Summary
Este método fornece uma maneira de acoplar optogenetics e de sensores genetically codificados do cálcio aos níveis citosónicos da imagem basal do cálcio e às mudanças em transientes evocados do cálcio nos músculos da parede do corpo do modelo C. elegansdo organismo.
Abstract
O organismo modelo C. elegans fornece um sistema excelente para executar a imagem latente in vivo do cálcio. Seu corpo transparente e manipulabilidade genética permitem a expressão direcionada de sensores de cálcio geneticamente codificados. Este protocolo esboça o uso destes sensores para a imagem latente in vivo da dinâmica do cálcio em pilhas alvejadas, especificamente os músculos da parede do corpo dos sem-fins. Ao utilizar a coexpressão de channelrhodopsina pré-sináptica, a estimulação da liberação de acetilcolina de neurônios motores excitatórios pode ser induzida usando pulsos de luz azul, resultando em despolarização muscular e alterações reprodutíveis no cálcio citoplasmático Níveis. Duas técnicas de imobilização de vermes são discutidas com diferentes níveis de dificuldade. A comparação dessas técnicas demonstra que ambas as abordagens preservam a fisiologia da junção neuromuscular e permitem a quantificação reprodutível dos transientes de cálcio. Emparelhando a optogenética e a imagem latente funcional do cálcio, as mudanças na manipulação e na homeostase pós-sináptica do cálcio podem ser avaliadas em uma variedade de fundos do mutante. Os dados apresentados valiam ambas as técnicas da imobilização e examinam especificamente os papéis do C. elegans Sarco (endo) o ATPase reticular Plasmic do cálcio e o canal cálcio-ativado do potássio de BK na regulação do cálcio do músculo da parede do corpo.
Introduction
Este papel apresenta métodos para a imagem latente in vivo do cálcio de C. elegans músculos da parede do corpo usando a estimulação neuronal optogenética. Emparelhar um indicador de cálcio geneticamente codificado expresso (GECI) com luz azul desencadeou a despolarização neuronal e fornece um sistema para observar claramente os transientes pós-sinápticos evocados de cálcio. Isso evita o uso de estimulação elétrica, permitindo uma análise não invasiva de mutantes que afetam a dinâmica pós-sináptica do cálcio.
O GECIS do único-fluorophore, tal como gcamp, usa uma única molécula fluorescente da proteína fundida ao domínio M13 da quinase da corrente clara do miosina em seu fim do N-terminal e no calmodulina (CaM) no C-Terminus. Em cima do emperramento do cálcio, o domínio do CaM, que tem uma afinidade elevada para o cálcio, sofre uma mudança conformacional que induz uma mudança conformacional subseqüente na proteína fluorescente que conduz a um aumento na intensidade1da fluorescência. GCaMP fluorescência está animado em 488 nm, tornando-se inadequado para ser usado em conjunto com channelrhodopsin, que tem um comprimento de onda de excitação semelhante de 473 nm. Assim, a fim de par de medições de cálcio com a estimulação da channelrhodopsina, a proteína verde fluorescente do GCaMP precisa ser substituída por uma proteína vermelha fluorescente, mRuby (RCaMP). Usando o músculo expressado rcamp, em combinação com a expressão colinérgicos do neurônio do motor do channelrhodopsin, permite estudos na junção neuromuscular do sem-fim (nmj) com uso simultâneo do optogenetics e da imagem latente funcional dentro do mesmo animal o 2.
O uso de channelrhodopsin ignora a necessidade de a estimulação elétrica despolarizar as junções neuromusculares de C. elegans, que só pode ser alcançada em preparações dissecadas, tornando esta técnica mais fácil de empregar e mais precisa ao segmentar tecidos específicos. Por exemplo, channelrhodopsin tem sido usado anteriormente em C. elegans para ativar os neurônios específicos de formareversível, levandoa uma ativação robusta de neurônios excitatórios ou inibidoresde inibição3,4. O uso da despolarização luz-estimulada igualmente contorna a edição de dano neuronal devido à estimulação elétrica direta. Isto fornece uma oportunidade de examinar os efeitos de muitos protocolos diferentes da estimulação, incluindo estimulações sustentadas e repetidas, na dinâmica pós-sináptica do cálcio4.
