Summary
البروتوكول وصف أسلوب استنساخه مصممة للاستخدام مع supernatants ثقافة الخلية للكشف عن سطح [ابيتوبس] في حويصلات صغيرة خارج الخلية (EV). فإنه يستخدم إيمونوبريسيبيتيشن EV محددة باستخدام الخرز مقترنة بالأجسام المضادة التي تعترف بسطح مستضد CD9، CD63، و CD81. الأسلوب هو الأمثل للتحليل الخلوي تدفق المتلقين للمعلومات.
Abstract
التدفق الخلوي (FC) هو الأسلوب المفضل للقياس الكمي شبه علامات مستضد سطح الخلية. في الآونة الأخيرة، استخدمت هذا الأسلوب لتحليلات المظهرية من حويصلات خارج الخلية (EV) بما في ذلك اكسوسوميس (Exo) في الدم المحيطي وسوائل الجسم الأخرى. صغر حجم EV ولايات استخدام صكوك مخصصة لها عتبة الكشف عن حوالي 50-100 نانومتر. وبدلاً من ذلك، يمكن ربط EV ميكروبيدس مطاط يمكن الكشف عنها بواسطة FC. يمكن استخدام ميكروبيدس، مترافق مع الأجسام المضادة التي تعترف بعلامات/الكتلة المرتبطة EV CD63 التمايز و CD9 و CD81 لالتقاط EV. يمكن تحليل أكسو معزولة عن سم مع أو بدون تخصيب اليورانيوم قبل واسطة تنبيذ فائق. وهذا النهج مناسبة لتحليلات EV باستخدام الصكوك FC التقليدية. وتبين النتائج التي توصلنا إليها ارتباط خطي بين قيم كثافة Fluorescence يعني (MFI) وتركيز EV. تعطيل EV خلال sonication هائلة انخفضت مؤسسة مونتانيار، مما يشير إلى أن الأسلوب لا يكشف عن الحطام الغشاء. ونحن التقرير طريقة دقيقة وموثوق بها لتحليل المستضدات السطحية EV، التي يمكن تنفيذها بسهولة في أي مختبر.
Introduction
تفرز خلايا الحويصلات خارج الخلية (EV) ذات أحجام مختلفة بما في ذلك ميكروفيسيكليس (MV) واكسوسوميس (Exo). يمكن التمييز بين هذا الأخير من السيارات حسب الحجم وحجرة سوبسيلولار الأصلية. يتم تحرير MV (200 – 1,000 نانومتر في الحجم) من الخلايا الأصل قبل ذرف من غشاء البلازما. على العكس من ذلك، تنبع من الأغشية اندوسومال أكسو (30-150 nm) وهي التي تطلق في الفضاء خارج الخلية عندما تلتحم الهيئات مولتيفيسيكولار (مفب) مع غشاء الخلية1،2.
EV بصورة متزايدة كالمؤشرات الحيوية التشخيص كذلك، يحتمل أن تكون، أدوات العلاجية في العديد من المجالات بما في ذلك الأورام والأمراض العصبية وأمراض القلب وأمراض العظام والعضلات3،،من45. غالبية العظمى من الدراسات الجارية باستخدام EV باستغلال العوامل العلاجية عزلة حويصلات من تكييف الخلية المتوسطة (سم) من الخلايا المزروعة في المختبر. الخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs) تأثيراً مفيداً في عدة سياقات، والمستمدة من لجنة السلامة البحرية EV أظهرت فوائد في نماذج من احتشاء عضلة القلب الاسكيمية/ضخه إصابة6 والدماغ إصابة7. كما يحمل EV المستمدة من لجنة السلامة البحرية محصنة ضد الأنشطة مودولاتوري التي يمكن استغلالها لعلاج الرفض المناعي، كما هو موضح في نموذج للعلاج-صهر الاختلاس – مقابل – المضيف المرض8. بنشاط تخصيب الخلايا الجذعية السائل السلوى (حفص) سم مع MVs واكسو، موزعة بين في الحجم (50 – 1,000 nm)، التي تتوسط العديد من الآثار البيولوجية، مثل انتشار الخلايا المتمايزة، والأوعية، وتثبيط التليف، و كارديوبروتيكشن4. ونحن قد أظهرت مؤخرا أن قيمة المنشأة، ولا سيما أكسو، يفرز من الخلايا البشرية السلف المستمدة من القلب (أكسو-الحزب الشيوعي الصيني) تقليل حجم احتشاء عضلة القلب في الفئران5،9.
أكسو حصة مجموعة مشتركة من البروتينات على سطحها، بما في ذلك تيتراسبانينس (CD63، CD81، CD9) و histocompatibility الرئيسية المعقدة الفئة الأولى (MHC--أنا). وبالإضافة إلى هذه المجموعة المشتركة من البروتينات، كما أكسو تحتوي على بروتينات محددة ل EV مجموعة فرعية من نوع الخلية المنتجة. علامات أكسو تكتسب أهمية قصوى لأنها تلعب دوراً حاسما في الاتصالات بين الخلوية، وبالتالي تنظم العديد من العمليات البيولوجية5،10. بسبب صغر حجمها، إيجاد طريقة سهلة لتحليل EV استخدام الكلاسيكية التدفق الخلوي (FC) يظل مهمة صعبة.
