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Biology

ocular microvessels के मास स्पेक्ट्रोमेट्री आधारित proteomics विश्लेषण के लिए नमूना तैयारी

Published: February 22, 2019 doi: 10.3791/59140
Automatic Translation
*1, 1, 1, 1, 1, 1, *1
1Department of Ophthalmology, University Medical Centre of the Johannes Gutenberg University Mainz
* These authors contributed equally

Summary

नेत्र सूक्ष्मवाहिकीय बिस्तरों के proteome लक्षण वर्णन मनुष्यों में कई नेत्र विकृतियों की गहराई से समझने के लिए निर्णायक है । इस अध्ययन को दर्शाता है एक प्रभावी, तेजी से, और प्रोटीन निष्कर्षण के लिए मजबूत विधि और छोटे रक्त वाहिकाओं से नमूना तैयार करने के लिए मॉडल जहाजों के रूप में सुअर का लघु पीछे सिलिअरी धमनियों को रोजगार मास स्पेक्ट्रोमेट्री आधारित प्रोटिओमिक्स विश्लेषण.

Abstract

विट्रो में पृथक नेत्र रक्त वाहिकाओं का उपयोग करने के लिए आंख की pathophysiological राज्य को समझने के लिए उंनत तकनीकी दृष्टिकोण का उपयोग कर बहुत कुछ रोगों के बारे में हमारी समझ का विस्तार किया है । मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस)-आधारित प्रोटिओमिक्स एक शक्तिशाली उपकरण के रूप में उभरा है आणविक तंत्र और स्वास्थ्य और रोग में संवहनी बिस्तरों में प्रोटीन संकेतन रास्ते में परिवर्तन जानने के लिए. हालांकि, नमूना तैयारी कदम से पहले एमएस विश्लेषण करने के लिए प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है और में जटिल proteome की गहराई से आलोचनीय । यह विशेष रूप से नेत्र microvessels की तैयारी के लिए महत्वपूर्ण है, जहां विश्लेषण के लिए उपलब्ध नमूना की मात्रा अक्सर सीमित है और इस प्रकार, इष्टतम प्रोटीन निष्कर्षण के लिए एक चुनौती बन गया है । इस लेख में एक अनुकरणीय रेट्रोब्लबार नेत्र संवहनी बिस्तर से नमूना तैयार करने के लिए एक कुशल, तेजी से और मजबूत प्रोटोकॉल प्रदान करने के लिए प्रयास सुअर का कम पीछे सिलिअरी धमनियों. वर्तमान विधि से प्रोटीन निष्कर्षण प्रक्रियाओं पर ध्यान केंद्रित दोनों सतह पर तैरनेवाला और नमूना निम्नलिखित homogenization के गोली, नमूना केन्द्रापसारक फिल्टर उपकरणों के साथ सफाई से पहले एक आयामी जेल वैद्यरसंचलन और पेप्टाइड शुद्धि के लिए लेबल के लिए कदम-मुक्त परिमाणन में एक तरल क्रोमेटोग्राफी-इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण-रैखिक आयन ट्रैप-ऑर्करैप एमएस सिस्टम । हालांकि इस पद्धति को विशेष रूप से नेत्र microvessels के प्रोटिओमिक्स विश्लेषण के लिए विकसित किया गया है, हम भी ठोस सबूत है कि यह भी आसानी से अंय ऊतक आधारित नमूनों के लिए नियोजित किया जा सकता है प्रदान की गई है ।

Introduction

प्रोटियोमिक्स के क्षेत्र में प्रगति, जो एकीकृत और नायाब डेटा संग्रह शक्ति परमिट, बहुत कुछ रोग की स्थिति में अंतर्निहित आणविक तंत्र की हमारी समझ में क्र ांतिकारी परिवर्तन के रूप में के रूप में अच्छी तरह से प्रतिबिंबित में एक विशिष्ट कोशिका जनसंख्या या ऊतक1,2,3,4की शारीरिक स्थिति । proteomics भी विभिन्न नेत्र नमूनों की संवेदनशीलता और निष्पक्ष विश्लेषण है कि अंतिम निदान और रोग का निदान के लिए संभावित रोग मार्कर की पहचान की सुविधा के कारण नेत्र अनुसंधान में एक महत्वपूर्ण मंच साबित हो गया है, के रूप में हाल के वर्षों में कई अध्ययनों से सुंदर ढंग से सबूत, हमारा1,5,6,7,8,9,10में से कुछ सहित । तथापि, यह अक्सर नैतिक कारणों की वजह से proteomic विश्लेषण के लिए मानव नमूने प्राप्त करने के लिए मुश्किल है, विशेष रूप से विश्वसनीय तुलनात्मक विश्लेषण के लिए स्वस्थ व्यक्तियों से नियंत्रण सामग्री के लिए की जरूरत पर विचार. दूसरी ओर, यह इष्टतम और विश्वसनीय द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमेट्रिक विश्लेषण के लिए पर्याप्त मात्रा में नमूनों को प्राप्त करना भी चुनौतीपूर्ण है । यह विशेष रूप से जन-सीमित जैविक सामग्रियों के लिए महत्वपूर्ण है जैसे कि आंख की सूक्ष्म रक्त वाहिकाओं । ऐसा ही एक प्रमुख रेट्रोब्यूलर रक्त वाहिका जो नेत्र रक्त प्रवाह के विनियमन में निर्णायक भूमिका निभाता है, वह छोटी पश् चवर्ती पित्त धमनी (एसपीसीए) है । इस संवहनी बिस्तर में कोई भी क्षोभ या विसंगतियों गंभीर नैदानिक नतीजों में परिणाम हो सकता है, जो कई दृष्टि-धमकी वाले रोगों जैसे ग्लूकोमा और नोन्टेरिटिक पूर्वकाल इस्कीमिक ऑप्टिक न्यूरोपैथी (naion) के रोगजनन के लिए नेतृत्व कर सकते हैं11 , 12. हालांकि, उपर्युक्त कमियों के कारण इस धमनी बिस्तर में प्रोटीयोम परिवर्तन को कम करने वाले अध्ययनों की कमी है । इसलिए, हाल के वर्षों में, घर सूअर (Sus scrofa डोमेस्टिका linnaeus, १७५८) मानव और13सूअरों के बीच उच्च सुघड़ और जातिवृत् तीय समानताएं के कारण नेत्र अनुसंधान में एक अच्छा जानवर मॉडल के रूप में उभरा है, 14,15. porcine नेत्र नमूने आसानी से उपलब्ध हैं और सबसे महत्वपूर्ण बात, मानव ऊतकों का अधिक सटीक प्रतिनिधित्व कर रहे हैं.

आंख में इन रक्त वाहिकाओं की महत्वपूर्ण भूमिका को ध्यान में रखते हुए, के रूप में अच्छी तरह के रूप में कार्यपद्धति की कमी कुशल प्रोटीन निष्कर्षण और इन microvessels से विश्लेषण के लिए catered, हम पहले से सुअर का spca के proteome विशेषता है एक में घर का उपयोग प्रोटोकॉल है कि16प्रोटीन की एक उच्च संख्या की पहचान के परिणामस्वरूप । इस अध्ययन के आधार पर, हम और अधिक अनुकूलित और वर्णित में गहराई से इस लेख में हमारी पद्धति है, जो नमूनों की मिनट मात्रा से proteome विश्लेषण की अनुमति देता है मॉडल ऊतक के रूप में सुअर का spca का उपयोग । जबकि इस अध्ययन का मुख्य उद्देश्य जन-सीमित नेत्र रक्त वाहिकाओं के लिए एक एमएस-संगत पद्धति स्थापित करने के लिए किया गया था, हम पर्याप्त प्रयोगात्मक सबूत है कि वर्णित कार्यप्रवाह भी मोटे तौर पर विभिन्न ऊतक आधारित नमूनों के लिए लागू किया जा सकता है प्रदान की गई है.

