Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

कोशिका-वातानुकूलित मीडिया से Extracellular बुलबुले के प्रवाह Cytometric विश्लेषण

Published: February 12, 2019 doi: 10.3791/59128
Automatic Translation
*1, *1, 1,2,3, 1
1Cellular and Molecular Cardiology Laboratory, Cardiocentro Ticino Foundation, Switzerland, 2Molecular Cardiology Institute, Dept. of Cardiology, University of Zürich, 3Faculty of Biomedical Science, Università Svizzera Italiana, Switzerland
* These authors contributed equally

Summary

प्रोटोकॉल छोटे extracellular बुलबुले (EV) पर सतह epitopes का पता लगाने के लिए सेल कल्चर supernatants के साथ प्रयोग के लिए तैयार एक reproducible विधि का वर्णन करता है । यह विशिष्ट EV immunoprecipitation एंटीबॉडी कि सतह प्रतिजन CD9, CD63, और CD81 पहचान के साथ मिलकर मोतियों का उपयोग कर इस्तेमाल करता है । विधि बहाव प्रवाह cytometry विश्लेषण के लिए अनुकूलित है ।

Abstract

फ्लो cytometry (एफसी) सेल-सतह प्रतिजन मार्कर के अर्द्ध मात्रात्मक माप के लिए पसंद की विधि है । हाल ही में, इस तकनीक को परिधीय रक्त और अन्य शरीर के तरल पदार्थ में exosomes (Exo) सहित extracellular बुलबुले (EV) के phenotypic विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया गया है । EV जनादेश के छोटे आकार 50-100 एनएम के आसपास एक का पता लगाने दहलीज होने समर्पित उपकरणों का उपयोग करें । वैकल्पिक रूप से, EV लेटेक्स microbeads के लिए बाध्य किया जा सकता है कि एफसी द्वारा पता लगाया जा सकता है । Microbeads, एंटीबॉडी के साथ संयुग्मित जो ev-संबद्ध मार्करों/Cluster of विभेद CD63, CD9, और CD81 का इस्तेमाल ev कैप्चर के लिए किया जा सकता है । सेमी से पृथक Exo के साथ या पूर्व संवर्धन के बिना ultracentrifugation द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है । यह दृष्टिकोण EV विश्लेषण पारंपरिक एफसी उपकरणों का उपयोग करने के लिए उपयुक्त है । हमारे परिणाम प्रतिदीप्ति तीव्रता (MFI) मूल्यों और EV एकाग्रता मतलब के बीच एक रैखिक सहसंबंध प्रदर्शित करता है । इस विधि झिल्ली मलबे का पता नहीं लगाता है, यह दर्शाता है कि sonication के माध्यम से EV नाटकीय रूप से कम MFI में खलल न डालें । हम EV surface एंटीजन के विश्लेषण के लिए एक सटीक और विश्वसनीय विधि की रिपोर्ट करते हैं, जिसे किसी भी प्रयोगशाला में आसानी से लागू किया जा सकता है ।

Introduction

कोशिकाओं microvesicles (एमवी) और exosomes (Exo) सहित विभिन्न आकारों के extracellular बुलबुले (EV) स्रावित । बाद दोनों आकार और मूल के उपसेलुलर डिब्बे से एमवी से प्रतिष्ठित किया जा सकता है । एमवी (200 – आकार में 1000 एनएम) प्लाज्मा झिल्ली से बहा द्वारा माता पिता की कोशिकाओं से जारी कर रहे हैं । इसके विपरीत, Exo (30-150 एनएम) endosomal झिल्ली से शुरू होता है और extracellular अंतरिक्ष में जारी किए जाते है जब multivesicular शरीर (MVB) सेल झिल्ली1,2के साथ फ्यूज ।

EV तेजी से नैदानिक के रूप में के रूप में अच्छी तरह के रूप में उपयोग किया जाता है, संभवतः, कैंसर विज्ञान, तंत्रिका विज्ञान, कार्डियोलोजी, और पुराने ऑस्टियोआर्थराइटिस3,4,5सहित कई क्षेत्रों में चिकित्सीय उपकरण । चल रहे अध्ययनों का एक विशाल बहुमत चिकित्सीय एजेंटों के रूप में EV का उपयोग सेल से बुलबुले के अलगाव का फायदा उठाने के वातानुकूलित माध्यम (सेमी) इन विट्रो में प्रसंस्कृत कोशिकाओं । Mesenchymal स्टेम सेल (MSCs) कई संदर्भों में लाभकारी प्रभाव डालती है, और एमएससी-व्युत्पंन EV के मॉडल में लाभ दिखाया गया है रोधगलन/reperfusion चोट6 और मस्तिष्क चोट7। एमएससी-व्युत्पंन EV भी प्रतिरक्षा modulatory गतिविधियों है कि प्रतिरक्षा अस्वीकृति के इलाज के लिए शोषण किया जा सकता है प्रदर्शन, के रूप में चिकित्सा के एक मॉडल में प्रदर्शन-दुर्दम्य भ्रष्टाचार बनाम-मेजबान रोग8। एमनियोटिक द्रव स्टेम कोशिकाओं (hAFS) सक्रिय रूप से MVs और Exo के साथ सेमी समृद्ध, विषम रूप से आकार में वितरित (50-1000 एनएम), जो इस तरह के विभेदित कोशिकाओं के प्रसार के रूप में कई जैविक प्रभाव, मध्यस्थता, angiogenesis, फाइब्रोसिस के निषेध, और cardioprotection4. हम हाल ही में दिखाया है कि EV, और विशेष रूप से Exo, मानव कार्डियक द्वारा स्रावित जनक कोशिकाओं (Exo-सीपीसी) चूहों में infarct आकार कम रोधगलन5,9.