A natureza transparente de C. elegans torna-o ideal para a análise funcional de imagens fluorescentes. No entanto, ao estimular os neurônios excitatórios de acetilcolina na NMJ, espera-se que os animais respondam com uma contração muscular imediata4, tornando a imobilização dos vermes críticos na visualização de alterações discretas de cálcio. Tradicionalmente, os agentes farmacológicos têm sido usados para paralisar os animais. Uma tal droga usada é Levamisole, um agonista do receptor de acetilcolina colinérgico5,6,7. Desde que levamisol conduz à ativação persistente de um SubType de receptores excitatórios do músculo, este reagente é inadequado para o estudo da dinâmica do cálcio do músculo. A ação de levamisol induz a despolarização pós-sináptica, elevando o cálcio citosólico, e obstruindo observações depois da estimulação pré-sináptica. Para evitar o uso de drogas paralisantes, examinamos dois métodos alternativos para imobilizar C. elegans. Os animais foram colados para baixo e, em seguida, dissecado aberto para expor os músculos da parede do corpo, semelhante ao existente C. elegans nmj método de eletrofisiologia8, ou nanobeads foram utilizados para imobilizar animais intactos9. Ambos os procedimentos permitiram as medidas reprodutíveis dos transientes do cálcio do descanso e do músculo evocado que eram facilmente quantifiable.
Os métodos deste trabalho podem ser utilizados para medir os níveis de cálcio citosólico basal e transientes em células musculares da parede do corpo pós-sináptica em C. elegans. Exemplos de dados empregando as duas técnicas de imobilização diferentes são dadas. Ambas as técnicas aproveitam a optogenética para despolarizar as células musculares sem o uso de estimulação elétrica. Estes exemplos demonstram a viabilidade deste método em avaliar as mutações que afetam o tratamento pós-sináptica do cálcio nos sem-fins e apontam os prós e os contras das duas aproximações da imobilização.
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Protocol
1. configuração do microscópio
- Use um microscópio composto com capacidades da fluorescência. Para este estudo, os dados foram coletados em um microscópio vertical (tabela de materiais) equipado com LEDs para excitação.
- A fim de visualizar corretamente as alterações de fluorescência nos músculos da parede do corpo, use um objetivo de alta ampliação.
- Para preparações dissecadas, use um objetivo de imersão de água 60x NA 1,0 (tabela de materiais).
- Para preparações com nanoesferas, use um objetivo de imersão de óleo 60x NA 1,4 (tabela de materiais). Esta ampliação assegura a suficiente resolução dos músculos para o sensor da câmera.
- Use uma câmera elevada da sensibilidade unida ao microscópio para capturar imagens em uma taxa de frame elevada a fim controlar mudanças rápidas em níveis do cálcio. Para este estudo, a imagem com um sistema de sCMOS (tabela dos materiais) capaz da imagem latente cheia do frame em 100 Hertz, como tempos da ascensão para os sinais de CA2 + pode ser tão rápida quanto dezenas de milissegundos.
- Controle de aquisição de câmera e excitação de fluorescência LED com um software de microgerente rodando em ImageJ10 de acordo com as instruções do fabricante (tabela de materiais).
- Use um plug-in de plataforma eletrônica de código aberto, que conecta uma placa de microcontrolador de código aberto externo (tabela de materiais), para gerenciar os pulsos de temporização externos para controlar a excitação de fluorescência.
Nota: as saídas digitais estão disponíveis dos pinos digitais 8 a 13 que fornecem bocados de saída 0 a 5. Estes podem ser abordados como base 2 valores de 1, 10, 100, etc. As configurações da porta serial são indicadas na tabela 1 e estão disponíveis no site do microgerente (tabela de materiais). O firmware para a placa do microcontrolador está igualmente disponível neste Web site. - Para controlar a lógica de cronometragem, ative o protocolo de aquisição de micromanager no software de acordo com as instruções do fabricante (tabela de materiais).
Observação: isso simultaneamente inicia uma duração de quadro de câmera predefinida e o número de quadros a serem ativados, bem como o obturador lógico e LED âmbar predefinido para excitação de fluorescência. Neste caso, o interruptor ambarino do estado sólido do diodo emissor de luz é controlado pela saída do bocado 1 do microcontrolador através do pino 9. Os frames da câmera para fora TTL (placa traseira para fora o conector 3) disparam um stimulator. Isto cronometra precisamente a ativação do diodo emissor de luz azul para a ativação do channelrhodopsin em um tempo ajustado que segue a ativação da seqüência da imagem latente. - Para estimular a canalrhodopsina com luz azul e gravar alterações RCaMP, use dois LEDs. Ative o channelrhodopsin com um diodo emissor de luz com um comprimento de onda máximo da emissão de 470 nanômetro e um filtro do bandpass (455 a 490 nanômetro) e excitar rcamp com um diodo emissor de luz com um comprimento de onda máximo da emissão de 594 nanômetro e um filtro do bandpass (570 a 600 nm).