यह कल्पना की है कि इस कार्यप्रवाह व्यापक proteome विश्लेषण के लिए सामग्री की छोटी मात्रा से उच्च गुणवत्ता एमएस-संगत नमूनों की तैयारी के लिए महत्वपूर्ण भूमिका निभाई होगी ।

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Protocol

सभी प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं पशु नमूनों का उपयोग दृष्टि और नेत्र विज्ञान में अनुसंधान के लिए एसोसिएशन के लिए सख्त पालन में प्रदर्शन किया गया (arvo) नेत्र और दृष्टि अनुसंधान और संस्थागत दिशा निर्देशों के द्वारा पशुओं के उपयोग के लिए वक्तव्य. यह अध्ययन नेत्र विज्ञान विभाग, विश्वविद्यालय चिकित्सा केंद्र मेंज़ में आयोजित और अनुमोदित किया गया था ।

नोट: ऑप्टिक तंत्रिका और असाधारण ऊतकों के साथ एक साथ porcine आँखें स्थानीय वक्षताकार तुरंत पोस्टमार्टम से ताजा प्राप्त किया गया. enucleated आंखें बर्फ में प्रयोगशाला में ले जाया गया ठंडा फॉस्फेट buffered खारा (pbs) और तुरंत इस्तेमाल किया । नियोजित कार्यप्रवाह का योजनाबद्ध अवलोकन चित्र 1में दर्शाया गया है ।

1. समाधान

  1. क्रेब्स-हेनसेलीत (K-H) बफर तैयार करने के लिए, निम्नलिखित रसायनों का वज़न (२७.६८ ग्राम की nacl, नहको3की ८.४ ग्राम, एमजीएसओ की १.४ ग्राम, १.१८ ग्राम की mgso4और ०.६४ ग्राम के ख2पीओ4) को एक शुष्क और स्वच्छ ५० मिलीलीटर शंकु अपकेंद्रिका ट्यूब में और , १.४७ जी के cacl2 और ८.० जी ग्लूकोज की एक और ट्यूब में.
    नोट: इन रसायनों के पाउडर मिश्रण को ठंडे और सूखी जगह पर संग्रहित किया जाना चाहिए । cacl2 और ग्लूकोज पाउडर मिश्रण सबसे अच्छा तैयार करने के लिए नमी और clumping के अवशोषण को रोकने के ताजा है ।
  2. गोली नमूना प्रति निष्कर्षण बफर 2a के २०० μl तैयार करने के लिए, मिश्रण १०० μl के निष्कर्षण बफर 2 और अभिकर्मक एक के १०० μl ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीन निष्कर्षण किट से (देखें बी-6 सामग्री की तालिकामें) ।
    नोट: लंबे समय तक उपयोग के लिए काम भागों में निष्कर्षण बफर 2, अभिकर्मक एक और प्रोटीज अवरोधक कॉकटेल शामिल ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीन निष्कर्षण किट के घटकों aliquot और-20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर । दोहराया ठंड और गल से बचें । अभिकर्मकों को कमरे के तापमान (आरटी) को गोली निष्कर्षण प्रक्रिया के प्रारंभ से पहले गल दें ।
  3. अमोनियम बाइअरबोनेट (एबीसी, १०० मिमी) समाधान तैयार करने के लिए, विआयनित पानी के ५० एमएल में एबीसी के ०.३९ जी को भंग करें ।
  4. 10 मिमी 1, 4-डाइथायोथ्रिटॉल (डीटीटी) समाधान तैयार करने के लिए, १०० मिमी एबीसी के 20 मिलीलीटर में डीटीटी के 30 मिलीग्राम को भंग करें ।
  5. ५५ मिमी आयोडोएसिटामाइड (आईएए) समाधान तैयार करने के लिए, १०० मिमी एबीसी के 20 मिलीलीटर में आईएए के २०० मिलीग्राम को भंग करें ।
    नोट: iaa अंधेरे में रखा जाना चाहिए । एक एल्यूमीनियम पन्नी का उपयोग करने के लिए प्रकाश संवेदनशील समाधान के साथ ट्यूबों लपेटो ।
  6. 10 मिमी एबीसी और 10% (vol/vol) acetonitrile (acn) युक्त ट्रिप्सिन बफर तैयार करें । ट्रिप्सिन के 20 μg की एक शीशी में ट्रिप्सिन बफर के १.५ मिलीलीटर जोड़ें अपनी सामग्री को भंग करने के लिए एक 13 एनजी/μl ट्रिप्सिन काम समाधान तैयार करने के लिए ।
    नोट: अनुक्रमण ग्रेड संशोधित ट्रिप्सिन lyophilized की आपूर्ति की है और उपयोग तक-20 डिग्री सेल्सियस में संग्रहित किया जाना चाहिए ।
  7. पेप्टाइड निष्कर्षण बफर तैयार करने के लिए, acn के साथ 5% फॉर्मिक एसिड के 1:2 (v/v) मिलाएं ।
    नोट: चरणों में सभी समाधान तैयार 1.3-1.7 ताजा बस का उपयोग करने से पहले और किसी भी अप्रयुक्त मात्रा त्यागें.
  8. ०.१% trifluoroacetic एसिड (tfa) तैयार करने के लिए, 10 मिलीलीटर विआयनीकृत पानी के साथ tfa के 10 μl मिश्रण ।

2. लघु पश् चवर्ती पित्त धमनियों का पृथक्करण

नोट: सुअर का आंख मूल रूप से पूर्वकाल में विभाजित है (चित्रा 2ए) और पीछे वर्गों (चित्रा 2बी).

  1. एक विच्छेदन बर्फ से युक्त कक्ष में नेत्र ग्लोब प्लेस-शीत कश्मीर एच बफर । ध्यान से तेजी मेयो कैंची की एक जोड़ी के साथ मांसपेशियों और ऊतकों के आसपास दूर काट.
  2. एक स्केलपेल के साथ एक चीरा बनाने के लिए और आंख पूर्वकाल और पीछे halves में अलग कर दिया जाता है जब तक तेज मेयो कैंची की एक जोड़ी के साथ भूमध्यवर्ती विमान के साथ दुनिया में कटौती । मानक पैटर्न संदंश की एक जोड़ी का उपयोग कर आंख के पीछे आधा से संभव के रूप में ज्यादा के रूप में काचाभ शरीर को हटा दें ।
    नोट: दो हिस्सों में आँख ग्लोब की जुदाई विच्छेदन डिश में एक चलती आंख के बिना आसानी से spca के अलगाव की सुविधा । हालांकि, यह चरण अनिवार्य नहीं है । जहाजों को भी आंख ग्लोब खोलने के बिना अलग किया जा सकता है ।
  3. विच्छेदन पिन का उपयोग ध्यान से नीचे रेटिना पक्ष के साथ आंख के पीछे आधा पिन और ऑप्टिक तंत्रिका experimenter की ओर का सामना करना पड़.
  4. धीरे दूर ऑप्टिक तंत्रिका आसपास के संयोजी ऊतकों को छात्र vannas वसंत कैंची की एक जोड़ी के साथ अंतर्निहित रेट्रोब्यूबार vasculature बेनकाब काट ।
  5. spca (5-8 शाखाओं के बीच) जहाजों की छोटी शाखाओं के रूप में देखा जा सकता है कि श्वेतपटल घुसना और ऑप्टिक तंत्रिका सिर के चारों ओर परिधीय (चित्रा 2सी) । प्रकार की एक जोड़ी के साथ आसपास के संयोजी ऊतकों के साथ पैराऑप्टिक और डिस्टल spca को अलग करें 5 प्रेसिजन चिमटी और vannas capsulotomy कैंची (चित्रा 2डी) ।
    नोट: सुनिश्चित करें कि K-H बफ़र आइसोलेशन प्रक्रिया भर में बर्फ-ठंडा रहता है । यह अत्यधिक बफर हर 20-30 मिनट, परिवेश के तापमान पर निर्भर करता है बदलने की सिफारिश की है ।