وهنا، يقدم بروتوكول مبسط لتحليل EV استخدام FC، التي يمكن تطبيقها للتخصيب قبل العينات التي تم الحصول عليها من خلال تنبيذ فائق أو مباشرة إلى سم (الشكل 1). يستخدم الأسلوب حبات مغلفة بجسم معين التي تربط الكنسي المرتبطة أكسو السطحية [ابيتوبس] (CD63, CD9, CD81) دون يغسل إضافية. يمكن إجراء تحليلات FC استخدام cytometer تقليدية مع عدم وجود حاجة لإجراء تعديلات قبل القياسات. وقد وصف أساليب لتوصيف المستضدات على جزيئات صغيرة فردية باستخدام سيتوميتيرس تدفق مجموعات أخرى فيما يتعلق بمختلف تطبيقات11،،من1213. هنا، استخدمنا حبات المغناطيسية فونكتيوناليزيد لإلقاء القبض على جزيئات صغيرة واكسو، تليها phenotyping الجزيئات الملتقطة بنادي. على الرغم من أن يمكن استخدام هذا الأسلوب لتحديد خصائص مستضدي تكوين حويصلات صغيرة صدر عن أي نوع من الخلايا في المختبر، هنا قدمنا شروط ثقافة الخلية المحددة التي تنطبق لثقافة السلف القلب البشري خلايا (الحزب الشيوعي) وأكثر البيئة المناسبة لإنتاج EV بهذه الخلايا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-جمع وتجهيز الوسائط مكيفة
- معطف 55 سم2 أطباق بيتري مع الجيلاتين من جلد الخنزير 0.02 في المائة في برنامج تلفزيوني.
- لوحة لجنة البرنامج والتنسيق (8,000/سم2) في أطباق المغلفة مسبقاً مع 7 مل من المتوسطة (إيمدم "تعديل دولبيكو" ل Iscove) وتستكمل مع 20% FBS (مصل بقرى الجنين) و 1% البنسلين/ستربتوميسين (P/S).
ملاحظة: مصطلح "الحزب الشيوعي الصيني" يشير إلى الخلايا البشرية explant المشتقة التي تم وصفها في أماكن أخرى14. ويمكن جمع سم من أنواع الخلايا المختلفة المستزرعة في ظروف ثقافة معينة. ارتداء القفازات وتعمل تحت غطاء بيولوجية. - حالما تصل إلى الخلايا عن التقاء 80%، إزالة المتوسطة الثقافة وغسل الخلايا مرتين مع دولبيكو في "برنامج تلفزيوني" (PBS) Ca وملغ خالية من واستبدله مع 10 مل من أكسو-إنتاج المصل خالية المتوسطة (متوسطة [دميم] "ارتفاع الجلوكوز تعديل النسر" دولبيكو، 4.5 g/mL).
ملاحظة: المضي قدما انخفاض تدريجي لتركيز المصل في الثقافة المتوسطة، تتكيف تدريجيا في الخلايا إلى حالة خالية من المصل (SF). للخلايا الحساسة للمتوسط خالية من المصل وإعداد متوسطة تحتوي على FBS ولكن نفدت من EV. تعد المتوسطة يكمل مع جميع العناصر الغذائية، بالإضافة إلى 10%-20% (v/v) FBS. الطرد المركزي في المتوسط بين عشية وضحاها في 100,000 × ز، 4 درجة مئوية. كن على علم أن هذا الإجراء لا يضمن إزالة 100 ٪ من EV FBS-مشتقة. - بعد 7 أيام، جمع سم في أنابيب البولي بروبلين أجهزة الطرد مركزي.
ملاحظة: الوقت لتكييف المتوسط يعتمد على نوع الخلية. للخلايا حساسة للمتوسط خالية من مصل الدم، زيادة حجم الأولى المتوسطة وتقليل الوقت لجمع سم إلى 24-48 ساعة. - مسح سم من الحطام الخلية بأجهزة الطرد المركزي في 3,000 س ز لمدة 20 دقيقة في 4-10 درجة مئوية. جمع المادة طافية في أنبوب كاتشين 100 عامل تصفية جهاز الطرد مركزي.
- مسح تركيز سم بالغزل الأنبوب في 2,000 س ز لمدة 20 دقيقة في 4-10 درجة مئوية.
ملاحظة: هذه الخطوة سوف يقلل حجم سم تسمح باستخدام أنابيب صغيرة الحجم لأجهزة الطرد المركزي عالية السرعة الخطوات الأولية وسوف يسهم في القضاء على مجاميع صغيرة من البروتين. - جمع الركاز في أنبوب ميكروسينتريفوجي. أجهزة الطرد المركزي في 10,000 س ز لمدة 15 دقيقة في 4-10 درجة مئوية.
- جمع المادة طافية وانتقل إلى القسم 2 (EV الإثراء). إذا لم يتوفر ultracentrifuge المضي مباشرة إلى القسم 3 (تحليل تتبع نانوحبيبات (NTA) التحديد الكمي).
ملاحظة: تخصيب اليورانيوم قبل الكسر EV يحسن القراءة النهائية في كثافة الفلورية (انظر نتائج تمثيلية و الشكل 4). يمكن تخزين المطهرة سم (من نقطة 1.8) عند 4 درجة مئوية ثم لم يعد 1-2 أيام أو بدلاً من ذلك في −80 درجة مئوية لعدة أشهر. وينبغي المجازين لإزالة أي الحطام الخلوية قبل التخزين في-80 درجة مئوية لضمان أنه لم يتم تشكيل الركام اكسوسومي في عملية تجميد أذاب 5 سم.