- A fim ativar simultaneamente o channelrhodopsin e capturar mudanças em níveis fluorescentes de RCaMP, co-ilumina ambos os diodos emissores de luz e transmite-o à mesma trilha ótica usando um combinador dichroic do feixe.
- Controle o sincronismo da iluminação do diodo emissor de luz com os interruptores do Estado contínuo (tabela dos materiais) controlados por sinais do TTL (tempo nominal máximo da volta-sobre, 1 senhora, tempo de turn-off 0,3 MS: 0 a 90% giram-em e desligam o tempo de < 100 μs).
- Ajuste a intensidade do diodo emissor de luz com as fontes de alimentação lineares controladas atuais do baixo ruído (tabela dos materiais).
- Para assegurar o sincronismo preciso do diodo emissor de luz azul, ative-o diretamente pelo pulso do TTL ao relé do contínuo-estado de um stimulator. Programe o protocolo de estimulação de luz azul em um estimulador (tabela de materiais), que atua como um temporizador preciso desde o início da aquisição de imagem até a iluminação LED azul. Neste experimento, ative a estimulação de luz azul após 2 s de captura de fluorescência rcamp apenas e use um trem de 5, 2 MS pulsos de luz azul com intervalos de 50 ms intervalo para ativar channelrhodopsin.
Nota: o atraso antes de pulsos de luz azul, a duração dos pulsos de luz azul, o tempo entre pulsos, e o número de pulsos no trem pode ser definido neste momento e deve refletir os parâmetros específicos de interesse experimental.
preparação da amostra 2. C. elegans e aquisição de dados
- Para estimular oticamente os neurônios pré-sinápticos, obter animais expressando channelrhodopsin em neurônios colinérgicos excitatórios, conduzido com a região do promotor UNC-17 , e rcamp expressa em todos os músculos da parede do corpo conduzido com o promotor Myo-3 região2.
Nota: recomenda-se apenas o uso de animais com transgenes integrados e níveis robustos de fluorescência, pois a expressão variável nos tipos de células correspondentes pode afetar a confiabilidade da aquisição de dados. - Faça um estoque de trabalho de todos-Trans da retina diluindo o pó da retina (tabela de materiais) em etanol para criar uma concentração final de 100 mm e armazenar a-20 ° c. Este estoque de trabalho será estável por aproximadamente um ano.
- Criar um estoque de OP50 E. coli, cultivado em meios de lb, suplementado com todo-Trans da retina a partir do estoque de trabalho feito na etapa 2,2, em uma concentração final de 80 μm. O volume utilizado para o estoque OP50 + retinal dependerá do número de placas necessárias para o experimento.
- Placas de mídia de crescimento de nematódeos de sementes (NGM) com aproximadamente 300 μL do estoque de OP50 + retiniana e permitem secar as placas durante a noite à temperatura ambiente no escuro.
- Cresça cepas c. elegans para a idade desejada no escuro em OP50 + placas retinianas ngm a 20 ° c. Para este experimento, use vermes adultos.
- Para o experimento usando a preparação dissecada, use apenas vermes adultos gravid como a realização da dissecção em animais mais jovens e menores é extremamente desafiador. Deixe os animais nas placas OP50-retinal por um mínimo de 3 dias para uma ativação eficaz do channelrhodopsin.
- Se utilizar a preparação dissecada8,11 (Figura 1A), realize dissecções com pouca luz.
- Coloque os animais em um prato de dissecação com uma base de cobertura revestida de silicone que é preenchida com uma solução de 1 mm CA2 + extracelular composta de 150 mm NaCl, 5 mm KCl, 1 mm CAcl2,4mm MgCl2, 10 mm de glicose, 5 mm de sacarose e 15 mm de HEPES (pH 7,3 ,-340 OSM).
- Cola para baixo os animais usando o adesivo líquido da pele tópica com coloração azul ao longo do lado dorsal do verme e fazer uma incisão lateral cutícula ao longo da interface cola/Worm usando agulhas de vidro.
- Use uma pipeta de boca para limpar as vísceras internas da cavidade do sem-fim.
- Cole para baixo a aleta da cutícula do animal para expor os músculos medial ventral da parede do corpo para a imagem latente.
- Se utilizar a preparação de nanoesferas (Figura 1B)
- Faça uma solução de agarose de 5% derretida usando ddH2o para um volume final de 100 ml.
- Usando uma pipeta de Pasteur, coloc uma gota da solução derretida do agarose em uma corrediça de vidro e coloc imediatamente uma segunda corrediça de vidro sobre a parte superior, perpendicular ao primeiro, usando a pressão delicada para criar uma almofada mesmo do agarose. Remova o slide superior antes de usar.