Exo tetraspanins (CD63, CD81, CD9) और प्रमुख histocompatibility जटिल वर्ग मैं (MHC-i) सहित, उनकी सतह पर प्रोटीन का एक आम सेट साझा करें । प्रोटीन के इस आम सेट के अलावा, Exo भी उत्पादक सेल प्रकार के EV सबसेट के लिए विशिष्ट प्रोटीन होते हैं । Exo मार्करों सर्वोपरि महत्व प्राप्त कर रहे है क्योंकि वे अंतर में एक महत्वपूर्ण भूमिका सेलुलर संचार, जिससे कई जैविक प्रक्रियाओं को विनियमित5,10। क्योंकि उनके छोटे आकार के, एक आसान तरीका है EV शास्त्रीय प्रवाह cytometry (एफसी) का उपयोग कर एक चुनौतीपूर्ण कार्य रहता है खोज ।

यहां, हम EV एफसी का उपयोग कर विश्लेषण के लिए एक सरलीकृत प्रोटोकॉल मौजूद है, जो ultracentrifugation के माध्यम से या सीधे सेमी (चित्रा 1) के माध्यम से प्राप्त पूर्व समृद्ध नमूनों के लिए लागू किया जा सकता है । विधि अतिरिक्त बहाकर बिना विहित Exo-संबद्ध सतह epitopes (CD63, CD9, CD81) बांधता है कि एक विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ लेपित मोतियों का उपयोग करता है । एफसी विश्लेषण समायोजन के लिए कोई ज़रूरत नहीं माप से पहले के साथ एक पारंपरिक cytometer का उपयोग किया जा सकता है । प्रतिजनों के लक्षण वर्णन के लिए विधियां अलग छोटे प्रवाह cytometers का उपयोग कर कणों पर विभिंन अनुप्रयोगों के संबंध में अंय समूहों द्वारा वर्णित किया गया है11,12,13। यहां, हम छोटे कणों और Exo, एफसी द्वारा कब्जा कर लिया कणों के phenotyping के बाद के कब्जा के लिए कार्यात्मक चुंबकीय मोतियों का इस्तेमाल किया । हालांकि इस विधि के लिए छोटे इन विट्रो में किसी भी कोशिका प्रकार द्वारा जारी बुलबुले की प्रतिजनी संरचना विशेषताएं इस्तेमाल किया जा सकता है, यहां हम विशिष्ट सेल संस्कृति की स्थिति है कि मानव कार्डियक जनक कोशिकाओं की संस्कृति के लिए आवेदन (सीपीसी) प्रदान की और सबसे इन कोशिकाओं द्वारा EV के उत्पादन के लिए उपयुक्त वातावरण ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. वातानुकूलित मीडिया का संग्रह और संसाधन

  1. कोट ५५ cm2 पंजाबियों में ०.०२% सुअर का त्वचा जिलेटिन के साथ पेट्री व्यंजन ।
  2. प्लेट सीपीसी (8000/सेमी2) है Iscove संशोधित Dulbecco मध्यम (IMDM) के 7 मिलीलीटर के साथ पूर्व में लेपित व्यंजन 20% FBS (भ्रूण गोजातीय सीरम) और 1% पेनिसिलिन/Streptomycin (पी/एस) के साथ पूरक ।
    नोट: शब्द "सीपीसी" मानव explant व्युत्पंन कोशिकाओं है कि14कहीं वर्णित किया गया है को संदर्भित करता है । मुख्यमंत्री विभिंन कोशिका विशिष्ट संस्कृति की स्थिति में संस्कृति प्रकार से एकत्र किया जा सकता है । दस्ताने पहनते है और एक जैविक डाकू के तहत काम करते हैं ।
  3. एक बार कोशिकाओं के बारे में ८०% संगम तक पहुंचने, संस्कृति माध्यम निकालें, Dulbecco के पंजाबियों (पंजाब) सीए के साथ दो बार कोशिकाओं को धो-और एमजी-मुक्त और सीरम मुक्त Exo-उत्पादन मध्यम (Dulbecco के संशोधित ईगल मध्यम [DMEM] उच्च ग्लूकोज के 10 मिलीलीटर के साथ की जगह, ४.५ ग्राम/
    नोट: संस्कृति के माध्यम में सीरम एकाग्रता की एक प्रगतिशील कमी के साथ आगे बढ़ें, धीरे से सीरम मुक्त हालत (एस एफ) के लिए कोशिकाओं को अनुकूलित करने के लिए । सीरम मुक्त माध्यम के लिए संवेदनशील हैं कि कोशिकाओं के लिए FBS युक्त एक माध्यम तैयार लेकिन EV के समाप्त. तैयार मध्यम सभी पोषक तत्वों के साथ पूरक, प्लस 10% – 20% (v/v) FBS । १००,००० × जी, 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर मध्यम केंद्रापसारक । ध्यान रखें कि इस कार्यविधि FBS-व्युत्पंन EV के १००% हटाने की गारंटी नहीं है ।
  4. 7 दिनों के बाद, एक के रूप में सेमी केंद्रापसारक ट्यूबों लीजिए ।
    नोट: मध्यम कंडीशनिंग के लिए समय कक्ष प्रकार पर निर्भर करता है । उन कक्षों के लिए जो सीरम-मुक्त माध्यम के प्रति संवेदनशील होते हैं, मध्यम की आरंभिक मात्रा बढ़ाते हैं और मुख्यमंत्री संग्रह के लिए समय को 24-48 ज में घटाएँ.
  5. 4-10 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए ३,००० x g पर केंद्रापसारक द्वारा सेल मलबे से स्पष्ट मुख्यमंत्री । एक १०० केडीए केंद्रापसारक फ़िल्टर ट्यूब में supernatant लीजिए.
  6. 4-10 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए २,००० x g पर ट्यूब कताई द्वारा मुख्यमंत्री को मंजूरी दे दी ।
    नोट: यह कदम उच्च गति केंद्रापसारक कदम के लिए छोटे मात्रा ट्यूबों के उपयोग की अनुमति सेमी की प्रारंभिक मात्रा कम हो जाएगा और छोटे प्रोटीन समुच्चय को खत्म करने में योगदान देगा ।
  7. एक microcentrifuge ट्यूब में ध्यान लीजिए । 15 मिनट के लिए 4-10 डिग्री सेल्सियस पर १०,००० x g पर केंद्रापसारक ।
  8. supernatant लीजिए और धारा 2 (EV संवर्धन) के लिए आगे बढ़ें । यदि कोई ultracentrifuge उपलब्ध नहीं है, तो सीधे अनुभाग 3 (Nanoparticle ट्रैकिंग विश्लेषण (ंत्) ठहराव) पर जाएं ।
    नोट: EV अंश के पूर्व संवर्धन प्रतिदीप्ति तीव्रता में अंतिम पठन-आउट को बेहतर बनाता है (प्रतिनिधि परिणाम और 4 चित्रादेखें) । साफ सेमी (प्वाइंट १.८ से) 4 ° c में अब तो 1-2 दिन या वैकल्पिक रूप से − 80 डिग्री सेल्सियस पर कई महीनों के लिए संग्रहित किया जा सकता है । 5 सेमी पूर्व--80 ° c में भंडारण से पहले किसी भी सेलुलर मलबे को दूर करने के लिए सुनिश्चित करें कि exosome आकार का मलबा फ्रीज-गल प्रक्रिया में नहीं बनाई गई है के लिए मंजूरी दे दी जानी चाहिए ।