2-خارج الخلية حويصلات الإثراء أولتراسينتريفوجي (اختياري)
- مكان المادة طافية من الخطوة 1.8 في أنبوب ultracentrifuge جدار سميك البولي. ملء الأنبوب مع 1 × الفوسفات المالحة المخزن المؤقت (PBS) حتى تصل إلى القدرة القصوى (3.2 مل).
- تحميل عينات في دوار زاوية ثابتة تيتانيوم (8 x 3.2 مل، كعامل 13). تحميل الدوار في أولتراسينتريفوجي سطح المنضدة. أولتراسينتريفوجي في 100,000 س ز ح 3 في 4-10 درجة مئوية.
- تجاهل المادة طافية وريسوسبيند بيليه في 100 ميليلتر من 1 x PBS.
3-نانوحبيبات تتبع تحليل (NTA) التحديد الكمي
- تمييع 1 ميكروليتر من عينة (من أي خطوة أو 2.3 1.8) في ميليلتر 999 لبرنامج تلفزيوني 1 x. تحميل النموذج بحقنه 1 مل، تجنب تكوين فقاعة. تحميل المحاقن في ميناء مدخل قاعة الامتحان.
- قم بتشغيل الليزر. فتح الكاميرا مع زر التقاط . ضبط التركيز.
- سجل على الأقل 3 إطارات مختلفة من 60 ثانية كل.
- تحليل عمليات الشراء المختلفة 3 باستخدام الخيار عملية دفعية في البرنامج.
ملاحظة: إذا لم يتوفر تكنولوجيا الإدارة الوطنية للسياحة، تنفيذ إجراء تقييم كمي بروتين بمقايسة برادفورد (1 × 108 جزيئات تتوافق مع 1 – 2 ميكروغرام من البروتين الكلي بعد تنبيذ فائق أو 50-60 ميكروغرام مجموع البروتين إذا كان يتم إجراء القياس الكمي مباشرة لسم ك ويشمل البروتينات الملوثات المختلفة من EV؛ انظر الجدول 1)5.
4-نموذج إعداد
- إعداد مجموعة من أنواع الخرز التقاط 3 (CD9 الخرز والخرز CD63 CD81 الخرز في 1: نسبة 1:1؛ انظر الجدول للمواد) ودوامه.
ملاحظة: تم اختبار التجمع لتكون مستقرة لمدة شهر واحد. يمكن استخدام نوع واحد من التقاط حبة، وهذا سوف يسمح الكشف عن السكان الفرعية EV لا ديسكريمينابل مع مجموعة خرز. باستخدام مستضد واحد التقاط الخرز، فإنه سوف يكون من الممكن المعاصرة تثبت وجود بروتينات تيتراسبانين، مثل CD9، أو CD81، أو CD63، والكشف عن مستضد الاهتمام بجسم الفلورسنت. الخرز مطاط ألدهيد-كبريتات البديلة متاحة تجارياً أيضا. يقدم هذه الخرز مسعور سطح الامتزاز بالسيارات و EV. - في أنبوب أسفل جولة، إضافة حجم المقابلة في جزيئات8 1 x 10 زائد 1 ميليلتر من حبة البركة، تناظر 1.2 × 105 حبات في المجموع (بالنسبة لكل اختبار).
- إعداد أنبوب يحتوي على 1 ميليلتر من حبات دون EV بمثابة مراقبة سلبية، يشار هنا إلى "الخرز".
- ضبط حجم الصوت إلى 100 ميليلتر مع برنامج تلفزيوني x 1. ضع الأنبوبة في حرارية-خلاط، ويهز 400 لفة في الدقيقة بين عشية وضحاها في 4-10 درجة مئوية.
- في اليوم التالي، نقل العينات إلى لوحة 96-كذلك قاع جولة (أو أنابيب FC).
- إضافة الأجسام المضادة (10 ميكروغرام/مل من CD9_FITC و 10 ميكروغرام/مل من CD63_PE و 5 ميكروغرام/مل من CD81_PE).
- احتضان ح 1 في 4-10 درجة مئوية.
- إضافة 100 ميليلتر من 1 x برنامج تلفزيوني لكل بئر.
- الشروع في اقتناء.
5-اقتناء
- فتح برنامج اكتساب والبدء في الصك (سيتوميتير > "برنامج بدء تشغيل نظام"). فتح تجربة جديدة.
- إنشاء قالب تجريبي، ثم حدد لوحة ومن ثم إضافة لوحة. حدد موضع العينات على اللوحة، ثم اضغط تعيين كنموذج جيد.
- قم بإدخال اسم العينة (أي الحزب الشيوعي الصيني #1_CD9FITC) في قواعد التسمية. فتح علامة التبويب القناة والتبديل على فيتك وقنوات PE.
- تحميل اللوحة في الصك.
- اضغط على الأرض دوت وخلق مؤامرة نقطة جديدة (P1). تعيين إلى الأمام منطقة مبعثر (منتدى التعاون الأمني-أ) مقابل الجانب مبعثر-المنطقة (SSC-أ).
- حدد تهيئة للبدء الليزر وفلويديكس. اضغط الحصول البدء في اقتناء.
- ضبط مقياس لإظهار السكان في منتصف P1. في P1 رسم بوابة "الخرز" حول السكان ككل (باستثناء الحطام) (الشكل 2 أ). اضغط على التوقف.
