Summary
Protokollen beskriver en reproducerbar metode udviklet til brug med celle kultur analysere at opdage overflade epitoper på små ekstracellulære vesikler (EV). Det udnytter specifikke EV immunoprecipitation ved hjælp af perler kombineret med antistoffer, der genkender overflade antigen CD9, CD63 og CD81. Metoden er optimeret til downstream flow flowcytometri analyse.
Abstract
Flowcytometri (FC) er den foretrukne metode til semi-kvantitative målinger af celle-overflade antigen markører. For nylig, denne teknik er blevet brugt for fænotypiske analyser af ekstracellulære vesikler (EV) herunder exosomes (Exo) i det perifere blod og andre kropsvæsker. Den lille størrelse af EV mandater brugen af dedikerede instrumenter at have en påvisningsgrænse omkring 50-100 nm. Alternativt, EV kan være bundet til latex microbeads, der kan registreres af FC. Microbeads, konjugeret med antistoffer, der genkender EV-associerede markører/klynge af differentiering CD63, CD9 og CD81 kan bruges til EV capture. EXO isoleret fra CM kan analyseres med eller uden forudgående berigelse af ultracentrifugering. Denne fremgangsmåde er egnet til EV analyser ved hjælp af konventionelle FC instrumenter. Vores resultater viser en lineær korrelation mellem betyde fluorescens intensitet (MFI) værdier og EV koncentration. Forstyrre EV gennem sonikering dramatisk faldt MFI, der angiver, at metoden ikke registrerer membran rester. Vi rapporterer en nøjagtig og pålidelig metode til analyse af EV overflade antigener, som nemt kan implementeres i alle laboratorier.
Introduction
Celler udskiller ekstracellulære vesikler (EV) i forskellige størrelser, herunder microvesicles (MV) og exosomes (Exo). Sidstnævnte kan skelnes fra MV ved både størrelse og subcellulært rummet af oprindelse. MV (200-1000 nm i størrelse) frigives fra overordnede celler ved at udgyde fra plasmamembran. Omvendt Exo (30-150 nm) stammer fra endosomal membraner og er udgivet i det ekstracellulære rum, når de multivesicular organer (MVB) fuse med cellemembranen1,2.
EV i stigende grad bruges som diagnostisk biomarkører så godt som, potentielt, terapeutiske værktøjer på mange områder herunder onkologi, neurologi, kardiologi og bevægeapparatet sygdomme3,4,5. Et stort flertal af igangværende undersøgelser ved hjælp af EV som terapeutiske agenter udnytter isolation af vesikler fra celle-aircondition medium (CM) af in vitro-kulturperler celler. Mesenchymale stamceller (msc) udøve gavnlige virkninger i flere sammenhænge, og MSC-afledte EV har vist fordele i modeller af Myokardie iskæmi/reperfusion skade6 og hjerne skade7. MSC-afledte EV også udviser immun modulerende aktiviteter, der kan udnyttes til at behandle immun afvisning, som påvist i en model af terapi-ildfaste graft - versus - host-sygdommen8. Fostervand væske stamceller (hAFS) aktivt berige CM MVs og Exo, uensartet fordelt i størrelse (50-1000 nm), der mægle flere biologiske effekter, såsom spredning af differentierede celler, angiogenese, hæmning af fibrose, og cardioprotection4. Vi har for nylig vist, at EV, og især Exo, udskilles af menneskelige hjerte-afledte stamceller (Exo-CPC) reducere Myokardie infarkt størrelse i rotter5,9.
EXO deler et fælles sæt af proteiner på deres overflade, herunder tetraspanins (CD63, CD81, CD9) og store histocompatibility komplekse klasse I (MHC-jeg). Ud over denne fælles proteiner, Exo også indeholder proteiner specifikke for EV delmængde af typen producent celle. EXO markører få afgørende betydning, fordi de spiller en afgørende rolle i Inter cellulære kommunikation, derved regulere mange biologiske processer5,10. På grund af deres lille størrelse, at finde en nem måde at analysere EV ved hjælp af klassisk flow flowcytometri (FC) forbliver en udfordrende opgave.