- Adicionar aproximadamente 4 μL de nanoesferas de poliestireno (tabela de materiais) ao meio da almofada de agarose.
- Na luz baixa, escolha 4-6 C. elegans na solução do nanobead, certificando-se que os animais não colocam sobre se, e coloc com cuidado uma lamínula na parte superior.
- Coloc o prato preparado da corrediça ou da dissecção no microscópio, e encontre-o e concentre-se em um sem-fim usando a ampliação 10x e a iluminação brilhante fraca do campo.
- Mude para a ampliação 60x e excitação de fluorescência RCaMP para identificar um músculo ventromedial da parede do corpo que é anterior à vulva e no plano focal correto.
Nota: músculos anteriores à vulva são selecionados como eles refletem os músculos comumente estimulados em experimentos de eletrofisiologia. - Mude o caminho da imagem da ocular para a câmera, puxando o botão de alternância e clicando em Live dentro do software de aquisiçãode dados (tabela de materiais).
Nota: Certifique-se de que a via de estimulação da luz azul está desligada neste ponto para garantir que a channelrhodopsina não seja ativada antes de capturar imagens. - Concentre a imagem dentro do software de aquisição de dados usando o foco fino do microscópio.
- Uma vez que o músculo está claramente em foco, desligue a imagem ao vivo, descarregando o botão ao vivo .
- Clique no botão ROI no software de aquisição de dados e crie uma caixa em torno do músculo que está sendo focado.
- No estimulador, ligue a via de estimulação de luz azul que foi previamente programada no passo 1,10.
- Clique em adquirir no software de imagem para capturar a imagem através da câmera CMOS. Para fazer isso, defina o tempo de exposição para 10 s com 1.000 quadros e 2x binning.
3. análise de dados
- Abra o arquivo de dados no software de imagem (tabela de materiais) e, usando a ferramenta Polygon, delinear o músculo de interesse. Este é o ROI.
- Ir para imagem | Stacks | Plotar o perfil do eixo Z e exportar os pontos de dados resultantes para o software de planilha (tabela de materiais). Essa função plota o valor médio de seleção de ROI versus o ponto de tempo.
- Mova o ROI muscular criado com a ferramenta Polygon fora do animal para obter uma medição de fluorescência de fundo usando as etapas descritas em 3,2. Exporte os dados resultantes para a pasta de trabalho da planilha.
- Na pasta de trabalho da planilha, subtraia os valores de fluorescência de fundo dos valores de fluorescência muscular em cada ponto de tempo. Isto fornece o fundo subtraído sinal fluorescente.
- A média do fundo subtraída fluorescência para os primeiros 2 s de pontos de dados. Isto dará a medição de fluorescência basal, F.
- Use a medição de fluorescência basal para calcular o nível de fluorescência normalizado em cada ponto de tempo. Para fazer isso, use a equação (ΔF/F) + 1. ΔF representa (F (t)-F), onde F (t) é a medida de fluorescência em um determinado ponto de tempo e F é o valor da linha de base. O + 1 é adicionado como um deslocamento do eixo y.
- Repita as etapas 3.2-3.6 para cada imagem muscular que é coletada. O uso de células musculares únicas ou múltiplas por imagem é a critério do pesquisador. O n do experimento pode ser determinado realizando-se uma análise de potência.
- Use os dados processados das etapas 3.2-3.6 para fazer um traço dos valores fluorescentes no software de representação gráfica de acordo com as instruções do fabricante (tabela de materiais).
- Deste traço, meça a cinética do transiente do cálcio, tal como a ascensão ao tempo de pico e a metade do tempo de deterioração, usando as ferramentas fornecidas no software do gráfico de acordo com as instruções do fabricante.
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Representative Results
Essa técnica avaliou alterações nos mutantes que se achavam afetar o manuseio do cálcio ou a despolarização muscular. Os níveis de fluorescência basal e os transientes fluorescentes foram visualizados e a cinética de cálcio e cálcio citosólico em repouso no músculo foi avaliada. É importante que os animais foram cultivados em todos-trans retiniana por pelo menos três dias para garantir a incorporação bem-sucedida da retina, ativando assim subsequentemente a channelrhodopsina (Figura 2a). Se os animais não forem expostos a todos-trans-retiniana, não é desencadeado nenhum transiente de cálcio muscular (Figura 2B). Embora esses animais ainda possam ser usados para avaliar os níveis de cálcio citosólico basal, quaisquer alterações dinâmicas no cálcio não serão capturadas. Adicionalmente, como um controle interno para a saúde animal ou da dissecção, o animal empreenderá após a estimulação clara azul. Uma gravação com uma contração muscular que causa o movimento bruto mínimo do corpo do verme foi selecionada para coleta de dados ao usar nanogrânulos para imobilização. Se o músculo usado para coletar os valores brutos de fluorescência contrai vigorosamente, fazendo com que todo o corpo do verme se mova, o traço transitório refletirá esse artefato de movimento (Figura 2C) e deverá ser descartado da quantificação.
