Summary
Proteom karakterisering af okulær mikrovaskulære senge er afgørende for dybdegående forståelse af mange okulær sygdomme hos mennesker. Denne undersøgelse viser en effektiv, hurtig og robust metode for protein udvinding og forberedelse af prøver fra små blodkar, der beskæftiger de svin kort bageste ciliaere arterier som model skibe til masse-massespektrometri-baseret proteomics analyser.
Abstract
Brug af isolerede okulær blodkar in vitro-at dechifrere den patofysiologiske tilstand i øjet ved hjælp af avancerede teknologiske metoder har stærkt udvidet vores forståelse af visse sygdomme. Massespektrometri (MS)-baseret proteomics fremstod som et kraftfuldt værktøj til at optrævle ændringer i de molekylære mekanismer og protein signalering veje i de vaskulære senge i sundhed og sygdom. Prøven forberedelsestrin før MS analyser er imidlertid afgørende at få reproducerbare resultater og grundig udredning af det komplekse proteomet. Dette er især vigtigt for forberedelse af okulær microvessels, hvor mængden af prøven til analyser er ofte begrænset og således udgør en udfordring for optimal protein udvinding. Denne artikel bestræber sig på at yde en effektiv, hurtig og robust protokol for forberedelse af prøver fra en eksemplarisk retrobulbær okulær vaskulære seng beskæftiger de svin kort bageste ciliaere arterier. De nuværende metode fokuserer på protein ekstraktion procedurer fra både supernatanten og pellet af prøven efter homogenisering, prøve rengøring med centrifugal filter anordningerne inden endimensional gel elektroforese og peptid rensning trin til label-fri kvantificering i en liquid chromatography-electrospray Ionisation-lineær ion trap-Orbitrap MS system. Selvom denne metode er blevet udviklet specielt til proteomics analyser af okulær microvessels, har vi også givet overbevisende beviser for at det kan også være let ansat til andre væv-baserede prøver.
Introduction
Avancement inden for proteomics, hvilke tilladelser integreret og uovertruffen data indsamling magt, har stærkt revolutioneret vores forståelse for de molekylære mekanismer bag visse sygdomstilstande samt som afspejler den fysiologiske tilstand af en bestemt celle population eller væv1,2,3,4. Proteomics har også vist sig for at være en vigtig platform i oftalmologiske forskning på grund af følsomhed og uvildig analyse af forskellige okulær prøver, at den lettere identifikation af potentielle sygdom markører til endelige diagnose og prognose, som fremgår elegant af mange undersøgelser i de seneste år, herunder nogle af vores1,5,6,7,8,9,10. Det er dog ofte vanskeligt at opnå menneskelige prøver for proteom analyser af etiske grunde, især i betragtning af behovet for kontrolmateriale fra raske personer for pålidelig komparative analyser. På den anden side er det også udfordrende at opnå tilstrækkelig mængde af prøver for optimal og pålidelig massespektrometrisk analyser. Dette er især vigtigt for masse-begrænsede biologiske materialer såsom mikro-blodkar i øjet. En sådan større retrobulbær blodkar, som spiller afgørende roller i reguleringen af okulær blodgennemstrømningen er den korte bageste ciliaere arterie (sPCA). Enhver undertrykkelse af netbårne eller uregelmæssigheder i denne vaskulære seng kan resultere i alvorlige kliniske konsekvenser, hvilket kan føre til patogenesen af flere sight-truende sygdomme såsom grøn stær og nonarteritic forreste iskæmisk optisk neuropati (NAION)11 , 12. men der er en manglende undersøgelser belyse proteomet ændringer i denne arteriel sengen på grund af de ovennævnte ulemper. Derfor, i de seneste år, har huset svin (Sus scrofa domestica Linnaeus, 1758) opstået som en god dyremodel i oftalmologiske forskning på grund af de høje morfologiske og fylogenetiske ligheder mellem mennesker og svin13, 14,15. Svin okulær prøver er let tilgængelige og vigtigst, er mere nøjagtig repræsentation af menneskelige væv.
I betragtning af den vigtige rolle af disse blodkar i øjet, samt mangel på metodik sørget for effektiv protein udvinding og analyser fra disse microvessels, har vi tidligere karakteriseret proteomet af svin sPCA ved hjælp af en in-house protokol, der resulterede i identifikation af et stort antal proteiner16. Baseret på denne undersøgelse, har vi yderligere optimeret og beskrevet dybdegående vores metodologi i denne artikel, som tillader proteomet analyse fra små mængder af prøver ved hjælp af de svin sPCA som model væv. Omend det vigtigste formål med denne undersøgelse var at etablere en MS-kompatibel metode til masse-limited okulær blodkar, har vi givet betydelige eksperimentelle bevismateriale at arbejdsprocessen beskrives også kan anvendes bredt til forskellige væv-baserede prøver.
Det er forestillede sig, at denne arbejdsproces vil være medvirkende til forberedelse af høj kvalitet MS-kompatible prøver fra små mængder af materialer til omfattende proteomet analyser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimentelle procedurer ved hjælp af animalske prøver blev udført i nøje overholdelse af foreningen for forskning i Vision og oftalmologi (ARVO) erklæring om brug af dyr i Ophthalmic og Vision forskning og af institutionelle retningslinjer. Denne undersøgelse blev gennemført og godkendt på Institut for oftalmologi, University Medical Center Mainz.
Bemærk: Svin øjne synsnerven og ekstraokulær væv blev indhentet friske fra det lokale slagteri straks efter slagtning. Kerneløse øjne blev transporteret til laboratoriet i iskold fosfatbufferet saltopløsning (PBS) og bruges straks. Den skematiske oversigt over arbejdsgangen ansat er afbilledet i figur 1.
1. løsninger
- For at forberede Krebs-Henseleit (K-H) buffer, vejer de følgende kemikalier (27.68 g NaCl, 8,4 g NaHCO3, 1.4 g af KCl, 1,18 g af MgSO4og 0,64 g KH2PO4) ind i en tør og ren 50 mL konisk centrifugeglas og , 1,47 g CaCl2 og 8,0 g glukose i et andet rør.
Bemærk: Pulver blanding af disse kemikalier skal opbevares på et køligt og tørt sted. CaCl2 og glucose pulver blanding er bedst forberedt friske at forhindre absorption af fugt og sammenklumpning. - For at forberede kit 200 µL af udvinding buffer 2A pr. pellet prøve, mix 100 µL af udvinding buffer 2 og 100 µL af reagens A fra transmembrane protein ekstraktionen (Se B6 i Tabel af materialer).
