WNT, FGF, hh e BMP vias3,4 ,5. Os defeitos na proliferação, na sobrevivência ou na diferenciação das pilhas conduzirão às malformações craniofacial, que estão entre os defeitos congénitos os mais freqüentemente de ocorrência. Camundongos transgênicos são ferramentas úteis para estudar mecanismos de morfogênese craniofacial e patogênese1,2,3,4,5. Compreender as mudanças nas estruturas craniofacial durante o desenvolvimento e a patogénese ajudarão a esclarecer princípios de desenvolvimento chaves assim como os mecanismos de malformações craniofacial1,2,3 ,4,5.
A coloração da montagem inteira ou dos tecidos seccionados com anticorpos específicos é uma técnica inestimável para determinar a distribuição espacial das proteínas de interesse 6. Formalmente, a imunocoloração tecidual pode depender tanto da imunohistoquímica (IHC) quanto da imunofluorescência (IF). Comparado com o produto opaco da reação gerado com um substrato cromogênico tal como 3, 3 '-Diaminobenzidine (DAB) por IHC, se envolve o uso de conjugados fluorescentes visíveis pela microscopia de fluorescência. Portanto, se pode diferenciar claramente as células positivas do ruído de fundo, e permite que as imagens sejam analisadas quantitativamente e melhoradas de forma simples por software como o ImageJ e o Adobe Photoshop7,8. Toda a abordagem de coloração de montagem funciona em pequenos blocos de tecido (menos de 5 mm de espessura), que podem fornecer informações tridimensionais sobre a localização de proteínas/antígenos sem a necessidade de reconstrução das secções9,10 . Entretanto, comparado com as seções do tecido, a imunomarcação inteira da montagem é demorada e exige grandes volumes de soluções do anticorpo. Nem todos os anticorpos são compatíveis com a abordagem básica de montagem inteira. Além disso, a penetração incompleta de anticorpos resultará em coloração irregular ou coloração negativa falsa. Aqui nós focaremos na deteção da imunofluorescência das proteínas/antígenos em tecidos seccionados. Para os tecidos duros (por exemplo, cabeça, dente, osso longo), o depósito do cálcio durante o desenvolvimento/patogénese faz a amostra difícil à seção e enxaguado facilmente fora durante o tratamento da imunomarcação11,12. A maioria dos protocolos atualmente disponíveis descalcificam os tecidos duros antes da incorporação para facilitar a seccionamento, o que consome tempo e pode destruir a morfologia e os antígenos das amostras se manuseados de forma inadequada11,12. Para superar as questões, otimizamos uma abordagem de critilização de tecidos duros sem descalcificação, levando a uma melhor visualização de sua morfologia e distribuição de proteínas de sinalização.
O protocolo aqui descrito está sendo utilizado para determinar alterações morfométricas e histológicas nos tecidos craniofaciais de camundongos transgênicos BMP. Especificamente, o protocolo inclui (1) colheita e dissecação dos tecidos da cabeça, (2) seção e imunocoloração de marcadores experimentais (pSmad1/5/9), juntamente com a coloração de TUNEL, (3) imagens das seções utilizando microscópio de fluorescência e, finalmente (4) analisando e quantificando os resultados. O protocolo para preparar e os tecidos duros do criossecção sem descalcificação é descrito igualmente13. Esses métodos são otimizados para os tecidos craniofaciais. Eles também são aplicáveis a outros tecidos de várias idades de amostras com modificações apropriadas.
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Protocol
Todos os experimentos de mouse foram realizados de acordo com as diretrizes da Universidade de Michigan cobrindo o cuidado humano e o uso de animais em pesquisa. Todos os procedimentos animais utilizados neste estudo foram aprovados pelo Comitê institucional de cuidado e uso de animais (IACUC) da Universidade de Michigan (protocolo #PRO00007715).
1. preparação do tecido
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Preparação de tecidos embrionários
- Prepare 1 10 cm prato e vários 3,5 cm pratos contendo fosfato tampão salina (PBS), e 1 12-bem placa de cultura contendo 2 mL 4% paraformaldeído (PFA) em PBS em cada poço para cada rato grávido. Coloque todos os pratos de Petri e a placa no gelo.
Nota: Manuseie 4% de PFA em uma capa de fumaça. - Embriões dissecantes de camundongos grávidas em PBS gelado com fórceps e tesoura como descrito anteriormente14.
- Brevemente, eutanizar um rato grávido com CO2, agarre a pele abaixo do centro da barriga com fórceps e corte através da pele somente, a seguir puxe delicadamente na pele para separá-la do subjacente a parede abdominal do músculo.