- اضغط على الأرض دوت وخلق مؤامرة نقطة جديدة (P2). تعيين إلى الأمام مبعثر-الطول (منتدى التعاون الأمني-H) مقابل منتدى التعاون الأمني-ألف. بوابة المؤامرة نقطة جديدة في "الخرز". في P2 رسم بوابة جديدة حول السكان أكبر وتسميته "نوع" (الشكل 2A).
ملاحظة: تم تصميم هذه الاستراتيجية من أجل تجنب قدر الإمكان إدراج المجاميع الخرز في اقتناء وتحليل الخطوات. - اضغط على الأرض دوت وإنشاء قطعتي دوت مختلفة؛ فيتك واحد مقابل SSC-أ وبي واحد مقابل SSC-ألف بوابة المؤامرة نقطة جديدة على "نوع".
- حدد عدد الأحداث سجل (مثلاً من 20,000). حدد السجل وبدء التجربة.
6-بيانات التحليل
- تحميل ملفات اقتناء في تحليل البرمجيات.
ملاحظة: الخطوات التالية يجب أن يطبق على كل عينة بما في ذلك الخرز فقط وكل عينة غير معروف. - فتح بروتوكول جديد وإنشاء قطع دوت اتباع نفس الاستراتيجية هو موضح في الخطوة 5.
- تعيين كافة المحاور مبعثر على المقياس الخطي وجميع المحاور الأسفار لتسجيل النطاق.
- إظهار Fluorescence هندسي (س-جميان-مؤسسة مونتانيار) في قنوات فيتك وبي.
- حساب نسبة س-زيعني عينات/س-زيعني من الخرز الملون مع الأجسام المضادة دون اكسوسومي.
- تغيير مقارنة إضعاف مؤسسة مونتانيار مختلفة EV الإعداد.
7-خارج الخلية حويصلة رقم المعايرة
ملاحظة: المقاطع من 7 إلى 10 يمكن أن يؤديها لإعداد العدد من الجسيمات وتركيز الأجسام المضادة وخصوصية، ولكن يمكن تخطي إذا كان نوع الخلية، التي تستمد EV، والأجسام المضادة لا تزال هي نفسها.
- تمييع الجسيمات، التي تم الحصول عليها من الخطوة 2-3، في برنامج تلفزيوني 1 x للحصول على سلسلة من المعلقات التي تتراوح من 5 × 105 إلى 2.5 × 108 الجسيمات.
- لكل تعليق إضافة في أنبوب أسفل جولة 1 ميليلتر لالتقاط حبة بركة.
- يتبع البروتوكول من الخطوة 4، 3.
8-جسم المعايرة
ملاحظة: عادة ما يتم إجراء معايرة الأجسام المضادة عن طريق إضافة جسم واحد لكل أنبوبة.
- الاحتفاظ بعدد EV (مجموع الجسيمات أو محتوى البروتين) ثابتة في جميع العينات.
ملاحظة: تجريبيا يتحدد العدد المناسب كما هو موضح أعلاه في القسم 7. - يتبع البروتوكول من الخطوات 4.1 إلى 4.5.
- اختبار مجموعة من الأجسام المضادة تركيزات أعلاه وأقل من المبلغ الذي أوصت به المورد. على سبيل المثال، لجسم بتركيز مقترح من 10 ميكروغرام/مل كل اختبار، اختبار 1، 2، 5، 10، 20 و 50 ميكروغرام/مل. وتشمل عينة مع "الخرز فقط"، مشيراً إلى أن تركيز أعلى من الأجسام المضادة.
- احتضانها ح 1 في 4-10 درجة مئوية.
- إضافة 100 ميليلتر من برنامج تلفزيوني x 1 لكل عينة.
- الحصول على العينات.
9-حضانة الوقت
- تحقق من الوقت الحضانة القيام بعمليات الشراء في نقاط زمنية مختلفة (مثلاً، ح 1، ح 2 وح 5).
- يتبع البروتوكول بدءاً من الباب 4.
- احتضان عينات في 4 – 10 درجة مئوية ح 1.
- الحصول على عينات.
- احتضان عينات في 4 – 10 درجة مئوية ح 3.
- الحصول على عينات.
10-بروتوكول التحقق من الصحة
-
ربط EV
- في أنبوب أسفل جولة، إضافة حجم المقابلة للجسيمات 1 × 108 أو المبلغ المقابل للبروتين الكلي.
- ضبط حجم الصوت إلى 100 ميليلتر مع برنامج تلفزيوني x 1.
- تعطيل الغشاء EV سونيكيشن (بدلاً من ذلك خطوة صدمة حرارة يمكن تطبيقها) وفقا لإرشادات الشركة المصنعة. تعيين تواتر وكثافة. يمكن إنشاء فترة sonication تجريبيا إعداد تجربة الزمن بالطبع (أي، 0 s، 30 ثانية، 1 دقيقة، 5 دقيقة، إلخ.).
- أضف 1 ميليلتر من حبة البركة.
- يتبع البروتوكول بدءاً من الخطوة 4، 4.
-
جسم خصوصية
- إعداد أنبوب واحد لكل مفتش مترافق فلوروتشرومي وإضافة مجمع EV الخرز كما هو موضح في الخطوة 4، 6.
ملاحظة: يجب أن تطابق ايستب fluorochrome مترافق مع مفتش من الأجسام المضادة المستخدمة.