Bemærk: Alikvot komponenter af den transmembrane protein udvinding kit bestående af ekstraktionsbuffer 2, reagens A og protease hæmmer cocktail i arbejdende dele og opbevares ved-20 ° C til langvarig brug. Undgå gentagen nedfrysning og optøning. Tø reagenser til stuetemperatur (RT) forud for starten af ekstraktionsmetode pellet. - For at forberede ammoniumbicarbonat (ABC, 100 mM) opløsning, opløse 0,39 g af ABC i 50 mL deioniseret vand.
- For at forberede 10 mM opløses 1, 4-dithiothreitol (DTT) løsning, 30 mg DTT i 20 mL af 100 mM ABC.
- For at forberede 55 mM Iodoacetamide (IAA) løsning, 200 mg af IAA i 20 mL af 100 mM ABC opløses.
Bemærk: IAA skal holdes i mørke. Bruge en aluminiumsfolie til wrap rør med lysfølsomme løsninger. - Forberede trypsin buffer indeholdende 10 mM ABC og 10% (vol / vol) acetonitril (ACN). Tilsættes 1,5 mL trypsin buffer i et hætteglas med 20 µg af trypsin at opløse dens indhold til at forberede en 13 ng/µL trypsin brugsopløsning.
Bemærk: Sekventering grade ændret trypsin leveres frysetørret og oplagres på-20 ° C indtil brug. - For at forberede peptid ekstraktionsbuffer, mix 1:2 (v/v) af 5% myresyre med ACN.
Bemærk: Forberede alle løsninger i trin 1.3-1,7 frisk lige inden brug og kassere alle ubrugte volumen. - For at forberede 0,1% trifluoreddikesyre (TFA), mix 10 µL af TFA med 10 mL deioniseret vand.
2. isolering af korte bageste ciliaere arterier
Bemærk: Svin øjet er dybest set opdelt i de forreste (fig. 2A) og bageste afsnit (figur 2B).
- Plads øjet globe i en dissektion salen indeholdende iskold K-H buffer. Omhyggeligt skæres væk omkringliggende muskler og væv med en skarp Mayo saks.
- Gøre et snit med en skalpel og skære globe langs den ækvatoriale fly med en skarp Mayo saks, indtil øjnene er opdelt i de forreste og bagerste halvdele. Fjern som meget glasagtige kroppen som muligt fra den bageste halvdel af øjet ved hjælp af en standard mønster pincet.
Bemærk: Adskillelse af øjet kloden i to halvdele letter isolering af sPCA med lethed uden at have et bevægeligt øje i dissektion parabol. Dette trin er imidlertid ikke obligatorisk. Fartøjerne kan også isoleres uden at åbne øje globe. - Bruge dissektion pins til omhyggeligt pin ned den bageste halvdel af øjet nethinden side ned og synsnerven vender opad mod eksperimentatoren.
- Forsigtigt skære væk bindevævet omkring synsnerven for at afdække de underliggende retrobulbær Vaskulaturen med en studerende markriyor foråret saks.
- SPCA kan ses som korte grene af fartøjer (mellem 5-8 grene), der trænger gennem sclera og circumferentially surround synsnerven hoved (figur 2C). Isolere paraoptic og distale sPCA sammen med de omkringliggende bindevæv med et par type 5 precision pincet og markriyor capsulotomi saks (figur 2D).
Bemærk: Sikre, at K-H buffer forbliver iskold hele proceduren isolation. Det anbefales stærkt at ændre bufferen hver 20-30 min, afhængig af omgivelsernes temperatur.
3. Prøvetilberedning
- Forsigtigt fjerne bindevæv fra de arterielle segmenter ved hjælp af ekstra fin spids type 5 precision pincet og markriyor capsulotomi saks under et stereomikroskop og skyl de isolerede arterier i iskold PBS til at fjerne forurenende stoffer og blod restkoncentrationer.
Bemærk: Hvis prøverne ikke er udsat for de næste skridt straks, snap-fryse dem i flydende nitrogen og butik i-80 ° C indtil videre anvendelse. - Pool arterier fra to øjne til at opnå en biologisk kopiere, overføre dem til 1,5 mL microcentrifuge rør, og vejer prøver ved hjælp af en Analysevægt.
- Hver tube, tilføje en blanding af 0,5 og 1,0 mm zirkonium oxid perler, efterfulgt af væv protein udvinding reagens (T-PER; Se B7 i Tabel af materialer).
Bemærk: Mængden af T-PER er afhængig af vægten af prøverne i hvert rør, med et forhold på 1 mL reagens til 50 mg af prøven. En generel regel af tommelfingeren at følge når lastning rør til homogenisering er en volumen-forholdet på 1:1:2 = prøve: perler: T-PER (fig. 3A). Brug ikke for stor en mængde af ekstraktionsbuffer og for lidt en mængde perler til at forhindre ineffektive homogenisering. - Indlæse prøveglassene i en blender homogeniseringsapparat (Se D6 i Tabel af materialer). Indstil timer til 2 min og hastighed niveau 6, og starte homogenisering. Efter løb, check prøver til fuldstændig homogenisering og gentage cyklus indtil prøver er helt homogeniseret (fig. 3B).
Bemærk: Ialt 24 prøveglassene kan være homogeniseret i en køre. Det er vigtigt at opbevare prøverne kolde i løbet af homogenisering procedure at minimere protein denaturering. Bullet blender homogeniseringsapparat anvendes i denne undersøgelse har en iboende afkøling funktion, der holder prøverne koldt. I tilfælde hvor ingen interne afkøling funktion er tilgængelig i homogeniseringsapparat, kan prøver opbevares på is i mellem hver kørsel. - Omhyggeligt afpipetteres homogenatet i friske microcentrifuge rør. Der centrifugeres prøver på 10.000 x g i 20 min. ved 4 ° C til pellet uopløselige proteiner og separat supernatanten der indeholder opløselige proteiner. Omhyggeligt afpipetteres ud supernatanten i friske microcentrifuge rør uden at røre pellet lag (figur 3C).
Bemærk: Både supernatanten og pellet kan lagres i-80 ° C indtil videre anvendelse.
4. pellet fordøjelsen
- Tilføje 200 µL af udvinding buffer 2A og 5 µL af protease hæmmer cocktail til hver pellet prøve. Suspendere pellet flere gange med en pipette.
Bemærk: Bland udvinding reagenser godt før du tilføjer til pelleten. Holde udvinding buffer 2A på is og protease inhibitor på RT i hele ekstraktionsmetode. -
Bruge en ultrasonic homogeniseringsapparat til helt homogeniseres pellet.