- Em seguida, corte na cavidade abdominal seguindo a mesma linha da incisão da pele. Retire o útero contendo uma corda de embriões e retire os embriões cortando suavemente a parede uterina. Os tecidos extraembrionic tais como o saco e o amnion de gema serão removidos.
- Corte e isole a cabeça de cada embrião.
- Transfira cada cabeça em cada poço de uma placa de 12 poços contendo 4% de PFA com uma pipeta ou fórceps de transferência plástica. Fixar amostras em 4% de PFA a 4 ° c durante 4 h. Enxágüe amostras em PBS a 4 ° c com agitação suave por 12 h.
Nota: Para embriões mais jovens do que o dia embrionário 16,5 (E 16.5), fixar as cabeças do embrião com 4% de PFA diretamente após o isolamento. Para embriões na E 16.5 ou posterior, retire para descartar a pele e o tecido adiposo das cabeças e enxágüe várias vezes em PBS frio gelado antes da fixação. - Cabeças de cryoprotect.
- Transfira cada cabeça para uma nova placa de 12 poços contendo 2 mL de sacarose a 30% em PBS usando uma pipeta ou pinça de transferência plástica. Agitar suavemente a 4 ° c até que a cabeça se afunda na parte inferior do prato.
- Incorporar cabeças.
- Transfira a cabeça criocroprotegida para um molde que contenha o composto de temperatura de corte ideal (OCT). Equilibrar amostras em OCT por vários minutos. Ajuste o local e a direção das amostras com fórceps.
- Coloque o molde em gelo seco para congelar. Armazene crimolantes resultantes em um saco plástico a-80 ° c até estar pronto para criseccionamento.
Nota: O lado aparado das amostras deve enfrentar a parte inferior do molde de incorporação.
- Prepare 1 10 cm prato e vários 3,5 cm pratos contendo fosfato tampão salina (PBS), e 1 12-bem placa de cultura contendo 2 mL 4% paraformaldeído (PFA) em PBS em cada poço para cada rato grávido. Coloque todos os pratos de Petri e a placa no gelo.
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Preparação de tecidos duros secçóes pós-natal
- Eutanizar em 3 semanas ou 3 meses de rato velho com CO2. Retire a pele e os tecidos adiposos. Corte e isole a cabeça ou ossos longos do mouse.
- Fixe e cryoprotect a cabeça ou o osso longo dos ratos como descrito nas etapas 1.1.3 – 1.1.4.
- Incorpore na gelatina de 8% em uma maneira similar como a etapa 1.1.5. Mantenha os cryomoldes em um saco plástico em-80 ° c até cryosectioning.
Nota: Descalcificação não é necessária aqui. Para preparar 8% de gelatina, misture 8 g de gelatina com 100 mL de PBS e deixe ferver utilizando um microondas. Esteja ciente de que a mistura ferve facilmente.
2. criseccionamento
- Ajuste a temperatura do criostat a-18 ° c para os tecidos macios encaixados em Oct ou-25 ° c e mais baixo para os tecidos duros secçóes encaixados na gelatina. Mantenha as amostras na câmara do criostato por cerca de 30 min para equilibrar a temperatura do criostat.
- Expelir o bloco do crimolador. Congele o bloco no mandril da amostra (suporte do tecido) através da montagem com uma gota de OCT. Mantenha o lado aparado da amostra mais distante do mandril (voltado para o operador).
- Coloque o mandril montado no bloco no suporte do objeto do criostat. Ajuste o suporte da lâmina para fazer o ângulo da lâmina 3 ° – 5 ° em relação à amostra.
- Colete 10 μm de seções em lâminas de microscópio revestido. Seque as seções completamente em RT, em seguida, armazená-los em-80 ° c.
3. coloração histológica e imagem microscópica
- Coloração por imunofluorescência
- Tirar slides de-80 ° c. Mantenha os slides em RT por 1 h para secar seções. Enxágüe slides em 0,1% PBST (0,1% polietileno glicol tert-octylfenilo éter em PBS; ver tabela de materiais) três vezes por 5 min cada para lavar Out Oct e permeabilize seções.
- Opcionalmente, realize a recuperação do antígeno (opcional).
- Tampão do citrato de pré-aquecimento (pH 6 do citrato de sódio de 10 mM) no prato de coloração com vaporizador ou banho de água a 95 – 100 ° c. Mergulhe as lâminas no tampão citrato, incubar por 10 min.
- Leve o prato de coloração para fora do vapor ou banho de água para RT. cool as lâminas em RT para 20 min ou mais15.
