Summary
Protokollen beskriver en reproduserbar metode utviklet for bruk med celle kultur supernatants for å oppdage overflaten epitopes på små ekstracellulære blemmer (EV). Det bruker bestemte EV immunoprecipitation bruker perler kombinert med antistoffer som gjenkjenner overflate antigen CD9, CD63 og CD81. Metoden er optimalisert for nedstrøms flyt cytometri analyse.
Abstract
Flowcytometri (FC) er metoden for valg for semi kvantitativ måling av celle-overflate antigen markører. Nylig er denne teknikken brukt for fenotypiske analyser av ekstracellulære blemmer (EV) inkludert exosomes (Exo) i perifert blod og andre kroppsvæsker. Den lille størrelsen på EV mandater bruk av dedikert instrumenter har en gjenkjenning terskel rundt 50-100 nm. Alternativt kan EV være bundet til latex microbeads som kan gjenkjennes av FC. Microbeads, konjugert med antistoffer som gjenkjenner EV-assosiert markører/klynge av differensiering CD63, CD9 og CD81 kan brukes for EV-fangst. EXO isolert fra CM kan analyseres med eller uten pre berikelse av ultracentrifugation. Denne tilnærmingen er egnet for EV analyser konvensjonelle FC instrumenter. Våre resultater viser en lineær sammenheng mellom mener fluorescens intensitet (MFI) verdier og EV konsentrasjon. Forstyrre EV gjennom sonication dramatisk redusert MFI, indikerer at metoden ikke oppdager membran rusk. Vi rapporterer en nøyaktig og pålitelig metode for analyse av EV overflaten antigener, som lett kan implementeres i et laboratorium.
Introduction
Celler skiller ekstracellulære blemmer (EV) av forskjellige størrelser, inkludert microvesicles (MV) og exosomes (Exo). Sistnevnte kan skilles fra MV av både størrelse og subcellular rommet opprinnelsesland. MV (200 – 1000 nm i størrelse) frigis fra overordnede celler av shedding fra plasma membranen. Derimot Exo (30-150 nm) kommer fra endosomal membraner og utgis i ekstracellulære plass når multivesicular organer (MVB) smelter med cellemembranen1,2.
EV er i økende grad brukt som diagnostiske biomarkers også, muligens terapeutiske verktøy i mange områder, inkludert onkologi, nevrologi, kardiologi og musculoskeletal sykdommer3,4,5. Et stort flertall av pågående studier med EV som terapeutiske agenter utnytte isolering av blemmer fra celle-conditioned medium (CM) i vitro kulturperler celler. Stamceller (MSCs) utøve gunstige effekter i flere sammenhenger, og MSC-avledet EV har vist fordelene i modeller av hjerteinfarkt iskemi/reperfusion skade6 og hjerne skader7. MSC-avledet EV også utstillingen immun modulatory aktiviteter som kan utnyttes til å behandle uimottakelig avvisning, som vist i en modell av terapi-ildfast graft - versus - host sykdom8. Amniotic væske stamceller (hAFS) aktivt beriker CM med MVs og Exo, heterogeneously distribuert i størrelse (50 – 1000 nm), som megle flere biologiske effekter, for eksempel spredning av differensierte celler, angiogenese, hemming av fibrosis, og cardioprotection4. Vi har nylig vist at EV, og spesielt Exo, skilles ut av menneskelig hjerte-avledet progenitor celler (Exo-CPC) redusere betennelsessykdommer som hjerteinfarkt størrelse i rotter5,9.
EXO deler et felles sett av protein på overflaten deres, inkludert tetraspanins (CD63, CD81, CD9) og store histocompatibility kompleks klasse I (MHC-jeg). I tillegg til denne felles sett av proteiner, Exo også inneholde proteiner bestemt EV delsettet av produsent celle type. EXO markører er å få avgjørende betydning fordi de spiller en avgjørende rolle i mellom mobil kommunikasjon, og dermed regulerer mange biologiske prosesser5,10. På grunn av sin lille størrelse, finne en enkel måte å analysere EV med klassisk flyt cytometri (FC) er en utfordrende oppgave.