- Indstil amplitude til 60 og cyklus til 1. Bruge en sonde, der er lavet af titanium (Ø 0,5 mm, 80 mm lang), som er relevante for homogenisering af prøver med små mængder (10-500 µL).
- Fordyb sonden i pellet og udvinding buffer blandingen og tryk på startknappen at udsætte prøven til ultralyd bølger.
- Der sonikeres prøven indtil pellet klumper er helt homogeniseret. Pause i et par sekunder mellem hver sonikering.
- Check for fuldstændig homogenisering visuelt. Mix homogenatet flere gange med en pipette til at sikre, at der er ingen klumper.
Bemærk: Pellet udtræk procedure bør udføres på isen for at forhindre protein denaturering på grund af varme, der genereres i løbet af homogenisering (figur 4).
5. prøve rengøring og Buffer Exchange
- Bruge centrifugal filter enheder med 3 kDa cutoff (Se D3 i Tabel af materialer) for denne procedure i henhold til producentens anvisninger med ændringer hvor det er relevant. Første indsætte filterenhed i et microcentrifuge rør (leveres i filter pack).
- Tilsæt 200 µL af prøven homogenatet til ét filter enhed og tilføje 200 µL med deioniseret vand ind i samme filter. Cap det sikkert (figur 5A).
- Placere filterenhed i en centrifuge og spin for 14.000 x g i 15 min. ved 4 ° C.
- Fjern enheden fra centrifugen og separat filterenhed indeholdende prøve koncentrat fra det microcentrifuge rør indeholdende filtratet. Kassér filtratet (figur 5B).
- Rekonstruere koncentratet ved at tilføje 400 µL med deioniseret vand ind i filterenhed. Gentag trin 5.3 og 5.4 tre gange. Omhyggeligt afpipetteres 'renset' prøve koncentrat til en ren microtube.
Bemærk: Typisk, en 200 µL rå prøve vil give ~ 50-70 µL af koncentrat efter filtrering. - Gentag trin 5.1-5.5 for den resterende prøve homogeniseret.
6. protein måling
- Bruge bicinchoninic syre (BCA) protein assay kit (Se B5 i Tabel af materialer) for at bestemme protein koncentrationer af supernatanten og pellet fraktioner i sPCA prøverne på en pladelæseren.
- Forberede albumin standard (BSA) fortyndinger (endelige BSA koncentrationer interval mellem 25 til 2.000 µg/mL) fra en 1 mL ampul bestående af 2 mg/mL BSA, ifølge producentens anvisninger.
- Tilsæt 10 µL af hver BSA standard fortynding og prøve replikater (både supernatanten og pellet) i hver brønd med en 96-godt flad bund mikrotiterplade.
- Forberede BCA arbejder reagens ved at tilføje 50 dele af BCA reagens A 1 del af BCA reagens B.
Bemærk: Beregne den samlede mængde arbejde reagens kræves for hver måling inden forberedelsen og frisk forberede tilstrækkeligt volumen baseret på antallet af prøver og standard fortyndinger til analyseres. - Omhyggeligt afpipetteres 200 µL af BCA arbejder reagens til hver brønd. Dække mikrotiterplade og inkuberes ved 37 ° C i 30 min. Efter afkøling plade til RT, måling af absorbans ved 562 nm på en Pladelæser (Se D13 i Tabel af materialer).
- Baseret på standardkurven genereres for hver BSA standard koncentrationen (µg/mL), bestemme protein koncentrationer af prøverne.
7. endimensional gelelektroforese (1DE)
- Forberede prøverne 1DE som vist i tabel 1 (for et eksempel). Bland prøven blandingen godt med en pipette. Opvarme prøverne ved 70 ° C i 15 min og afkøles til RT.
- Forbered 1 x kører Buffer ved at tilføje 50 mL af MES SDS kører Buffer til 950 mL deioniseret vand. Bland godt.
-
Forberede præfabrikerede 4-12% Bis-Tris protein geler (Se B4 i tabel materialer).
- Skære åbne det plast pose for at fjerne gel kassette og skyl kassette med deioniseret vand.
- Fjern kammen ud af gel kassette i én glidende bevægelser, pas på ikke for at beskadige brøndene.
- Forsigtigt skyl lastning brønde 2 - 3 gange med 1 x kører Buffer ved hjælp af en pipette. Invertere og Ryst forsigtigt gel kassetten for at fjerne den buffer, sikring af, at der ingen luftbobler i brøndene.
- Fjern den hvide tape i bunden af gel kassetter.
- Indsæt geler (maksimalt to kassetter) i gelen kører tank, og når fuldt samlet, lås gel spænding kile.
- Fyld den øverste (katode) buffer kammer med 200 mL af kører Buffer, indtil brøndene er helt dækket. Check for utætheder.
- Tilsættes 500 µL af antioxidant (Se A14 i Tabel af materialer) at den kører Buffer.
Bemærk: Antioxidant er en ordentlighed reagens, der skal bruges med prøver reduceres med reduktionsmiddel (Se tabel 1) for at opretholde de reducerende forhold under elektroforese og at forhindre re-oxidation af følsomme aminosyrer som tryptophan og methionin. - Omhyggeligt indlæses 50 µg prøve pr. vognbane ved hjælp af en pipette. Derefter indlæse pre farves protein standard som Molekylær masse markør (Se A18 i Tabel af materialer).
- Fyld (anode) buffer andetkammer med 600 mL kører Buffer.
- Køre geler til ~ 60 min på en konstant spænding på 175 V. I slutningen af flugt, Fjern forsigtigt gel fra kassette pladen ved hjælp af en gel kniv.
-
Omhyggeligt overføre geler i en gel farvning boks.
- Forberede fastsættelse løsningen friske baseret på det samlede antal geler, der skal farves ifølge producentens instruktioner som beskrevet i tabel 2.
- Ryste gel(s) i den fastsættelse løsning i 10 min på RT på en vuggende platform.
-
Kassér den fastsættelse løsning og bejdse geler med kolloid blå farvning kit.
- Forberede den farvning løsninger friske baseret på det samlede antal geler, der skal farves, ifølge producentens instruktioner som beskrevet i tabel 3.
- Først måle den passende mængde og blande direkte komponenterne i gelen farvning boks er markeret med en asterisk (*). Ryste gel(s) i Farvningsopløsningen uden Stainer B i 10 min på RT på en vuggende platform.
- Tilføje Stainer B direkte ind i farvning kasse indeholdende den * farvning løsning. Sørg for at ryste Stainer B godt før brug.
Forsigtighed: Udføre forberedelsestrin 7.10.1 og 7.11.1 under et stinkskab.