3. नमूना तैयारी

  1. धीरे एक stereomicroscope के तहत अतिरिक्त फाइन-टिप प्रकार 5 परिशुद्धता चिमटी और vannas capsulotomy कैंची का उपयोग कर धमनी क्षेत्रों से संयोजी ऊतकों को हटाने और बर्फ में अलग धमनियों कुल्ला-ठंड pbs contaminants और रक्त अवशेषों को दूर करने के लिए ।
    नोट: यदि नमूने अगले चरणों में तुरंत नहीं किए जाते हैं, तो उन्हें तरल नाइट्रोजन में स्नैप-फ्रीज करें और आगे उपयोग होने तक-८० डिग्री सेल्सियस में स्टोर कर लें ।
  2. दो आंखों से पूल धमनियों एक जैविक प्रतिकृति प्राप्त करने के लिए, उंहें १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूबों में स्थानांतरण, और एक विश्लेषणात्मक संतुलन का उपयोग कर नमूनों वजन ।
  3. प्रत्येक ट्यूब के लिए, ०.५ मिमी और १.० मिमी zirconium ऑक्साइड मोती का एक मिश्रण जोड़ने के लिए, ऊतक प्रोटीन निष्कर्षण अभिकर्मक के द्वारा पीछा किया (टी-प्रति; B7 देखें सामग्री की तालिकामें).
    नोट: टी-प्रति की मात्रा प्रत्येक ट्यूब में नमूनों के वजन पर निर्भर है, प्रतिकारक के 1 मिलीलीटर के अनुपात के साथ ५० मिलीग्राम का नमूना । अंगूठे का एक सामांय नियम का पालन करें जब एकरूपता के लिए ट्यूबों लोड हो रहा है की एक मात्रा अनुपात है 1:1:2 = नमूना: मोती: टी प्रति (चित्रा 3ए) । बहुत बड़ा निष्कर्षण बफ़र की एक मात्रा का उपयोग न करें और बहुत कम मोतियों की राशि अकुशल homogenization को रोकने के लिए ।
  4. ( सामग्री की तालिकामें D6 देखें) एक ब्लेंडर homogenizer में नमूना ट्यूबों लोड । टाइमर को 2 मिनट और गति स्तर 6 पर सेट करें और, homogenization प्रारंभ करें । चलाने के बाद, नमूनों को पूरी तरह से एकरूपता और दोहराने चक्र के लिए नमूने की जांच जब तक पूर्ण रूप से एकरूपता (चित्र 3ख) ।
    नोट: एक रन में 24 नमूना ट्यूबों की कुल homogenized जा सकता है । प्रोटीन विकृतीकरण को कम करने के लिए अनुमनीकरण प्रक्रिया के दौरान नमूनों को ठंडा रखना महत्वपूर्ण है । इस अध्ययन में इस्तेमाल बुलेट ब्लेंडर homogenizer एक अंतर्निहित शीतलन विशेषता है कि नमूने ठंडा रहता है । मामलों में जहां कोई आंतरिक शीतलन सुविधा homogenizer में उपलब्ध है, नमूने बर्फ पर रखा जा सकता है प्रत्येक रन के बीच में ।
  5. ताजा microcentrifuge ट्यूबों में ध्यान से पिपेट homogenate । १०,००० एक्स जी पर अपकेंद्रित्र नमूने 20 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर पेलेट अघुलनशील प्रोटीन और पृथक सतह पर तैरनेवाला घुलनशील प्रोटीन युक्त । सावधानी से गोली परत (चित्रा 3सी) को छूने के बिना सतह पर तैरनेवाला ताजा microcentrifuge ट्यूबों में बाहर पिपेट ।
    नोट: दोनों सतह पर तैरनेवाला और गोली में संग्रहीत किया जा सकता है-८० ° c आगे उपयोग तक ।

4. पेलेट पाचन

  1. प्रत्येक गोली नमूना करने के लिए निष्कर्षण बफर 2a और प्रोटीज अवरोधक कॉकटेल के 5 μl के २०० μl जोड़ें । एक पिपेट के साथ कई बार गोली निलंबित ।
    नोट: गुद को जोड़ने से पहले निष्कर्षण अभिकर्मकों को अच्छी तरह मिलाएं । निष्कर्षण प्रक्रिया भर में RT पर बर्फ और प्रोटीज अवरोध करनेवाला पर निकासी बफर 2a रखें.
  2. पूरी तरह से गोली homogenizer करने के लिए एक अल्ट्रासोनिक homogenizer का उपयोग करें ।
    1. आयाम सेट करने के लिए ६० और चक्र करने के लिए 1. टाइटेनियम से बने जांच (Ø ०.५ मिमी, ८० मिमी लंबी) का उपयोग करें, जो छोटे खंडों (10-500 μl) के साथ नमूनों के एकरूपता के लिए उपयुक्त है ।
    2. गोली और निष्कर्षण बफर मिश्रण में जांच विसर्जित कर दिया और अल्ट्रासोनिक तरंगों के लिए नमूना बेनकाब करने के लिए प्रारंभ बटन दबाएँ ।
    3. नमूना sonicate जब तक गोली clumps पूरी तरह से homogenized हैं । प्रत्येक sonication के बीच कुछ सेकंड के लिए रोकें ।
    4. पूर्ण एकरूपता नेत्रहीन के लिए जांच करें । मिश्रण एक पिपेट के साथ कई बार homogenate सुनिश्चित करने के लिए कि कोई clumps हैं ।
      नोट: गोली निष्कर्षण प्रक्रिया बर्फ पर किया जाना चाहिए एकरूपता के दौरान उत्पन्न गर्मी के कारण प्रोटीन विकृतीकरण को रोकने के लिए (चित्रा 4).

5. नमूना सफाई और बफर एक्सचेंज

  1. 3 केडीए कटऑफ के साथ केन्द्रापसारक फिल्टर उपकरणों का उपयोग करें ( सामग्री की तालिकामें D3 देखें) इस प्रक्रिया के लिए जहां लागू संशोधनों के साथ निर्माता के निर्देशों के अनुसार. सबसे पहले, (फिल्टर पैक में प्रदान की) एक microcentrifuge ट्यूब में फिल्टर इकाई डालें.
  2. एक फिल्टर डिवाइस के लिए नमूना homogenate की pipette २०० μl और एक ही फिल्टर में विआयनीकृत पानी की २०० μl जोड़ें । इसे सुरक्षित रूप से कैप (चित्रा 5ए) ।
  3. फिल्टर यूनिट को एक सेंट्रेज में रखें और १४,००० एक्स जी के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए स्पिन करें ।
  4. डिवाइस को अपकेंद्री से निकालें और फ़िल्टर इकाई को अलग करें जिसमें नमूना ध्यान केंद्रित करना है जिसमें सूक्ष्मकेंद्रज ट्यूब से छानना शामिल है । छानना (चित्रा 5ख) त्यागें ।
  5. फिल्टर इकाई में विआयनीकृत पानी की ४०० μl जोड़कर ध्यान केंद्रित । चरण ५.३ और ५.४ तीन बार दोहराएं । ध्यान से पिपेट ' साफ ' नमूना एक साफ microtube में ध्यान केंद्रित ।
    नोट: आमतौर पर, एक २०० μl कच्चे तेल का नमूना निस्पंदन के बाद ~ 50-70 μl ध्यान की उपज होगी ।
  6. शेष नमूना homogenates के लिए चरण 5.1-5.5 दोहराएं ।

6. प्रोटीन मापन

  1. bicinchoninic एसिड (बीसीए) प्रोटीन परख किट ( सामग्री की तालिकामें B5 देखें) का उपयोग करने के लिए सतह पर तैरनेवाला की प्रोटीन सांद्रता और एक थाली रीडर पर spca नमूनों की गोली भिन्न निर्धारित करते हैं ।
  2. निर्माता के निर्देशों के अनुसार एल्ब्युमिन स्टैंडर्ड (bsa) dilutions (अंतिम bsa सांद्रता रेंज के बीच 25 से २,००० μg/एमएल) एक 1 मिलीलीटर इंजेक्शन की शीशी शामिल 2 मिलीग्राम/
  3. पिपेट 10 μl प्रत्येक bsa मानक कमजोर पड़ने और नमूना प्रतिकृति (दोनों सतह पर तैरनेवाला और गोली) एक ९६-अच्छी तरह से फ्लैट-नीचे microplate के एक अच्छी तरह से ।
  4. बीसीए अभिकर्मक ए के 1 भाग को बीसीए अभिकर्मक बी के ५० भाग जोड़कर बीसीए वर्किंग अभिकर्मक तैयार करें ।
    नोट: तैयार करने से पहले प्रत्येक माप के लिए आवश्यक कार्य अभिकर्मक की कुल मात्रा की गणना करें और हौसले से नमूनों की संख्या और मानक dilutions के आधार पर पर्याप्त मात्रा में तैयार करने के लिए assayed ।
  5. एक अच्छी तरह से बीसीए काम कर रहे अभिकर्मक के २०० μl ध्यान से पिपेट । microplate कवर और 30 मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर सेते । टी करने के लिए थाली ठंडा करने के बाद, एक थाली रीडर पर ५६२ एनएम पर absorbance उपाय (देखें D13 सामग्री की तालिकामें) ।
  6. मानक प्रत्येक bsa मानक एकाग्रता (μg/एमएल) के लिए उत्पंन वक्र के आधार पर, नमूनों की प्रोटीन सांद्रता निर्धारित करते हैं ।

7. एक आयामी जेल इलेक्ट्रोफोरोसिस (1de)