Her presenterer vi en forenklet protokoll for EV analyse med FC, som kan brukes til pre beriket prøver innhentet gjennom ultracentrifugation eller direkte til CM (figur 1). Metoden bruker perler belagt med et spesifikt antistoff som binder kanoniske Exo-assosiert overflaten epitopes (CD63, CD9, CD81) uten flere vasker. FC analyser utføres med en konvensjonell cytometer uten behov for justeringer før mål. Metoder for karakterisering av antigener på enkelte små partikler bruker flyt cytometers har blitt beskrevet av andre grupper med hensyn til ulike programmer11,12,13. Her brukte vi functionalized magnetiske perler for erobringen av små partikler og Exo, etterfulgt av phenotyping fanget partikler av FC. Selv om denne metoden kan brukes til å beskrive antigen sammensetningen av små blemmer utgitt av en celle type i vitro, gitt her vi bestemt celle kultur betingelsene som gjelder for kulturen i menneskets hjerte progenitor celler (CPC) og de riktig miljø for produksjon av EV av disse cellene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. innsamling og behandling av betinget Media
- Coat 55 cm2 Petri retter med 0,02% svin huden gelatin i PBS.
- Plate CPC (8000/cm2) i pre belagt retter med 7 mL av Iscoves endret Dulbecco Medium (IMDM) med 20% FBS (Fetal Bovine Serum) og 1% Penicillin/Streptomycin (P/S).
Merk: Begrepet "CPC," refererer til menneskelig explant avledet celler som beskrevet andre steder14. CM kan hentes fra forskjellige celletyper kultivert bestemt kultur forhold. Bruk hansker og arbeide under biologiske hette. - Når celler nå om 80% samløpet, fjerne kultur medium, vask celler to ganger med Dulbecco's PBS (PBS) Ca og Mg-uten og erstatte den med 10 mL av serum-free Exo-produksjon medium (Dulbeccos endret Eagles mellomstore [DMEM] høy glukose, 4.5 g/mL).
Merk: Fortsett med en progressiv nedgang av serum konsentrasjonen i kultur medium, gradvis tilpasse celler serum-fri tilstand (SF). For celler som er følsomme for serum-free medium forberede et medium som inneholder FBS men utarmet av EV. Forberede medium supplert med alle næringsstoffene, pluss 10%-20% (v/v) FBS. Sentrifuge middels natten på 100.000 × g, 4 ° C. Vær oppmerksom på at denne fremgangsmåten ikke garanterer 100% fjerning av FBS-avledet EV. - Etter 7 dager, samle CM i en polypropylen sentrifuge rør.
Merk: Tiden for middels condition, avhenger av hvilken celle. For celler som er følsomme for serum-free medium, øke første volumet av medium og redusere tiden for CM samling til 24-48 timer. - Fjerne CM fra celle rusk ved sentrifuge 3000 x g for 20 min på 4-10 ° C. Samle nedbryting i et 100 kDa sentrifuge filter rør.
- Konsentrat ryddet CM av spinning røret 2000 x g for 20 min på 4-10 ° C.
Merk: Dette trinnet vil redusere første volumet cm tillater bruk av små volumer rør for høyhastighets sentrifuge trinn og vil bidra til å eliminere lite protein aggregat. - Samle konsentrat i et microcentrifuge rør. Sentrifuger 10.000 x g i 15 min på 4-10 ° C.
- Samle nedbryting og videre til del 2 (EV berikelse). Hvis en ultracentrifuge ikke er tilgjengelig videre direkte til del 3 (hydrogenion sporing analyse (NTA) kvantifisering).
Merk: Pre berikelse EV brøkdel forbedrer siste lese-out fluorescens intensitet (se representant resultater og Figur 4). Ryddet CM (fra punkt 1.8) kan lagres på 4 ° C for lenger enn 1-2 dager eller alternativt på −80 ° C i flere måneder. 5 CM bør være pre-ryddet å fjern mobilnettet rusk før-80 ° c for å sikre at exosome størrelse rusk ikke er dannet i fryse-Tin prosessen.
2. ekstracellulære blemmer berikelse av Ultracentrifuge (valgfritt)
- Plass nedbryting fra trinn 1.8 i en polykarbonat tykk vegg ultracentrifuge tube. Fyll røret med 1 x fosfat buffer saltvann (PBS) til den når den maksimal kapasiteten (3,2 mL).