- Ryste gel(s) i Farvningsopløsningen natten for det bedste samlede resultat.
Bemærk: De farvede bånd bliver synlige inden for 10 min efter tilsætning af Stainer B. farvning kræver et minimum af 3 h og intensiteten ikke varierer hvis venstre for overtid i Farvningsopløsningen. - Forsigtigt dekanteres Farvningsopløsningen og erstatte med 200 mL deioniseret vand. Ryst gel(s) i mindst 7-8 timer i vand for at fjerne baggrunden.
Bemærk: Deioniseret vand skal ændres flere gange under den destaining procedure bedre fjerne overdreven pletten. Gel(s) kan også stå i vand i op til 3 dage uden at kompromittere protein band intensitet. Hvis gel(s) ikke udsættes umiddelbart til de næste trin, kan det gemmes i 20% ammonium sulfat løsning ved 4 ° C til langtidsopbevaring.
8. i-gel Tryptic fordøjelse
Bemærk: Denne protokol ifølge metoden af Shevchenko et al.17, med mindre ændringer. Denne procedure bør udføres i en laminar flow hætte og bruge dedikeret sæt af pipetter, tips, rør og glasvarer specifikt til dette formål. Bære handsker og passende lab beklædning på alle tidspunkter for at forhindre keratin og anden forurening. Forberede alle løsninger og reagenser, der anvendes i denne procedure kort før brug.
- Punktafgifter protein bånd fra gel med rene, nye mikrotomen vinger. Skær bandet i små stykker (ca 1 mm x 1 mm 2 mm x 2 mm). Omhyggeligt overføre gel stykker til 1,5 mL microcentrifuge rør.
Bemærk: Stykker, der er for lille kunne blokere pipette tips og større stykker vil reducere peptid opsving. Udøve forsigtighed ved brug af mikrotomen vinger, som er meget skarpe. -
Affarvning
- Tilsæt 500 μL af affarvning løsning indeholdende 100 mM ABC løsning/ACN (1:1, v/v) og inkuberes prøver på RT for 30 min med lejlighedsvis omrystning eller vortexing.
- Omhyggeligt pipette ud af den destaining løsning. Kontroller visuelt for enhver rør med resterende plet. Gentag trin 8.2.1 Hvis gel stykker stadig farves blå.
-
Reduktion og alkylering
- Tilføje ~ 400 µL frisklavede DTT-opløsning og inkuberes ved 56 ° C i 30 min. sørge for, at løsningen helt dækker gel stykker. Omhyggeligt afpipetteres ud af den reducerende løsning og kassér.
- Tilføje ~ 400 µL af frisklavede IAA opløsning og inkuberes i mørke på RT for 30 min. Fjern det alkylerende buffer med en pipette og kassér.
-
Fordøjelsen
- Tilsættes 500 µL af pæn ACN på RT for 10-15 min, indtil gel stykker skrumpe og blive uigennemsigtig. Afpipetteres ud ACN og lufttørre gel stykker for 5-10 min. under kølerhjelmen.
- Med pipette overfoeres 50 µL af trypsin løsning til hvert rør helt dække gel stykker. Inkuber rør i 4 ° C i 30 min.
- Efter 30 min, tjekke hver tube hvis alle trypsin løsning er blevet absorberet af gel stykker. Tilføje tilstrækkeligt volumen af trypsin buffer (50-100 µL, afhængigt af mængden i røret) for at helt dække gel stykker, hvis det er nødvendigt. Inkuber prøver natten over ved 37 ° C.
-
Peptid udvinding
- Omhyggeligt afpipetteres den udpakkede peptid løsning fra rør og overførsel til ren microtubes. Tørre supernatanten i en centrifugal Vakuumfordamper.
Bemærk: Smid ikke de resterende gel stykker. - Tilsæt 100 µL af ekstraktionsbuffer (Se trin 1.7) til hver tube og Inkuber i 30 minutter ved 37 ° C under omrystning.
- Der afpipetteres supernatanten i den samme microtubes, der indeholder de udpakkede peptider ifølge de respektive bands og tørre ned i et vakuum centrifuge.
Bemærk: Hvis ikke anvendes straks, kan tørrede peptid ekstrakter gemmes i-20 ° C op til flere måneder indtil videre anvendelse.
- Omhyggeligt afpipetteres den udpakkede peptid løsning fra rør og overførsel til ren microtubes. Tørre supernatanten i en centrifugal Vakuumfordamper.
9. peptid rensning
Bemærk: Dette peptid eksempelprocedure afsaltning og rensning udføres med brug af Christensen18 pipette tips (Se C15 i Tabel af materialer). Bruge et nyt tip til hver prøve.
- Forberede den følgende løsninger friske i konisk centrifugeglas og delprøve til 2 mL microcentrifuge rør peptid rensning procedure, som vist i tabel 4. Et resumé af rør til peptid rensning er som følger: rør en (prøveopløsning), rør B (befugtning løsning), rør C (ækvilibrering løsning), Tube D (vask løsning), Tube E (eluering løsning), Tube F (en tom 2 mL eller 5 mL microcentrifuge tube, afhængig af antallet af prøver der skal renses for bortskaffelse af affald), og Tube G (en ren, Tom microtube, kapacitet 0,2 mL).
- Rekonstruere tørrede peptid ekstrakter fra trin 8.6.3 med 10 µL af 0,1% TFA. Dette rør er udpeget Tube A.
- Der sonikeres rør A i et ultralydsbad med isbad i 5 min.
- Spin ned prøveopløsningen i en benchtop centrifugeres ved 1.000 x g i 1 min.
- Indstille en P10 mikropipette til den maksimale volumenindstilling af 10 µL og vedhæfte en C18 pipette tip sikkert.
- Fordyb pipette tip til fugtning løsning (Tube B) og omhyggeligt Aspirér i emballagen. Langsomt dispensere affald i Tube F. Gentag dette trin mindst 7 - 8 gange.
Bemærk: Trykkes pipette stemplet til en død stop og langsomt frigive eller undvære stemplet under hele proceduren. Tag forholdsregler for ikke at indføre luftbobler ind i drikkepenge under pipettering for at sikre maksimal peptid binding til C18 kolonne. - Reagensglasset tip for peptid bindende ved sugning 10 µL ækvilibrering løsning i Tube C. kassere løsningen og gentage denne procedure 3 til 4 gange.
- Næste, Aspirér og dispensere prøveopløsningen i rør A flere gange (afhængigt af den tilsvarende gel band tykkelse) for at binde peptider til spids kolonne.