Nota: Como alternativas, use tampão Tris-EDTA (base Tris de 10 mM, EDTA 1mM, 0, 5% Tween 20, pH 9,0) ou tampão EDTA (1 mM EDTA, 0, 5% Tween 20, pH 8,0) para recuperação de antígeno induzida por calor. Use uma panela de pressão, microondas, ou banho de água para a recuperação de antígeno induzida por calor, além do vapor quente. Uma recuperação enzima-induzida do antígeno usando o tripsina ou o pepsina são uma outra alternativa. Otimize o tempo de concentração e tratamento da recuperação enzimática para evitar cortes prejudiciais. Otimize o método de recuperação do antígeno para cada combinação de anticorpos/antígenos.
- Incubar cada slide com 200 μL de solução de bloqueio (5% de soro de burro diluído em 0,1% PBST) em RT por 30 min, em seguida, retire a solução de bloqueio sem enxaguar.
- Incubar cada slide com 100 μL de anticorpo primário ou anticorpos diluídos na solução de bloqueio por 1 h em RT ou O/N a 4 ° c. Enxague as lâminas com PBS três vezes por 10 min cada na RT.
- Incubar cada slide com 100 μL de anticorpo secundário diluído em solução de bloqueio por 1 h em RT. enxágüe as lâminas em PBS três vezes por 10 min cada na RT. Proteja os slides da luz.
- Monte os slides.
- Adicione duas gotas de meio de anti-fade com DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phenylindole) no slide. Em seguida, cubra com um lamínula.
- Conservar a 4 ° c no escuro até estar pronto para a imagem.
Nota: Como uma alternativa, Rotule os núcleos com DAPI ou o corante 33324 de Hoechst diluiu 1:2000 no PBS em RT primeiramente, a seguir monta com glicerol.
- Terminal deoxinucleotidil transferase dUTP Nick end rotulagem (tunel) coloração.
Nota: DNA de duas cordas com 3 '-hidroxila Termini (3 ' OH DNA Termini) irá formar-se durante a apoptose na célula. Aqui, nós fornecemos um protocolo que Rotule o livre 3 ' Oh DNA Termini in situ através da rotulagem de fragmentos de DNA com o Digoxigenina-nucleotídeo utilizando terminal deoxinucleotidil transferase (TDT) por coloração específica usando um kit comercial (ver tabela de materiais ).- Opcionalmente, as seções da mancha com preliminar e Alexa fluor-488 etiquetou anticorpos secundários antes da mancha de TUNEL. Enxágüe as lâminas em PBS três vezes por 10 min cada.
Nota: Esta etapa é opcional para uma coloração dupla de uma proteína e TUNEL no mesmo slide. - Incubar cada slide com 100 μL de proteinase K (10 μg/mL em 10 mM TRIS pH 7,5 e 5 mM EDTA) por 5 min em RT. enxágüe as lâminas com PBS três vezes por 10 min cada na RT.
Nota: Ajuste o tempo de incubação e a temperatura da proteinase K para cada tipo de tecido. Para secções de 10 μm de cabeças de embriões fixadas em 4% de PFA, incubar durante 5 min em RT. Além do método usando proteinase K, usar tratamentos alternativos, como necessário, incluindo (1) preparado recentemente 0,1% polietileno glicol tert-octilfenil éter, 0,1% citrato de sódio, 10 min a 37 ° c; (2) 0,25% – 0,5% de pepsina em HCl (pH 2) ou 0,25% de tripsina, 10 min a 37 ° c; e (3) irradiação de microondas com tampão citrato de 0,1 M (pH 6). - Aplique 200 μL de solução de bloqueio (5% de soro de burro diluído em 0,1% PBST) para cada slide, incubar em RT por 30 min, bata a solução de bloqueio sem enxaguar.
- Aplique 50 μL do tampão de equilíbrio fornecido pelo kit a cada slide na RT durante, pelo menos, 10 s. toque fora do tampão sem enxaguar.
- Prepare a mistura da reação (enzima de força de trabalho TdT) misturando a enzima de TdT com o amortecedor da reação fornecido pelo jogo na relação de 3:7. Aplicar 50 μL da mistura de reacção a cada lâmina e incubar a 37 ° c durante 1 h. toque fora do tampão sem enxaguar.
- Aplique 200 μL do tampão de batente (1:30 diluído em ddH2o) fornecido pelo jogo a cada corrediça, a seguir INCUBAR em RT por 10 minutos. Enxague as lâminas com PBS três vezes por 10 min cada.
- Etiqueta com anticorpo de RHODAMINE.
- Aplique 50 μL de conjugado antidigoxigenina pré-aquecido (RT) (rodamina) (1:1 diluído em solução de bloqueio) a cada lâmina. Incubar em RT por 30 min no escuro.