  1. 1de के लिए नमूने तैयार करें जैसा तालिका 1 (एक नमूने के लिए) में दिखाया गया है । मिश्रण एक पिपेट के साथ अच्छी तरह से नमूना मिश्रण । 15 मिनट के लिए ७० डिग्री सेल्सियस पर नमूनों हीट और आरटी के लिए शांत ।
  2. ९५० मिलीलीटर विआयनीकृत पानी के लिए बफर चल एमईएस एसडीएस के ५० मिलीलीटर जोड़कर 1x बफर चल तैयार करते हैं । अच्छी तरह मिलाएं ।
  3. प्रीकास्टिंग 4-12% बीआईएस-Tris प्रोटीन जैल तैयार करें (B4 को सामग्रियों की तालिका में देखें) ।
    1. कट खोलने के लिए प्लास्टिक की थैली जेल कैसेट हटाने और विआयनीकृत पानी के साथ कैसेट कुल्ला ।
    2. एक द्रव गति में जेल कैसेट से बाहर कंघी निकालें, देखभाल करने के लिए कुओं को नुकसान नहीं ले ।
    3. धीरे लोडिंग कुओं कुल्ला 1x एक pipette का उपयोग कर चल बफर के साथ 2-3 बार । उलटा और धीरे से बफर को दूर करने के लिए जेल कैसेट हिला, यह सुनिश्चित करना है कि कुओं में कोई हवाई बुलबुले ।
    4. जेल कैसेट के तल पर सफेद टेप निकालें ।
  4. जेल रनिंग टैंक में जैल (अधिकतम दो कैसेट) डालें और एक बार पूरी तरह से इकट्ठे, जेल तनाव कील लॉक करें ।
  5. जब तक कुओं को पूरी तरह से कवर कर रहे हैं चल बफर के २०० मिलीलीटर के साथ ऊपरी (कैथोड) बफर चैंबर भरें । किसी भी लीक के लिए जांच करें ।
  6. एंटीऑक्सीडेंट के ५०० μl जोड़ें ( सामग्री की तालिकामें A14 देखें) चल रहे बफर के लिए ।
    नोट: एंटीऑक्सीडेंट एक औचित्य अभिकर्मक है कि एजेंट को कम करने के साथ कम नमूनों के साथ प्रयोग किया जाना चाहिए ( तालिका देखें 1) इलेक्ट्रोफोरोसिस के दौरान कम करने की स्थिति को बनाए रखने के लिए और इस तरह के tryptophan के रूप में संवेदनशील अमीनो एसिड के पुनः ऑक्सीकरण को रोकने के लिए और मेथियोनीन.
  7. ध्यान से एक pipette का उपयोग कर लेन प्रति नमूना के ५० μg लोड । फिर, एक आणविक द्रव्यमान मार्कर के रूप में पूर्व दाग प्रोटीन मानक लोड ( सामग्री की तालिकामें A18 देखें).
  8. निम्न (anode) बफ़र कक्ष ६०० mL बफ़र चल रहा है के साथ भरें ।
  9. के लिए जैल भागो ~ ६० मिनट की एक निरंतर वोल्टेज पर १७५ V. चलाने के अंत में, ध्यान से एक जेल चाकू का उपयोग कर कैसेट थाली से जेल हटा दें ।
  10. सावधानीपूर्वक जैल को जेल धुंधला बॉक्स में स्थानांतरित करें ।
    1. टेबल 2में बताए गए निर्माता के निर्देशों के अनुसार, दाग की आवश्यकता वाले जैल की कुल संख्या के आधार पर फिक्सिंग समाधान को ताजा तैयार करें ।
    2. एक रॉकिंग मंच पर आरटी में 10 मिनट के लिए समाधान फिक्सिंग में जेल (एस) हिला ।
  11. फिक्सिंग समाधान त्यागें और कोलाइडयन ब्लू धुंधला किट के साथ जैल दाग ।
    1. दाग की जरूरत है कि जैल की कुल संख्या के आधार पर धुंधला समाधान ताजा तैयार, निर्माता के निर्देशों के अनुसार के रूप में तालिका 3में वर्णित है ।
    2. सबसे पहले, उचित मात्रा को मापने और सीधे मिश्रण एक तारांकन (* जेल धुंधला बॉक्स में) के साथ चिह्नित घटकों । एक रॉकिंग मंच पर आरटी पर 10 मिनट के लिए दाग बी के बिना धुंधला समाधान में जेल (एस) हिला ।
    3. धुंधला करने वाले बॉक्स में सीधे दाग को जोड़ें * धुंधला समाधान । का उपयोग करने से पहले अच्छी तरह से धुंधला बी शेक करने के लिए सुनिश्चित करें ।
      सावधानी: तैयारी कदम 7.10.1 और 7.11.1 एक धूआं हुड के तहत बाहर ले ।
  12. सबसे अच्छा समग्र परिणामों के लिए रात भर धुंधला समाधान में जेल (ओं) हिला ।
    नोट: दाग बैंड धुंधला दाग के बाद 10 मिनट के भीतर दिखाई बन जाएगा B. stainer 3 एच की एक ंयूनतम आवश्यकता है और तीव्रता अलग नहीं है अगर धुंधला समाधान में अब घंटे के लिए छोड़ दिया है ।
  13. ध्यान से धुंधला दाग समाधान और विआयनीकृत पानी की २०० मिलीलीटर के साथ बदलें । जेल (ओं) को पानी में कम से 7-8 एच के लिए हिला पृष्ठभूमि स्पष्ट है ।
    नोट: deionized पानी में कई बार बदला जाना चाहिए destaining प्रक्रिया के दौरान बेहतर अत्यधिक दाग को दूर करने के लिए । जेल (एस) भी प्रोटीन बैंड की तीव्रता से समझौता किए बिना 3 दिनों के लिए पानी में छोड़ा जा सकता है । यदि जेल (एस) अगले चरणों के अधीन नहीं है, तो इसे लंबी अवधि के भंडारण के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 20% अमोनियम सल्फेट समाधान में संग्रहित किया जा सकता है ।

8. में-जेल tryptic पाचन

नोट: यह प्रोटोकॉल शेवचेंको एट अल.17द्वारा विधि के अनुसार है, मामूली संशोधनों के साथ । इस प्रक्रिया को एक लामिना प्रवाह हुड में किया जाना चाहिए और इस प्रयोजन के लिए विशेष रूप से पिसेट, सुझावों, ट्यूबों, और कांच के बर्तनों के समर्पित सेट का उपयोग करें । केरातिन और अन्य संदूषण को रोकने के लिए हर समय दस्ताने और उपयुक्त प्रयोगशाला परिधान पहनें । शीघ्र ही उपयोग करने से पहले इस प्रक्रिया में उपयोग किए गए सभी समाधानों और अभिकर्मकों को तैयार करें ।

  1. आबकारी जेल से प्रोटीन बैंड साफ, नए माइक्रोटोम ब्लेड के साथ । बैंड को छोटे टुकड़ों में काटें (लगभग 1 मिमी x 1 मिमी से 2 मिमी x 2 मिमी) । सावधानी से जेल के टुकड़ों को १.५ मिलीलीटर माइक्रोसेंटरेज ट्यूबों में स्थानांतरित करते हैं ।
    नोट: टुकड़े कि बहुत छोटे है पिपेट युक्तियां और बड़ा टुकड़े रोकना पेप्टाइड वसूली कम हो जाएगा सकता है । माइक्रोटोम ब्लेड का उपयोग करते समय सावधानी बरतें, जो बेहद तेज हैं ।
  2. destaining
    1. १०० मिमी एबीसी समाधान/acn (1:1, v/v) युक्त समाधान destaining के ५०० μl जोड़ें और सामयिक मिलाते या vortexing के साथ 30 मिनट के लिए आरटी पर नमूने सेते ।
    2. ध्यान से destaining समाधान बाहर पिपेट । अवशिष्ट दाग के साथ किसी भी ट्यूबों के लिए नेत्रहीन की जाँच करें । 8.2.1 चरण दोहराएं यदि जेल टुकड़े अभी भी नीले दाग रहे हैं ।
  3. न्यूनीकरण और ऐल्कीलन
    1. नए सिरे से तैयार डीटीटी समाधान के ~ ४०० μl जोड़ें और 30 मिनट के लिए ५६ डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं । सुनिश्चित करें कि समाधान पूरी तरह से जेल के टुकड़ों को शामिल किया गया है । ध्यान से कम करने के समाधान बाहर पिपेट और त्यागें ।
    2. जोड़ें ~ नए सिरे से तैयार iaa समाधान के ४०० μl और 30 मिनट के लिए आरटी में अंधेरे में सेते । एक पिपेट और छंटे के साथ ऐल्किलन बफर निकालें ।
  4. पाचन
    1. 10-15 मिनट के लिए आरटी में स्वच्छ acn के ५०० μl जोड़ें जब तक जेल टुकड़े हटना और अपारदर्शी हो जाते हैं । 5-10 मिनट के लिए हुड के तहत acn और एयर-ड्राई जेल टुकड़े बाहर पिपेट ।
    2. पूरी तरह से जेल के टुकड़े को कवर करने के लिए प्रत्येक ट्यूब में ट्रिप्सिन समाधान के पिपेट ५० μl । 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस में ट्यूबों सेते ।
    3. 30 मिनट के बाद, सभी ट्रिप्सिन समाधान जेल टुकड़े द्वारा अवशोषित कर लिया गया है, तो प्रत्येक ट्यूब की जाँच करें । पूरी तरह से जेल टुकड़े को कवर करने के लिए ट्रिप्सिन बफर (50-100 μl, ट्यूब में मात्रा के आधार पर) की पर्याप्त मात्रा में जोड़ें, यदि आवश्यक हो । ३७ डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात नमूने सेते हैं ।
  5. पेप्टाइड निष्कर्षण
    1. सावधानीपूर्वक पाइपेट ट्यूबों से निकाले गए पेप्टाइड समाधान को साफ माइक्रोट्यूब पर स्थानांतरित करें । एक केन्द्रापसारक वैक्यूम वाष्पक में सतह पर तैरनेवाला सूखी ।
      नोट: शेष जेल के टुकड़ों को न छोड़ें ।
    2. निष्कर्षण बफर के १०० μl जोड़ें (चरण १.७ करने के लिए देखें) प्रत्येक ट्यूब और मिलाते हुए के साथ ३७ डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए सेते ।
    3. पिपेट एक ही microtubes संबंधित बैंड के अनुसार निकाले पेप्टाइड्स युक्त में सतह पर तैरनेवाला और एक निर्वात अपकेंद्रीकरण में नीचे सूखी ।
      नोट: अगर तुरंत इस्तेमाल नहीं किया, सूखे पेप्टाइड निष्कर्षों में संग्रहीत किया जा सकता है-20 कई महीनों तक ° c आगे उपयोग करने के लिए.