Forsigtighed: Aspiration og udlevering trin under bindende procedure (trin 9,8) gennemføres inden for Tube A. Ikke undvære prøveopløsningen til spilde. - Vask C18 pipette tip ved sugning vask løsning i Tube D og kassere det affald (Tube F) 4 til 5 gange.
- Endelig elueres de bundne peptider af pipettering eluering løsning (Tube E) og udlevering af eluant til rør G.
- Gentag de hele trin 2 til 3 cyklusser pr. prøve at øge prøve opsving.
- Kassér spidsen efter én prøve rensning og bruge et nyt tip til den næste prøve.
- Kemisk renset peptid eluater i et vakuum koncentrator.
Bemærk: Renset prøverne er nu klar til LC-MS/MS analyser i LC-ESI-LTQ-Orbitrap MS system. Gemme de tørrede prøver i-20 ° C indtil videre anvendelse.
10. flydende kromatografi-electrospray Ionisation-MS/MS analyser
Bemærk: Label-fri kvantitative proteomics analyser er udført på en liquid chromatography-electrospray Ionisation-lineær ion trap-Orbitrap (LC-ESI-LTQ-Orbitrap) MS system. LC er sammensat af Rheos Allegro kvaternære pumpe udstyret med en online afgasser (koblet til en HTS PAL autosampler, og systemet består af en 30 mm x 0.5 mm C18 pre kolonne tilsluttet en 150 mm x 0.5 mm C18 kolonne. Brug omvendt fase vandigt opløsningsmiddel A bestående af LC-MS grade vand med 0,1% (v/v) myresyre og organisk opløsningsmiddel B bestående af LC-MS grade acetonitril med 0,1% (v/v) myresyre. Brug gradient med en køretid på 60 min. per gel band, som beskrevet i detaljer i vores tidligere undersøgelser6,16.
- Opløse renset peptid prøver i 10 µL af 0,1% TFA. Der sonikeres prøver på is i 5 min.
- Der afpipetteres 10 µL prøver i en V-bund 96-brønd plade og forsegle med en klar, selvklæbende dække film.
- Overføre pladen til autosampler.
- Brug de følgende forløb for hver køretid på 60 min.: 0-35 min. (15-40% væske B), 35-40 min. (40-60% opløsningsmiddel B), 40-45 min (60-90% opløsningsmiddel B), 45-50 min. (90% opløsningsmiddel B), 50-53 min. (90-10% opløsningsmiddel B) og 53-60 min. (10% opløsningsmiddel B).
- Brug følgende massespektrometrisk betingelser af instrumentet: positiv ion electrospray Ionisation tilstand, spray spænding (2.15 kV), kapillær temperatur (220 ° C), data-afhængige erhvervelse mode, automatiske erhvervelse skifte mellem Orbitrap-MS og LTQ MS/MS, orbitrap opløsning (30.000), m/z vifte (300 til 1.600), mål automatisk gain control (AGC, 1,0 x 106 ioner), interne rekalibrering (polydimethlycyclosiloxane [PCM] på m/z 445.120025 ioner i realtid), låse masse indstillingen aktiveret i MS tilstand, tandem data opnået ved at vælge top fem mest intense forløber ioner, yderligere fragmentering af kollision-induceret dissociation (CID), normaliseres kollisionen energi (NCE, 35% med aktivering tid 30 MS med gentagelsesantal 3) og dynamisk udstødelse varighed (600 s).
Bemærk: De resulterende fragmenterede ioner registreres i LTQ. - Køre mindst tre biologiske flergangsbestemmelser for hver prøve.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Begrænset udsnit tilgængelighed er en af de store ulemper i oftalmologiske forskning. Tilsvarende, udvindingsmetoder for optimal protein udbytte fra små mængder af prøver som okulær blodkar er ofte diskutabel. Til dato, er der en mangel på metoder dækket især protein udvinding fra retrobulbær blodkar. Derfor, som et første trin i metoden optimering og som en proof-of-principle at sammenligne effektivitet og robusthed af flere almindeligvis ansat protein udvinding rengøringsmidler til en relativt nye reagens, T-PER, vi gennemført en pilotundersøgelse, ved hjælp af hjertets væv fra mus (af let og tilstrækkeligt prøve tilgængelighed for optimering trin). Vi sammenlignede protein udbytte ved at sammenligne de samlede protein koncentrationer og samlede proteiner ved hjælp af følgende reagenser: T-PER, 0,02% n-dodecyl-β-D-maltoside (Bettinas), 1% 3-[(3-cholamidopropyl)-dimethylammonio] -1-propan sulfonat (CHAPS), 1% amidosulfobetaine-14 (ASB-14) og en blanding af ACN og TFA (20% ACN / 1% TFA). Det samlede beløb af proteiner i prøverne ekstraheres med hver af disse rengøringsmidler er afbilledet i figur 6A, med det højeste udbytte fra væv udvundet med T-PER (56.4 µg/mg væv), efterfulgt af Bettinas (22.88 µg/mg væv), kæbe (16.01 µg/mg væv), ASB-14 (11.56 µg/mg væv) og det laveste udbytte fra ACN/TFA (4,38 µg/mg væv). Konsekvent, de samlede proteiner identificeret var også den højeste i T pr. ekstraheres prøven (1649 proteiner) > Bettinas (1310 proteiner) > CHAPS (1319 proteiner) > ASB-14 (1121 proteiner) > ACN/TFA (924 proteiner), som vist figur 6B. Baseret på disse resultater, vi fortsatte med protein udvinding fra sPCA prøver med T-PER.
Næste, optimering af prøven forberedelse protokoller forud før fraktionering i 1DE er et meget afgørende skridt til at opnå godt adskilt protein bands og meget reproducerbare resultater mellem prøver og replikater. Betydningen af disse trin reflekteres og fremhævet i resultaterne af 1DE. Figur 7 viser en sammenligning af 1DE protein profiler af sPCA før og efter underkastes den optimerede prøveforberedelsen og rengøring trin. Samlet, en høj grad af udtværing og fattige adskillelse mellem protein bands blev observeret på lane 3. Denne profil viser, at prøverne kan indeholde udvinding reagens og også forurenende stoffer, såsom lipider og celleaffald. Men sPCA prøver der var opdelt i supernatanten og pellet, og underkastes den optimerede protokol resulterede i eksemplarisk 1DE profiler, som er repræsenteret i lane 1 og 2 (figur 7).