2. Ultracentrifuge द्वारा Extracellular बुलबुले संवर्धन (वैकल्पिक)

  1. एक पाली कार्बोनेट मोटी दीवार ultracentrifuge ट्यूब में कदम १.८ से supernatant प्लेस । 1x फॉस्फेट बफर खारा (पंजाब) के साथ ट्यूब भरें जब तक यह अधिक से अधिक क्षमता (३.२ एमएल) तक पहुंचता है ।
  2. एक टाइटेनियम निश्चित कोण रोटर (8 x ३.२ एमएल, k-फैक्टर 13) में नमूने लोड । एक तालिका के ultracentrifuge में रोटर लोड । Ultracentrifuge पर 3 ज के लिए १००,००० x g पर 4 – 10 ° c.
  3. supernatant त्यागें और १०० µ में गोली resuspend 1x पंजाब के एल ।

3. Nanoparticle ट्रैकिंग विश्लेषण (ंत्) ठहराव

  1. नमूना के 1 µ एल पतला (या तो कदम २.३ या १.८ से) ९९९ µ में 1x पंजाब के एल । एक 1 मिलीलीटर सिरिंज में नमूना लोड, बुलबुला गठन से परहेज । परीक्षा कक्ष के प्रवेश बंदरगाह में सिरिंज लोड ।
  2. लेजर चालू करें । कैप्चर बटन के साथ कैमरा खोलें । फ़ोकस समायोजित करें ।
  3. ६० s प्रत्येक के कम से कम 3 अलग फ्रेम रिकॉर्ड ।
  4. सॉफ्टवेयर में बैच प्रक्रिया विकल्प का उपयोग कर 3 अलग अधिग्रहण का विश्लेषण ।
    नोट: यदि ंत् प्रौद्योगिकी उपलब्ध नहीं है, ब्रैडफोर्ड परख द्वारा एक प्रोटीन ठहराव प्रदर्शन (1 x 108 कणों के अनुरूप 1 – 2 µ g कुल प्रोटीन के ultracentrifugation के बाद या करने के लिए 50 – 60 µ g कुल प्रोटीन अगर ठहराव सीधे के रूप में मुख्यमंत्री के लिए किया जाता है यह प्रोटीन EV से अलग दूषित पदार्थों में शामिल; तालिका 1देखें)5.

4. नमूना तैयारी

  1. कब्जा मोती के 3 प्रकार के एक पूल तैयार (CD9 मोती, CD63 मोती, और एक 1:1:1 अनुपात में CD81 मोती; सामग्री की तालिकादेखें) और भंवर ।
    नोट: पूल 1 महीने के लिए स्थिर होने का परीक्षण किया गया है । पर कब्जा मनका का एक प्रकार का इस्तेमाल किया जा सकता है, यह EV उप का पता लगाने की अनुमति होगी, मोतियों की पूल के साथ discriminable नहीं आबादी । एकल प्रतिजन पर कब्जा मोतियों का उपयोग करके, यह समकालीन करने के लिए संभव हो जाएगा tetraspanin प्रोटीन की उपस्थिति प्रदर्शन, जैसे CD9, CD81, या CD63, और फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी द्वारा पता चला ब्याज की प्रतिजन । वैकल्पिक एल्डिहाइड-सल्फेट लेटेक्स मोती भी व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं । एमवी और EV के सोखना के लिए इन मोतियों वर्तमान hydrophobic सतह ।
  2. एक दौर में नीचे ट्यूब, 1 x 108 कणों से अधिक 1 मनका पूल के µ एल, इसी में १.२ x 105 मोती के लिए इसी मात्रा की मात्रा में जोड़ें (प्रत्येक परीक्षण के लिए) ।
  3. एक ट्यूब के लिए EV कि नकारात्मक नियंत्रण के रूप में काम करेंगे बिना मोतियों की 1 µ एल युक्त, इसके द्वारा "मोतियों" के रूप में भेजा ।
  4. 1x पंजाबियों के साथ १०० µ l को वॉल्यूम समायोजित करें । एक थर्मामीटरों-मिक्सर में ट्यूब प्लेस, और 4-10 डिग्री सेल्सियस पर रात भर ४०० rpm पर हिला ।
  5. अगले दिन, एक गोल नीचे ९६-अच्छी तरह से थाली (या एफसी ट्यूबों) के लिए नमूने ले जाएं ।
  6. जोड़ें एंटीबॉडी (10 µ g/ml ऑफ़ CD9_FITC, 10 µ g/ml ऑफ़ CD63_PE, और 5 µ g/ml of CD81_PE).
  7. 4-10 डिग्री सेल्सियस पर 1 ज मशीन ।
  8. प्रत्येक अच्छी तरह से 1x पंजाबियों के १०० µ एल जोड़ें ।
  9. अधिग्रहण के लिए आगे बढ़ें ।