Um mapeamento da mutação ao Locus do gene SCA-1 foi isolado de uma tela para mutações que impactam a localização nicotínico do receptor do músculo de C. elegans . O gene C. elegans SCA-1 codifica o único homólogo do ATPase de cálcio reticular plasmático (endo) do Sarco (serca) no sem-fim e é a única bomba do serca atual nos músculos12,13da parede do corpo. Os mutantes da perda--função SCA-1 foram previstos para expor mudanças no tratamento do cálcio do músculo baseado no papel importante serca joga em manter a homeostase do cálcio em músculos mamíferos14,15,16 ,17,18. O Geci rcamp foi expressado nos músculos da parede do corpo e o channelrhodopsin luz-ativado azul foi expressado em neurônios colinérgicos excitatórios para avaliar a dinâmica basal intracelular do cálcio e do cálcio em Mutants SCA-1 . Com a técnica de preparo dissecado, observou-se aumento dos níveis basais de fluorescência do RCaMP no mutante SCA-1 quando comparado ao controle (Figura 3a, B), sugerindo que a perda da função serca leva a níveis elevados de cálcio citoplasmático em repouso. Quando a dinâmica do cálcio foi examinada, após estimulação pré-sináptica desencadeada com um trem de 5, 2 MS pulsos de luz azul (Figura 3C), houve uma diminuição significativa nos níveis máximos de cálcio nos mutantes SCA-1 (tm5339) como comparado ao controle (Figura 3D), o que pode refletir as lojas de cálcio reduzidas no Sr. Entretanto nenhuma mudança foi considerada na ascensão ao tempo de pico ou no tempo de deterioração da metade (Figura 3E, F). Isto sugere que as mudanças evocadas no cálcio citosólico de uma ou outra fonte externa tais como a entrada do cálcio através dos receptores da acetilcolina e/ou dos canais tensão-fechados do cálcio assim como das lojas internas não sejam afetadas em mutantes SCA-1 (tm5339) . Resultados semelhantes podem ser observados por meio da preparação de nanoesferas, como mostra a Figura 419. Esta recapitulação de dados fornece evidências de que ambas as técnicas são fisiológicas para medir o músculo da parede corporal descansando níveis de cálcio citoplasmático, bem como observando transientes de cálcio estimulados. Isto também demonstra que a dissecção do verme não causa danos ao animal que altera a sua manipulação de cálcio ou a capacidade de despolarizar os músculos pós-sinápticos.
Este protocolo também pode ser usado para examinar mutantes que indiretamente impactam o manuseio de cálcio em C. elegans. A perda de mutantes da função SLO-1 (eg142) foi avaliada para demonstrar isto. O gene SLO-1 codifica um canal de potássio BK ativado porcálcio, queé expresso em ambos os neurônios e músculos20,21. Os estudos têm descrito previamente um papel para SLO-1 em músculos da parede decorpo, demonstrandoque a perda de mutantes da função tem um defeito na repolarização pós-sináptica depois dos potenciais da ação do músculo20,21. As possíveis alterações nos níveis basais de cálcio e na dinâmica transitória do cálcio devido a essa hiperexcitabilidade foram examinadas com imobilização de nanoesferas. Quando os níveis basais de RCaMP foram medidos, os mutantes do SLO-1 (eg142) apresentaram aumento da fluorescência em relação aos controles (Figura 5a, B)19. Isso sugere que os canais BK também podem regular os níveis basais de cálcio citosólico. Não foram observadas alterações nos níveis máximos de cálcio em relação ao controle (Figura 5C, D) na avaliação da cinética de transiente de cálcio evocado. No entanto, os mutantes do SLO-1 (eg142) exibiram aumento significativo do tempo de pico em relação ao controle (Figura 5E). Isto pode refletir um aumento previamente relatado na excitabilidade pré-sináptica20,21. No entanto, não houve alteração significativa no tempo de meia decadência em mutantes SLO-1 (eg142) em relação ao controle (Figura 5F). Juntos, esses dados demonstram que esse método pode ser usado para avaliar os efeitos de mutações pré e pós-sinápticas tanto em repouso quanto em cálcio muscular estimulado da parede corporal.
| Configuração de série | Valor |
| Tempo limite de resposta | 500 |
| Taxa de baud | 57600 |
| DelayBetweenCharsMs | 0 |
| Handshaking | Fora |
| Paridade | Nenhum |
| Stopbits | 1 |
| Verbose | 0 |
Tabela 1: configurações de porta serial para plug-in de microcontrolador, que controla uma placa de microcontrolador externo. Isto é usado para programar pulsos de sincronismo externos para controlar a excitação da fluorescência.