I kernen, baseret på disse lovende resultater, metoden optimeret til hurtig, robust og effektiv opløseligt protein ekstraktion fra okulær microvessels beskæftiger væv protein udvinding reagens (T-pr.) og ved hjælp af ekstraktionsbuffer 2A (TM-PEK) til at udtrække membran-baserede proteiner, der findes i prøven pellet. Efterfølgende, prøve homogenater (T-PER fraktion) udsættes for buffer exchange og prøve rengøring med 3 kDa centrifugal filter enheder før 1DE. Den optimale prøve koncentration er 50 µg pr. brønd. På den anden side har det at blive fremhævet her, at denne protokol er ikke kun relevant for små væv såsom blodkar, men er også muligt for andre væv-baserede prøver. Dette fremgår af 1DE profiler murine hjernen, og hjerte væv, som viste, at der er stort antal proteiner, der kan udvindes fra både supernatanten (fig. 8A, B) og pellet fraktioner (figur 8C, D ).
Figur 1 : Oversigt over arbejdsgangen. En skematisk fremstilling af de protokoller, der er ansat for etiket-fri kvantitative proteomet analyse af de svin sPCA. Generelt er denne procedure opdelt i to store afsnit bestående af microvessel prøve præparationstrin og MS-baseret proteomics tilgang. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Repræsentant fotografier af svin øjnene. (A) Lateral Se af øjet globe viser hornhinden, som er placeret i den forreste del af øjet, sclera, omkringliggende muskler og synsnerven. (B) bageste se øje viser synsnerven. (C) grene af sPCA set på bagsiden af øjet globe sammensat af paraoptic og distale grene. (D) isolerede sPCA med omgivende fedt og bindevæv. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Prøve homogenisering. Repræsentant fotografier viser prøve (A) før og (B) efter homogenisering. (C) den homogeniserede prøver blev yderligere opdelt i supernatanten der indeholder opløselige proteiner og pellet indeholdende uopløselige, transmembrane-baserede proteiner. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : Pellet protein ekstraktionsmetode. For at undgå protein denaturering, udpakkes pellet prøver på is. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5 : Prøve rengøring. Buffer exchange er udført med 3 kDa cutoff centrifugal filtre til at rense prøver før MS analyse. Repræsentant fotografier viser homogenatet (A) før og (B) efter filtrering. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6 : Sammenligning af protein udvinding effektivitet og robusthed mellem T-PER og fire fælles protein udvinding rengøringsmidler. Søjlediagrammer skildrer (A) protein beløb og (B) samlet antal proteiner ved hjælp af T-PER, 0,02% Bettinas, 1% CHAPS, 1% ASB-14 og 20% ACN / 1% TFA. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7 : Repræsentant 1DE gel af svin sPCA protein profiler før og efter optimering. Lane 3 skildrer 1DE profil af stikprøven, som ikke blev udsat for nogen forudgående rengøring trin. Lane 1 og 2 viser eksemplarisk protein profiler af sPCA supernatanten og pellet, henholdsvis efter at underkaste prøverne de optimerede prøveforberedelsen og rengøring trin. Gel var plettet med kolloid blå farvning kit. M = markør. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 8 : Repræsentant kolloid blå-farvede 1DE gel eksemplarisk væv-baserede prøver. Protein profiler af supernatanten (A, B) og pellet (C, D) murine hjernen, og hjerte væv prøver henholdsvis på 50 µg pr. brønd. Supernatanten og pellet proteiner blev udvundet beskæftiger T-PER og transmembrane protein udvinding kit, henholdsvis. M = markør. R1-R3 repræsenterer tre replikater. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Komponent | Volumen (µL) |
| Prøven (supernatanten eller pellet) | x |
| SDH prøve Buffer (4 x) | 2.5 |
| Reduktionsmiddel (10 x) | 1 |
| Ionbyttet vand | Op til 6,5 (afhængigt af sample volumen) |
| Samlede volumen pr. prøve | 10 |
| Bemærk: x er beregnet baseret på proteinkoncentration (50 µg total protein pr. prøve). | |
Tabel 1:1 Dimensional gelelektroforese (1DE). Detaljer om de komponenter, der kræves for prøveforberedelse til at udføre 1DE.
| Løsning | For 1 gel (mL) | For 2 geler (mL) | For 4 gels (mL) |
| Ionbyttet vand | 40 | 80 | 160 |
| Methanol | 50 | 100 | 200 |
| Eddikesyre | 10 | 20 | 40 |
Tabel 2: Gel fiksering. Detaljer om de komponenter, der kræves til at forberede 1DE fastsættelse løsning.
| Løsning | For 1 gel (mL) | For 2 geler (mL) | For 4 gels (mL) |
| * Ionbyttet vand | 55 | 110 | 220 |
| * Methanol | 20 | 40 | 80 |
| * Stainer A | 20 | 40 | 80 |
| Stainer B | 5 | 10 | 20 |
Tabel 3: Gel farvning. Oplysninger om komponenter til forberedelse af den kolloid blå farvning løsning.
| Løsning (for) | Sammensætning | ACN ** | H2O ** | TFA | Samlede volumen * |
| Fugte | 100% ACN | 2 mL | 2 mL | ||
| #Washing og ækvilibrering | 0,1% TFA | 10 mL | 10 ΜL | ~ 10 mL | |
| Peptid eluering | 0,1% TFA i 60: 40 = ACN: H2O | 6 mL | 4 mL | 10 ΜL | ~ 10 mL |
| Bemærk: * den samlede mængde bør justeres efter det samlede antal prøver, der skal underkastes Zip Tip rengøring. | |||||
| ** Brug HPLC-grade eller LC-MS-grade. | |||||
| # Forbered to separate Eppendorf-rør til vask og ækvilibrering, henholdsvis. | |||||
Tabel 4: peptid rensning. Oplysninger om komponenterne og deres respektive kompositioner for peptid rensning procedure ved hjælp af C18 pipette tips.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Omfattende proteomet profilering af en bred vifte af okulær prøver er en vigtig og uundværlig første skridt til at belyse molekylære mekanismer og signalering veje impliceret i sundhed og sygdom. For at få data af høj kvalitet og sikre reproducerbarheden af resultaterne fra disse analyser de foregående prøve forberedelsestrin er vigtigt, som understreget i en anmeldelse af Mandal et al., diskuteres indgående prøve behandling procedurer til forskellige dele af øjet beskæftiger to-dimensionelle gel elektroforese og masse massespektrometri strategi1. I linje af disse undersøgelser giver vores nuværende undersøgelse en optimeret trinvise protokol for hurtig, robust og yderst effektive MS-kompatible prøveforberedelse ved hjælp af de svin sPCA som model okulær microvessels. Denne undersøgelse blev indledt på grundlag af mangel på specifikke metoder til at udtrække tilstrækkelige mængder af proteiner fra kvantitet-indskrænket arteriel prøver at skabe høj kvalitet MS data. Vores metode er også et forsøg på at bidrage til den eksisterende organ viden om brugen af mikro-skala teknikker, der giver fremragende proteomet kortlægning18.