- Laste inn eksemplene i en Titan fast vinkel rotor (8 x 3.2 mL, k-faktoren 13). Last rotoren i en tabletop ultracentrifuge. Ultracentrifuge på 100.000 x g for 3t på 4-10 ° C.
- Forkast nedbryting og resuspend pellet i 100 µL av 1 x PBS.
3. hydrogenion sporing analyse (NTA) kvantifisering
- Fortynne 1 µL av prøven (fra enten trinn 2.3 eller 1.8) i 999 µL av 1 x PBS. Laste inn eksemplet i 1 mL sprøyte, unngå boble formasjon. Legg i sprøyten i innløpet havnen i eksamen kammeret.
- Slå på laser. Åpne kameraet med knappen fange . Justere fokus.
- Registrere minst 3 forskjellige rammer 60 s hver.
- Analysere 3 forskjellige oppkjøpene alternativet Satsvis prosess i programvaren.
Merk: Hvis NTA teknologien ikke er tilgjengelig, kan du utføre en protein kvantifisering av Bradford analysen (1 x 108 partikler tilsvarer 1 – 2 µg totale protein etter ultracentrifugation eller 50 – 60 µg totale protein hvis kvantifisering utføres direkte i CM som Det inkluderer proteiner forurensninger forskjellig fra EV; se tabell 1)5.
4. eksempel forberedelse
- Forberede en pool av 3 typer fangst perler (CD9 perler, CD63 perler og CD81 perler på en 1:1:1 ratio, se Tabellen for materiale) og vortex.
Merk: Bassenget er testet for å være stabil for 1 måned. Én type fange perle kan bli brukt, dette gjør påvisning av EV subpopulasjoner ikke discriminable med pool av perler. Ved å bruke én antigen fange perler, vil det være mulig å moderne demonstrere tilstedeværelsen av tetraspanin proteiner, som CD9, CD81 eller CD63, og antigen rundt oppdaget av fluorescerende antistoff. Alternative aldehyd-sulfat latex perler er også tilgjengelige. Disse perlene presentere hydrofobe overflate for opptak av MV og EV. - I en rund bunn tube, legge mengden av volumet tilsvarende på 1 x 108 partikler pluss 1 µL av perle, tilsvarer 1.2 x 105 perler totalt (for hver test).
- Forberede et rør som inneholder 1 µL av perler uten EV som skal fungere som negativ kontroll, herved kalt "Perler".
- Juster volumet til 100 µL med 1 x PBS. Sett røret i en thermo-mikser og riste på 400 rpm overnatting på 4-10 ° C.
- Neste dag, flytte prøvene til en runde 96-brønns bunnplaten (eller FC rør).
- Legg antistoffer (10 µg/mL av CD9_FITC, 10 µg/mL av CD63_PE og 5 µg/mL av CD81_PE).
- Inkuber 1t på 4-10 ° C.
- Tilsett 100 µL av 1 x PBS hver brønn.
- Videre til oppkjøpet.
5. Kjøp
- Åpne oppkjøpet programvaren og starte opp maskinen (Cytometer > System oppstartsprogram). Åpne et nytt eksperiment.
- Opprette en eksperimentell mal og deretter velge Plate , og deretter Legge til platen. Velg stillingen til prøvene på tallerkenen, og trykk deretter Satt også som eksempler.
- Angi utvalg (dvs. CPC #1_CD9FITC) i Navngiving regler. Åpne kategorien kanal og slå på FITC og PE kanaler.
- Laste inn platen i maskinen.
- Trykk Dot Plot og opprette ny dot tomten (P1). Angi frem Scatter området (FSC-A) mot siden Scatter-området (SSC-A).
- Velg Initialiser laser og fluidics. Trykk anskaffe starte oppkjøpet.
- Juster skalaen for å vise befolkningen i P1. P1 tegne "PERLER" porten rundt hele befolkningen (unntatt rusk) (figur 2A). Trykk Stopp.
- Trykk Dot Plot og opprette ny dot tomten (P2). Angi frem Scatter-høyde (FSC-H) versus FSC-A. Gate nye dot plottet på "PERLER". Tegne en ny port rundt befolkningen betydeligere P2 og navnet den "SINGLETER" (figur 2A).
Merk: Denne strategien er utviklet for å unngå så mye som mulig inkludering av perler mengdefunksjoner i både oppkjøp og analyse. - Trykk Dot Plot og opprette to forskjellige dot tomter; en FITC mot SSC-A og PE versus SSC-A. Gate nye dot plottet på "SINGLETER."