- Enxague as lâminas com PBS três vezes por 10 min cada. Monte slides como etapa 3.1.6.
- Opcionalmente, as seções da mancha com preliminar e Alexa fluor-488 etiquetou anticorpos secundários antes da mancha de TUNEL. Enxágüe as lâminas em PBS três vezes por 10 min cada.
4. aquisição de imagens
- Use controles positivos (tecidos positivos para o antígeno alvo) para verificar a rotulagem do sinal e os controles negativos (omitir o anticorpo primário, o controle isotipo ou os tecidos negativos para o antígeno alvo) para avaliar o fundo de imagens o fluorescente Microscópio.
- Defina as condições do equipamento e da câmera (exposições e outras configurações gerais) para imagens com base na intensidade do sinal de controles negativos e positivos.
Nota: Essas condições variam de (1) câmeras e microscópios usados para imagens, (2) anticorpos e (3) tecidos para cada experimento. As condições comuns utilizadas para os tecidos craniofaciais são ISO 200 com um tempo de exposição variando de 1/100 s a 1 s dependem da qualidade e especificidade dos anticorpos. As ampliações apropriadas variam dependendo do tamanho das amostras e da finalidade dos experimentos. - Adquira imagens com microscópio de epifluorescência convencional ou microscópio confocal. Adquira imagens (incluindo as dos controles correspondentes) nas mesmas condições para cada canal de cores. Salvar imagens com o mesmo formato (TIFF é melhor para preservar as informações).
5. quantificação da fluorescência
Nota: Comparar estatisticamente a coloração entre diferentes grupos será mais informativo em muitos casos. Com as imagens de imunofluorescência, quantificar o nível relativo da proteína medindo a densidade do sinal, contando células positivas, ou calculando áreas positivas. Para a análise estatística, o número mínimo de amostras biologicamente independentes é 3. Um método típico é gerar pelo menos três seções de cada amostra e tirar imagens para pelo menos três áreas representativas em cada seção.
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Quantificação da intensidade de fluorescência usando ImageJ
- Abra o software e use analisar ≫ definir medições para verificar se a área e a densidade integrada estão selecionadas. Use o arquivo > abrir para abrir imagens a serem analisadas.
- Use a barra de ferramentas para selecionar o ícone quadrado ou círculo na extrema esquerda. Selecione a área a ser analisada na imagem usando a ferramenta de seleção. Use analisar > Measure para obter a leitura da área selecionada e a densidade integrada na janela resultados. Selecione uma região ao lado de uma célula positiva que não tenha fluorescência para ler o plano de fundo.
- Repita o passo 5.1.2 para analisar outras imagens. Ajustado a área a ser analisada para corresponder com a da primeira imagem.
- Copie todos os dados na janela resultados e cole em uma planilha quando terminar de analisar.
- Calcule a intensidade de fluorescência corrigida (CTCF) como densidade integrada — (área da célula selecionada x fluorescência média de leituras de fundo). Compare a diferença da fluorescência total corrigida da célula entre as amostras e faça um gráfico.
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Quantificação do número de células positivas de imagens fluorescentes usando ImageJ
- Contagem manual de células.
- Use ImageJ > plugins > análise para instalar o Cell Counter plugin.
- Use o arquivo > abrir para abrir imagens a serem analisadas. Use Plugins > análise > contador de células para abrir a janela de contador e a janela de resultados.
Nota: Contador de células não funciona em pilhas. Para contagem de pilhas, plugin Plot z axis Profile, em seguida, use Image > Stacks ≫ traçar o perfil do eixo z para monitorar a intensidade de um ROI em movimento usando uma ferramenta de rastreamento de partículas. Esta ferramenta pode ser manual ou automática. - Clicando em um dos botões na parte inferior da janela do contador para iniciar a contagem. Clique diretamente em uma célula/objeto a ser contabilizar até o acabamento.
- Clique no botão Results na janela Count . O número total de células contados será mostrado na janela de resultados . Salve o log de resultados como planilha e analise.
- Contagem automatizada de células.
- Use o arquivo > abrir para abrir imagens a serem analisadas. Converta a imagem RGB em uma imagem de escala cinza antes de prosseguir.
- Use Image > ajustar > Threshold para selecionar todas as áreas que precisam ser contabilizadas.
- Use analisar ≫ analisar partículas para obter o número de células/partículas. Defina um intervalo do tamanho de partícula válido (por exemplo, 100-Infinity) em vez do padrão de 0-infinito para contar células/partículas dentro de um intervalo específico. Salve o log de resultados como planilha e analise.