9. पेप्टाइड शुद्धि

नोट: इस पेप्टाइड नमूना विलवटिंग और शुद्धि प्रक्रिया सी के उपयोग के साथ किया जाता है18 पिपेट युक्तियाँ (देखें C15 सामग्री की तालिकामें). प्रत्येक नमूने के लिए एक नई युक्ति का उपयोग करें ।

  1. निम्नलिखित समाधानों को ताजा करें शंकु अपकेंद्री ट्यूबों और aliquot में पेप्टाइड शोधन प्रक्रिया के लिए 2 मिलीलीटर माइक्रोसेंटेज ट्यूबों में, जैसा कि तालिका 4में दिखाया गया है । पेप्टाइड शुद्धि के लिए ट्यूबों का एक सारांश इस प्रकार है: ट्यूब एक (नमूना समाधान), ट्यूब बी (गीला समाधान), ट्यूब सी (समरूप समाधान), ट्यूब डी (धोने समाधान), ट्यूब ई (रेफरेंस समाधान), ट्यूब एफ (एक खाली 2 मिलीलीटर या 5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब, पर निर्भर करता है नमूनों की संख्या को साफ किया जा करने के लिए, अपशिष्ट निपटान के लिए), और ट्यूब जी (एक साफ, खाली microtube, क्षमता ०.२ मिलीलीटर).
  2. ०.१% tfa के 10 μl के साथ कदम 8.6.3 से सूखे पेप्टाइड निष्कर्षों का पुनर्निर्माण । इस ट्यूब को ट्यूब ए नामित किया गया है ।
  3. sonicate ट्यूबों 5 मिनट के लिए बर्फ के साथ एक अल्ट्रासोनिक स्नान में ।
  4. 1 मिनट के लिए १,००० एक्स जी में एक बेंच टॉप सेंट्रेडिज में नमूना समाधान नीचे स्पिन ।
  5. 10 μl की अधिकतम मात्रा सेटिंग के लिए एक P10 micropipette सेट और सुरक्षित रूप से एक सी18 पिपेट टिप देते हैं ।
  6. गीला समाधान (ट्यूब बी) में पिपेट टिप विसर्जित कर दिया और सावधानी से पैकिंग सामग्री में महाप्राण । धीरे से कचरे को ट्यूब एफ में बांटना । इस चरण को कम से 7-8 बार दोहराएं ।
    नोट: एक मृत बंद करने के लिए पिपेट प्लंजर दबाना और प्रक्रिया के दौरान धीरे से रिहाई या डुबकी बांटना । C18 कॉलम के लिए बाध्यकारी अधिकतम पेप्टाइड सुनिश्चित करने के लिए पाइपेटिंग के दौरान सुझावों में हवा के बुलबुले पेश नहीं करने के लिए एहतियात बरतें ।
  7. समकारी पेप्टाइड के लिए टिप ट्यूब सी में 10 μl समानता समाधान के लिए बाध्य द्वारा बाध्यकारी है । समाधान छोड़ें और इस कार्यविधि को 3 से 4 बार दोहराएं ।
  8. अगले, महाप्राण और ट्यूब में नमूना समाधान बांटना एक कई बार (इसी जेल बैंड मोटाई पर निर्भर करता है) को टिप कॉलम को पेप्टाइड्स बांध ।
    सावधानी: आकांक्षा और बाध्यकारी प्रक्रिया के दौरान कदम तिरस्कारी (चरण ९.८) ट्यूब ए के भीतर किया जाता है । अपशिष्ट के लिए नमूना समाधान का वितरण न करें ।
  9. ट्यूब डी में धोने के समाधान के लिए aspirating और यह अपशिष्ट (ट्यूब एफ) 4 से 5 बार करने के लिए discarding द्वारा सी18 पिपेट टिप धो लो ।
  10. अंत में, रेफरेंस समाधान (ट्यूब ई) और ट्यूब जी में मायांत तिरस्कारी द्वारा बाध्य पेप्टाइड्स elute ।
  11. नमूना पुनर्प्राप्ति को बढ़ाने के लिए पूरे चरण 2 से 3 चक्र प्रति नमूना दोहराएँ ।
  12. एक नमूना शुद्धिकरण के बाद टिप छोड़ें और अगले नमूने के लिए एक नया टिप का उपयोग करें ।
  13. सूखी शुद्ध पेप्टाइड एक वैक्यूम संसांद्रक में eluates ।
    नोट: शुद्ध नमूने अब lc-ESI-ltq-ऑर्कटरप ms सिस्टम के लिए एलसी-ms/ms विश्लेषण के लिए तैयार हैं । -20 डिग्री सेल्सियस में सूखे नमूनों की दुकान और अधिक उपयोग तक ।

10. लिक्विड क्रोमेटोग्राफी-इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण-एमएस/

नोट: लेबल-मुक्त मात्रात्मक प्रोटिओमिक्स विश्लेषण एक तरल क्रोमेटोग्राफी पर किया जाता है-इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण-रैखिक आयन ट्रैप-ऑर्करैप (LC-ESI-ltq-ऑर्बिटरप) एमएस सिस्टम । LC एक ऑनलाइन degasser (एक एचटीएस पाल autosampler करने के लिए युग्मित के साथ rheos allegro चतुष्क पंप से बना है, और इस प्रणाली एक १५० मिमी x ०.५ मिमी सी18 कॉलम से जुड़े एक 30 मिमी x ०.५ मिमी सी18 पूर्व स्तंभ शामिल हैं । रिवर्स चरण जलीय विलायक एक ०.१% के साथ नियंत्रण रेखा के एमएस ग्रेड पानी से मिलकर (v/v/फॉर्मिक एसिड और कार्बनिक विलायक बी नियंत्रण रेखा के साथ मिलकर-एमएस ग्रेड acetonitrile ०.१% (v/ हमारे पिछले अध्ययन6,16में विस्तार से वर्णित के रूप में, जेल बैंड प्रति ६० मिनट के एक चल रहे समय के साथ ढाल का प्रयोग करें ।

  1. ०.१% tfa के 10 μl में शुद्ध पेप्टाइड नमूनों को भंग । 5 मिनट के लिए बर्फ पर नमूनों sonicate ।
  2. एक V-नीचे ९६ में पिपेट 10 μl नमूने-अच्छी तरह से थाली और एक स्पष्ट, स्वयं चिपकने वाला कवर फिल्म के साथ मुहर ।
  3. autosampler करने के लिए थाली हस्तांतरण ।
  4. ६० मिनट के प्रत्येक रनिंग टाइम के लिए निम्न ग्रैडिएंट का उपयोग करें: 0-35 min (15-40% सॉल्वेंट b), 35-40 min (40-60% सॉल्वेंट b), 40-45 min (60-90% सॉल्वेंट b), 45-50 min (९०% सॉल्वेंट b), 50-53 min (90-10% सॉल्वेंट b), और 53-60 min (10% सॉल्वेंट b) ।
  5. साधन के निम्न मास स्पेक्ट्रोमेट्रिक स्थितियों का उपयोग करें: सकारात्मक आयन इलेक्ट्रोस्प्रे आयनन मोड, स्प्रे वोल्टेज (२.१५ केवी), केशिका तापमान (२२० डिग्री सेल्सियस), डेटा पर निर्भर अधिग्रहण मोड, स्वचालित अधिग्रहण के बीच स्विचन-ऑर्करैप-MS और ltq ms/ms, ऑर्बटरप रिज़ॉल्यूशन (३०,०००), m/z श्रेणी (३०० to १,६००), लक्ष्य स्वचालित लाभ नियंत्रण (agc, १.० x 106 आयनों), आंतरिक पुनर्व्यवस्था (polydimethlycyclosiloxane [PCM] at m/z ४४५.१२००२५ आयनों वास्तविक समय में), लॉक जन विकल्प MS मोड में सक्षम, टैंडेम डेटा शीर्ष पांच सबसे तीव्र अग्रदूत आयनों का चयन करके प्राप्त की, आगे विखंडन द्वारा टकराव प्रेरित (सीआईडी), सामान्यीकृत टकराव ऊर्जा (nce, 30 ms के सक्रियकरण समय के साथ ३५% दोहराने की गिनती के साथ 3), और गतिशील बहिष्करण अवधि (६०० एस).
    नोट: परिणामस्वरूप खंडित आयनों ltq में दर्ज कर रहे हैं ।
  6. प्रत्येक नमूने के लिए तीन जैविक प्रतिकृति कम से चला ।