- Velg antall hendelser som skal loggføres (f.eks 20.000). Velg post og starte eksperimentet.
6. dataanalyse
- Legg oppkjøpet filene i analyseprogramvare.
Merk: Følgende må brukes hvert utvalg inkludert perler bare og hver ukjent utvalg. - Åpne en ny protokoll og opprette dot tomter følge samme strategi beskrevet i trinn 5.
- Angi alle scatter akser lineær skala og alle fluorescens aksene logge skala.
- Vis det fluorescens geometriske gjennomsnittet (X-Gmean-MFI) i FITC og PE.
- Beregne forholdet X-Gmener prøvene / X-Gmener av perler beiset med antistoff uten exosome.
- Sammenlign fold endre MFI forskjellige EV forberedelser.
7. ekstracellulære Vesicle nummer titrering
Merk: Avsnitt 7 til 10 kan utføres for å definere antall partikler, antistoffer konsentrasjon og spesifisitet, men kan hoppet hvis hvilken celle, som EV er avledet, og antistoffer forblir den samme.
- Fortynne partikler, fra trinn 2.3, 1 x PBS å få en rekke suspensjoner oppstiller fra 5 x 105 å 2.5 x 108 partikler.
- For hver suspensjon Legg i en rund bunn tube 1 µL av fange perle.
- Følg protokollen fra trinn 4.3.
8. antistoff titrering
Merk: Antistoff titrering er vanligvis utført ved å legge til et enkelt antistoff for hver rør.
- Holde antall EV (totalt partikkel eller proteininnhold) konstant i alle prøvene.
Merk: Riktig bestemmes empirisk som beskrevet over i Seksjon 7. - Følg protokollen fra trinn 4.1 til 4,5.
- Teste en rekke antistoff konsentrasjoner ovenfor og nedenfor hvor anbefalt av leverandøren. For eksempel for et antistoff med en foreslått konsentrasjon av 10 µg/mL per test, test 1, 2, 5, 10, 20 og 50 µg/mL. Inkluder et utvalg med "bare perler", legger den høyeste konsentrasjonen av antistoff.
- Inkuber 1t på 4-10 ° C.
- Legg 100 µL av 1 x PBS for hvert utvalg.
- Erverve prøvene.
9. inkubasjonstiden
- Kontroller inkubasjon tiden utføre oppkjøp på ulike tidspunkt (f.eks 1 h 2 h og 5 h).
- Følg protokollen fra seksjon 4.
- Inkuber eksempler på 4-10 ° C 1t.
- Få prøver.
- Inkuber eksempler på 4-10 ° C for 3t.
- Få prøver.
10. protokollen validering
-
EV bindende
- I en rund bunn tube, legge mengden volum tilsvarer 1 x 108 partikler eller tilsvarende beløp totale protein.
- Juster volumet til 100 µL med 1 x PBS.
- Forstyrre EV membranen av sonication (også en varme sjokk trinn kan brukes) i henhold til produsentens instruksjoner. Angi og. Den sonication perioden kan være empirisk etablert sette en tid-retters eksperiment (dvs. 0 s, 30 s, 1 min, 5 min, etc.).
- Legg 1 µL av perle.
- Følg protokollen fra trinn 4.4.
-
Antistoff spesifisitet
- Forberede en tube for hver fluorochrome-konjugerte IgG og legge komplekset av perler-EV som beskrevet i trinn 4.6.
Merk: Fluorochrome-konjugerte Isotype samsvare med IgG av brukte antistoffer.
- Forberede en tube for hver fluorochrome-konjugerte IgG og legge komplekset av perler-EV som beskrevet i trinn 4.6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Totalt antall partikler til enkelt farging
Siden en enkelt perle kan knytte mer enn én partikkel, testet vi ulike forhold til å angi minste totale EV (enkelt antistoff per tube) for å nå den tidlige eksponentielle fasen av MFI kurve. En fast konsentrasjon av antistoff ble brukt under antall partikler varierte fra 5 x 105 til 2,5 x 108. Som vist i figur 3A, antall partikler som tillater oss å sikre at antistoffer utfører innen en akseptabel MFI, er unngå bruk av et overskudd av EV, 1 x 108 partikler/flekker.