Figura 1: representação gráfica de diferentes técnicas de imobilização. (A) este gráfico demonstra a técnica de dissecção para imobilização. O corpo do sem-fim é colado para baixo (azul) em torno do lado dorsal do animal. Uma incisão dorsal ao longo da cutícula gera um retalho de cutícula. Esta aleta foi colada para baixo para expor o NMJs intact dado forma entre sinapses do cabo ventral do nervo no verde (channelrhodopsin) e RCaMP que expressa os músculos no vermelho. (B) este gráfico demonstra a técnica de imobilização de nanoesferas. O sem-fim intacto é cercado por uma respresentação dos nanobeads na solução, que quando comprimida pelo COVERSLIP sobrejacente, imobilizar o sem-fim. Devido à transparência de C. elegans, o cabo do nervo ventral pode ser visualizado em verde (channelrhodopsin) e rcamp expressando os músculos podem ser visualizados em vermelho. O ovóide no meio do verme representa a vulva, que é um marco identificando os músculos ventral da parede do corpo. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: traços representativos de transientes de cálcio. (A) única representação de traço de um transiente de cálcio evocado por um trem de 5, 2 MS pulsos de luz azul em intervalos de 50 ms intervalo, gravado em um animal com movimento corporal limitado (-movimento) cultivado na presença de todos-Trans da retina (+ All- trans -retiniana). Os artefatos de espiga são os pulsos de estimulação de luz azul, como ambos os LEDs são coiluminados simultaneamente. (B) única representação de traço que mostra a ausência de um transiente de cálcio em resposta a um trem de 5, 2 MS pulsos de luz azul com intervalos de intervalo de 50 ms em um animal que não foi exposto a todos-Trans Retiniana (-todosTrans -retina ,-movimento). (C) única representação de traço de um transiente de cálcio que tem sido evocado por um trem de 5, 2 MS pulsos de luz azul com intervalos de interpulso de 50 ms, gravado em um animal que teve contração muscular significativa levando a artefatos de movimento (+ movimento, + todas asTrans -retinianas). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: níveis basais de cálcio e transientes de cálcio evocados do controle e das amostras SCA-1 (tm5339) preparadas utilizando a técnica de dissecção. (A) imagens representativas da fluorescência basal do rcamp nos mutantes e controles SCA-1 (tm5339) . Barra de escala = 50 μm. (B) quantificação dos níveis de fluorescência basal nos mutantes SCA-1 (tm5339) (n = 13) e controle (n = 9). (C) traços médios de Ensemble de transientes de cálcio evocados para os mutantes SCA-1 (tm5339) e animais de controle. (D) quantificação da fluorescência de pico de rcamp da channelrhodopsina evocou respostas de cálcio em mutantes SCA-1 (tm5339) (n = 12) e controles (n = 9). (E) quantificação da ascensão ao tempo de pico de transientes de cálcio evocados por channelrhodopsina em mutantes SCA-1 (tm5339) (n = 12) e controles (n = 8). (F) a quantificação do tempo de decaimento da channelrhodopsina evocou transientes de cálcio em mutantes SCA-1 (tm5339) (n = 12) e controles (n = 7). Os valores estatisticamente significantes foram: não significante p > 0,05, * p ≤ 0,05, * * p ≤ 0,01, * * * p ≤ 0,001. As barras de erro representam média ± SEM. os dados foram normalizados por meio de testes de Shapiro-Wilk e a significância foi determinada com um teste de Mann-Whitney para distribuições não normais. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: níveis basais de cálcio e transientes de cálcio evocados das amostras de controle e SCA-1 (tm5339) preparadas com imobilização de nanoesferas. (A) imagens representativas da fluorescência basal nos mutantes e controles SCA-1 (tm5339) , barra de escala 50 μm. (B) quantificação dos níveis basais de fluorescência do rcamp nos mutantes SCA-1 (tm5339) (n = 14) e no controle (n = 13) . (C) média de transientes de cálcio evocados para os mutantes e controles SCA-1 (tm5339) . (D) quantificação da fluorescência de pico de rcamp após resposta evocada de cálcio em mutantes SCA-1 (tm5339) (n = 14) e controles (n = 13). (E) quantificação da ascensão ao tempo de pico de transientes de cálcio evocados nos mutantes SCA-1 (tm5339) (n = 14) e controles (n = 12). (F) quantificação do tempo de meia decadência de transientes de cálcio evocados nos mutantes SCA-1 (tm5339) (n = 14) e controle (n = 13). A figura é adaptada de19. Os valores estatisticamente significantes foram: não significante p > 0, 5, * p ≤ 0, 5, * * p ≤ 0, 1, * * * p ≤ 0, 1. As barras de erro mostram média ± SEM. a normalidade dos dados foi avaliada por meio de testes de Shapiro-Wilk e a significância foi determinada com um teste de Mann-Whitney para distribuições não normais. Este valor foi modificado com a permissão de19. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: níveis basais de cálcio e transientes de cálcio evocados de amostras de controle e SLO-1 (eg142) preparados com imobilização de nanogrânulos. (A) imagens representativas da fluorescência basal em mutantes e controles SLO-1 (eg142) , barra de escala 50 μm. (B) quantificação dos níveis de fluorescência do rcamp basal em mutantes SLO-1 (eg142) (n = 29) e o controle (n = 13). (C) média de transientes de cálcio evocados para mutantes e controles SLO-1 (eg142) . (D) quantificação da fluorescência de pico de rcamp após resposta evocada de cálcio em mutantes SLO-1 (eg142) (n = 29) e controles (n = 13). (E) quantificação da ascensão ao tempo de pico de transientes de cálcio evocados em mutantes SLO-1 (eg142) (n = 29) e controles (n = 13). (F) quantificação do tempo de meia decadência de transientes de cálcio evocados em mutantes SLO-1 (eg142) (n = 11) e controles (n = 13). A figura é adaptada de19. Os valores estatisticamente significantes foram: não significante p > 0, 5, * p ≤ 0, 5, * * p ≤ 0, 1, * * * p ≤ 0, 1. As barras de erro mostram média ± SEM. a normalidade dos dados foi avaliada por meio de testes de Shapiro-Wilk e a significância foi determinada com um teste de Mann-Whitney para distribuições não normais. Este valor foi modificado com a permissão de19. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
GECIs são uma ferramenta poderosa em C. elegans neurobiologia. O trabalho anterior utilizou técnicas de imagem de cálcio para examinar uma ampla variedade de funções em ambos os neurônios e células musculares, incluindo respostas sensoriais e comportamentais, com variados métodos de estimulação. Alguns estudos utilizaram estímulos químicos para desencadear transientes de cálcio em neurônios de cinzas sensoriais22,23 ou para induzir ondas de cálcio nos músculos faríngeos24. Outro grupo utilizou estimulação mecânica, enquanto os vermes foram mantidos em chips microfluídico para examinar as respostas de cálcio em neurônios receptores de toque25. Ainda, outros empregaram a estimulação elétrica para visualizar mudanças do cálcio em ambos os neurônios26 e músculos da parede do corpo27. O que é comum entre esses estudos é a exigência de estímulos externos, como soluções ou equipamentos, para desencadear transientes de cálcio. O protocolo delineado aqui capitaliza sobre o controle obtido a partir da estimulação optogenética, que proporciona especificidade neuronal, aliada à análise funcional do músculo GECIs expresso2 no mesmo paradigma experimental.
Duas formas de imobilização de vermes são descritas e, embora cada método deva ser avaliado quando se aborda as necessidades experimentais, as preparações dissecadas e fisiologicamente intactas produzem resultados complementares, permitindo que os investigadores usem qualquer abordagem em sua pesquisa. Há um desafio técnico aumentado a usar a técnica da dissecção, com o usuário que está sendo exigido para dominar o uso exato da colagem cirúrgica e da microdissecção sem danificar o cabo ou os músculos do nervo. Adicionalmente, devido ao nível de dificuldade da dissecção, apenas adultos gravid devem ser usados, o que pode limitar os pontos de tempo experimentais. Além disso, a técnica de dissecção também é muito mais difícil de executar em mutantes que produzem animais pequenos, finos ou doentes, mais uma vez possivelmente limitando parâmetros experimentais. A vantagem desta técnica é que limita o artefato de movimento do corpo resultante da despolarização, colagem impede o excesso de movimento do corpo do verme, e também fornece acesso à NMJ para mudanças de solução e aplicações de drogas. Adicionalmente, cada preparação expõe a mesma área do worm, que garante músculos da parede do corpo será consistentemente em foco. A segunda técnica, usando nanobeads para imobilizar os vermes, é menos envolvida e pode ser rapidamente aprendida. Além disso, qualquer animal de idade pode ser usado com este método, permitindo alterações na manipulação de cálcio através do desenvolvimento a ser monitorado. O cuidado não precisa de ser tomado ao coloc os sem-fins na solução do nanobead, porque demasiada manipulação dos animais pode fazer com que estourem. Além disso, a lamínula não deve ser movida uma vez colocada em cima dos animais, pois isso pode causar os animais a rolar ou torcer sobre si mesmos, novamente levando ao dano. Embora usar os nanobeads possa fornecer um ensaio da elevado-produção em que os animais poderiam potencial ser recuperados, não há nenhuma padronização da posição do corpo do animal, assim que cada animal não pode ter os músculos da parede do corpo em um plano focal desobstruído. Se o experimento apela a um grande número de animais, podem ser necessários diferentes métodos de imobilização, como micropoços à base de agar, que permitem a imagem latente de fluorescência de cálcio a granel28. Independentemente das limitações dessas duas técnicas, pode ser utilizada para obter transientes de cálcio confiáveis e facilmente quantificáveis dentro dos músculos da parede corporal C. elegans .