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Representative Results

सीमित नमूना उपलब्धता नेत्र अनुसंधान में प्रमुख खामियों में से एक है । तदनुसार, इस तरह के नेत्र रक्त वाहिकाओं के रूप में नमूनों की छोटी मात्रा से इष्टतम प्रोटीन उपज के लिए निष्कर्षण तरीकों अक्सर बहस कर रहे हैं । तिथि करने के लिए, वहाँ तरीकों का एक धनाभाव विशेष रूप से रेट्रोब्लबार रक्त वाहिकाओं से प्रोटीन निष्कर्षण के लिए catered है । इसलिए, विधि अनुकूलन में एक पहला कदम के रूप में और एक सबूत के सिद्धांत के रूप में एक अपेक्षाकृत नए अभिकर्मक के लिए कई सामांयतः नियोजित प्रोटीन निष्कर्षण डिटर्जेंट की प्रभावकारिता और मजबूती की तुलना करने के लिए, टी प्रति, हम बाहर एक प्रायोगिक अध्ययन किया कार्डियक ऊतकों का उपयोग चूहों से (अनुकूलन चरणों के लिए आसान और पर्याप्त नमूना उपलब्धता के कारण). हम कुल प्रोटीन सांद्रता और निम्नलिखित अभिकर्मकों का उपयोग कर की पहचान की कुल प्रोटीन की तुलना द्वारा प्रोटीन उपज की तुलना: टी-प्रति, ०.०२% एन-डोडेसिल-β-डी-माल्टोसाइड (ddm), 1% 3-[(3-कोलामाइडोप्रोपएल)-डाइमेथिलम्मोनियो] -1-प्रोपेन सल्फोनेट (chaps), 1% एमिडोसल्फोबेटीन-14 (एएसबी-14) और एसीएन और टीएफए (20% एससीएन/1% tfa) का मिश्रण । इन डिटर्जेंट में से प्रत्येक के साथ निकाले गए नमूनों में प्रोटीन की कुल मात्रा के रूप में चित्र 6Aमें दर्शाया गया है, टी-प्रति (५६.४ μg/मिलीग्राम ऊतक) के साथ निकाले गए ऊतकों से उच्चतम उपज के साथ, इसके बाद ddm (२२.८८ μg/मिलीग्राम ऊतक), chaps (१६.०१ μg/ ऊतक), एएसबी-14 (११.५६ μg/मिलीग्राम ऊतक) और acn/tfa (४.३८ μg/मिलीग्राम ऊतक) से सबसे कम उपज । लगातार, कुल प्रोटीन की पहचान भी टी प्रति निकाले नमूने में सबसे अधिक थे (१६४९ प्रोटीन) > ddm (१३१० प्रोटीन) > chaps (१३१९ प्रोटीन) > asb-14 (११२१ प्रोटीन) > acn/tfa (९२४ प्रोटीन), के रूप में दिखाया गया चित्रा 6बी। इन परिणामों के आधार पर, हम टी-प्रति के साथ spca नमूनों से प्रोटीन निष्कर्षण के साथ दीं ।

अगले, नमूना तैयारी प्रोटोकॉल के अनुकूलन से पहले 1de में fractionation अच्छी तरह से अलग प्रोटीन बैंड और नमूने और replicates के बीच अत्यधिक reproducible परिणाम प्राप्त करने के लिए एक बहुत ही महत्वपूर्ण कदम है । इन चरणों का महत्व प्रतिबिंबित और 1de के परिणामों में हाइलाइट किया गया है । चित्रा 7 से पहले और बाद में अनुकूलित नमूना तैयारी और सफाई चरणों के अधीन spca के 1de प्रोटीन प्रोफाइल की तुलना से पता चलता है । कुल मिलाकर, प्रोटीन बैंड के धब्बा और गरीब जुदाई की एक उच्च डिग्री लेन 3 में मनाया गया । इस प्रोफाइल दर्शाता है कि नमूनों निष्कर्षण अभिकर्मक और भी ऐसे रक्तदाब और सेलुलर मलबे के रूप में contaminants शामिल हो सकते हैं । हालांकि, spca नमूनों कि सतह पर तैरनेवाला और गोली में अलग कर रहे थे और, अनुकूलित प्रोटोकॉल के अधीन अनुकरणीय 1de प्रोफाइल के परिणामस्वरूप, के रूप में लेन 1 और 2 में प्रतिनिधित्व किया (चित्रा 7) ।

सार में, इन आशाजनक परिणाम के आधार पर, तेजी से, मजबूत और कुशल नेत्र microvessels से घुलनशील प्रोटीन निष्कर्षण के लिए अनुकूलित विधि ऊतक प्रोटीन निष्कर्षण अभिकर्मक को रोजगार है (टी प्रति) और निष्कर्षण बफर 2a का उपयोग (TM-pek) निकालने के लिए झिल्ली आधारित प्रोटीन नमूना गोली में पाया. बाद में, नमूना homogenates (टी प्रति अंश) बफर एक्सचेंज के अधीन है और 3 केडीए केन्द्रापसारक फिल्टर इकाइयों के साथ 1 डे से पहले नमूना सफाई । इष्टतम नमूना एकाग्रता अच्छी तरह से प्रति ५० μg है । दूसरी ओर, यह यहाँ पर प्रकाश डाला जाना चाहिए कि यह प्रोटोकॉल केवल छोटे ऊतकों के लिए लागू नहीं है जैसे रक्त वाहिकाओं, लेकिन अन्य ऊतक आधारित नमूनों के लिए भी संभव है. यह मूरीन मस्तिष्क और हृदय के ऊतकों की 1de प्रोफाइल का सबूत है, जो प्रदर्शन किया है कि वहां प्रोटीन की बड़ी संख्या है कि दोनों सतह पर तैरनेवाला से निकाला जा सकता है (चित्रा 8ए, बी) और गोली भिन्न (चित्रा 8सी, डी ).

Figure 1
चित्रा 1 : कार्यप्रवाह अवलोकन. प्रोटोकॉल का एक योजनाबद्ध निरूपण जो पोर्सीन spca के लेबल-मुक्त मात्रात्मक proteome विश्लेषण के लिए नियोजित है । सामान्य तौर पर, इस प्रक्रिया को दो प्रमुख वर्गों में विभाजित किया जाता है जिसमें माइक्रोपोत नमूना तैयारी कदम और एमएस-आधारित प्रोटियोमिक्स दृष्टिकोण शामिल है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2 : सुअर का आंखों के प्रतिनिधि तस्वीरें । (क) नेत्र ग्लोब के पार्श्व दृश्य कॉर्निया से पता चलता है, जो आंख के पूर्वकाल भाग में स्थित है, sclera, मांसपेशी और ऑप्टिक तंत्रिका आसपास । (इ) नेत्र का पश् च दृश् य दृक् तंत्रिका को दर्शाता है । (ग) नेत्र ग्लोब के पीछे देखा spca की शाखाओं paraऑप्टिक और बाहर की शाखाओं से बना । (घ) चारों ओर वसा और संयोजी ऊतकों के साथ अलग spca । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3 : नमूना homogenization. प्रतिदर्श (ए) से पहले और (ख) homogenization के बाद दिखा प्रतिनिधि तस्वीरें । (ग) homogenized नमूने आगे घुलनशील प्रोटीन और अघुलनशील, transmembrane आधारित प्रोटीन युक्त गोली युक्त सतह पर तैरनेवाला में अलग कर दिया गया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4 : गोली प्रोटीन निष्कर्षण प्रक्रिया । आदेश में प्रोटीन विकृतन को रोकने के लिए, गोली नमूने बर्फ पर निकाले जाते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए । 