Antistoff titrering
Vi valgte den riktige konsentrasjonen av antistoff som resulterer i det høyeste signalet forebygge uspesifikke antistoff bindingen. Denne testen er optimalisert for 1 x 108 partikler, som bestemmes i forrige innstilling. Anti-CD9_FITC, anti-CD63_PE og anti-CD81_PE ble testet med konsentrasjonene varierer fra 1 til 50 µg/mL (figur 3B). Anti-CD9_FITC og anti-CD63_PE antistoffer ga en god oppløsning av signal (7,5 og 130-fold endring av MFI vs perler alene, henholdsvis) når den brukes på konsentrasjon av 10 µg/mL mens valgte konsentrasjonen for anti-CD81_PE antistoffer var 5 µg/mL (465.3 brett Endre MFI).
Metoden validering
For å bekrefte at vår metode er egnet til å analysere bare "cup-formet" ekstracellulære blemmer og ikke membran rusk, brukt vi ulike sonication trinn på 10% av amplitude, løsningen som inneholder partikler. 100 µL av 1 x PBS løsning som inneholder 1 x 108 partikler gjennomgikk forskjellige sonication skritt fra 30 sekunder til 5 minutter og den resulterende forberedelsen inneholder både knust og godt formet EV ble analysert som beskrevet (eksperimentell protokoll fra punkt 3.3). som et resultat vi fant at 30 sekunder av sonication redusere MFI som var helt dumpet etter 1 minutt. På denne timepoint er ingen fluorescens synlig for EV markører (figur 3D).
Flow cytometri karakteristikk av HEK293 - og CPC-avledet exosomes
Disse resultatene ble generert følger protokollen presentert ovenfor med metoden ultracentrifuge isolasjon. De isolerte exosomes er kvantifisert NTA teknologi og lastet over natten med 1 µL av blandet perler (1 x anti-CD9:1 x anti-CD63:1 x anti-CD81). Den komplekse perler + Exo var farget med riktig mengde av antistoff anti-CD9_FITC, anti-CD63_PE og anti-CD81_PE (figur 3EF og tabell 2).
Videre, ved hjelp av EV-CPC vi sammenlignet FC analyse med eller uten pre berikelse av ultracentrifugation. Figur 4 viser at begge er egnet til å profil Exo overflate markører. Pre berikelse ekstracellulære blemmer brøkdel forbedrer fluorescens intensitet spesielt for CD63_PE og CD81_PE flekker (Figur 4 og tabell 3).
Figur 1: protokoll og NTA tomter. (A) skjematisk fremstilling av eksperimentelle protokollen. (B) representant NTA tomter for betinget Media, før Ultracentrifuge og etter Ultracentrifuge trinn. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: oppkjøp og dataanalyse. (A) flyt cytometri analyse begynner med å skape en første gate til hele perler befolkningen "perler" (unntatt rusk) og deretter en annen gate for å skille mellom "singleter" hendelser. Singleter er gated på tomten satt opp med FSC-H som x-aksen og FSC-A som y-aksen. (B-D) Representant dot tomter viser høyre SKIFT fluorescens intensitet for positiv bestander av perler-exosomes komplekser (grønn, CD9 + rød CD63 +; brun CD81 +). Isotype kontroll (fiolett) overlappe negative grå farget perler. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Titrering kurver for antall partikler (pilene viser valgte mengde partikler, 1 x 10-8). (A) antistoff konsentrasjoner (pilene viser valgte konsentrasjonen for hver brukt antistoff). (B) både antall partikler og antistoff konsentrasjon er plottet vs mener fluorescens intensitet (MFI). (C) kurven viser 3 forskjellige kjøp av preparatet med 1-2 h eller 5 h antistoff inkubasjon. (D) kurven viser reduksjon av fluorescens etter sonication på ulike tidspunkt. (E-F) Kaste endring (gjennomsnittlig ± SD) av MFI for CD9, CD63 og CD81 vs negativ kontroll (perler + antistoffer, ingen EV) vises HEK293 EV (n = 3 uavhengige gjentak) og CPC EV (n = 3 primære linjer fra 3 forskjellige pasienter) Vennligst klikk her for å se en større versjon av Dette tallet.