C. elegans fornecer muitas vantagens como um in vivo sistema para os estudos de imagem funcional. Os animais são transparentes, permitindo o emparelhamento da despolarização neuronal optogenética através do uso de channelrhodopsin com o GECI RCaMP para medir os transientes pós-sinápticos resultantes do cálcio no músculo. Os níveis de pré-estimulação da fluorescência do RCaMP também podem ser usados para avaliar os níveis de cálcio citosólico basal. O tratabilidade genético de C. elegans faz o estudo de mutações novas que podem afetar a homeostase do cálcio ou a manipulação fácil perseguir, frequentemente com os alelos prontamente disponíveis do mutante. Usando as técnicas esboçadas neste protocolo, os dados pós-sináptica da cálcio-imagem latente podem ser obtidos eficientemente e a custo relativamente baixo, fazendo a este um sistema atrativo para uma escala larga de experiências da imagem latente.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Os autores agradecem ao Dr. Alexander Gottschalk por ZX1659, o RCaMP e o channelrhodopsin que contêm a tensão do sem-fim, Dr. Hongkyun Kim para a tensão do sem-fim de SLO-1 (eg142) , e o projeto nacional do Bioresource para a tensão do sem-fim SCA-1 (tm5339) .
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| all-trans retinal | Sigma-Aldrich | R2500 | Necessary for excitation of channel rhodopsin |
| Amber LED | RCaMP illumination | ||
| Arduino UNO | Mouser | 782-A000066 | Controls fluorescence illumination |
| Blue LED | channelrhodopsin illumination | ||
| BX51WI microscope | Olympus | Fixed state compound microscope | |
| Current controlled low noise linear power supply | Ametek | Sorenson | Controls LED intensity |
| Igor Pro | Wavemetrics | Wavemetrics.com | Graphing software |
| ImageJ | NIH | imagej.nih.gov | Image processing software |
| LUMFLN 60x water NA 1.4 | Olympus | Water immersion objective for dissected preparation | |
| Master-8 Stimulator | A.M.P.I | Master timer for image acquisition and LED illumination | |
| Micro-Manager | micro-manager.org | Controls camera acquisition and LED excitiation | |
| Microsoft Excel | Microsoft | Spreadsheet software | |
| pco.edge 4.2 CMOS camera | pco. | 4.2 | High-speed camera |
| PlanApo N 60x oil NA 1.4 | Olympus | Oil immersion objective for nanobead preparation | |
| Polybead microspheres | Polysciences, Inc. | 00876-15 | For worm immobilization |
| solid state switches | Sensata Technologies | Crydom CMX100D6 | Controls timing of LED illumination |
| Transgenic strain, sca-1(tm5339); [zxIs6{Punc17::chop-2 (h134R)::yfp,lin-15(+)}; Pmyo3::RCaMP35] |
Richmond Lab | SY1627 | Excitatory neuronal channelrhodopsin and body wall muscle RCaMP expressing worm line with SERCA mutant allele |
| Transgenic strain, slo-1 (eg142); [zxIs6{Punc17::chop-2 (h134R)::yfp,lin-15(+)}; Pmyo3::RCaMP35] |
Richmond Lab | Excitatory neuronal channelrhodopsin and body wall muscle RCaMP expressing worm line with calcium-activated BK potassium channel mutant allele | |
| Transgeneic strain, [zxIs6{Punc17::chop-2 (h134R)::yfp,lin-15(+)}; Pmyo3::RCaMP35] |
Gottschalk Lab | ZX1659 | Excitatory neuronal channelrhodopsin and body wall muscle RCaMP expressing worm line |
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