Figure 5
चित्रा 5 : नमूना सफाई । बफर विनिमय एमएस विश्लेषण से पहले नमूनों को साफ करने के लिए 3 केडीए कटऑफ केन्द्रापसारक फिल्टर के साथ किया जाता है । समरूप (A) से पहले और (B) निस्पंदन के बाद प्रदर्शित होने वाले प्रतिनिधि फ़ोटोग्राफ़ । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 6
चित्रा 6 : प्रोटीन निष्कर्षण प्रभावकारिता और टी-प्रति और चार आम प्रोटीन निष्कर्षण डिटर्जेंट के बीच मजबूती की तुलना । बार चार्ट का चित्रण (A) प्रोटीन मात्रा और (B) टी-प्रति, ०.०२% ddm, 1% chaps, 1% का उपयोग कर पहचाने गए प्रोटीन की कुल संख्या-14 और 20% acn/1% tfa । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 7
चित्रा 7 : सुअर का spca प्रोटीन प्रोफाइल के प्रतिनिधि 1de जेल से पहले और बाद में अनुकूलन । लेन 3 नमूना है कि किसी भी पूर्व सफाई कदम के अधीन नहीं किया गया था की 1de प्रोफ़ाइल दर्शाया गया है । लेन 1 और 2 अनुकूलित नमूना तैयार करने और सफाई चरणों के लिए नमूनों को subjecting के बाद, क्रमशः spca सतह पर तैरनेवाला और गोली, के अनुकरणीय प्रोटीन प्रोफाइल दिखाएँ. जेल कोलाइडयन ब्लू धुंधला किट के साथ दाग था । एम = मार्कर । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 8
चित्रा 8 : प्रतिनिधि कोलाइडयन नीला-अनुकरणीय ऊतक आधारित नमूनों की 1de जेल । सतह पर तैरनेवाला के प्रोटीन प्रोफाइल (ए, बी) और गोली (सी, डी) murine मस्तिष्क और कार्डियक ऊतक के नमूनों की, क्रमशः, ५० μg प्रति अच्छी तरह से. supernatant और गोली प्रोटीन टी प्रति और ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीन निष्कर्षण किट, क्रमशः रोजगार निकाला गया । एम = मार्कर । R1-R3 तीन replicates का प्रतिनिधित्व करते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

घटक मात्रा (μl)
नमूना (supernatant या गोली) एक्स
LDS नमूना बफ़र (4x) २.५
कम करने एजेंट (10x) 1
विआयनित जल अप करने के लिए ६.५ (नमूना मात्रा के आधार पर)
प्रति नमूना कुल मात्रा 10
ध्यान दें: एक्स प्रोटीन एकाग्रता के आधार पर गणना की जाती है (५० μg प्रति सैंपल कुल प्रोटीन).

तालिका 1:1 आयामी जेल इलेक्ट्रोफोरोसिस (1de) । 1de करने के लिए नमूना तैयारी के लिए आवश्यक घटकों का विवरण ।

समाधान 1 जेल (एमएल) के लिए 2 जैल (mL) के लिए 4 जैल (mL) के लिए
विआयनित जल ४० ८० १६०
मेथनॉल ५० १०० २००
एसिटिक अम्ल 10 20 ४०

तालिका 2: जेल निर्धारण। 1de के लिए फिक्सिंग समाधान तैयार करने के लिए आवश्यक घटकों का विवरण ।

समाधान 1 जेल (एमएल) के लिए 2 जैल (mL) के लिए 4 जैल (mL) के लिए
* विआयनित जल ५५ ११० २२०
* मेथनॉल 20 ४० ८०
* stainer एक 20 ४० ८०
stainer B 5 10 20

तालिका 3: जेल धुंधला। कोलाइडयन ब्लू धुंधला समाधान की तैयारी के लिए घटकों का विवरण ।

समाधान (के लिए) संरचना acn * * H2O * * TFA कुल मात्रा *
गीला १००% acn 2 मिलीलीटर 2 मिलीलीटर
#Washing और साम्य ०.१% tfa 10 एमएल 10 μl ~ 10 मिलीलीटर
पेप्टाइड रेफरेंस ०.१% tfa में 60:40 = acn: H2O 6 mL 4 मिलीलीटर 10 μl ~ 10 मिलीलीटर
नोट: * कुल मात्रा नमूनों की कुल संख्या ज़िप टिप सफाई के अधीन किया जा करने के लिए अनुसार समायोजित किया जाना चाहिए.
* * एचपीएलसी ग्रेड या एलसी-एमएस ग्रेड का उपयोग करें ।
# धोने और समानता, क्रमशः के लिए दो अलग eppendorf ट्यूबों तैयार करते हैं ।

तालिका 4: पेप्टाइड शुद्धि. घटक और पेप्टाइड शुद्धि प्रक्रिया के लिए उनके संबंधित रचनाओं के विवरण सी का उपयोग कर18 पिपेट युक्तियाँ.

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Discussion

आंख के नमूनों की एक विविध रेंज के व्यापक proteome रूपरेखा एक महत्वपूर्ण और अपरिहार्य पहला कदम आणविक तंत्र और संकेतन स्वास्थ्य और रोग में फंसा रास्ते को स्पष्ट करने के लिए है । आदेश में उच्च गुणवत्ता डेटा प्राप्त करने के लिए और इन विश्लेषणों से प्राप्त परिणामों की पुनरुत्पादन सुनिश्चित करने के लिए, पूर्ववर्ती नमूना तैयारी कदम महत्वपूर्ण हैं, के रूप में मंडल एट अल द्वारा एक समीक्षा में प्रकाश डाला । कि चर्चा में गहराई से नमूना प्रसंस्करण प्रक्रियाओं आँख के विभिन्न भागों के लिए दो आयामी जेल इलेक्ट्रोफोरोसिस और मास स्पेक्ट्रोमेट्री रणनीति1रोजगार. इन जांचों की कतार में, हमारे वर्तमान अध्ययन मॉडल नेत्र microvessels के रूप में सुअर का spca का उपयोग तेजी से, मजबूत और अत्यधिक कुशल एमएस-संगत नमूना तैयारी के लिए एक अनुकूलित कदम दर कदम प्रोटोकॉल प्रदान करता है । यह जांच विशिष्ट पद्धति के धनाभाव के बाद शुरू की गई मात्रा से प्रोटीन की पर्याप्त मात्रा-सीमित धमनी के नमूनों को निकालने के लिए उच्च गुणवत्ता एमएस डेटा उत्पंन करने के लिए । हमारे विधि भी सूक्ष्म पैमाने पर तकनीक है कि सक्षम उत्कृष्ट proteome मानचित्रण18के उपयोग पर ज्ञान के मौजूदा शरीर में योगदान करने के लिए एक प्रयास है ।

इस प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल में कई महत्वपूर्ण पहलू हैं जिन्हें एक मात्रात्मक proteome विश्लेषण के लिए अनुकूलतम प्रदर्शन के लिए ध्यान में रखा जाना चाहिए । सबसे पहले, यह महत्वपूर्ण है कि नमूनों, मात्रा की परवाह किए बिना, पूर्ण एकरूपता के अधीन है इष्टतम प्रोटीन निष्कर्षण सुनिश्चित करने के लिए । हमारी कार्यप्रणाली में, विभिंन आकार के मोती और बुलेट ब्लेंडर homogenizer के मिश्रण का उपयोग पूरा ऊतक lysis के लिए महत्वपूर्ण भूमिका निभाई थी । प्रकार और मोती का आकार नमूना प्रकार और राशि पर निर्भर करते थे । इस तरह के वर्तमान में उपयोग zro2 और स्टेनलेस स्टील के रूप में उच्च घनत्व के साथ मोती, मध्यम कठिन ऊतकों के लिए उपयुक्त हैं और रक्त वाहिकाओं के लिए विशेष रूप से अच्छी तरह से काम किया.

दूसरा, यह गोली से सतह पर तैरनेवाला अलग करने के लिए और, निर्दिष्ट किट का उपयोग कर पाचन और निष्कर्षण करने के लिए बाद विषय के लिए आवश्यक है. इस कदम को उच्च आणविक वजन प्रोटीन ऐसे ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीन के रूप में निकालने के लिए निर्णायक है, जो अन्यथा हल्के डिटर्जेंट का उपयोग कर homogenize करने के लिए मुश्किल कर रहे हैं19,20,21. जोरदार आंदोलन या मिलाते हुए तरीकों के दौरान पेश किया छप-अप द्वारा किए गए नमूना नुकसान से बचने के लिए sonication का उपयोग करते हुए उपजी गोली का सबसे अच्छा भंग है ।

तीसरा, यह उल्लेखनीय है कि सभी नमूना तैयारी प्रक्रियाएं कम तापमान (4 डिग्री सेल्सियस) पर की जाती हैं, जब तक कि कार्यप्रणाली में अन्यथा संकेत न दिया जाए । यह निष्कर्षण प्रक्रियाओं के दौरान न्यूनतम प्रोटीन विकृतन सुनिश्चित करने के लिए है । चौथा, नमूने की दोहराया फ्रीज-thawing प्रोटीन गिरावट और नमूना गुणवत्ता की गिरावट को रोकने के लिए बचा जाना चाहिए ।