- إعداد أنبوب واحد لكل مفتش مترافق فلوروتشرومي وإضافة مجمع EV الخرز كما هو موضح في الخطوة 4، 6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
العدد الكلي للجزيئات لتلطيخ واحد
حيث يمكن ربط حبة واحدة أكثر من الجسيمات، اختبرنا الظروف المختلفة لتعيين مقدار أصغر من مجموع EV (جسم واحد كل أنبوب) للوصول إلى المرحلة المبكرة الأسية لمؤسسة مونتانيار منحنى. واستخدمت بتركيز ثابت من جسم بينما العدد الإجمالي للجسيمات التي تتراوح من 5 × 105 إلى 2.5 × 108. كما هو موضح في الشكل 3 ألف، عدد الجسيمات التي تسمح لنا بالتأكد من أن ينفذ الجسم داخل مؤسسة مونتانيار مقبولة، تجنب استخدام فائض EV، هو 1 × 108 جزيئات/التلوين.
معايرة الأضداد
نحن نخبة من تركيز مناسب من الأجسام المضادة الناشئة في إشارة أعلى منع الربط جسم غير محدد. تم تحسين هذا الاختبار للجسيمات 1 × 108 ، كما هو محدد في الإعداد السابقة. تم اختبار CD9_FITC المضادة ومكافحة CD63_PE مكافحة CD81_PE بتركيزات تتراوح بين 1 إلى 50 ميكروغرام/مل (الشكل 3B). الأجسام المضادة CD9_FITC ومكافحة CD63_PE أعطى قرار جيد من إشارة (تغيير 7.5 و 130-fold من مؤسسة مونتانيار مقابل الخرز وحدها، على التوالي) عندما يستخدم بتركيز من 10 ميكروغرام/مل مع تركيز محدد للأجسام المضادة-CD81_PE 5 ميكروغرام/مل (حظيرة 465.3 تغيير مؤسسة مونتانيار).
أسلوب التحقق من الصحة
من أجل التأكد من أن لدينا طريقة مناسبة لتحليل فقط "على شكل كأس" حويصلات خارج الخلية ولا غشاء الحطام، طبقنا الخطوات sonication مختلفة، 10 في المائة سعة، إلى الحل الذي يحتوي على جسيمات. 100 ميليلتر من 1 × الحل برنامج تلفزيوني يحتوي على 1 × 108 جزيئات خضع الخطوات سونيكيشن مختلفة من 30 ثانية إلى 5 دقائق وتم تحليل إعداد الناتج تحتوي على EV كل مقطوعة وجيدا على شكل كوصف (التجريبية بروتوكول من نقطة 3.3). نتيجة لذلك وجدنا أن إنقاص 30 ثانية سونيكيشن مؤسسة مونتانيار التي كانت ملقاة تماما بعد دقيقة واحدة. في هذا تيميبوينت، لا الأسفار الكشف عن أي من علامات EV (3D الشكل).
التدفق الخلوي توصيف المستمدة من HEK293 والحزب الشيوعي الصيني اكسوسوميس
هذه النتائج تم إنشاؤها بعد البروتوكول الواردة أعلاه باستخدام أسلوب العزل أولتراسينتريفوجي. اكسوسوميس معزولة كمياً بتكنولوجيا الإدارة الوطنية للسياحة، ومحملة 1 ميليلتر من حبات مختلطة بين عشية وضحاها (x 1 مكافحة-CD9:1 العاشر لمكافحة-CD63:1 x CD81 مكافحة). الخرز المعقدة + أكسو كانت ملطخة بكمية مناسبة من الأجسام المضادة--CD9_FITC، CD63_PE المضادة، ومكافحة--CD81_PE (الرقم 3E، و و الجدول 2).
وعلاوة على ذلك، باستخدام EV-الحزب الشيوعي الصيني أننا مقارنة تحليل FC مع أو بدون تخصيب اليورانيوم قبل واسطة تنبيذ فائق. ويبين الشكل 4 أن كلا الأسلوبين مناسبة للشخصية أكسو علامات السطحية. تخصيب اليورانيوم قبل الكسر حويصلات خارج الخلية يحسن إلى حد كبير كثافة الأسفار خاصة لCD63_PE و CD81_PE المصبوغة (الشكل 4 و الجدول 3).
رقم 1: البروتوكول والإدارة الوطنية للسياحة المؤامرات. (أ) التمثيل التخطيطي لبروتوكول تجريبي. (ب) ممثل الإدارة الوطنية للسياحة المؤامرات للخطوة مكيفة وسائط الإعلام وأولتراسينتريفوجي قبل وبعد أولتراسينتريفوجي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: تحليل البيانات واكتساب. (A) التدفق الخلوي التحليل تبدأ بإنشاء بوابة أولى لكل حبات السكان "الخرز" (باستثناء الحطام) وثم البوابة ثانية التمييز بين الأحداث "نوع". يتم عن طريق بوابة نوع في مؤامرة إعداد مع منتدى التعاون الأمني-H كالمحور السيني ومنتدى التعاون الأمني-أ كمحور y. (ب-د) قطع دوت الممثل عرض مفتاح shift الأيمن للأسفار كثافة سكان المجمعات الخرز-اكسوسوميس (أخضر، CD9 + CD63 الأحمر +؛ وبني CD81 +) إيجابية. ايستب التحكم (البنفسجي) تتداخل الخرز الملونة الرمادية السلبية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: منحنيات المعايرة لعدد الجسيمات (الأسهم بإظهار المبلغ المحدد للجسيمات، 1 x 108)- (أ) تركيزات الأجسام المضادة (تبين الأسهم التركيز المحدد لكل استخدام الأجسام المضادة). (ب) عدد كلا من الجسيمات والأجسام المضادة تركيز هي الأرض مقابل fluorescence متوسط الكثافة (MFI). (ج) منحنى عرض اقتناء مختلف 3 إعداد مع ح 1 – 2 أو ح 5 جسم الحضانة. (د) منحنى عرض انخفاض الأسفار بعد سونيكيشن في نقاط زمنية مختلفة. (ه-و) أمثال التغيير (يعني ± SD) لمؤسسة مونتانيار لمقابل CD9 و CD63 و CD81 تظهر المراقبة السلبية (الخرز + الأجسام المضادة، لا EV) ل HEK293 EV (ن = replicates المستقلة 3) وللحزب الشيوعي الصيني EV (n = 3 خطوط الخلايا الأولية من 3 مرضى مختلفين) من فضلك انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من وهذا الرقم-
الشكل 4: مؤسسة مونتانيار التحليل والمقارنة بين إجراءين: المباشر EV-الربط مع الخرز (التقاط الخرز العزلة) وتخصيب اليورانيوم قبل مع أولتراسينتريفوجي (Ultracentrifuge العزلة). وتظهر بيانات شكل أمثال التغيير (يعني ± SD) لمؤسسة مونتانيار CD9 (A) و (ب) CD63 CD81 (ج) مقابل السيطرة السلبية (الخرز + الأجسام المضادة، لا EV). N = 3 خطوط الخلايا الأولية من 3 مرضى مختلفين. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| الحزب الشيوعي الصيني | الإدارة الوطنية للسياحة الزيركونيم (جزء/ميليلتر) | الزيركونيم (ميكروغرام/ميليلتر) |
| الحزب الشيوعي الصيني #1 أولتراسينتريفوجي قبل | 5.02E + 06 | 2.01 |
| الحزب الشيوعي الصيني #1 أولتراسينتريفوجي بعد | 6.10E + 07 | 1.04 |
| الحزب الشيوعي الصيني #2 أولتراسينتريفوجي قبل | 5.74E + 06 | 2.30 |
| الحزب الشيوعي الصيني #2 أولتراسينتريفوجي بعد | 7.43E + 07 | 0.79 |
| الحزب الشيوعي الصيني #3 أولتراسينتريفوجي قبل | 2.02E + 06 | 1.90 |
| الحزب الشيوعي الصيني #3 أولتراسينتريفوجي بعد | 2.91E + 07 | 0.42 |
الجدول 1: مقارنة بين تركيز الإدارة الوطنية للسياحة، وتركيز البروتين للمريض 3 مختلفة مشتقة الحزب الشيوعي الصيني قبل وبعد أولتراسينتريفوجي.
| أمثال التغيير لمؤسسة مونتانيار ± SD | CD9 | CD63 | CD81 |
| HEK293 | 24.44 ± 19.17 | 430.7 ± 344.9 | 535.2 ± 410.3 |
| الحزب الشيوعي الصيني #1 | 14.15 ± 3.72 | 236.05 ± 43.40 | 353.30 ± 452.43 |
| الحزب الشيوعي الصيني #2 | 15.76 ± 1.87 | 983.06 ± 195.63 | 374.45 ± 108.05 |
| الحزب الشيوعي الصيني #3 | 8.94 ± 7.19 | 830.50 ± 184.73 | 60.05 ± 23.18 |
الجدول 2: قيمة التغيير إضعاف (يعني ± SD) لمؤسسة مونتانيار ل HEK293 EV (n = 3 replicates المستقلة) والحزب الشيوعي الصيني EV (n = 3 خطوط الخلايا الأولية من 3 مرضى مختلفين).
| أمثال التغيير لمؤسسة مونتانيار ± SD | LDV | CD63 | CD81 |
| التقاط حبات العزلة | 2.96 ± 1.45 | 65.65 ± 18.87 | 21.85 ± 6.12 |
| العزلة أولتراسينتريفوجي | 7.47 ± 2.71 | 236.00 ± 25.06 | 65.05 ± 13.38 |
الجدول 3: قيمة التغيير حظيرة لمؤسسة مونتانيار (يعني ± SD) للحزب الشيوعي الصيني EV (n = 3 خطوط الخلايا الأولية من مرضى مختلفين 3) معزول بواسطة التقاط الخرز أو أولتراسينتريفوجي.
الجدول 4: مواصفات المنتج واحدة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ويظل التقليدية FC تقنية الأسلوب التحليلي الأكثر مباشرة لتوصيف علامات على السطح EV وأعرب عن. وفي هذا الصدد، تحديد بروتوكول أنسب أمر حاسم للحصول على معلومات مفيدة عن الكسور الجسيمات الفردية للاهتمام بتجنب القيود بسبب حساسية الصك. وصفت لنا طريقة استخدام الجسيمات المغناطيسية مقترنة بالأجسام المضادة التي تعترف أكسو والمستضدات السطحية EV الصغيرة التي تصلح للتطبيق FC المتلقين للمعلومات. علينا التحقق من أن أسلوب استخدام نوعين من خلايا مختلفة: الحزب الشيوعي الصيني البشرية الأولية التي أخذت في الظهور كمصدر خلية رئيسية للنهج العلاجية المستندة إلى أكسو لأمراض القلب؛ وخلايا HEK293، خط خلية مخلدة تستخدم على نطاق واسع في بحوث علم الأحياء الخلية بسبب نمو الخلايا موثوقة واللدونه.
الطريقة يمكن تطبيقها على إثراء ultracentrifuge EV و، لتحليل أسرع، أيضا مباشرة في المختبر في الخلية-المستمدة سم مع لا تخصيب اليورانيوم قبل واسطة تنبيذ فائق. انطلاق المواد أمر بالغ الأهمية عند مقارنة عينات. إضافة التقاط الخرز مباشرة إلى مجلس الوزراء سوف سرعة الإجراء ولكن في نفس الوقت تقليل كثافة الأسفار، كما هو مبين في الشكل 4A. من المهم أيضا لاستخدام مبلغ مناسب لبرنامج تلفزيوني لمزيج الخرز و EV أثناء الخطوة "الالتقاط" 4.4. عند استخدام وقت حضانة ثابتة، ستنخفض زيادة حجم كثافة الأسفار بسبب عدم كفاءة EV اقتران.
حد من البروتوكول أن حبة التقاط واحدة يمكن ربط متعددة EV/أكسو الجسيمات على سطحه. وسيحد هذا إمكانية تحديد مجموعات فرعية EV معربا عن تركيبة غريبة من مولدات المضادات التي تستخدم تلطيخ متعددة. ولهذا الأسلوب القائم على حبة غلة البيانات شبه كمي. استخدام الخرز تحمل أساسها التقاط واحد (CD9 أو CD63 أو CD81) سوف تسمح بأقصى توصيف الجسيمات التي تعبر عن اثنين [ابيتوبس]: الكشف عن أحد الحاضرين على حبة والمعترف بها بجسم الالتقاط وواحد من الأجسام المضادة التي يتم وأضاف في وقت لاحق.
معيار الذهب الحالي لاكسو تحليلات استخدام FC بروتوكول وضعت بها فإن دير Vlist et al في عام 201215. أنها تسمح لتحليل الاستبانة لقيمة المنشأة باستخدام تكوين أمثل لنادي الراقية المتاحة تجارياً (مثلاً، تدفق دينار بحريني). هذا البروتوكول هو مفصلة للغاية ومفيدة ولكن لا يزال بحاجة إعداد أجهزة معقدة مع المعايرة FC محددة قبل استخدام. بعد ثلاث سنوات، اقترح بوسبيتشالوفا et al.16 بروتوكول مبسط لتحليل FC لاكسو استخدام cytometer مكرسة خصيصا لتحليل الجزيئات الصغيرة (مثلاً، الأوج A50 الصغرى)17. فيما يتعلق بهذا البروتوكول وغيرها التي استخدمت في إعداد عتبة الخاصة11، وهنا نقترح بروتوكول أساسي لأداء صغيرة EV phenotyping استخدام الخرز ملزمة المغناطيسية التي هي مناسبة للصكوك FC التقليدية ولا تتطلب أي الإعداد الخاصة. وقد وصف بروتوكولات مختلفة الأساليب المستندة إلى حبة لتوصيف EV الصغيرة الموجودة في سوائل الجسم بنادي12. هنا، نعرض إيمونوكابتوري السكان الفرعية المنفصلة من حويصلات إيجابية ل CD9 و CD63 و CD81 التي تستخدم عادة ك علامات أكسو18. ألدهيد-كبريتات مطاط19،20 والبوليستيرين12حبات تبقى بدائل صالحة لربط EV في سم وبلازما الدم السائل؛ ومع ذلك، تمكين ألدهيد المجموعات المعرضة على سطح الجسيمات البوليمر اقتران غير محدد من البروتينات وغيرها من المواد إلى جزيئات المطاط، مما يزيد من خطر التلوث بهيئات بروتين دهني أو أبوبتوتيك أثناء العزل والكشف عن عملية21،22.
ربط الخرز المستخدمة في البروتوكول EV كامل فقط، على شكل جيد. فاقترحنا لتعطيل هيكل EV سونيكيشن إخماد الإشارة (الباب 4، "بروتوكول التحقق من الصحة"). وفي الواقع، دقيقة واحدة من نتائج سونيكيشن في الأسفار تناقص كثافة، مما يدل على أن إشارة إيجابية لا يمكن أن تتأثر بالحطام غشاء تمتز على الخرز.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
شيء يعلن عنه.