Der er flere kritiske aspekter i denne forsøgsplan, som skal tages i betragtning for optimal ydeevne for en kvantitativ proteom-analyse. For det første er det vigtigt, at prøverne, uanset beløb, er udsat for fuldstændig homogenisering at sikre optimal protein udvinding. I vores metode var brug af en blanding af forskellige størrelse perler og bullet blender homogeniseringsapparat medvirkende til komplet væv lysering. Type og størrelse af perler bruges afhænger af prøvetype og mængde. Perler med højere tætheder, som i øjeblikket udnyttet ZrO2 og rustfrit stål, er velegnet til medium-hårde væv og arbejdede især godt for blodkar.
For det andet er det bydende nødvendigt at adskille supernatanten fra pellet og underkaste den sidstnævnte for fordøjelsen og udvinding ved hjælp af den angivne kit. Dette trin er afgørende for at udtrække høj molekylvægt proteiner såsom transmembrane proteiner, som ellers er vanskeligt at homogenisere bruge milde rengøringsmidler19,20,21. Udfældet pellet opløses bedst ved hjælp af sonikering for at undgå prøve tab af splash-up indført under energisk agitation eller ryster metoder.
For det tredje er det bemærkelsesværdigt at alle prøve forberedelse procedurer udføres ved lav temperatur (4 ° C), medmindre andet er angivet i metoden. Dette er at sikre minimal protein denaturering under ekstraktion procedurer. Fjerde, gentagne fryse-optøning af prøverne bør undgås for at forhindre protein nedbrydning og forringelse af prøven kvalitet.
Endelig, fjernelse af forurenende stoffer og vaske-og rengøringsmidler er nødvendige efter protein udvinding at forhindre downstream interferens under i-gel fraktionering, enzymatisk fordøjelse og MS analyse18,22. Disse forurenende stoffer forstyrrer ofte beslutning om elektroforetisk adskillelse og tilsvarende, påvirke visualisering af resultatet, som vist i 1DE profil (figur 7). For at omgå dette problem, er brugen af centrifugal cutoff filter enheder begunstiget for deres brugervenlighed og minimal protein tab.
Selv om de nuværende eksperimentelle procedurer giver en dybdegående outlook i vigtige prøve forberedelsestrin for optimal etiket-fri kvantitative MS analyser, er der to begrænsninger. Først, sPCA prøver var samlet fra to svin øjne til at give tilstrækkelige mængder af væv til efterfølgende analyse. Da øjnene fra det lokale slagteri er randomiseret og det vides derfor ikke om blodkarrene er isoleret fra øjnene af de samme dyr, afbøder prøve pooling mellem individuelle variationer5,6. Den nuværende metode kan dog også tilpasses for individuelle prøveforberedelse afhængigt af mængden af prøver, der er tilgængelige. Den præsenterede metode har andet er blevet udviklet specielt til 1DE gel-baserede fraktionering. Selv om foreneligheden af den nuværende metode for integration med top-down og andre metoder til fraktionering garanterer undersøgelse, vi har valgt 1DE på grund af flere faktorer spænder fra god reproducerbarhed, lethed af kvalitetskontrol til bedre dybde af analyser , især for komplekse prøver som i øjeblikket eksemplificeret okulær blodkar1,5,23.
Til sidst, trods de begrænsninger, der er fremhævet ovenfor, repræsenterer beskrevet arbejdsprocessen en enkel, men effektiv tilgang til strenge prøve forberedelsestrin catered specielt til analyse af små beløb af blodkar. Det er også vigtigt at understrege her, at denne metode kan let integreres til massespektrometri-baseret proteom analyse af andre celle - og tissue-baserede prøver.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Dr. Manicam er understøttet af de interne Universitet forskningsmidler (Stufe 1) fra University Medical Center af Johannes Gutenberg Universitet Mainz og tilskud fra Deutsche Forschungsgemeinschaft (MA 8006/1-1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A. Chemicals | |||
| 1, 4-Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 1.11474 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2) | Carl Roth | 5239.1 | 2.5 mM |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190169 | |
| Formic acid (CH2O2) | AppliChem | A0748 | |
| HPLC-grade acetonitrile (ACN, C2H3N) | AppliChem | A1605 | |
| HPLC-grade methanol (CH3OH) | Fisher Scientific | M/4056/17 | |
| HPLC-grade water | AppliChem | A1589 | |
| Iodoacetamide (IAA) | Sigma-Aldrich | I6125 | |
| Kalium chloride (KCl) | Carl Roth | 6781.1 | 4.7 mM |
| Kalium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Carl Roth | 3904.2 | 1.2 mM |
| LC-MS-grade acetic acid | Carl Roth | AE69.1 | |
| Magnesium sulphate (MgSO4) | Carl Roth | 261.2 | 1.2 mM |
| NuPAGE Antioxidant | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | NP0005 | |
| NuPAGE LDS Sample buffer | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | NP0007 | 4x |
| NuPAGE MES SDS Running Buffer | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | NP0002 | 20x |
| NuPAGE Sample reducing agent | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | NP0004 | 10x |
| SeeBlue Plus2 pre-stained protein standard | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | LC5925 | |
| Sequencing grade modified trypsin | Promega | V5111 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Carl Roth | 9265.2 | 118.3 mM |
| Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) | Carl Roth | 965.3 | 25 mM |
| Trifluoroacetic acid (TFA, C2HF3O2) | Merck Millipore | 108178 | |
| α-(D)-(+)- Glucose monohydrate | Carl Roth | 6780.1 | 11 mM |
| B. Reagents and Kits | |||
| 0.5 mm zirconium oxide beads | Next Advance | ZROB05 | |
| 1.0 mm zirconium oxide beads | Next Advance | ZROB10 | |
| Colloidal Blue Staining Kit | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | LC6025 | To stain 25 mini gels per kit |
| NuPAGE 4-12 % Bis-Tri gels | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | NP0321BOX | 1.0 mm, 10-well |
| Pierce Bicinchoninic Acid (BCA) Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| ProteoExtract Transmembrane Protein Extraction Kit, TM-PEK | Merck Millipore | 71772-3 | 20 reactions per kit |
| Tissue Protein Extraction Reagent (T-PER) | Thermo Scientific | 78510 | |
| C. Tools | |||
| 96-well V-bottom plates | Greiner Bio-One | 651180 | |
| Corning 96-well flat-bottom plates | Sigma-Aldrich | CLS3595-50EA | |
| Disposable microtome blades | pfm Medical | 207500014 | |
| Disposable scalpels #21 | pfm Medical | 200130021 | |
| Dissection pins | Carl Roth | PK47.1 | |
| Extra Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Falcon conical centrifuge tubes (50 mL) | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Mayo scissors, Tough cut | Fine Science Tools | 14130-17 | |
| Precision tweezers | Fine Science Tools | 11251-10 | Type 5 |
| Precision tweezers, straight with extra fine tips | Carl Roth | LH53.1 | Type 5 |
| Self-adhesive sealing films for microplates | Ratiolab (vWR) | RATI6018412 | |
| Standard pattern forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | |
| Student Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 91501-09 | |
| Vannas capsulotomy scissors | Geuder | 19760 | Straight, 77 mm |
| ZipTipC18 pipette tips | Merck Millipore | ZTC18S096 | |
| D. Equipment and devices | |||
| 150 × 0.5 mm BioBasic C18 column | Thermo Scientific, Rockford, USA | 72105-150565 | |
| 30 × 0.5 mm BioBasic C18 pre-column | Thermo Scientific, Rockford, USA | 72105-030515 | |
| Amicon Ultra-0.5 3K Centrifugal Filter Devices | Merck Millipore | UFC500396 | Pack of 96. |
| Analytical balance | Sartorius | H51 | |
| Autosampler | CTC Analytics AG, Zwingen, Switzerland | HTS Pal | |
| BBY24M Bullet Blender Storm | Next Advance | NA-BB-25 | |
| Eppendorf concentrator, model 5301 | Sigma-Aldrich | Z368172 | |
| Eppendorf microcentrifuge, model 5424 | Fisher Scientific | 05-403-93 | Non-refrigerated |
| Heraeus Primo R Centrifuge | Thermo Scientific | 75005440 | Refrigerated |
| Labsonic M Ultrasonic homogenizer | Sartorius | BBI-8535027 | |
| LC-MS pump, model Rheos Allegro | Thermo Scientific, Rockford, USA | 22080 | |
| LTQ Orbitrap XL mass spectrometer | Thermo Scientific, Bremen, Germany | ||
| Multiskan Ascent plate reader | Thermo Labsystems | v2.6 | |
| Rotator with vortex | neoLab | 7-0045 | |
| Titanium probe (Ø 0.5 mm, 80 mm long) | Sartorius | BBI-8535612 | |
| Ultrasonic bath, type RK 31 | Bandelin | 329 | |
| Xcell Surelock Mini Cell | Life Technologies | El0001 |
References
- Mandal, N., Heegaard, S., Prause, J. U., Honoré, B., Vorum, H. Ocular proteomics with emphasis on two-dimensional gel electrophoresis and mass spectrometry. Biological Procedures Online. 12, 56-88 (2010).
- Gregorich, Z. R., Ge, Y. Top-down proteomics in health and disease: Challenges and opportunities. Proteomics. 14, 1195-1210 (2014).
- Aebersold, R., Mann, M.
- Aebersold, R., Mann, M. Mass-spectrometric exploration of proteome structure and function. Nature. 537, 347-355 (2016).
- Cehofski, L. J., Mandal, N., Honoré, B., Vorum, H.
- Manicam, C., et al. Proteomics Unravels the Regulatory Mechanisms in Human Tears Following Acute Renouncement of Contact Lens Use: A Comparison between Hard and Soft Lenses. Scientific Reports. 8, 11526 (2018).
- Perumal, N., Funke, S., Pfeiffer, N., Grus, F. H. Characterization of lacrimal proline-rich protein 4 (PRR 4) in human tear proteome. Proteomics. 14, 1698-1709 (2014).
- Perumal, N., Funke, S., Pfeiffer, N., Grus, F. H. Proteomics analysis of human tears from aqueous-deficient and evaporative dry eye patients. Scientific Reports. 6, 29629 (2016).
- Perumal, N., Funke, S., Wolters, D., Pfeiffer, N., Grus, F. H. Characterization of human reflex tear proteome reveals high expression of lacrimal proline-rich protein 4 (PRR4). Proteomics. 15, 3370-3381 (2015).
- Perumal, N., et al. Characterization of the human aqueous humour proteome: A comparison of the genders. PloS ONE. 12, 0172481 (2017).
- Hayreh, S. S. Posterior ciliary artery circulation in health and disease the Weisenfeld lecture. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45, 749-757 (2004).
- Zeitz, O., et al. Glaucoma progression is associated with decreased blood flow velocities in the short posterior ciliary artery. British Journal of Ophthalmology. 90, 1245-1248 (2006).
- Verma, N., Rettenmeier, A. W., Schmitz-Spanke, S. Recent advances in the use of Sus scrofa (pig) as a model system for proteomic studies. Proteomics. 11, 776-793 (2011).
- Foulds, W. S., Kek, W. K., Luu, C. D., Song, I. C., Kaur, C. A porcine model of selective retinal capillary closure induced by embolization with fluorescent microspheres. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51, 6700-6709 (2010).
- Sanchez, I., Martin, R., Ussa, F., Fernandez-Bueno, I.
- Manicam, C., Perumal, N., Pfeiffer, N., Grus, F. H., Gericke, A. First insight into the proteome landscape of the porcine short posterior ciliary arteries: Key signalling pathways maintaining physiologic functions. Scientific Reports. 6, 38298 (2016).
- Shevchenko, A., Tomas, H., Havli, J., Olsen, J. V., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nature Protocols. 1, 2856-2860 (2006).
- Feist, P., Hummon, A. B. Proteomic challenges: sample preparation techniques for microgram-quantity protein analysis from biological samples. International Journal of Molecular Sciences. 16, 3537-3563 (2015).
- Cox, B., Emili, A. Tissue subcellular fractionation and protein extraction for use in mass-spectrometry-based proteomics. Nature Protocols. 1, 1872-1878 (2006).
- Zhang, L., et al. Proteomic analysis of mouse liver plasma membrane: use of differential extraction to enrich hydrophobic membrane proteins. Proteomics. 5, 4510-4524 (2005).
- Zhou, H., et al. Improved recovery and identification of membrane proteins from rat hepatic cells using a centrifugal proteomic reactor. Molecular & Cellular Proteomics. 10, 111 (2011).
- de la Cuesta, F., Mourino-Alvarez, L., Baldan-Martin, M., Moreno-Luna, R., Barderas, M. G. Contribution of proteomics to the management of vascular disorders. Translational Proteomics. 7, 3-14 (2015).
- Cottingham, K. 1DE proves its worth... again. Journal of Proteome Research. 9, 1636 (2010).