अंत में, contaminants और डिटर्जेंट को हटाने के लिए आवश्यक है प्रोटीन निष्कर्षण निम्नलिखित में जेल फ्रैक्शन के दौरान बहाव के हस्तक्षेप को रोकने के लिए, एंजाइमेटिक पाचन, और एमएस विश्लेषण18,22। ये contaminants अक्सर electrophoretic जुदाई के संकल्प के साथ हस्तक्षेप और तदनुसार, परिणाम के दृश्य को प्रभावित, के रूप में 1de प्रोफ़ाइल में दिखाया गया है (चित्रा 7) । इस मुद्दे को दरकिनार करने के लिए, केन्द्रापसारक कटऑफ फिल्टर उपकरणों का उपयोग अपने आसानी से उपयोग और न्यूनतम प्रोटीन हानि के लिए इष्ट है ।

यद्यपि वर्तमान प्रायोगिक कार्यविधियां इष्टतम लेबल-मुक्त मात्रात्मक MS विश्लेषण के लिए महत्वपूर्ण नमूना तैयारी चरणों में गहन दृष्टिकोण प्रदान करती हैं, दो सीमाएं हैं । सबसे पहले, spca नमूनों दो सुअर का आंखों से परित के बाद विश्लेषण के लिए पर्याप्त मात्रा में ऊतकों प्रदान किया गया । के बाद से प्राप्त की आँखें स्थानीय वक्षतोर यादृच्छिक कर रहे हैं और इसलिए, यह ज्ञात नहीं है अगर रक्त वाहिकाओं एक ही जानवर की आँखों से अलग किया जा रहा है, नमूना पूलिंग अंतर-व्यक्तिगत विविधताओं को mitigates5,6. हालांकि, वर्तमान कार्यप्रणाली भी उपलब्ध नमूनों की मात्रा के आधार पर व्यक्तिगत नमूना तैयार करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । दूसरा, प्रस्तुत पद्धति को विशेष रूप से 1de जेल आधारित फ्रैक् शन के लिए विकसित किया गया है । हालांकि ऊपर के साथ एकीकरण के लिए वर्तमान विधि की अनुकूलता-नीचे और अन्य प्रभाजन तरीकों वारंट जांच, हम 1de के लिए चुना अच्छा reproducibility से लेकर कई कारकों के कारण, विश्लेषण की बेहतर गहराई के लिए गुणवत्ता नियंत्रण में आसानी , विशेष रूप से जटिल नमूनों जैसे कि वर्तमान में उदाहरण के लिए,1,5,23।

अंत में, ऊपर प्रकाश डाला सीमाओं के बावजूद, वर्णित कार्यप्रवाह कड़े नमूना तैयारी कदम के लिए एक सरल अभी तक मजबूत दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करता है रक्त वाहिकाओं की छोटी राशि के विश्लेषण के लिए विशेष रूप से catered. यह भी यहां पर प्रकाश डाला है कि इस विधि को आसानी से मास स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए एकीकृत किया जा सकता है महत्वपूर्ण है-अंय कोशिका और ऊतक के आधार पर प्रोटिमिक विश्लेषण-नमूने आधारित है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

डॉ manicam आंतरिक विश्वविद्यालय अनुसंधान धन द्वारा समर्थित है (stufe 1) जोहान्स gutenberg विश्वविद्यालय मैंज के विश्वविद्यालय चिकित्सा केंद्र से और ड्यूश forschungsgemeinschaft से एक अनुदान (एमए 8006/1-1).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
A. Chemicals
1, 4-Dithiothreitol (DTT) Sigma-Aldrich 1.11474
Calcium chloride dihydrate (CaCl2)   Carl Roth  5239.1 2.5 mM 
Dulbecco's phosphate-buffered saline (PBS)  Thermo Fisher Scientific 14190169
Formic acid (CH2O2) AppliChem A0748
HPLC-grade acetonitrile (ACN, C2H3N) AppliChem A1605
HPLC-grade methanol (CH3OH) Fisher Scientific M/4056/17
HPLC-grade water  AppliChem A1589
Iodoacetamide (IAA) Sigma-Aldrich I6125
Kalium chloride (KCl)   Carl Roth  6781.1 4.7 mM 
Kalium dihydrogen phosphate (KH2PO4)  Carl Roth  3904.2 1.2 mM 
LC-MS-grade acetic acid  Carl Roth  AE69.1
Magnesium sulphate (MgSO4)    Carl Roth  261.2 1.2 mM 
NuPAGE Antioxidant Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) NP0005
NuPAGE LDS Sample buffer  Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) NP0007 4x
NuPAGE MES SDS Running Buffer  Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) NP0002 20x
NuPAGE Sample reducing agent  Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) NP0004 10x
SeeBlue Plus2 pre-stained protein standard  Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) LC5925
Sequencing grade modified trypsin Promega V5111
Sodium chloride (NaCl)  Carl Roth  9265.2 118.3 mM 
Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3)  Carl Roth  965.3 25 mM 
Trifluoroacetic acid (TFA,  C2HF3O2) Merck Millipore 108178
α-(D)-(+)- Glucose monohydrate  Carl Roth  6780.1 11 mM 
B. Reagents and Kits
0.5 mm zirconium oxide beads  Next Advance ZROB05
1.0 mm zirconium oxide beads  Next Advance ZROB10
Colloidal Blue Staining  Kit Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) LC6025 To stain 25 mini gels per kit
NuPAGE 4-12 % Bis-Tri gels Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) NP0321BOX 1.0 mm, 10-well
Pierce Bicinchoninic Acid (BCA) Protein Assay Kit  Thermo Fisher Scientific 23227
ProteoExtract Transmembrane Protein Extraction Kit, TM-PEK Merck Millipore 71772-3 20 reactions per kit
Tissue Protein Extraction Reagent (T-PER) Thermo Scientific 78510
C. Tools
96-well V-bottom plates Greiner Bio-One 651180
Corning 96-well flat-bottom plates Sigma-Aldrich CLS3595-50EA
Disposable microtome blades pfm Medical 207500014
Disposable scalpels #21 pfm Medical 200130021
Dissection pins  Carl Roth PK47.1
Extra Fine Bonn Scissors  Fine Science Tools 14084-08
Falcon conical centrifuge tubes (50 mL) Fisher Scientific 14-432-22
Mayo scissors, Tough cut  Fine Science Tools 14130-17
Precision tweezers  Fine Science Tools 11251-10 Type 5
Precision tweezers, straight with extra fine tips Carl Roth LH53.1 Type 5
Self-adhesive sealing films for microplates Ratiolab (vWR) RATI6018412
Standard pattern forceps  Fine Science Tools 11000-12
Student Vannas spring scissors  Fine Science Tools 91501-09
Vannas capsulotomy scissors   Geuder 19760  Straight, 77 mm
ZipTipC18 pipette tips Merck Millipore ZTC18S096
D. Equipment and devices
150 × 0.5 mm BioBasic C18 column Thermo Scientific, Rockford, USA 72105-150565
30 × 0.5 mm BioBasic C18 pre-column  Thermo Scientific, Rockford, USA 72105-030515
Amicon Ultra-0.5 3K Centrifugal Filter Devices  Merck Millipore UFC500396 Pack of 96.
Analytical balance Sartorius H51
Autosampler  CTC Analytics AG, Zwingen, Switzerland HTS Pal
BBY24M Bullet Blender Storm  Next Advance NA-BB-25
Eppendorf concentrator, model 5301 Sigma-Aldrich Z368172
Eppendorf microcentrifuge, model 5424 Fisher Scientific 05-403-93 Non-refrigerated
Heraeus Primo R Centrifuge Thermo Scientific 75005440 Refrigerated
Labsonic M Ultrasonic homogenizer  Sartorius BBI-8535027
LC-MS pump, model Rheos Allegro Thermo Scientific, Rockford, USA 22080
LTQ Orbitrap XL mass spectrometer  Thermo Scientific, Bremen, Germany
Multiskan Ascent plate reader  Thermo Labsystems v2.6
Rotator with vortex  neoLab 7-0045
Titanium probe (Ø 0.5 mm, 80 mm long) Sartorius BBI-8535612
Ultrasonic bath, type RK 31 Bandelin 329
Xcell Surelock Mini Cell Life Technologies El0001

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References

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जीव विज्ञान मुद्दा १४४ रक्त वाहिकाओं microvessels लघु पीछे सिलिअरी धमनियों proteomics मास स्पेक्ट्रोमेट्री आँख सुअर
ocular microvessels के मास स्पेक्ट्रोमेट्री आधारित proteomics विश्लेषण के लिए नमूना तैयारी
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Perumal, N., Straßburger, L., Schmelter, C., Gericke, A., Pfeiffer, N., Grus, F. H., Manicam, C. Sample Preparation for Mass-spectrometry-based Proteomics Analysis of Ocular Microvessels. J. Vis. Exp. (144), e59140, doi:10.3791/59140 (2019).

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