5. अधिग्रहण

  1. अधिग्रहण सॉफ्टवेयर खोलें और साधन शुरू (Cytometer > प्रणाली स्टार्टअप कार्यक्रम) । कोई नया प्रयोग खोलें ।
  2. एक प्रयोगात्मक टेम्पलेट बनाएँ, फिर थाली का चयन करें और फिर थाली जोड़ें। प्लेट पर नमूनों की स्थिति का चयन करें और फिर नमूना के रूप में अच्छी तरह से सेटदबाएँ.
  3. नामकरण नियमोंमें नमूना नाम (यानी सीपीसी # 1_CD9FITC) दर्ज करें । चैनल टैब खोलें और FITC और पीई चैनल पर स्विच करें ।
  4. यंत्र में थाली लोड ।
  5. डॉट प्लॉट दबाएँ और एक नया डॉट प्लॉट (P1) बनाएँ । फॉरवर्ड स्कैटर क्षेत्र (FSC-a) बनाम साइड स्कैटर-क्षेत्र (SSC-a) सेट करें.
  6. का चयन करें प्रारंभ करने के लिए लेज़र और fluidics । अधिग्रहण शुरू करने के लिए अधिग्रहण दबाएं ।
  7. जनसंख्या P1 के बीच में दिखाने के लिए स्केल समायोजित करें । P1 में पूरी आबादी के आसपास "मोती" गेट ड्रा (मलबे को छोड़कर) (चित्रा 2a) । प्रेस बंद करो।
  8. डॉट प्लॉट दबाएँ और एक नया डॉट प्लॉट (P2) बनाएँ । सेट आगे तितर बितर-ऊंचाई (FSC-एच) बनाम FSC-A । गेट पर नई डॉट साजिश "मनका." P2 में बड़ी आबादी के आसपास एक नया गेट ड्रा और यह नाम "SINGLETS" (चित्रा 2a).
    नोट: इस रणनीति के रूप में संभव के रूप में दोनों अधिग्रहण और विश्लेषण चरणों में मोती समुच्चय के शामिल किए जाने से बचने के लिए बनाया गया है ।
  9. प्रेस डॉट साजिश और दो अलग डॉट भूखंड बनाने के लिए; एक FITC बनाम एसएससी-ए और एक पे बनाम एसएससी-ए । गेट पर नया डॉट प्लॉट "SINGLETS."
  10. रिकॉर्ड करने के लिए ईवेंट्स की संख्या का चयन करें (उदा., २०,०००) । रिकॉर्ड चुनें और प्रयोग शुरू करें ।

6. डेटा विश्लेषण

  1. विश्लेषण सॉफ़्टवेयर में प्राप्ति फ़ाइलें लोड ।
    नोट: निंन चरणों का पालन केवल और हर अज्ञात नमूना मोती सहित हर नमूने के लिए लागू किया जाना है ।
  2. एक नया प्रोटोकॉल खोलें और एक ही चरण 5 में वर्णित रणनीति के बाद डॉट भूखंडों बनाएं ।
  3. सभी स्कैटर अक्षों को रेखीय स्केल और सभी प्रतिदीप्ति अक्षों को स्केल लॉग करने के लिए सेट करें ।
  4. FITC और पीई चैनलों में प्रतिदीप्ति ज्यामितीय माध्य (X-Gmean-MFI) दिखाएं ।
  5. अनुपात की गणना x-g नमूनों कामाध्य /exosome बिना एंटीबॉडी से सना हुआ मोतियों का x-g माध्य.
  6. अलग EV तैयारी के गुना परिवर्तन MFI की तुलना करें ।

7. Extracellular पुटिका संख्या अनुमापन

नोट: वर्गों 7 करने के लिए 10 कणों की संख्या, एंटीबॉडी एकाग्रता और विशिष्टता स्थापित करने के लिए प्रदर्शन किया जा सकता है, लेकिन अगर सेल प्रकार, जिसमें से EV प्राप्त कर रहे हैं, और एंटीबॉडी एक ही रह रहे हैं छोड़ दिया जा सकता है ।

  1. कण पतला, २.३ कदम से प्राप्त, 1x पंजाब में 5 x 105 से २.५ x 108 कणों से लेकर निलंबन की एक श्रृंखला प्राप्त करने के लिए ।
  2. प्रत्येक निलंबन के लिए कब्जा मनका पूल के एक दौर में नीचे ट्यूब 1 µ एल में जोड़ें ।
  3. ४.३ चरण से प्रोटोकॉल का पालन करें ।

8. एंटीबॉडी अनुमापन

नोट: एंटीबॉडी अनुमापन आमतौर पर प्रत्येक ट्यूब के लिए एक एकल एंटीबॉडी जोड़कर किया जाता है ।

  1. सभी नमूनों में EV (कुल कण या प्रोटीन कंटेंट) की संख्या लगातार रखें ।
    नोट: उपयुक्त संख्या अनुभाग 7 में ऊपर वर्णित के रूप में empirically निर्धारित किया गया है ।
  2. प्रोटोकॉल के लिए चरण ४.१ से ४.५ का पालन करें ।
  3. ऊपर और आपूर्तिकर्ता द्वारा अनुशंसित राशि के नीचे एंटीबॉडी सांद्रता की एक श्रेणी का परीक्षण करें । उदाहरण के लिए, एक सुझाव एकाग्रता के साथ एक एंटीबॉडी के लिए 10 µ g/ml प्रति परीक्षण, परीक्षण 1, 2, 5, 10, 20 और ५० µ g/ एंटीबॉडी के उच्चतम एकाग्रता जोड़ने, "केवल मोतियों" के साथ एक नमूना शामिल हैं ।
  4. 4-10 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए मशीन ।
  5. प्रत्येक नमूने के लिए 1x पंजाबियों के १०० µ एल जोड़ें ।
  6. नमूने प्राप्त ।

9. मशीन समय

  1. विभिंन समय अंक (जैसे, 1 एच, 2 एच, और 5 एच) में अधिग्रहण कर रही मशीन समय की पुष्टि करें ।
  2. अनुभाग 4 से प्रारंभ होने वाले प्रोटोकॉल का पालन करें ।
  3. 1 एच के लिए 4-10 डिग्री सेल्सियस पर नमूनों की मशीन
  4. नमूने प्राप्त ।
  5. 3 एच के लिए 4-10 डिग्री सेल्सियस पर नमूनों की मशीन
  6. नमूने प्राप्त ।