Figur 4: MFI analyse og sammenligning mellom to prosedyrene: direkte EV-binding med perler (fange perler isolasjon) og pre berikelse med ultracentrifuge (Ultracentrifuge isolasjon). Dataene vises som brett endring (gjennomsnittlig ± SD) av MFI for (A) CD9, (B) CD63 og (C) CD81 vs negativ kontroll (perler + antistoffer, ingen EV). N = 3 primære linjer fra 3 forskjellige pasienter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| CPC | CONC NTA (del/µL) | Kons (µg/µL) |
| CPC #1 før Ultracentrifuge | 5.02E + 06 | 2.01 |
| CPC #1 etter Ultracentrifuge | 6.10E + 07 | 1.04 |
| CPC #2 pre Ultracentrifuge | 5.74E + 06 | 2.30 |
| CPC #2 etter Ultracentrifuge | 7.43E + 07 | 0,79 |
| CPC #3 før Ultracentrifuge | 2.02E + 06 | 1,90 |
| CPC #3 etter Ultracentrifuge | 2.91E + 07 | 0.42 |
Tabell 1: Sammenligning mellom NTA konsentrasjon og protein konsentrasjon for 3 forskjellige pasient avledet CPC før og etter ultracentrifuge.
| KASTE ENDRING AV MFI ± SD | CD9 | CD63 | CD81 |
| HEK293 | 24.44 ± 19.17 | 430.7 ± 344.9 | 535.2 ± 410.3 |
| CPC #1 | 14.15 ± 3,72 | 236.05 ± 43.40 | 353.30 ± 452.43 |
| CPC #2 | 15.76 ± 1.87 | 983.06 ± 195.63 | 374.45 ± 108.05 |
| CPC #3 | 8.94 ± 7.19 | 830.50 ± 184.73 | 60.05 ± 23.18 |
Tabell 2: Verdien av kaste endring (gjennomsnittlig ± SD) av MFI for HEK293 EV (n = 3 uavhengige gjentak) og CPC EV (n = 3 primære linjer fra 3 forskjellige pasienter).
| KASTE ENDRING AV MFI ± SD | CD9 | CD63 | CD81 |
| Fange perler isolasjon | 2.96 ± 1.45 | 65.65 ± 18.87 | 21.85 ± 6.12 |
| Ultracentrifuge isolasjon | 7,47 ± 2,71 | 236.00 ± 25.06 | 65.05 ± 13.38 |
Tabell 3: Verdien av kaste endring av MFI (gjennomsnittlig ± SD) for CPC EV (n = 3 primære linjer fra 3 forskjellige pasienter) isolert av fange perler eller ultracentrifuge.
Tabell 4: Enkelt produktspesifikasjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Konvensjonelle FC teknikken fortsatt metoden enkleste analytisk å karakterisere indikatorer uttrykt på overflaten av EV. I denne forbindelse, er velge den mest passende protokollen avgjørende å få nyttig informasjon om individuelle partikkel fraksjoner av interesse ved å unngå begrensninger på grunn av instrumentet følsomhet. Vi beskrev en metode å bruke magnetiske partikler sammen med antistoffer som gjenkjenner Exo og små EV overflaten antigener som nedstrøms FC anvendes. Vi validert metoden bruker to ulike celletyper: primære menneskelige CPC som dukker opp som en stor celle kilde for Exo-baserte terapeutiske metoder for hjertesykdommer; og HEK293 celler, en udødeliggjort cellen linje utbredt i biologi forskning på grunn av pålitelig cellevekst og plastisitet.
Metoden kan brukes til ultracentrifuge-beriket EV og for raskere analyse, også direkte vedrørende in vitro celle-avledet CM med ingen pre berikelse av ultracentrifugation. Den starte materialet er viktig når du sammenligner prøver. Legge til fange perler direkte til CM vil gjøre opp prosedyren, men samtidig redusere fluorescens intensitet, som vist i figur 4A. Det er også viktig å bruke en passende mengde PBS for å blande perler og EV under det "fange" steget 4.4. Når du bruker en konstant inkubasjon tid, minker en økt volum fluorescens intensitet på grunn av ineffektiv EV kopling.