Acknowledgments
وأيد L.B. المنح البحثية هلموت هورتين ستيفتونغ وفيلا شتيفتونغ، زيوريخ (سويسرا). وأيده كل المنح البحثية لمؤسسة العلوم الوطنية السويسرية، ومؤسسة سيسيليا-أوغوستا، لوغانو، و "الشيخ ستيفتونغ" für هيرز أوند كريسلاوفكرانخيتين (سويسرا)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IMDM | Gibco | 12440061 | |
| Amicon Ultra-15, PLHK Ultracel-PL Membran, 100 kDa | Millipore | UFC910024 | |
| CytoFlex, Flow Cytometer Platform | Beckman Coulter | CytoFlex | |
| DMEM, high glucose, HEPES, no phenol red | Gibco | 21063045 | |
| Dulbecco's PBS (PBS) Ca- and Mg-free | Lonza | BE17-512F | |
| ExoCap CD63 Capture Kit | JSR Life Sciences | Ex-C63-SP | |
| ExoCap CD81 Capture Kit | JSR Life Sciences | Ex-C81-SP | |
| ExoCap CD9 Capture Kit | JSR Life Sciences | Ex-C9-SP | |
| Exosome-Depleted FBS | Thermofisher | A2720801 | |
| Exosome-depleted FBS Media Supplement | SBI | EXO-FBS-250A-1 | |
| FBS-Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270106 | |
| FITC anti-human CD9 Antibody | Biolegend | 312104 RRID: AB_2075894 | |
| Flow Cytometer analysis software | Beckman Coulter | Kaluza | |
| NanoSight LM10 | Malvern | NanoSight LM10 | |
| NanoSight Software | Malvern | NTA 2.3 | |
| Optima Max-XP | Beckman Coulter | 393315 | |
| PE anti-human CD63 Antibody | Biolegend | 353004 RRID:AB_10897809 | |
| PE anti-human CD81 (TAPA-1) Antibody | Biolegend | 349505 RRID:AB_10642024 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Thermomixer C | Eppendorf | 5382 000 015 | |
| TLA-110 | Beckman Coulter | TLA-110 rotors |
References
- Barile, L., Vassalli, G. Exosomes: Therapy delivery tools and biomarkers of diseases. Pharmacology & Therapeutics. , (2017).
- Thery, C. Exosomes: secreted vesicles and intercellular communications. Molecular Biology Reports. 3, 15 (2011).
- Yadav, D. K., et al. Liquid biopsy in pancreatic cancer: the beginning of a new era. Oncotarget. 9, 26900-26933 (2018).
- Balbi, C., et al. First Characterization of Human Amniotic Fluid Stem Cell Extracellular Vesicles as a Powerful Paracrine Tool Endowed with Regenerative Potential. Stem Cells Translational Medicine. 6, 1340-1355 (2017).
- Andriolo, G., et al. Exosomes From Human Cardiac Progenitor Cells for Therapeutic Applications: Development of a GMP-Grade Manufacturing Method. Frontiers in Physiology. 9, (2018).
- Lai, R. C., et al. Exosome secreted by MSC reduces myocardial ischemia/reperfusion injury. Stem Cell Research. 4, (2009).
- Doeppner, T. R., et al. Extracellular Vesicles Improve Post-Stroke Neuroregeneration and Prevent Postischemic Immunosuppression. Stem Cells Translational Medicine. 4, 1131-1143 (2015).
- Kordelas, L., et al. MSC-derived exosomes: a novel tool to treat therapy-refractory graft-versus-host disease. Leukemia. 28, 970-973 (2014).
- Barile, L., et al. Extracellular vesicles from human cardiac progenitor cells inhibit cardiomyocyte apoptosis and improve cardiac function after myocardial infarction. Cardiovascular Research. 103, 530-541 (2014).
- Longatti, A., et al. High affinity single-chain variable fragments are specific and versatile targeting motifs for extracellular vesicles. Nanoscale. 10, 14230-14244 (2018).
- Menck, K., Bleckmann, A., Schulz, M., Ries, L., Binder, C. Isolation and Characterization of Microvesicles from Peripheral Blood. Journal of Visualized Experiments. , (2017).
- Inglis, H., Norris, P., Danesh, A. Techniques for the analysis of extracellular vesicles using flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. , (2015).
- Arakelyan, A., et al. Flow Virometry to Analyze Antigenic Spectra of Virions and Extracellular Vesicles. Journal of Visualized Experiments. , (2017).
- Chimenti, I., et al. Isolation and expansion of adult cardiac stem/progenitor cells in the form of cardiospheres from human cardiac biopsies and murine hearts. Methods Molecular Biology. 879, 327-338 (2012).
- van der Vlist, E. J., Nolte-'t Hoen, E. N., Stoorvogel, W., Arkesteijn, G. J., Wauben, M. H. Fluorescent labeling of nano-sized vesicles released by cells and subsequent quantitative and qualitative analysis by high-resolution flow cytometry. Nature Protocols. 7, 1311-1326 (2012).
- Pospichalova, V., et al. Simplified protocol for flow cytometry analysis of fluorescently labeled exosomes and microvesicles using dedicated flow cytometer. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 25530 (2015).
- van der Pol, E., et al. Particle size distribution of exosomes and microvesicles determined by transmission electron microscopy, flow cytometry, nanoparticle tracking analysis, and resistive pulse sensing. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 12, 1182-1192 (2014).
- Witwer, K. W., et al. Updating the MISEV minimal requirements for extracellular vesicle studies: building bridges to reproducibility. Journal of Extracellular Vesicles. 6, 1396823 (2017).
- Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Current Protocols in Cellular Biology. , Chapter 3, Unit 3.22 (2006).
- Suarez, H., et al. A bead-assisted flow cytometry method for the semi-quantitative analysis of Extracellular Vesicles. Scientific Reports. 7, 11271 (2017).
- Sodar, B. W., et al. Low-density lipoprotein mimics blood plasma-derived exosomes and microvesicles during isolation and detection. Scientific Reports. 6, 24316 (2016).
- Sluijter, J. P. G., et al. Extracellular vesicles in diagnostics and therapy of the ischaemic heart: Position Paper from the Working Group on Cellular Biology of the Heart of the European Society of Cardiology. Cardiovascular Research. 114, 19-34 (2018).