10. प्रोटोकॉल मांयता

  1. EV बाइंडिंग
    1. एक दौर में नीचे ट्यूब, 1 x 108 कणों या कुल प्रोटीन की इसी राशि के लिए इसी मात्रा की मात्रा में जोड़ें ।
    2. 1x पंजाबियों के साथ १०० µ l को वॉल्यूम समायोजित करें ।
    3. sonication द्वारा EV झिल्ली को बाधित (वैकल्पिक रूप से एक गर्मी सदमे कदम लागू किया जा सकता है) निर्माता के निर्देशों के अनुसार । आवृत्ति और तीव्रता सेट करें । sonication अवधि एक समय-पाठ्यक्रम प्रयोग (यानी, 0 एस, 30 एस, 1 मिनट, 5 मिनट, आदि) की स्थापना empirically स्थापित किया जा सकता है ।
    4. मनका पूल के 1 µ एल जोड़ें ।
    5. ४.४ चरण से प्रारंभ होने वाले प्रोटोकॉल का पालन करें ।
  2. एंटीबॉडी विशिष्टता
    1. प्रत्येक fluorochrome-संयुग्मित आईजीजी के लिए एक ट्यूब तैयार करें और चरण ४.६ में वर्णित के रूप में मोतियों-EV के जटिल जोड़ें ।
      नोट: fluorochrome-संयुग्मित Isotype के आईजीजी के साथ मेल खाना चाहिए एंटीबॉडी ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

एकल धुंधला के लिए कणों की कुल संख्या

चूंकि एक एकल मनका एक से अधिक कण बांध कर सकते हैं, हम विभिंन स्थितियों का परीक्षण करने के लिए कुल EV (ट्यूब प्रति एक एंटीबॉडी) की छोटी राशि के लिए MFI वक्र के प्रारंभिक घातीय चरण तक पहुंचने सेट । एंटीबॉडी की एक निश्चित एकाग्रता का इस्तेमाल किया गया था, जबकि कणों की कुल संख्या से लेकर 5 x 105 २.५ x 108. जैसा चित्र 3ए में दिखाया गया है, कणों की संख्या है कि हमें यह सुनिश्चित करने की अनुमति देता है कि एंटीबॉडी एक स्वीकार्य MFI के भीतर प्रदर्शन, EV के एक अतिरिक्त के उपयोग से परहेज, 1 x 108 कणों/

एंटीबॉडी अनुमापन

हम एंटीबॉडी की उचित एकाग्रता का चयन सबसे अधिक विशिष्ट एंटीबॉडी बाध्यकारी को रोकने के संकेत में जिसके परिणामस्वरूप । यह परीक्षण पिछले सेटिंग में निर्धारित के रूप में 1 x 108 कणों के लिए अनुकूलित किया गया है । एंटी-CD9_FITC, एंटी-CD63_PE, और एंटी-CD81_PE 1 से ५० µ g/mL (चित्र 3 बी) से लेकर सांद्रता के साथ परीक्षण किया गया । विरोधी CD9_FITC और विरोधी CD63_PE एंटीबॉडी संकेत का एक अच्छा संकल्प दिया (७.५ और १३०-MFI बनाम अकेले मोती के परिवर्तन गुना, क्रमशः) जब 10 µ जी की एकाग्रता में इस्तेमाल किया/एमएल जबकि विरोधी के लिए चयनित एकाग्रता CD81_PE एंटीबॉडी 5 µ जी/एमएल (४६५.३ गुना था बदलें MFI) ।

विधि सत्यापन

हमारे विधि केवल "कप के आकार का" extracellular बुलबुले और नहीं झिल्ली मलबे का विश्लेषण करने के लिए उपयुक्त है कि पुष्टि करने के लिए, हम कणों से युक्त समाधान करने के लिए, आयाम के 10% पर विभिन्न sonication के चरणों में लागू किया । १०० 1 x 108 कणों से युक्त 1x पंजाबियों समाधान के µ एल 5 मिनट के लिए 30 सेकंड से अलग sonication के कदम और जिसके परिणामस्वरूप दोनों टूट गया और अच्छी तरह से आकार EV युक्त तैयारी विश्लेषण किया गया के रूप में वर्णित (बिंदु से प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल ३.३). एक परिणाम के रूप में, हमने पाया है कि sonication कमी MFI कि पूरी तरह से 1 मिनट के बाद फेंक दिया गया था की 30 सेकंड । इस timepoint में, EV मार्कर (फिगर 3d) में से किसी के लिए कोई प्रतिदीप्ति detectable नहीं है ।

HEK293 के प्रवाह cytometry लक्षण-और सीपीसी व्युत्पंन exosomes

ये परिणाम ultracentrifuge आइसोलेशन विधि के साथ ऊपर प्रस्तुत प्रोटोकॉल के बाद उत्पन्न किए गए थे । अलग exosomes ंत् प्रौद्योगिकी द्वारा quantified रहे है और मिश्रित मोतियों की 1 µ एल के साथ रातोंरात भरी हुई (1x विरोधी CD9:1x विरोधी CD63:1x विरोधी CD81) । जटिल मोती + Exo एंटीबॉडी विरोधी CD9_FITC, विरोधी CD63_PE की उचित मात्रा के साथ दाग थे, और विरोधी CD81_PE (चित्रा 3E, एफ और 2 तालिका) ।

इसके अलावा, EV-सीपीसी का उपयोग करके हम के साथ या पूर्व संवर्धन के बिना ultracentrifugation द्वारा एफसी विश्लेषण की तुलना में । चित्रा 4 से पता चलता है कि दोनों तरीकों प्रोफ़ाइल Exo सतह मार्कर के लिए उपयुक्त हैं । extracellular बुलबुले के पूर्व संवर्धन काफी CD63_PE और CD81_PE धुंधला (चित्रा 4 और तालिका 3) के लिए विशेष रूप से प्रतिदीप्ति तीव्रता में सुधार ।