Nota: para obter outras informações da imagem, além da área, vá para analisar > definir medições e selecione a caixa ao lado das informações necessárias.
- Contagem manual de células.
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Representative Results
Secções de tecido craniofacial embrionário
Seguindo as etapas acima, as cabeças foram dissecadas do controle (P0-CRE) ou do mutante (Bmpr1a constitutively ativado em pilhas neurais da crista, P0-CRE; caBmpr1a) embriões no dia embrionário (E) 16,5 ou 18,5. Após a fixação em 4% de PFA por 4 h, as amostras foram encaixadas em OCT e cryosectioned coronally. As seções resultantes foram imunocoradas com anticorpos contra pSmad1/5/9 (fatores de sinalização BMP a jusante) ou 67 (um marcador de proliferação celular) sem recuperação do antígeno de acordo com o protocolo. Como mostrado, pSmad1/5/9 (Figura 1a) e 67 (Figura 1C) foram positivos nos ossos frontais dos embriões controle. Em embriões mutantes, os níveis de pSmad1/5/9 foram aumentados (Figura 1b), enquanto os de 67 foram diminuídos (Figura 1D) nos ossos frontais. A morte celular nessas amostras também foi verificada de acordo com o protocolo. Como demonstrado, mais células apoptóticas foram observadas nos ossos frontais de embriões mutantes do que os de embriões controle (Figura 1e, F).
Tecidos craniofaciais não descalcificados ou secções ósseas longas
Seguindo as etapas acima para tecidos duros secçóes, as cabeças dos ratos velhos de 3 semanas (P0-CRE; mtmg (membrana-tomate e membrana GFP)) foram fixadas com o PFA de 4% e encaixadas na gelatina de 8%. Os Cryosections coronal foram lavados com PBST e montados com meio do anti-desvanecimento com DAPI. Figura 2a , B demonstrar que a gelatina não interfere com sinais fluorescentes de tecidos seccionados.
As cabeças e o fémures de 3 ratos week-old ou 3 mês-velhos foram empregados para verific se os tecidos secçóes encaixados gelatina são bons para o se. As cabeças inteiras e as fémures foram processadas e seccionadas de acordo com o protocolo. As seções resultaram foram utilizadas para imunocoloração de SOX9 (Figura 3) ou para a imunomarcação dupla de OSX e E11/Podoplanina (Figura 4). Como demonstrado, foram obtidas seções de boa qualidade da maioria dos tecidos duros de 3 semanas, incluindo os compartimentos trabeculares e corticais do fêmur (Figura 3a, B, figura 4a– D), os ossos frontais (Figura 4e, F), o incisivo (Figura 3E, f, Figura 4i, J), os tecidos nasais (Figura 3C, D) e o crânio, incluindo a sutura nasal-premaxilla e os ossos circundantes (Figura 4G, H ) da cabeça. Enquanto que, com amostras de 3 meses de idade, as secções de boa qualidade só foram obtidas em alguns dos tecidos duros, incluindo os compartimentos trabeculares do fêmur (Figura 3G, H, Figura 4K, L), tecidos nasais (Figura 3i , J), e o crânio que inclui a sutura nasal-premaxilla e os ossos circunvizinhos (Figura 4m, N) da cabeça. Como mostrado na Figura 3, SOX9 células positivas foram detectadas especificamente nos condrócitos da placa de crescimento (Figura 3B) e na articulação (Figura 3h) do fêmur e no septo nasal (Figura 3D, J). No incisivo de 3 semanas de idade, SOX9 foi detectado nas células mesenquimais (Figura 3F). Os resultados de coloração dupla de OSX e E11 mostraram que o OSX foi detectado em osteoblastos, enquanto E11 foi detectado em osteócitos de ossos do fêmur e da cabeça (Figura 4B, D, H, L, N). No incisivo de 3 semanas, o OSX foi positivo em odontoblastos, enquanto E11 foi positivo em células mesenquimais folículo (Figura 4J). Estes resultados indicam que os tecidos duros secçóes encaixados com a gelatina conservam bem as funções do antígeno.