En begrensning av protokollen er at en enkelt fange perle kan binde flere EV/Exo partikler på overflaten. Dette vil begrense muligheten for å identifisere delsett av EV uttrykke merkelig kombinasjon av antigener ved hjelp av en flere flekker. Metoden perle-baserte gir derfor semi kvantitative data. Bruker perler bærer en enkelt fange Ab (CD9, CD63 eller CD81) vil tillate på maksimalt karakterisering av partikler som uttrykker to epitopes: den på perle og anerkjent av fanger antistoffer og den oppdaget av antistoffer som er senere lagt.
Gjeldende gullstandarden for Exo analyser bruker FC er en protokoll utviklet av van der Vlist et al. i 201215. Det gir en høy oppløsning analyse av EV med en optimalisert konfigurasjon av kommersielt tilgjengelig high-end FC (f.eks BD tilstrømningen). Denne protokollen er svært detaljert og nyttig, men fortsatt trenger en kompleks maskinvare setting med spesifikk FC kalibrering før bruk. Tre år senere, Pospichalova et al.16 foreslått en forenklet protokoll for FC analyse av Exo bruker en dedikert cytometer spesielt utviklet for analyse av små partikler (f.eks Apogee A50 mikro)17. Med hensyn til denne protokollen og andre som har brukt spesielle terskelen innstillingen11, foreslår her vi en grunnleggende protokoll for å utføre små EV phenotyping bruker magnetisk bindende perler som er egnet for konvensjonelle FC instrumenter og krever ingen spesiell setting. Forskjellige protokoller har beskrevet perle-baserte metoder for å karakterisere liten EV funnet i kroppsvæsker av FC12. Her viser vi immunocapture av diskrete undergrupper av blemmer positiv for CD9, CD63 og CD81 som ofte brukes som Exo markører18. Aldehyd-sulfat latex19,20 og isopor12perler forbli gyldig alternativer for binding av EV i CM og blodplasma fluid; imidlertid aktivere aldehyd grupper utsatt på overflaten av polymer partikkel koblingen av uspesifikke proteiner og andre materialer som latex partikler, dermed øker risikoen for forurensing av lipoprotein eller apoptotisk under isolasjon og gjenkjenning behandle21,22.
Perler brukt i protokollen binde bare hele, godt formet EV. Vi foreslått å forstyrre EV strukturen av sonication å slukke signalet (seksjon 4, "protokollen godkjenningen"). Faktisk ett minutt av sonication resulterer i redusert fluorescens intensitet, noe som viser at et positivt signal ikke påvirkes av membran rusk adsorbert på perler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingenting å fortolle.
Acknowledgments
L.B. ble støttet av forskningsmidler Helmut Horten Stiftung og Velux Stiftung, Zürich (Sveits). G.V. ble støttet av forskningsmidler Swiss National Science Foundation, Cecilia-Augusta grunnlaget, Lugano og SHK Stiftung für Herz-und Kreislaufkrankheiten (Sveits)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IMDM | Gibco | 12440061 | |
| Amicon Ultra-15, PLHK Ultracel-PL Membran, 100 kDa | Millipore | UFC910024 | |
| CytoFlex, Flow Cytometer Platform | Beckman Coulter | CytoFlex | |
| DMEM, high glucose, HEPES, no phenol red | Gibco | 21063045 | |
| Dulbecco's PBS (PBS) Ca- and Mg-free | Lonza | BE17-512F | |
| ExoCap CD63 Capture Kit | JSR Life Sciences | Ex-C63-SP | |
| ExoCap CD81 Capture Kit | JSR Life Sciences | Ex-C81-SP | |
| ExoCap CD9 Capture Kit | JSR Life Sciences | Ex-C9-SP | |
| Exosome-Depleted FBS | Thermofisher | A2720801 | |
| Exosome-depleted FBS Media Supplement | SBI | EXO-FBS-250A-1 | |
| FBS-Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270106 | |
| FITC anti-human CD9 Antibody | Biolegend | 312104 RRID: AB_2075894 | |
| Flow Cytometer analysis software | Beckman Coulter | Kaluza | |
| NanoSight LM10 | Malvern | NanoSight LM10 | |
| NanoSight Software | Malvern | NTA 2.3 | |
| Optima Max-XP | Beckman Coulter | 393315 | |
| PE anti-human CD63 Antibody | Biolegend | 353004 RRID:AB_10897809 | |
| PE anti-human CD81 (TAPA-1) Antibody | Biolegend | 349505 RRID:AB_10642024 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Thermomixer C | Eppendorf | 5382 000 015 | |
| TLA-110 | Beckman Coulter | TLA-110 rotors |
References
- Barile, L., Vassalli, G. Exosomes: Therapy delivery tools and biomarkers of diseases. Pharmacology & Therapeutics. , (2017).