Figure 1
चित्रा 1: प्रोटोकॉल और ंत् भूखंडों । (क) प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व । (ख) वातानुकूलित मीडिया, प्री-Ultracentrifuge और पोस्ट-Ultracentrifuge चरण के लिए प्रतिनिधि ंत् भूखंड. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2: प्राप्ति और डेटा विश्लेषण । (क) प्रवाह cytometry विश्लेषण पूरे मोतियों की आबादी के लिए एक पहले गेट बनाने के साथ शुरू होता है "मोती" (मलबे को छोड़कर) और फिर एक दूसरे के लिए "singlets" घटनाओं भेद गेट । Singlets x-अक्ष और FSC-a के रूप में y-अक्ष के रूप में FSC-H के साथ सेट किए गए प्लॉट पर gated हैं । (बी-डी) प्रतिनिधि डॉट भूखंडों मोती की सकारात्मक आबादी के लिए सही प्रतिदीप्ति तीव्रता की पारी दिखा-exosomes परिसरों (हरे, CD9 +; लाल CD63 +; ब्राउन CD81 +) । Isotype नियंत्रण (वायलेट) नकारात्मक ग्रे रंग का मोती ओवरलैप । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: कणों की संख्या के लिए अनुमापन घटता (तीर कणों की चयनित राशि दिखाने के लिए, 1 x 108). (क) एंटीबॉडी सांद्रता (तीर प्रत्येक प्रयुक्त एंटीबॉडी के लिए चयनित एकाग्रता दिखाते हैं) । (ख) कणों और एंटीबॉडी एकाग्रता की दोनों संख्या साजिश बनाम मतलब प्रतिदीप्ति तीव्रता (MFI) हैं । (ग) 1 के साथ तैयारी के 3 अलग अधिग्रहण दिखा वक्र-2 ज या एंटीबॉडी मशीन के 5 एच । (घ) अलग समय-बिंदुओं पर प्रतिदीप्ति निम्नलिखित sonication की कमी दिखा वक्र । (E-F) मोड़ो बदलें (मतलब ± एसडी) MFI के CD9 के लिए, CD63 और CD81 बनाम नकारात्मक नियंत्रण (मोतियों + एंटीबॉडी, कोई EV) HEK293 ev के लिए दिखाए जाते है (n = 3 स्वतंत्र प्रतिकृति) और सीपीसी EV के लिए (n = 3 विभिंन रोगियों से 4 प्राथमिक सेल लाइनों) कृपया यहां क्लिक करें का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यह आंकड़ा है ।

Figure 4
चित्रा 4: MFI विश्लेषण और दो प्रक्रियाओं के बीच तुलना: प्रत्यक्ष EV-मोतियों के साथ बंधन (मोतियों का अलगाव) और ultracentrifuge (ultracentrifuge अलगाव) के साथ पूर्व संवर्धन । डेटा (ए) CD9, (ख) CD63, और (सी) CD81 बनाम नकारात्मक नियंत्रण (मोती + एंटीबॉडी, नहीं EV) के लिए MFI के गुना परिवर्तन (मतलब ± एसडी) के रूप में दिखाया जाता है । 3 विभिन्न रोगियों से N = 3 प्राथमिक सेल लाइनों. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

सीपीसी ंत् (भाग/µ एल) (µ g/µ l)
सीपीसी # 1 पूर्व Ultracentrifuge 5.02 e + 06 २.०१
सीपीसी # 1 पोस्ट-Ultracentrifuge 6.10 ई + 07 १.०४
सीपीसी # 2 पूर्व Ultracentrifuge 5.74 e + 06 २.३०
# 2 सीपीसी के बाद Ultracentrifuge 7.43 ई + 07 ०.७९
सीपीसी # 3 पूर्व Ultracentrifuge 2.02 e + 06 १.९०
सीपीसी # 3 पोस्ट-Ultracentrifuge 2.91 ई + 07 ०.४२

तालिका 1: ंत् एकाग्रता और 3 अलग रोगी सीपीसी व्युत्पंन के लिए पहले और बाद ultracentrifuge के लिए प्रोटीन एकाग्रता के बीच तुलना ।

MFI ± एसडी की गुना बदलें CD9 CD63 CD81
HEK293 २४.४४ ± १९.१७ ४३०.७ ± ३४४.९ ५३५.२ ± ४१०.३
सीपीसी # 1 १४.१५ ± ३.७२ २३६.०५ ± ४३.४० ३५३.३० ± ४५२.४३
सीपीसी # 2 १५.७६ ± १.८७ ९८३.०६ ± १९५.६३ ३७४.४५ ± १०८.०५
सीपीसी # 3 ८.९४ ± ७.१९ ८३०.५० ± १८४.७३ ६०.०५ ± २३.१८

तालिका 2: HEK293 ev (n = 3 स्वतंत्र प्रतिकृति) और सीपीसी ev (एन = 3 विभिंन रोगियों से 4 प्राथमिक सेल लाइनों) के लिए MFI के गुना परिवर्तन (मतलब ± एसडी) के मूल्य ।

MFI ± एसडी की गुना बदलें CD9 CD63 CD81
कब्जा मोती अलगाव २.९६ ± १.४५ ६५.६५ ± १८.८७ २१.८५ ± ६.१२
Ultracentrifuge अलगाव ७.४७ ± २.७१ २३६.०० ± २५.०६ ६५.०५ ± १३.३८

तालिका 3: सीपीसी EV (एन = 3 विभिंन रोगियों से 3 प्राथमिक सेल लाइनों) के लिए MFI के गुना परिवर्तन के मूल्य पर कब्जा मोतियों या ultracentrifuge द्वारा पृथक ।

तालिका 4: एकल उत्पाद विनिर्देश ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

पारंपरिक एफसी तकनीक सबसे सरल विश्लेषणात्मक तरीका EV की सतह पर व्यक्त मार्करों की विशेषता बनी हुई है । इस संबंध में, सबसे उपयुक्त प्रोटोकॉल का चयन साधन संवेदनशीलता के कारण सीमाओं से परहेज द्वारा ब्याज की व्यक्तिगत कण भागों पर उपयोगी जानकारी प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है । हम एक तरीका है कि Exo और छोटे EV सतह एंटीजन जो अनुप्रवाह एफसी आवेदन के लिए उपयुक्त है पहचान एंटीबॉडी के साथ मिलकर चुंबकीय कणों का उपयोग कर विधि का वर्णन किया । हम दो विभिंन प्रकार के सेल का उपयोग कर विधि की पुष्टि: प्राथमिक मानव सीपीसी है कि हृदय रोग के लिए Exo आधारित चिकित्सकीय दृष्टिकोण के लिए एक प्रमुख कोशिका स्रोत के रूप में उभर रहे हैं; और HEK293 कोशिकाओं, एक अमर सेल व्यापक रूप से सेल जीवविज्ञान अनुसंधान में इस्तेमाल किया क्योंकि विश्वसनीय सेल विकास और प्लास्टिक की लाइन ।