Vi præsenterer her, en forenklet protokol for EV analyse ved hjælp af FC, som kan anvendes til pre beriget prøver gennem ultracentrifugering eller direkte til CM (figur 1). Metoden bruger perler belagt med en bestemt antistof, der bindes kanoniske Exo-associerede overflade epitoper (CD63, CD9, CD81) uden yderligere vasker. FC analyser kan udføres ved hjælp af en konventionel Flowcytometret uden behov for justeringer før målinger. Metoder til karakterisering af antigener på enkelte små partikler ved hjælp af flow cytometers har været beskrevet af andre grupper med hensyn til forskellige applikationer11,12,13. Her, brugte vi functionalized magnetiske perler til fangst af små partikler og Exo, efterfulgt af fænotyper fanget partikler af FC. Selv om denne metode kan bruges til at karakterisere antigene sammensætning af små blærer udgivet af enhver in vitro-celletype, givet her vi specifikke celle kultur betingelser, der gælder for kulturen i menneskers hjerte stamceller (CPC) og mest passende miljø til produktion af EV af disse celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. indsamling og behandling af konditioneret medier
- Coat 55 cm2 petriskåle med 0,02% svin hud gelatine i PBS.
- Plade CPC (8.000/cm2) i præ-coatede retter med 7 mL af Iscoves modificerede Dulbecco Medium (IMDM) suppleret med 20% FBS (føtal bovint Serum) og 1% Penicillin/Streptomycin (P/S).
Bemærk: Udtrykket "CPC" refererer til menneskelige eksplantat afledte celler, der har været beskrevet andetsteds14. CM kan indsamles fra forskellige celletyper kulturperler i specifikke kultur betingelser. Bære handsker og arbejde under en biologisk hætte. - Når celler når om 80% sammenløb, fjerne næringssubstratet, vaske cellerne to gange med Dulbecco's PBS (PBS) Ca - og Mg-fri og erstatte det med 10 mL af serumfrit Exo-produktion medium (Dulbeccos modificerede Eagle Medium [DMEM] høje glukose, 4,5 g/mL).
Bemærk: Gå videre med en progressiv nedsættelse af serumkoncentrationen dyrkningsmedium, tilpasses gradvist celler til serumfrit tilstand (SF). For celler, der er følsomme over for serumfrit medium udarbejder et medium indeholdende FBS men forarmet af EV. Forberede medium suppleret med alle næringsstoffer, plus 10%-20% (v/v) FBS. Centrifugeres medium natten på 100.000 × g, 4 ° C. Vær opmærksom på at denne procedure ikke garanterer 100% fjernelse af FBS-afledte EV. - Efter 7 dage, indsamle CM i en polypropylen centrifugeglas.
Bemærk: Tid til medium conditioning afhænger celletype. For celler, der er følsomme over for serumfrit medium, øge den oprindelige mængde af medium og formindske tid for CM samling til 24-48 h. - Ryd CM fra celle debris af centrifuger på 3.000 x g i 20 min. ved 4-10 ° C. Indsamle supernatanten i en 100 kDa filter centrifugeglas.
- Koncentrat ryddet CM ved at dreje røret på 2.000 x g i 20 min. ved 4-10 ° C.
Bemærk: Dette trin vil reducere den oprindelige mængde af CM at tillade brugen af små-volumen rør til højhastigheds-centrifuge skridt og vil bidrage til at fjerne små protein aggregater. - Indsamle koncentrat i et microcentrifuge rør. Der centrifugeres ved 10.000 x g i 15 min. ved 4-10 ° C.
- Indsamle supernatanten og fortsætte til afsnit 2 (EV berigelse). Hvis en ultracentrifuge ikke er tilgængelig fortsætte direkte til afsnit 3 (nanopartikel Tracking analyse (NTA) kvantificering).
Bemærk: Før tilsætning af EV brøkdel forbedrer endelige udlæsning i fluorescens intensitet (Se repræsentative resultater og figur 4). Ryddet CM (fra punkt 1.8) kan opbevares ved 4 ° C for ikke længere så 1-2 dage eller alternativt ved −80 ° C i flere måneder. 5 CM bør være pre-ryddet fjerne enhver celleaffald før opbevaring på-80 ° C for at sikre, at exosome mellemstore snavs ikke er dannet i forbindelse med fryse-tø.
2. ekstracellulære vesikler berigelse af Ultracentrifuge (valgfri)
- Sted supernatanten fra trin 1.8 i en polycarbonat tykvæggede ultracentrifuge tube. Fyld glasset med 1 x fosfat buffer saltvand (PBS), indtil den når den maksimale kapacitet (3,2 mL).