- Thery, C. Exosomes: secreted vesicles and intercellular communications. Molecular Biology Reports. 3, 15 (2011).
- Yadav, D. K., et al. Liquid biopsy in pancreatic cancer: the beginning of a new era. Oncotarget. 9, 26900-26933 (2018).
- Balbi, C., et al. First Characterization of Human Amniotic Fluid Stem Cell Extracellular Vesicles as a Powerful Paracrine Tool Endowed with Regenerative Potential. Stem Cells Translational Medicine. 6, 1340-1355 (2017).
- Andriolo, G., et al. Exosomes From Human Cardiac Progenitor Cells for Therapeutic Applications: Development of a GMP-Grade Manufacturing Method. Frontiers in Physiology. 9, (2018).
- Lai, R. C., et al. Exosome secreted by MSC reduces myocardial ischemia/reperfusion injury. Stem Cell Research. 4, (2009).
- Doeppner, T. R., et al. Extracellular Vesicles Improve Post-Stroke Neuroregeneration and Prevent Postischemic Immunosuppression. Stem Cells Translational Medicine. 4, 1131-1143 (2015).
- Kordelas, L., et al. MSC-derived exosomes: a novel tool to treat therapy-refractory graft-versus-host disease. Leukemia. 28, 970-973 (2014).
- Barile, L., et al. Extracellular vesicles from human cardiac progenitor cells inhibit cardiomyocyte apoptosis and improve cardiac function after myocardial infarction. Cardiovascular Research. 103, 530-541 (2014).
- Longatti, A., et al. High affinity single-chain variable fragments are specific and versatile targeting motifs for extracellular vesicles. Nanoscale. 10, 14230-14244 (2018).
- Menck, K., Bleckmann, A., Schulz, M., Ries, L., Binder, C. Isolation and Characterization of Microvesicles from Peripheral Blood. Journal of Visualized Experiments. , (2017).
- Inglis, H., Norris, P., Danesh, A. Techniques for the analysis of extracellular vesicles using flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. , (2015).
- Arakelyan, A., et al. Flow Virometry to Analyze Antigenic Spectra of Virions and Extracellular Vesicles. Journal of Visualized Experiments. , (2017).
- Chimenti, I., et al. Isolation and expansion of adult cardiac stem/progenitor cells in the form of cardiospheres from human cardiac biopsies and murine hearts. Methods Molecular Biology. 879, 327-338 (2012).
- van der Vlist, E. J., Nolte-'t Hoen, E. N., Stoorvogel, W., Arkesteijn, G. J., Wauben, M. H. Fluorescent labeling of nano-sized vesicles released by cells and subsequent quantitative and qualitative analysis by high-resolution flow cytometry. Nature Protocols. 7, 1311-1326 (2012).
- Pospichalova, V., et al. Simplified protocol for flow cytometry analysis of fluorescently labeled exosomes and microvesicles using dedicated flow cytometer. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 25530 (2015).
- van der Pol, E., et al. Particle size distribution of exosomes and microvesicles determined by transmission electron microscopy, flow cytometry, nanoparticle tracking analysis, and resistive pulse sensing. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 12, 1182-1192 (2014).
- Witwer, K. W., et al. Updating the MISEV minimal requirements for extracellular vesicle studies: building bridges to reproducibility. Journal of Extracellular Vesicles. 6, 1396823 (2017).
- Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Current Protocols in Cellular Biology. , Chapter 3, Unit 3.22 (2006).
- Suarez, H., et al. A bead-assisted flow cytometry method for the semi-quantitative analysis of Extracellular Vesicles. Scientific Reports. 7, 11271 (2017).
- Sodar, B. W., et al. Low-density lipoprotein mimics blood plasma-derived exosomes and microvesicles during isolation and detection. Scientific Reports. 6, 24316 (2016).
- Sluijter, J. P. G., et al. Extracellular vesicles in diagnostics and therapy of the ischaemic heart: Position Paper from the Working Group on Cellular Biology of the Heart of the European Society of Cardiology. Cardiovascular Research. 114, 19-34 (2018).