विधि ultracentrifuge को लागू किया जा सकता है, EV समृद्ध और, तेजी से विश्लेषण के लिए, पर भी सीधे इन विट्रो सेल में ultracentrifugation द्वारा कोई पूर्व संवर्धन के साथ मुख्यमंत्री व्युत्पंन । प्रारंभिक सामग्री महत्वपूर्ण है जब नमूनों की तुलना । कब्जा मोती सीधे मुख्यमंत्री को जोड़ने की प्रक्रिया को गति लेकिन एक ही समय में कमी प्रतिदीप्ति तीव्रता, के रूप में चित्र 4aमें दिखाया जाएगा । यह भी "कब्जा" कदम ४.४ के दौरान मोती और EV मिश्रण करने के लिए पंजाब के एक उचित राशि का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है । जब एक निरंतर मशीन समय का उपयोग कर, एक वृद्धि की मात्रा प्रतिदीप्ति असक्षम EV युग्मन के कारण तीव्रता में कमी होगी ।

प्रोटोकॉल की एक सीमा है कि एक भी कब्जा मनका अपनी सतह पर एकाधिक EV/Exo कणों को बांध कर सकते हैं । यह एक से अधिक धुंधला का उपयोग करते हुए प्रतिजनों की EV व्यक्त अजीब संयोजन के सबसेट की पहचान करने की संभावना को सीमित करेगा । मनका-आधारित विधि इसलिए अर्द्ध मात्रात्मक डेटा पैदावार । एक भी कब्जा अटल बिहारी (CD9, CD63 या CD81) ले जाने के मोती का प्रयोग अधिकतम कणों कि एक्सप्रेस दो epitopes: एक मनका पर मौजूद है और कैप्चरिंग एंटीबॉडी और एंटीबॉडी है कि द्वारा पता चला द्वारा मांयता प्राप्त के लक्षण वर्णन पर अनुमति देगा बाद में जोड़ा ।

Exo विश्लेषण के लिए वर्तमान स्वर्ण मानक एफसी का उपयोग कर एक वान डेर Vlist एट अल द्वारा विकसित प्रोटोकॉल है. २०१२15में । यह EV के एक उच्च संकल्प विश्लेषण के लिए अनुमति देता है वाणिज्यिक उपलब्ध उच्च अंत एफसी के एक अनुकूलित विंयास का उपयोग (जैसे, BD तांता) । इस प्रोटोकॉल अत्यंत विस्तृत और उपयोगी है, लेकिन अभी भी उपयोग करने से पहले विशिष्ट एफसी अंशांकन के साथ एक जटिल हार्डवेयर सेटिंग की जरूरत है । तीन साल बाद, Pospichalova एट अल.16 प्रस्तावित Exo के एफसी विश्लेषण के लिए एक सरलीकृत प्रोटोकॉल का उपयोग कर एक समर्पित cytometer विशेष रूप से छोटे कणों के विश्लेषण के लिए विकसित (जैसे, Apogee A50 माइक्रो)17। इस प्रोटोकॉल और दूसरों है कि विशेष दहलीज11सेटिंग का उपयोग किया है के लिए संमान के साथ, हम यहां एक बुनियादी प्रोटोकॉल का प्रस्ताव छोटे EV चुंबकीय बाध्यकारी मोतियों कि पारंपरिक एफसी उपकरणों के लिए उपयुक्त है phenotyping का उपयोग करने के लिए और किसी भी आवश्यकता नहीं है विशेष सेटिंग । अलग प्रोटोकॉल मनका आधारित तरीकों का वर्णन किया है छोटे एफसी12द्वारा शारीरिक तरल पदार्थ में पाया EV विशेषताएं । यहां, हम असतत उप के केप्चर कर शो CD9, CD63, और CD81 है कि सामांयतः Exo मार्करों के रूप में इस्तेमाल किया जाता है के लिए सकारात्मक बुलबुले की आबादी18। एल्डिहाइड-सल्फेट लेटेक्स19,20 और polystyrene12मोतियों मुख्यमंत्री और रक्त प्लाज्मा द्रव में EV वर्तमान के बंधन के लिए वैध विकल्प रहते हैं; हालांकि, एल्डिहाइड समूहों बहुलक कण की सतह पर उजागर विशिष्ट प्रोटीन और लेटेक्स कणों के लिए अंय सामग्री के युग्मन सक्षम, इस प्रकार अलगाव और पता लगाने के दौरान लिपोप्रोटीन या अपोप्तोटिक निकायों द्वारा संदूषण के जोखिम में वृद्धि प्रक्रिया२१,२२.

प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया मोतियों केवल पूरे, अच्छी तरह से आकार EV बांध । हम संकेत (खंड 4, "प्रोटोकॉल सत्यापन") बुझाने के लिए sonication द्वारा EV संरचना को बाधित करने का प्रस्ताव किया । दरअसल, कम प्रतिदीप्ति तीव्रता में sonication के परिणाम के एक मिनट, इस प्रकार दिखा रहा है कि एक सकारात्मक संकेत मोतियों पर झिल्ली मलबे adsorbed से प्रभावित नहीं किया जा सकता है ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

घोषित करने के लिए कुछ नहीं ।

Acknowledgments

L.B. हेल्मुट Horten Stiftung और Velux Stiftung, ज्यूरिख (स्विट्जरलैंड) के अनुसंधान अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था । G.V. स्विस नेशनल साइंस फाउंडेशन, सीसिलिया-Augusta फाउंडेशन, लूगानो, और SHK Stiftung फर Herz-und Kreislaufkrankheiten (स्विट्जरलैंड) के अनुसंधान अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था