- Indlæse prøver i en titanium fast vinkel rotor (8 x 3,2 mL, k-faktor 13). Indlæse rotor i en bordplade ultracentrifuge. Ultracentrifuge på 100.000 x g til 3 h på 4-10 ° C.
- Supernatanten og resuspenderes i 100 µL 1 x PBS.
3. nanopartikel Tracking analyse (NTA) kvantificering
- Fortyndes 1 µL af prøven (fra enten trin 2.3 eller 1,8) i 999 µL 1 x PBS. Læg prøven i en 1 mL sprøjte, undgå boble dannelse. Læg sprøjten i indløbsstuds undersøgelse kammer.
- Aktivere laser. Åbne kameraet med Capture -knappen. Justere fokus.
- Optage mindst 3 forskellige billeder af 60 s hver.
- Analysere de 3 forskellige overtagelser ved hjælp af indstillingen Batchproces i softwaren.
Bemærk: Hvis NTA teknologi ikke er tilgængelig, udføre en protein kvantificering af Bradford assay (1 x 108 partikler svarer til 1 – 2 µg af total protein efter ultracentrifugering eller 50 – 60 µg total protein hvis kvantificering foretages direkte i CM som Det omfatter proteiner forurenende stoffer forskellig fra EV; Se tabel 1)5.
4. Prøvetilberedning
- Forberede en pulje af de 3 typer af capture perler (CD9 perler, CD63 perler og CD81 perler på en 1:1:1 ratio; Se Tabel af materialer) og vortex.
Bemærk: Poolen er blevet testet for at være stabil i 1 måned. En enkelt type af erobrede perle kan bruges, det vil giver mulighed for påvisning af EV delpopulationer ikke discriminable med pool af perler. Ved hjælp af enkelt antigen indfange perler, vil det være muligt at moderne påvise tilstedeværelsen af tetraspanin proteiner, såsom CD9, CD81 eller CD63, og antigen af interesse registreret af fluorescerende antistof. Alternative aldehyd-sulfat latex perler er også kommercielt tilgængelige. Disse perler præsentere hydrofobe overflade for adsorption af MV og EV. - I en rund bund rør, tilføje mængden af mængde, der svarer til 1 x 108 partikler plus 1 µL af perle pool, svarende til 1,2 x 105 perler i alt (for hver test).
- Forberede et rør, der indeholder 1 µL af perler uden EV, der vil tjene som negativ kontrol, herved benævnt "Perler".
- Regulér lydstyrken til 100 µL med 1 x PBS. Glasset anbringes i en thermo-mixer, og ryste på 400 rpm overnatning på 4-10 ° C.
- Den næste dag, Flyt prøverne til en rund bund 96-brønd plade (eller FC rør).
- Tilføje antistof (10 µg/mL af CD9_FITC, 10 µg/mL af CD63_PE og 5 µg/mL CD81_PE).
- Inkubér 1 h på 4-10 ° C.
- Tilsæt 100 µL 1 x PBS til hver brønd.
- Fortsæt til erhvervelse.
5. anskaffelse
- Åbn erhvervelse software og starte instrumentet (Flowcytometret > System startprogram). Åbn et nyt eksperiment.
- Oprette en eksperimentel skabelon og derefter vælge og derefter Tilføje plader . Vælg placeringen af prøver på pladen og tryk Sæt som prøven godt.
- Angiv navnet prøve (dvs. CPC #1_CD9FITC) i Navngivning regler. Åbn fanen kanal og tænd FITC og PE kanaler.
- Læg pladen i instrumentet.
- Tryk på Dot Plot og oprette en ny dot plot (P1). Sæt frem Scatter område (FSC-A) versus Side Scatter-området (SSC-A).
- Vælg initialisere at starte laser og fluidics. Tryk på erhverve at starte erhvervelse.
- Justere skalaen for at vise befolkningen i midten af P1. I P1 tegne "Perler" gate omkring hele befolkningen (undtagen snavs) (figur 2A). Tryk på Stop.
- Tryk på Dot Plot og oprette en ny dot plot (P2). Angiv frem Scatter-højde (FSC-H) versus FSC-A. Gate den nye dot plot på "Perler." I P2 tegne en ny gate omkring den større befolkning og navngiv den "SLÅBROKKER" (figur 2A).
Bemærk: Denne strategi er designet for at undgå så meget som muligt optagelse af perler aggregater i både erhvervelse og analyse trin. - Tryk på Dot Plot og oprette to forskellige dot arealer; et FITC versus SSC-A og ét PE versus SSC-A. Gate den nye dot plot på "SLÅBROKKER."
- Vælg antallet af hændelser til at registrere (fx 20.000). Vælg Record og starte eksperimentet.
6. dataanalyse
- Indlæse filerne erhvervelse i analyse software.
Bemærk: Følgende trin skal anvendes på hver prøve, herunder perler kun og hver ukendt prøve. - Åbn en ny protokol og Opret dot parceller efter den samme strategi, der er beskrevet i trin 5.
- Sæt alle scatter akser til lineære skala og alle fluorescens akser til log skala.
- Vis fluorescens geometriske middelværdi (X-Gmean-MFI) i FITC og PE kanaler.
- Beregn forholdet X-Gmener af prøver / X-Gmener af perlerne farves med antistof uden exosome.
- Sammenlign folden ændre MFI forskellige præparater, EV.
7. ekstracellulære vesikel nummer titrering
Bemærk: Afsnit 7-10 kan udføres for at indstille antallet af partikler, antistoffer koncentration og specificitet, men kan springes over, hvis den celletype, hvorfra EV er afledt og antistoffer forbliver den samme.
- Fortynd partikler, fremstillet af trin 2.3, i 1 x PBS til at opnå en række suspensioner lige fra 5 x 105 til 2,5 x 108 partikler.
- For hver suspension tilføje i en rund bund tube 1 µL af capture perle pool.
- Følge protokollen fra trin 4.3.
8. antistoftitrering
Bemærk: Antistoftitrering er normalt udføres ved at tilføje et enkelt antistof til hvert rør.
- Holde antallet af EV (samlede partikel eller proteinindhold) konstant i alle prøver.
Bemærk: Det relevante nummer er empirisk bestemmes som beskrevet ovenfor i afsnit 7. - Følge protokollen fra trin 4.1 til 4.5.
- Teste en vifte af antistof koncentrationer ovenfor og nedenfor det beløb, der er anbefalet af leverandøren. For eksempel for et antistof med en foreslåede koncentration på 10 µg/mL pr. test, test 1, 2, 5, 10, 20 og 50 µg/mL. Omfatte en prøve med "perler kun", tilføjer den højeste koncentration af antistof.
- Inkuber i 1 time ved 4-10 ° C.
- Tilsæt 100 µL 1 x PBS for hver prøve.
- Erhverve prøverne.
9. inkubationstiden
- Kontrollere inkubationstiden udfører erhvervelser på forskellige tidspunkter (f.eks. 1 h, 2 h og 5 h).
- Følge protokollen fra afsnit 4.
- Inkuber prøver på 4-10 ° C i 1 time.
- Erhverve prøver.
- Inkuber prøver på 4-10 ° C til 3 h.
- Erhverve prøver.
10. protokol validering
-
EV bindende
- I en rund bund rør, tilføje mængden af mængde, der svarer til 1 x 108 partikler eller det tilsvarende beløb i total protein.
- Regulér lydstyrken til 100 µL med 1 x PBS.
- Forstyrre EV membranen ved ultralydbehandling (alternativt en heat shock skridt kan være anvendt) ifølge producentens anvisninger. Indstil frekvens og intensitet. Perioden sonikering empirisk kan etableres indstilling et tidsforløb eksperiment (dvs. 0 Sørensen, 30 s, 1 min., 5 min., osv.).
- Tilføj 1 µL af perle pool.
- Følge protokollen fra trin 4.4.
-
Antistof specificitet
- Forberede et rør til hver fluorokrom-konjugeret IgG og tilføje komplekset af perler-EV, som beskrevet i trin 4.6.
Bemærk: Fluorokrom-konjugeret Isotype skal stemme overens med de anvendte antistoffer IgG.
- Forberede et rør til hver fluorokrom-konjugeret IgG og tilføje komplekset af perler-EV, som beskrevet i trin 4.6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Samlede antal partikler for enkelt farvning
Da en enkelt perle kan binde mere end én partikel, testede vi forskellige betingelser for at angive den mindste samlede EV (enkelt antistof pr tube) at nå frem til den tidlige eksponentielle fase af MFI kurve. En bestemt koncentration af antistof blev brugt mens det samlede antal partikler varierede fra 5 x 105 til 2,5 x 108. Som vist i figur 3A, antallet af partikler, der gør det muligt for os at sikre, at antistoffet udfører inden for en acceptabel MFI, er at undgå brugen af et overskud af EV, 1 x 108 partikler/pletter.
Antistoftitrering
Vi har valgt den korrekte koncentration af antistof resulterer i det højeste signal at forhindre uspecifik antistof bindende. Denne test er blevet optimeret til 1 x 108 partikler, som fastlagt i den tidligere indstilling. Anti-CD9_FITC, anti-CD63_PE og anti-CD81_PE blev testet med koncentrationer spænder fra 1 til 50 µg/mL (figur 3B). Anti-CD9_FITC og anti-CD63_PE antistoffer gav en god opløsning af signal (7,5 og 130-fold ændring af MFI vs perler alene, henholdsvis) når det anvendes i koncentration på 10 µg/mL samtidig med den valgte koncentration for anti-CD81_PE antistoffer var 5 µg/mL (465.3 Fold Ændre MFI).
Metode validering
For at bekræfte, at vores metode er egnet til at analysere kun "kop-formet" ekstracellulære vesikler og ikke membran rester, anvendte vi forskellige sonikering trin, på 10% af amplitude, at den løsning, der indeholder partikler. 100 µL 1 x PBS løsning indeholdende 1 x 108 partikler undergik forskellige sonikering trin fra 30 sekunder til 5 minutter og den resulterende præparat indeholdende både brudt og velformede EV blev analyseret som beskrevet (eksperimentel protokol fra punkt 3.3). som et resultat, vi fandt, at 30 sekunder af sonikering falde MFI, der var helt dumpet efter 1 minut. På dette tidspunkt er ingen fluorescens påviselige for nogen af EV markørerne (figur 3D).
Flow flowcytometri karakterisering af HEK293 - og CPC-afledte exosomes
Disse resultater blev genereret efter protokollen præsenteret ovenfor med metoden ultracentrifuge isolation. De isolerede exosomes er kvantificeret ved NTA teknologi og indlæst natten med 1 µL af blandet perler (1 x anti-CD9:1 x anti-CD63:1 x anti-CD81). Den komplekse perler + Exo var plettet med den korrekte mængde antistof anti-CD9_FITC, anti-CD63_PE og anti-CD81_PE (figur 3EF og tabel 2).
Desuden ved hjælp af EV-CPC sammenlignede vi FC analyse med eller uden forudgående berigelse af ultracentrifugering. Figur 4 viser, at begge metoder er velegnede til profil Exo overflade markører. Før tilsætning af ekstracellulære vesikler brøkdel i høj grad forbedrer fluorescens intensitet især for CD63_PE og CD81_PE farvning (figur 4 og tabel 3).
Figur 1: protokol og NTA observationsområder. (A) skematisk fremstilling af den forsøgsplan. (B) repræsentant NTA observationsområder til aircondition medier, før Ultracentrifuge og efter Ultracentrifuge trin. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: erhvervelse og data analyse. (A) Flow flowcytometri analyse begynder med at skabe en første port til hele perler befolkning "perler" (undtagen snavs) og derefter en anden gate for at skelne mellem "slåbrokker" begivenheder. Housecoats er gated på et plot oprettet med FSC-H som x-aksen og FSC-A som y-aksen. (B-D) Repræsentative dot parceller viser højre-Skift af fluorescens intensitet for de positive populationer af perler-exosomes komplekser (grøn, CD9 +; rød CD63 +; brun CD81 +). Isotype kontrol (violet) overlapper negativ grå farvet perler. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Titrering kurver for antallet af partikler (pile viser det valgte antal partikler, 1 x 108). (A) antistof koncentrationer (pile viser den valgte koncentration for hver brugt antistof). (B) begge antallet af partikler og antistof koncentration er plot vs gennemsnitlige fluorescens intensitet (MFI). (C) kurve viser 3 forskellige erhvervelse af forberedelse med 1-2 h eller 5 h antistof inkubation. (D) kurve viser nedgang af fluorescens efter ultralydbehandling på forskellige tidspunkter. (E-F) Fold ændring (gennemsnit ± SD) af MFI for CD9, CD63 og CD81 vs negativ kontrol (perler + antistoffer, ingen EV) er vist for HEK293 EV (n = 3 uafhængige replikater) og for CPC-EV (n = 3 primære cellelinjer fra 3 forskellige patienter) venligst klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: MFI analyse og sammenligning mellem to procedurer: direkte EV-bindende med perler (Capture perler Isolation) og før berigelse med ultracentrifuge (Ultracentrifuge Isolation). Tallene vises som fold ændring (gennemsnit ± SD) af MFI for (A) CD9, (B) CD63 og (C) CD81 vs. negative kontrol (perler + antistoffer, ingen EV). N = 3 primære cellelinjer fra 3 forskellige patienter. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| CPC | CONC NTA (del/µL) | CONC (µg/µL) |
| CPC #1 før Ultracentrifuge | 5.02E + 06 | 2,01 |
| CPC #1 efter Ultracentrifuge | 6.10E + 07 | 1,04 |
| CPC #2 før Ultracentrifuge | 5.74E + 06 | 2.30 |
| CPC #2 post Ultracentrifuge | 7.43E + 07 | 0,79 |
| CPC #3 før Ultracentrifuge | 2.02E + 06 | 1,90 |
| CPC #3 efter Ultracentrifuge | 2.91E + 07 | 0,42 |
Tabel 1: Sammenligning mellem NTA koncentration og proteinkoncentration for 3 forskellige patienten afledt CPC før og efter ultracentrifuge.
| FOLD ÆNDRING AF MFI ± SD | CD9 | CD63 | CD81 |
| HEK293 | 24.44 ± 19.17 | 430.7 ± 344.9 | 535.2 ± 410.3 |
| CPC #1 | 14.15 ± 3,72 | 236.05 ± 43.40 | 353.30 ± 452.43 |
| CPC #2 | 15.76 ± 1,87 | 983.06 ± 195.63 | 374.45 ± 108.05 |
| CPC #3 | 8.94 ± 7.19 | 830.50 ± 184.73 | 60.05 ± 23,18 |
Tabel 2: Værdien af fold ændring (gennemsnit ± SD) af MFI for HEK293 EV (n = 3 uafhængige replikater) og CPC EV (n = 3 primære cellelinjer fra 3 forskellige patienter).
| FOLD ÆNDRING AF MFI ± SD | CD9 | CD63 | CD81 |
| Fange perler Isolation | 2.96 ± 1.45 | 65,65 ± 18,87 | 21.85 ± 6.12 |
| Ultracentrifuge isolering | 7,47 ± 2,71 | 236.00 ± 25.06 | 65.05 ± 13.38 |
Tabel 3: Værdi af fold ændring af MFI (gennemsnit ± SD) for CPC-EV (n = 3 primære cellelinjer fra 3 forskellige patienter) isoleret af capture perler eller ultracentrifuge.
Tabel 4: Enkelt produktspecifikation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Konventionelle FC teknik er fortsat den mest enkle analytisk metode til at karakterisere markører udtrykkes på overfladen af EV. I denne henseende, er at vælge den mest hensigtsmæssige protokol afgørende for at få nyttige oplysninger om individuelle partikel fraktioner af interesse ved at undgå begrænsninger på grund af instrument følsomhed. Vi beskrevet en metode, ved hjælp af magnetiske partikler kombineret med antistoffer, der genkender Exo og små EV overflade antigener, som er egnet til downstream FC ansøgning. Vi valideret metode ved hjælp af to forskellige celletyper: primære menneskelige CPC, der er ved at opstå som en stor celle kilde for Exo-baserede terapeutiske tilgange til hjertesygdomme; og HEK293 celler, en udødeliggjort cellelinie udbredt i celle biologi forskning på grund af pålidelig cellevækst og plasticitet.
Metoden kan anvendes til ultracentrifuge-beriget EV og for hurtigere analyse, også direkte på in vitro-celle-afledte CM med ingen før tilsætning af ultracentrifugering. Udgangsmaterialet er kritisk, når man sammenligner prøver. Tilføjelse af fanger perler direkte til fælles håndbog vil fremskynde proceduren men samtidig mindske fluorescens intensitet, som vist i figur 4A. Det er også afgørende for at bruge en passende mængde af PBS til at blande perler og EV under trinnet "fanger" 4.4. Når du bruger en konstant inkubationstiden, vil en øget volumen falde fluorescens intensitet på grund af ineffektive EV kobling.
En begrænsning af protokollen er, at en enkelt fange perle kan binde flere EV/Exo partikler på dens overflade. Dette vil begrænse muligheden for at identificere delmængder af EV udtrykker ejendommelig kombination af antigener ved hjælp af en flere farvning. Den perle-baserede metode giver derfor semi-kvantitative data. Ved hjælp af perler med en enkelt fanger Ab (CD9, CD63 eller CD81) tillader maksimale karakterisering af partikler, der udtrykker to epitoper: en nuværende på perle og anerkendt af den fanger antistof og den opdaget af antistof, der er efterfølgende tilføjede.
Den nuværende guld standard for Exo analyser ved hjælp af FC er en protokol udviklet af van der Vlist et al. i 201215. Det giver mulighed for en høj opløsning analyse af EV bruger en optimeret konfiguration af de kommercielt tilgængelige high-end FC (f.eks BD tilstrømning). Denne protokol er ekstremt detaljeret og nyttig, men stadig har brug for en kompleks hardware indstilling med specifikke FC kalibrering før brug. Tre år senere, Pospichalova et al.16 foreslået en forenklet protokol for FC analyse af Exo ved hjælp af en dedikeret Flowcytometret specielt udviklet til analyse af små partikler (f.eks. Apogee A50 mikro)17. Med hensyn til denne protokol og andre, der har brugt særlig tærskel indstilling11, foreslår her vi en grundlæggende protokol for at udføre små EV fænotyper ved hjælp af magnetiske bindende perler, der er velegnet til konventionelle FC instrumenter og kræver ingen særlige indstilling. Forskellige protokoller har beskrevet perle-baserede metoder til at karakterisere små EV fundet i kropsvæsker af FC12. Her viser vi immunocapture af diskrete delpopulationer af vesikler positiv for CD9, CD63 og CD81, der er almindeligt anvendt som Exo markører18. Aldehyd-sulfat latex19,20 og polystyren12perler forblive gyldige alternativer til binding af EV i CM og blodplasma væske; dog aktiverer aldehyd grupper udsat på overfladen af polymer partikel kobling af uspecifik proteiner og andre materialer til de latex partikler, hvilket øger risikoen for kontaminering af lipoprotein eller apoptotic organer under isolation og påvisning behandle21,22.
Perlerne anvendes i protokollen binde kun hele, velformede EV. Vi har foreslået at forstyrre EV struktur ved hjælp af sonikering til dæmpning af signalet (afsnit 4, "protokol validering"). Faktisk, et minut af sonikering resulterer i formindsket fluorescens intensitet, hvilket viser, at et positivt signal ikke kan påvirkes af membran vragrester adsorberet på perler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Intet at erklære.
Acknowledgments
L.B. blev støttet af forskningsbevillinger Helmut Horten Stiftung og Velux Stiftung, Zürich (Schweiz). G.V. blev støttet af forskningsbevillinger for Swiss National Science Foundation, Cecilia-Augusta Foundation, Lugano og SHK Stiftung für Herz-und Kreislaufkrankheiten (Schweiz)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IMDM | Gibco | 12440061 | |
| Amicon Ultra-15, PLHK Ultracel-PL Membran, 100 kDa | Millipore | UFC910024 | |
| CytoFlex, Flow Cytometer Platform | Beckman Coulter | CytoFlex | |
| DMEM, high glucose, HEPES, no phenol red | Gibco | 21063045 | |
| Dulbecco's PBS (PBS) Ca- and Mg-free | Lonza | BE17-512F | |
| ExoCap CD63 Capture Kit | JSR Life Sciences | Ex-C63-SP | |
| ExoCap CD81 Capture Kit | JSR Life Sciences | Ex-C81-SP | |
| ExoCap CD9 Capture Kit | JSR Life Sciences | Ex-C9-SP | |
| Exosome-Depleted FBS | Thermofisher | A2720801 | |
| Exosome-depleted FBS Media Supplement | SBI | EXO-FBS-250A-1 | |
| FBS-Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270106 | |
| FITC anti-human CD9 Antibody | Biolegend | 312104 RRID: AB_2075894 | |
| Flow Cytometer analysis software | Beckman Coulter | Kaluza | |
| NanoSight LM10 | Malvern | NanoSight LM10 | |
| NanoSight Software | Malvern | NTA 2.3 | |
| Optima Max-XP | Beckman Coulter | 393315 | |
| PE anti-human CD63 Antibody | Biolegend | 353004 RRID:AB_10897809 | |
| PE anti-human CD81 (TAPA-1) Antibody | Biolegend | 349505 RRID:AB_10642024 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Thermomixer C | Eppendorf | 5382 000 015 | |
| TLA-110 | Beckman Coulter | TLA-110 rotors |
References
- Barile, L., Vassalli, G. Exosomes: Therapy delivery tools and biomarkers of diseases. Pharmacology & Therapeutics. , (2017).
- Thery, C. Exosomes: secreted vesicles and intercellular communications. Molecular Biology Reports. 3, 15 (2011).
- Yadav, D. K., et al. Liquid biopsy in pancreatic cancer: the beginning of a new era. Oncotarget. 9, 26900-26933 (2018).
- Balbi, C., et al. First Characterization of Human Amniotic Fluid Stem Cell Extracellular Vesicles as a Powerful Paracrine Tool Endowed with Regenerative Potential. Stem Cells Translational Medicine. 6, 1340-1355 (2017).
- Andriolo, G., et al. Exosomes From Human Cardiac Progenitor Cells for Therapeutic Applications: Development of a GMP-Grade Manufacturing Method. Frontiers in Physiology. 9, (2018).
- Lai, R. C., et al. Exosome secreted by MSC reduces myocardial ischemia/reperfusion injury. Stem Cell Research. 4, (2009).
- Doeppner, T. R., et al. Extracellular Vesicles Improve Post-Stroke Neuroregeneration and Prevent Postischemic Immunosuppression. Stem Cells Translational Medicine. 4, 1131-1143 (2015).
- Kordelas, L., et al. MSC-derived exosomes: a novel tool to treat therapy-refractory graft-versus-host disease. Leukemia. 28, 970-973 (2014).
- Barile, L., et al. Extracellular vesicles from human cardiac progenitor cells inhibit cardiomyocyte apoptosis and improve cardiac function after myocardial infarction. Cardiovascular Research. 103, 530-541 (2014).
- Longatti, A., et al. High affinity single-chain variable fragments are specific and versatile targeting motifs for extracellular vesicles. Nanoscale. 10, 14230-14244 (2018).
- Menck, K., Bleckmann, A., Schulz, M., Ries, L., Binder, C. Isolation and Characterization of Microvesicles from Peripheral Blood. Journal of Visualized Experiments. , (2017).
- Inglis, H., Norris, P., Danesh, A. Techniques for the analysis of extracellular vesicles using flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. , (2015).
- Arakelyan, A., et al. Flow Virometry to Analyze Antigenic Spectra of Virions and Extracellular Vesicles. Journal of Visualized Experiments. , (2017).
- Chimenti, I., et al. Isolation and expansion of adult cardiac stem/progenitor cells in the form of cardiospheres from human cardiac biopsies and murine hearts. Methods Molecular Biology. 879, 327-338 (2012).
- van der Vlist, E. J., Nolte-'t Hoen, E. N., Stoorvogel, W., Arkesteijn, G. J., Wauben, M. H. Fluorescent labeling of nano-sized vesicles released by cells and subsequent quantitative and qualitative analysis by high-resolution flow cytometry. Nature Protocols. 7, 1311-1326 (2012).
- Pospichalova, V., et al. Simplified protocol for flow cytometry analysis of fluorescently labeled exosomes and microvesicles using dedicated flow cytometer. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 25530 (2015).
- van der Pol, E., et al. Particle size distribution of exosomes and microvesicles determined by transmission electron microscopy, flow cytometry, nanoparticle tracking analysis, and resistive pulse sensing. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 12, 1182-1192 (2014).
- Witwer, K. W., et al. Updating the MISEV minimal requirements for extracellular vesicle studies: building bridges to reproducibility. Journal of Extracellular Vesicles. 6, 1396823 (2017).
- Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Current Protocols in Cellular Biology. , Chapter 3, Unit 3.22 (2006).
- Suarez, H., et al. A bead-assisted flow cytometry method for the semi-quantitative analysis of Extracellular Vesicles. Scientific Reports. 7, 11271 (2017).
- Sodar, B. W., et al. Low-density lipoprotein mimics blood plasma-derived exosomes and microvesicles during isolation and detection. Scientific Reports. 6, 24316 (2016).
- Sluijter, J. P. G., et al. Extracellular vesicles in diagnostics and therapy of the ischaemic heart: Position Paper from the Working Group on Cellular Biology of the Heart of the European Society of Cardiology. Cardiovascular Research. 114, 19-34 (2018).