Figura 1: exemplos de resultados de If de pSmad1/5/9, de 67 ou de TUNEL em embriões do controle e em embriões do mutante com atividade aumentada do BMP. Os camundongos Bmpr1a (caBmpr1a) ativados constitutivamente foram cruzados com camundongos P0-CRE para aumentar a atividade de sinalização de BMP em células de crista neural (nccs). Foram dissecados os embriões de cabeça de controle (P0-CRE; caBmpr1a+/+) e mutante (P0-CRE; caBmpr1aFX/+) em e 16,5 ou e 18,5, fixados com 4% de PFA para 4h, criorprotegidos com 30% de sacarose por 1 dia, incorporados em Oct, e cryosectioned em-18 ° c. As seções do osso frontal (nível similar com o olho) foram usadas para a imunodetecção de encontro ao pSmad1/5/9, ao 67, ou à mancha de TUNEL. (A, b) pSmad1/5/9 (verde) padrões de coloração nos ossos frontais dos embriões de controle (a) ou mutante (b) na e 16.5. (C, D) Padrões de coloração de 67 (verde) nos ossos frontais dos embriões de controle (C) ou mutante (D) em e 18,5. (E, F) TUNEL (vermelho) padrões de coloração nos ossos frontais de controle (e) ou mutantes (F) embriões em E 18,5. Os núcleos foram corados com DAPI (azul). FB = osso frontal, B = cérebro. Barras de escala = 100 μm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: exemplos de resultados do sinal do repórter do mtmg de tecidos secçóes na cabeça. Cabeças de camundongos P0-CRE de 3 semanas de idade com o repórter de membrana-tomate e membrana GFP (mtmg) foram dissecados, fixados com 4% de PFA por 4h, criostprotegidos com 30% de sacarose por 2 dias, embutidos em gelatina a 8% e criseccionados a-25 ° c. Secções de cabeça mostram claramente GFP (verde, CRE recombinação positiva) e tomate (vermelho, CRE recombinação negativa) sinal no osso nasal e tecidos nasais (a, B). Os núcleos foram corados com DAPI (azul). RN = osso nasal, N = tecidos nasais, NS = septo nasal. Barras de escala = 250 μm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: exemplos de resultados de imunocoloração SOX9 de tecidos não descalcificados na cabeça e femora. Cabeças e fémures foram dissecados de camundongos de 3 semanas ou 3 meses de idade, fixados com 4% de PFA para 4h, criostprotegidos com 30% de sacarose por 2 dias, embutidos em 8% de gelatina e criseccionados a-25 ° c. As lâminas foram utilizadas para imunodetecção contra SOX9 (vermelho). Os núcleos foram corados com DAPI (azul) (B, D, F, H, J). Secções adjacentes desses tecidos foram utilizadas para A coloração de hematoxilina & eosina (H & E) (A, C, E, G, I). As cabeças de flecha em A e B indicam A placa de crescimento e em G e H, cartilagem articular. As setas em A e G indicam ossos trabeculares e em C, D, I e J, septo nasal. DM = mesenchyme dental, de = epitélio dental, FM = mesenchyme do folículo. Barras de escala = 50 μm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: exemplos de resultados de imunomarcação dupla OSX e E11 de tecidos não descalcificados na cabeça e na femora. Cabeças e fémures foram dissecados de camundongos de 3 semanas ou 3 meses de idade, fixados com 4% de PFA por 4h, criostprotegidos com 30% de sacarose por 2 dias, embutidos em gelatina a 8% e criseccionados a-25 ° c. Foram utilizadas secções para imunocoloração dupla com anticorpos contra o OSX (vermelho) e E11/Podoplanina (verde). Os núcleos foram corados com DAPI (azul) (B, D, F, H, J, L, N). Secções adjacentes desses tecidos foram utilizadas para coloração H & E (A, C, E, G, I, K, M). Setas em a, B, K e L indicam compartimentos trabeculares do fêmur; C e D, compartimentos corticais do fêmur; e em e e F, os ossos frontais. As pontas de seta em A e B indicam A placa de crescimento. BM = medula óssea, N = tecidos nasais, DM = mesenquime dentário, DE = epitélio dentário, FM = mesenquime folículo, NPS = sutura de pré-maxila nasal. Os ossos frontais (e, F) e a sutura nasal-premaxilla e os ossos circundantes (G, H, M, N) também são mostrados. Barras de escala = 50 μm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Aqui nós fornecemos um protocolo detalhado para a preparação da cabeça do rato e dos tecidos secçóes do osso, e criossecção para a imunomarcação da proliferação de pilha, da morte da pilha, e dos marcadores de sinalização do BMP. Também detalham a estratégia de obtenção de dados quantitativos de imagens imunofluorescentes. Esses métodos também podem ser aplicáveis a outros tecidos com modificações apropriadas.
As condições para a preparação dos tecidos variam consoante o tamanho e o tipo de tecidos. O tempo da fixação e do crioproteção precisa geralmente diversas horas à noite. Após a fixação, o tecido também pode ser incorporado em parafina e seccionado com um micrótomo16. Embora tanto parafina e OCT funcionem bem para imunocoloração, existem algumas diferenças entre eles. Os blocos de parafina podem ser mantidos por vários anos na RT, enquanto os blocos de OCT são de 1 ano a-80 ° c. A parafina preserva a morfologia do tecido, enquanto o cristal de gelo formado durante a incorporação de OCT pode afetar negativamente as estruturas teciduais. A parafina às vezes mascara epítopos de antígenos, enquanto a OCT preserva as atividades enzimáticas e os epítopos do antígeno. Conseqüentemente, não há nenhuma necessidade de recuperação do antígeno para a maioria dos anticorpos se fixado em 4% PFA para somente 4 h ou menos e incorporado em OCT. É, entretanto, ainda possível obter melhores resultados pela recuperação do antígeno, se os controles positivos não mostraram bons resultados da mancha em Cryosections.
A tintura de Hoechst e o DAPI podem ser usados para a contador-mancha nuclear. Eles têm semelhanças, como ambos (1) são UV-animado, pequenos Groove-ligando produtos químicos para emitir sinais proporcionais ao conteúdo total de DNA, e (2) são submetidos a foto-branqueamento após uma longa exposição. Entretanto, as tinturas de Hoechst são usadas tipicamente para manchar o índice do ADN em pilhas vivos devido a sua permeabilidade elevada. DAPI é usado tipicamente para manchar o ADN em pilhas fixas devido a sua baixa permeabilidade da membrana. Além disso, DAPI gera um sinal mais forte e mais estável do que Hoechst.
Os controles apropriados são essenciais para o IF. A especificidade de cada anticorpo novo deve ser confirmada pela análise ocidental do borrão, se aplicável. A concentração de trabalho óptima de um anticorpo preliminar particular deve ser determinada com o uso de diluições de série. Um controle positivo (tecido ou célula que se comprova a expressar a proteína/antígeno) deve ser incluído para verificar o processo de IF e a especificidade do anticorpo. Um controle negativo deve igualmente ser incluído, por exemplo, ausência do anticorpo preliminar, ou a substituição de IgG normal da mesma espécie para o anticorpo preliminar, ou os tecidos negativos para o antígeno do alvo. Ao tirar fotos, a amostra sem anticorpos secundários (controle de fundo) deve ser examinada independentemente com cada canal para definir os limites de ganho de sinal e offset para ser adaptado para a imagem final. Para a detecção de vários rótulos, controle de fundo e controles de rótulo único precisam estar preparados para evitar artefatos de sobreposição espectral. Todos os canais que serão usados para obter uma imagem de uma amostra de vários rótulos devem ser submetidos a correção de fundo independente, pois o nível de autofluorescência em cada canal varia substancialmente.
Nós igualmente fornecemos o protocolo para a preparação e o criossecção de tecidos duros secçóes encaixados na gelatina. Para os tecidos duros descalcificados incorporados de OCT, a maioria das seções duras do tecido serão destacadas dos vidros da corrediça durante procedimentos da imunomarcação, por causa de seu baixo caráter da adesão na corrediça. A fita adesiva projetada facilitar o criossecção ajuda a gerar seções da boa qualidade. Mas, essas seções são facilmente danificadas quando a fita está descascando. Para tecidos embutidos de gelatina, não há necessidade de um sistema de transferência de fita para gerar seções de boa qualidade. Como um meio de incorporação, a gelatina pode se infiltrar na amostra bem, embora tenha uma viscosidade menor em comparação com OCT. a gelatina tem sido utilizada em outras aplicações histológicas, tais como o tecido cerebral17,18 e secções ultrafinos de células para Immunocytochemistry19. Aqui, a gelatina foi usada para incorporar o osso secçóes, que gera blocos mais fáceis ao criossecção do que Oct. Há diversas pontas pequenas para começ boas seções de tecidos duros secçóes encaixados gelatina. O passo crítico é incorporar com gelatina em vez de OCT. Para obter uma melhor penetração, manter as amostras em 30% de sacarose mais um dia depois de afundar as amostras para o fundo. É igualmente importante ajustar a temperatura mais baixa do que usual em aproximadamente-25 ° c. Uma lâmina ultra afiada não é necessária. Embora uma temperatura mais baixa do Cryo (° c-25) faça algumas melhorias para criossecção de tecidos duros secçóes incorporados outubro, é ainda difícil começ uma boa integridade de estruturas do tecido. Como mostrado na figura 2, figura 3e Figura 4, as seções de boa qualidade aplicáveis à imunocoloração foram obtidas a partir de tecidos duros embutidos em gelatina (por exemplo, ossos trabeculares, ossos corticais, ossos do crânio, tecidos nasais e incisivos). Esses resultados provaram que a incorporação de gelatina melhora significativamente a integridade do espécime de seções de tecido duro, mas também aumenta a aderência das seções aos vidros de slides. Além disso, a gelatina preserva as funções do antígeno e exibe a compatibilidade com sinais fluorescentes e imunocoloração. Entretanto, esta técnica trabalha somente bem para até 3 amostras mês-velhas. As melhorias potenciais deste método são (1) dissecar as amostras mais mais para separar o tecido do alvo de outras peças para fazer a estrutura do tecido simples (no caso dos dentes, o mandíbula ou o maxila devem ser dissecados e reparado em vez da cabeça inteira) e (2) usar 10% de EDTA para descalcificar os tecidos por apenas 2 – 3 dias antes da crio-proteção. Este curto período de descalcificação não comprometerá os resultados da imunocoloração. Outra preocupação é que, como um meio de incorporação não aquoso, a gelatina não pode ser facilmente removida das lâminas, o que pode levar a um fundo maior dependendo dos métodos de coloração (por exemplo, coloração H & E).
Os resultados da imunocoloração não são fáceis de quantificar, então eles são geralmente usados semi-quantitativamente. As dificuldades e limitações da quantificação da imunocoloração dos tecidos craniofaciais incluem, entre outras, as seguintes: (1) é difícil definir a área a ser contada devido à complexidade da estrutura dos tecidos craniofaciais; (2) é difícil definir a área rotulada ou células rotuladas devido à natureza não-linear da imunocoloração; (3) há informação limitada para o alcance dinâmico do sinal; (4) é difícil comparar a intensidade dos sinais entre imagens ou grupos devido ao desvanecimento do sinal fluorescente durante a aquisição da imagem; e (5) o fundo do sinal pode mudar significativamente entre os anticorpos, as corrediças, e as amostras. Para aumentar a confiabilidade dos resultados da quantificação, o experimento deve ser cuidadosamente e rigorosamente realizado. Todas as amostras devem ser processadas nas mesmas condições. Durante a imunocoloração, vários controles são necessários para avaliar o fundo do sinal e definir a área positiva ou células para o sinal. Leve imagens convincentes e representativas para mostrar claramente a área a ser contada e rotulada células com bom contraste. Além disso, durante a aquisição da imagem, a configuração da câmera e a configuração do equipamento devem ser mantidas consistentes.
Tomados junto, nós apresentamos um protocolo padrão simples para a imunofluorescência em tecidos craniofacial do rato, especial para tecidos duros secçóes. A análise de imunocoloração dos tecidos craniofaciais não só ajudará a compreender o mecanismo da morfogênese durante o desenvolvimento, mas também ilustrará as alterações durante a patogênese. Além disso, a imunocoloração também pode ser usada para estudar o padrão de expressão de outros ligantes da via de sinalização, receptores ou outros marcadores fenotípicos, além da proliferação celular, morte celular e via de sinalização BMP. No entanto, as etapas críticas de um experimento de imunomarcação devem ser modificadas apropriadamente para cada antígeno/anticorpo ou tecido para obter coloração específica e sinais de fundo não específicos minimizados.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelos institutos nacionais de saúde (R01DE020843 a Y.M.), a Associação Internacional FOP (Y.M.), e um subsídio de ajuda da Fundação Nacional de ciências naturais da China (31500788 a J.Y.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adhesive tape | Leica | #39475214 | |
| Alexa fluor 488-goat anti-Rabbit secondary antibody | Invitrogen | A-11034 | |
| Antifade Mountant with DAPI | Invitrogen | P36931 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A2153 | |
| Coverslips | Fisher Brand | 12-545-E | |
| Cryostat | Leica | CM1850 | |
| EDTA | Sigma | E6758 | |
| Fluorescence microscope | Olympus | BX51 | |
| Gelatin | Sigma | G1890 | |
| In Situ Cell Death Detection Kit | Millipore | S7165 | |
| Microscope slides | Fisher Brand | 12-550-15 | |
| OCT Compound | Fisher Healthcare | 23-730-571 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | P4417 | |
| Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether | Sigma | T9284 | Triton X-100 |
| Proteinase K | Invitrogen | AM2542 | |
| Rabbit anti-Ki67 antibody | Cell Signaling Technology | 9129 | Lot#:3; RRID:AB_2687446 |
| Rabbit anti-pSmad1/5/9 antibody | Cell Signaling Technology | 13820 | Lot#:3; RRID:AB_2493181 |
| Sodium citrate | Sigma | 1613859 | |
| Sucrose | Sigma | S9378 | |
| Tris | Sigma | 10708976001 |
References
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