Materials

Name Company Catalog Number Comments
IMDM Gibco 12440061
Amicon Ultra-15, PLHK Ultracel-PL Membran, 100 kDa  Millipore UFC910024
CytoFlex, Flow Cytometer Platform Beckman Coulter CytoFlex
DMEM, high glucose, HEPES, no phenol red Gibco 21063045
Dulbecco's PBS (PBS) Ca- and Mg-free Lonza BE17-512F
ExoCap CD63 Capture Kit JSR Life Sciences Ex-C63-SP
ExoCap CD81 Capture Kit JSR Life Sciences Ex-C81-SP
ExoCap CD9 Capture Kit JSR Life Sciences Ex-C9-SP
Exosome-Depleted FBS Thermofisher A2720801
Exosome-depleted FBS Media Supplement SBI EXO-FBS-250A-1
FBS-Fetal Bovine Serum Gibco 10270106
FITC anti-human CD9 Antibody Biolegend 312104           RRID: AB_2075894
Flow Cytometer analysis software Beckman Coulter Kaluza
NanoSight LM10 Malvern NanoSight LM10
NanoSight Software Malvern NTA 2.3
Optima Max-XP Beckman Coulter 393315
PE anti-human CD63 Antibody Biolegend 353004           RRID:AB_10897809
PE anti-human CD81 (TAPA-1) Antibody Biolegend 349505           RRID:AB_10642024
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122
Thermomixer C Eppendorf 5382 000 015
TLA-110 Beckman Coulter TLA-110 rotors

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Barile, L., Vassalli, G. Exosomes: Therapy delivery tools and biomarkers of diseases. Pharmacology & Therapeutics. , (2017).
  2. Thery, C. Exosomes: secreted vesicles and intercellular communications. Molecular Biology Reports. 3, 15 (2011).
  3. Yadav, D. K., et al. Liquid biopsy in pancreatic cancer: the beginning of a new era. Oncotarget. 9, 26900-26933 (2018).
  4. Balbi, C., et al. First Characterization of Human Amniotic Fluid Stem Cell Extracellular Vesicles as a Powerful Paracrine Tool Endowed with Regenerative Potential. Stem Cells Translational Medicine. 6, 1340-1355 (2017).
  5. Andriolo, G., et al. Exosomes From Human Cardiac Progenitor Cells for Therapeutic Applications: Development of a GMP-Grade Manufacturing Method. Frontiers in Physiology. 9, (2018).
  6. Lai, R. C., et al. Exosome secreted by MSC reduces myocardial ischemia/reperfusion injury. Stem Cell Research. 4, (2009).
  7. Doeppner, T. R., et al. Extracellular Vesicles Improve Post-Stroke Neuroregeneration and Prevent Postischemic Immunosuppression. Stem Cells Translational Medicine. 4, 1131-1143 (2015).
  8. Kordelas, L., et al. MSC-derived exosomes: a novel tool to treat therapy-refractory graft-versus-host disease. Leukemia. 28, 970-973 (2014).
  9. Barile, L., et al. Extracellular vesicles from human cardiac progenitor cells inhibit cardiomyocyte apoptosis and improve cardiac function after myocardial infarction. Cardiovascular Research. 103, 530-541 (2014).
  10. Longatti, A., et al. High affinity single-chain variable fragments are specific and versatile targeting motifs for extracellular vesicles. Nanoscale. 10, 14230-14244 (2018).
  11. Menck, K., Bleckmann, A., Schulz, M., Ries, L., Binder, C. Isolation and Characterization of Microvesicles from Peripheral Blood. Journal of Visualized Experiments. , (2017).
  12. Inglis, H., Norris, P., Danesh, A. Techniques for the analysis of extracellular vesicles using flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. , (2015).
  13. Arakelyan, A., et al. Flow Virometry to Analyze Antigenic Spectra of Virions and Extracellular Vesicles. Journal of Visualized Experiments. , (2017).
  14. Chimenti, I., et al. Isolation and expansion of adult cardiac stem/progenitor cells in the form of cardiospheres from human cardiac biopsies and murine hearts. Methods Molecular Biology. 879, 327-338 (2012).
  15. van der Vlist, E. J., Nolte-'t Hoen, E. N., Stoorvogel, W., Arkesteijn, G. J., Wauben, M. H. Fluorescent labeling of nano-sized vesicles released by cells and subsequent quantitative and qualitative analysis by high-resolution flow cytometry. Nature Protocols. 7, 1311-1326 (2012).
  16. Pospichalova, V., et al. Simplified protocol for flow cytometry analysis of fluorescently labeled exosomes and microvesicles using dedicated flow cytometer. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 25530 (2015).
  17. van der Pol, E., et al. Particle size distribution of exosomes and microvesicles determined by transmission electron microscopy, flow cytometry, nanoparticle tracking analysis, and resistive pulse sensing. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 12, 1182-1192 (2014).
  18. Witwer, K. W., et al. Updating the MISEV minimal requirements for extracellular vesicle studies: building bridges to reproducibility. Journal of Extracellular Vesicles. 6, 1396823 (2017).
  19. Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Current Protocols in Cellular Biology. , Chapter 3, Unit 3.22 (2006).
  20. Suarez, H., et al. A bead-assisted flow cytometry method for the semi-quantitative analysis of Extracellular Vesicles. Scientific Reports. 7, 11271 (2017).
  21. Sodar, B. W., et al. Low-density lipoprotein mimics blood plasma-derived exosomes and microvesicles during isolation and detection. Scientific Reports. 6, 24316 (2016).
  22. Sluijter, J. P. G., et al. Extracellular vesicles in diagnostics and therapy of the ischaemic heart: Position Paper from the Working Group on Cellular Biology of the Heart of the European Society of Cardiology. Cardiovascular Research. 114, 19-34 (2018).

Tags

जीव विज्ञान अंक १४४ exosomes microvesicles प्रवाह cytometry exosomes phenotyping मोती वातानुकूलित मध्यम extracellular बुलबुले
कोशिका-वातानुकूलित मीडिया से Extracellular बुलबुले के प्रवाह Cytometric विश्लेषण
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Balbi, C., Bolis, S., Vassalli, G.,… More

Balbi, C., Bolis, S., Vassalli, G., Barile, L. Flow Cytometric Analysis of Extracellular Vesicles from Cell-conditioned Media. J. Vis. Exp. (144), e59128, doi:10.3791/59128 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter