Summary
Transgena lck:eGFP Sebrafisken uttrycker GFP högt i T-lymfocyter, och har använts för att studera T cell utveckling och akut lymfatisk leukemi. Denna linje kan användas till studie B-celler, som uttrycker lck på lägre nivåer. Det här protokollet beskriver rening av maligna och icke-maligna B-celler från lck:eGFP Zebrafiskar.
Abstract
Sebrafisken (Danio rerio) är en kraftfull modell för att studera lymfocyter utveckling. Som däggdjur besitter D. rerio en adaptiva immunsystemet som innehåller B- och T-lymfocyter. Studier av zebrafisk lymphopoiesis är svårt eftersom antikroppar erkänner D. rerio cell yta markörer inte är i allmänhet tillgängliga, komplicerande isolering och karakterisering av olika lymfocyter befolkningen, inklusive B-härstamning celler. Transgena linjerna med härstamning-specifika fluorophore uttryck används ofta för att kringgå denna utmaning. Raden transgena lck:eGFP har använts för att studera D. rerio T cell utveckling, och har också använts till modell T-cellernas utveckling och akut lymfatisk leukemi (T-ALL). Även om lck:eGFP fisk har använts att analysera T-härstamning, har de inte använts för att studera B-celler. Nyligen upptäckte vi att många Zebrafiskar B-celler uttrycker också lck, om än på lägre nivåer. Följaktligen uttrycker lck:eGFP B celler jämväl låga nivåer av GFP. Utifrån detta konstaterande har utvecklat vi ett protokoll för att rena B-lineage celler från lck:eGFP Zebrafiskar, som vi redovisar här. Vår metod beskriver hur att utnyttja en fluorescerande-aktiverad cell sorterare (FACS) för att rena B-celler från lck:eGFP fisk eller relaterade rader, till exempel dubbel-transgena rag2:hMYC; LCK:eGFP fisk. I dessa rader, B-celler, särskilt omogna B-celler, express GFP på låg men detekterbara nivåer, så att de kan särskiljas från T-celler, som uttrycker GFP högt. B-celler kan isoleras från märg, bräss, mjälte, blod eller andra vävnader. Detta protokoll ger en ny metod för att rena D. rerio B-celler, som möjliggör studier som fokuserar på ämnen som B cell utveckling och B-lymfocyter maligniteter.
Introduction
Zebrafiskar ger kraftfull attribut, till exempel genetiska manipulability, hög fruktsamhet, optisk genomskinlighet och snabb utveckling som underlättar studerar ryggradsdjur utveckling med hjälp av genetiska metoder. Dessa fördelar, tillsammans med de dela funktionerna av lever- och däggdjurspatogener blodbildningen, gör D. rerio idealisk för Invivo analyser av lymphopoiesis och lymfocyter funktion, från deras tidigaste utseende i larver under hela vuxenlivet. Blod utveckling i zebrafisk är beroende av väl bevarade genetiska processer som delas med däggdjur, och dessa omfatta det adaptiva immunsystemet. Molekylära mekanismer som styr lymfoida utveckling bevaras dessutom anmärkningsvärt mellan Zebrafiskar och däggdjur1.
Under de senaste 2 decennierna, transgena D. rerio linjer att etiketten specifika blod härstamningar och muterade bristfällig i dessa härstamningar har skapats2,3,4,5. En av dessa, lck:eGFP transgena linjen, använder Zebrafiskar lymfocyter protein tyrosine kinase (lck) arrangören för att köra GFP uttryck6. Denna gen, som uttrycks mycket av både T-lineage prekursorer och mogna T-lymfocyter, tillåter Invivo spårning av thymic T cell utveckling och ex vivo rening av T-lineage celler av FACS7. Tidigare använde vi denna linje i en framåt-genetiska ENU mutagenes skärm att identifiera könsceller mutanter benägna att T-ALL och studera somatically förvärvade genetiska händelser kopplade till T cell onkogenes8,9.
Vårt laboratorium ytterligare nyligen, nyttan av lck:eGFP Zebrafiskar. I dubbel-transgena rag2:hMYC (mänskliga MYC), lck:eGFP D. rerio som är kända för att utveckla T-ALL 10, upptäckte vi att B-lineage alla också uppstå11. Till skillnad från T-ALL i denna modell, som fluorescerar i ljust på grund av hög GFP uttryck, B-allt är svagt fluorescerande på grund av låga GFP nivåer, så att fisk med B-ALL särskiljas grovt från dem med T-ALL med hjälp av fluorescerande mikroskopi. Detta differentiella GFP uttryck tillåter också separation av GFPlo B-ALL celler från GFPHej T-ALL celler använder FACS11. Dessutom är låg lck uttryck inte unikt för Zebrafiskar B-ALL, som mänskliga B-ALL också snabb låga nivåer av LCK11,12. Jämväl, normala B-lineage celler D. rerio, möss och människor också uttrycka låga nivåer av lck/Lck/LCK, med omogna B-celler som har den högsta uttryck11,13. På grundval av per cell express B-lineage celler i lckeGFP Zebrafiskar eller derivat linjer 1-10% så mycket god Jordbrukarsed som T-lymfocyter. Dessa GFPlo celler uttryckligt kännetecken B cell mRNA som pax5 cd79b, blnk, btk, ighm, ighzoch andra, och kan renas från märg, bräss, mjälte eller perifera blod11. Därför isolerade både B - och T-lineage celler kan vara från lckeGFP Zebrafiskar, och när det gäller rag2hMYC, lckeGFP djur, B - och T-ALL celler samt11.
Här presenterar vi våra protokoll till effektivt FACS-rena icke-maligna B-celler från lck:eGFP Zebrafiskar och icke-maligna eller maligna B-celler av rag2hMYC; LCK:eGFP fisk, använder olika källa vävnader. Sådana celler kan jämväl kvantifieras av flödescytometri utan FACS isolering, om så önskas. Upptäckten av låg lck uttryck- och följaktligen låg GFP uttryck-b celler öppnar nya dörrar av experimentella möjligheter för lckeGFP Zebrafiskar, såsom i vivo B cell utvecklande studier. Således har denna transgena linje, först rapporterats i 2004, nytt liv när vi försöker utnyttja det för att snappa upp nya insikter om Zebrafiskar adaptiv immunitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla förfaranden som inbegriper Zebrafiskar godkändes av institutionella djur vård och användning kommittén (IACUC) vid University of Oklahoma Health Sciences Center.
1. isolera icke-maligna B och T-lymfocyter från transgena lck:eGFP fisk
- Söva fisken med hjälp av 0,02% tricaine (MS-222) i fisk systemet vatten.
- Undersöka 2 – 6 månad gammal fisk för fluorescerande thymi, som är belägna på den dorsomedial aspekten av gäl hålighet i Zebrafiskar och andra Benfiskar14. Använd ett epifluorescensmikroskop (470/40 excitation våglängd och 525/50 utsläpp filter) att upptäcka god Jordbrukarsed.
- Förbered i förväg 50 mL filter-steriliseras 1 x Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI) innehållande 1% fetalt bovint serum och 1% penicillin-streptomycin (sortering media). Oanvända sortering media kan lagras vid 4 ° C i upp till 2 månader.
- Avliva fisken genom att placera den i en bägare som innehåller 0,2% Tricaine under cirka 5 minuter, följt av is bad nedsänkning. Bekräfta döden genom upphörande av opercular (gill) rörelse.
- Placera euthanized fisken i en petriskål och dissekera lymfoida organ av intresse, använda fluorescerande mikroskopet för att dissekera de GFP+ thymi14, och ljusa fältinställningar för mikroskopi att dissekera de njure benmärg och mjälte15. Resultaten presenteras här erhölls med 3 månader gammal fisk. Lymfocyter proportioner och absoluta tal varierar efter ålder och genotyp (se diskussionen för ytterligare information).
- Placera varje dissekerade orgel i en 1,5 mL tub som innehåller 500 µL kallt sortering media.
- Homogenisera vävnaden på is med hjälp av en mortel mikro-tube Homogenisatorer.
- Passera en 35 µm nätfiltret att generera en enda cellsuspension homogeniserad vävnad. Hålla cellerna på is tills analys.
2. isolera maligna lymfocyter från dubbel-transgena rag2:hMYC; lck:eGFP Zebrafiskar
-
Börjar på 2-4 månader, mikroskopiskt skärm rag2:hMYC; LCK:eGFP fisk för onormala GFP mönster.
Obs: B-celler är god Jordbrukarsedlo i lck:eGFP bakgrunden, så B-ALL kräver övning att erkänna; T-ALL är uppenbara, eftersom T-celler är god JordbrukarsedHej. Följaktligen, den rag2:hMYC, lck:eGFP dual-transgena linje har två fenotyper: ljust fluorescerande T-ALL, som vanligtvis uppkommer bräss och sträcker sig in i kroppen, och svagt fluorescerande B-ALL.- Med fluorescerande Mikroskop, skärm fisken med hjälp av ”låg” exponeringsinställningar (200 ms, 2,4 x vinst) för att identifiera ljusa T-ALL (figur 1A) och ”hög exponering” (1,5 s, 3,4 x vinst) att identifiera dim B-ALL (figur 1A). WT kontroller och pre leukemiska fisk har god Jordbrukarsed lokaliserade endast i brässen (figur 1B).
- Söva och undersöka fisken enligt beskrivningen i steg 1.1 – 1.2.
- Kategorisera fisken baserat på omfattningen av GFP fluorescens, använder en enkel tre kategori-system:
Obs: Nivå 1: Fluorescens visas som en thymic tumör med endast begränsad lokal spridning.
Nivå 2: Fluorescens visas utanför tymus, där < 50% av kroppen.
Nivå 3: Fluorescens sträcker sig bortom 50% av kroppen. - Separata fisken med alla från dem utan cancer. Övervaka pre leukemiska fisk (dvs fisk utan GFP+ tumörer) en gång varje månad för utveckling av nya ALL. Av ~ 9 månader, alla rag2:hMYC, lck:eGFP fisk utveckla T-ALL, B-ALL, eller båda.
- För T - eller B-ALL cell isolering, Välj nivå 3 fisk (alla med > 50% av kroppen), som ger mer än 2 x 106 alla celler, och vanligtvis många fler.
- Avliva fisken som i steg 1.4.
Obs: Det finns två metoder för att erhålla alla celler: hela kroppen homogenisering och en peritoneal tvätta teknik16. Metoderna skiljer sig åt i det absoluta antalet celler samlas in för sortering, och således mängder FACS tid krävs och kostnad (se diskussionen för ytterligare information). - För endera metoden, först placera euthanized fisken i en petriskål och loss med ett rakblad, huvudet inklusive thymic regionen. Detta kan behandlas separat, om önskas, eller används för histologiska färgning.
-
Peritoneal tvätt metod
- Med P1000 pipett tvätta den fisk bukhålan med 500 µL kallt sortering media, samlar in celler och medier i en 5 mL tub.
- Använder en färsk pipettspetsen, injicera en ytterligare 200 – 300 µL kallt sortera media i kroppen hålighet. Sedan använda spetsen på pipetten, applicera tryck lätt på fisk kroppen att extrudera celler ur kroppen hålighet. Samla in detta media och tillsätt 5 mL röret.
- Upprepa steg 2.8.2 2 – 3 gånger. Hålla de insamlade cellerna i sortering media på is.
- Filtrera cellsuspensionen även en 35 µm mesh filtrera innan flödet flödescytometri/FACS och hålla cellerna på is tills analys.
-
Hela kroppen homogenisering
- Efter att fisk huvud, placera kroppen i en 1,5 mL tub som innehåller 200 µL sortering media.
- Homogenisera kroppen med hjälp av en mortel mikro-tube Homogenisatorer.
- Lägga till en ytterligare 300 µL kallt sortering media. Filtrera cellsuspensionen om en 35 µm mesh-filter. Lägga till sortering media som behövs för att tvätta alla celler genom filtret, tills endast vävnad skräp kvar på filtret. Hålla cellerna på is tills analys.
3. flödescytometrisk analys av normala och maligna B-lymfocyter
- Ställa in flödet flödescytometrisk analys och/eller FACS parametrar enligt tillverkarens guide.
-
Förvärva önskat antal händelser att initialt karakterisera provet. Analysera 1 x 104 till 5 x 104 händelser före sortering att fastställa specifika portar för efterföljande sortering stegen.
- Bestämma gates: definiera lymfocyter och progenitor cell grindar med framåt scatter (FSC) och side scatter (SSC) parametrar, exklusive cellulära skräp (figur 2A-C)17. FSC och SSC motsvarar cell storlek diameter granularitet, respektive.
Obs: GFP–, GFPlooch god JordbrukarsedHej celler skiljer sig 10-till-100-faldig när det gäller deras GFP fluorescensintensiteten, att göra åtskillnad mellan dessa populationer okomplicerad (siffrorna 2-5). Levande döda diskriminering kan bedömas på denna punkt med propidium jod (PI) eller 7-aminoactinomycin D (7-AAAD) livskraft färgning. Tidigare experiment med PI vanligtvis Visa > 95% livskraft GFP+ celler efter FACS. - Utesluta de cell midjekort jacka, enligt parametrarna för FACS maskinen används.
- Inom den lymfoida eller föregångare gates, avgöra antalet och andelen GFP+ celler.
- Bestämma gates: definiera lymfocyter och progenitor cell grindar med framåt scatter (FSC) och side scatter (SSC) parametrar, exklusive cellulära skräp (figur 2A-C)17. FSC och SSC motsvarar cell storlek diameter granularitet, respektive.
- Använda fykoerytrin (PE) och god Jordbrukarsed stödnivåer, definiera gate för GFP– vs. GFPlo kontra GFPHej celler.
Obs: B-celler uppvisar dim GFP fluorescens och T-celler visar ljusa GFP i lck:eGFP linjer. Många lymfoida organ eller tumörprover innehåller både GFP+ populationer. B-lineage celler/B-ALL är god Jordbrukarsedlo och T-lineage celler/T-ALL är god JordbrukarsedHej. Definiera gates att skilja mellan GFP–, GFPlooch god JordbrukarsedHej celler och samla in dessa populationer separat (figur 2A-C, figur 3A-C, figur 4A och figur 5a). - Sortera varje cell befolkningen till olika 15 mL polypropylen rör innehållande 2 mL sortering media eller direkt till olika 1,5 mL rör som innehåller en lämplig buffert för ytterligare analyser (t.ex., RNA, DNA eller protein utvinning, allo-transplantation, etc.).
- Hålla renat celler på is före ytterligare analyser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi använde flödescytometri att analysera och FACS att isolera GFPlo och god JordbrukarsedHej celler från thymus, njure benmärg och mjälte från lck:eGFP transgena Zebrafiskar. Analys av 3-månad-gammal fisk visade bräss innehöll mestadels GFP+ lymfocyter. GFP+ celler var i stort sett begränsade till lymfoida gaten tidigare beskrivits av Traver et al.17. Två distinkta GFP+ populationer, GFPlooch god JordbrukarsedHej,kan observeras i brässen. GFPHej lymfocyter representerade en högre procentsats, ~ 60%, medan GFPlo celler var mindre riklig, vilket motsvarar ~ 40% av totala thymic lymfocyter (tabell 1). Till skillnad från däggdjur, är fisk hematopoetiska märg lokaliserad inom njuren, snarare än inom ben. Vi har fastställt B-celler som är bosatta i njure märg också snabb låga nivåer av god Jordbrukarsed (figur 2B och figur 3B). GFPlo celler i benmärg var riklig, medan GFPHej celler var knappa (figur 2B och figur 3B)), som anger att endast en liten andel av T-lymfocyter var närvarande i benmärg vid 3 månaders ålder. Mjälten prover visade jämväl högre procentsatser av GFPlo än GFPHej celler (figur 2 c och figur 3 c). Vi analyserade också icke-maligna lymfocyter från thymus, benmärg och mjälte från dubbel-transgena lck:eGFP; rag2:hMYC Zebrafiskar, som är benägna att både B - och T-ALL11. I fisk som inte hade ännu utvecklat alla, liknade resultat från thymus, benmärg och mjälte singel-transgena lck:eGFP fisk. Numrerar av lymfocyter per orgel var dock ökat (figur 3), förmodligen på grund av MYC-driven expansion av omogna B och T-cells populationer där rag2 arrangören är aktiv.
Vi analyserade också dubbel-transgen fisk med B- eller T-ALL som hade utvecklat fluorescerande cancer av 6 månader. Förutsägbart, B-ALL fisk med svagt fluorescerande cancerformer innehöll mestadels god Jordbrukarsedlo celler (figur 4A). Däremot ljust fluorescerande fisk kan hamnen antingen isolerade T-ALL eller blandade populationer av både GFPlo B-ALL och god JordbrukarsedHej T-ALL celler (figur 5). Ett exempel på blandade alla, som innehåller olika B - och T-ALL, här visas (figur 5). För att bekräfta identiteter av GFPlo och god JordbrukarsedHej celler som B - och T-lineage, respektive, analyserade vi B - och T-cell-specifika avskrifter av kvantitativ realtids-PCR (qRT-PCR). Våra resultat visar god Jordbrukarsedlo celler uttrycker högre nivåer av B-cell avskrifter och god JordbrukarsedHej celler uttrycker högre nivåer av T-cell gener (figur 2D, figur3D, figur4B och figur 5B). Dessutom uttryck för lck och god Jordbrukarsed i GFPlo alla motsvarar dim i vivo GFP fluorescensen B-all (figur 2D, figur3D, figur4B och figur5B; qRT-PCR villkor och primers sekvenser tidigare beskrivits av Borga et al.) 11.
Figur 1: Distinkta fluorescens mönster i lck:eGFP transgen fisk. (A) fluorescerande mikroskopi bilder av rag2:hMYC; lck:eGFP fisk med ljust fluorescerande T-ALL (vänster) eller svagt fluorescerande B-ALL (höger). T-ALL är synlig med låg exponeringsinställningar; B-ALL kan endast ses med höga exponeringar. (B) hög exponeringsinställningar visar svag thymic fluorescens (gula cirklar) i vildtyps- lck:eGFP (vänster) och rag2:hMYC; lck:eGFP dubbel-transgen fisk utan alla (höger). Skala barer = 20 mm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 2: Lymfocyter befolkningen i lck:eGFP Zebrafiskar. Bilder överst visar en 3 månader gammal WT, lck:eGFP fisk med hög exponeringsinställningar eller dator-enhancement (för att underlätta visualisering). Skala barer = 20 mm. flödet flödescytometrisk analys av tymus (A), benmärg (B) och mjälten (C). Vänstra paneler visar FSC (x-axeln) och SSC (y-axeln), med svarta ovaler anger lymfocyter grindar. Mellersta paneler skildra fluorescens-baserade gating med GFP (x-axeln) och PE (y-axeln). GFPHej (blå rektangel), GFPlo (grön rektangel) och god Jordbrukarsed– (svarta ovaler) populationer visas. Rätt panelerna visar histogrammen för god JordbrukarsedHej och god Jordbrukarsedlo celler. Streckade visar linjer usenets kriterier i mellersta paneler. (D), WT lck:eGFP thymi sorterade för god JordbrukarsedHej (blå) och god Jordbrukarsedlo (grön). Uttryck av B-cell genen (pax5), T (cd4)-specifika gener)lck och god Jordbrukarsed. Resultaten är normaliserad till städning gener (β-aktin och eef1a1l1) och visas som ± medelfel (Birgitta)-faldig förändring. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Lymfocyter befolkningen i förväg leukemiska rag2:hMYC; lck:eGFP Zebrafiskar. Bilderna högst upp visar en 3-månad -gammal rag2:hMYC; lck:eGFP fisk med hög och dator-förbättrade exponeringar. Skalstapeln = 20 mm. paneler av delar A-D skildras i identiska format till figur 2. (D) uttryck för pax5, cd4, lckoch god Jordbrukarsed i FACS-renat thymic GFPlo (grön) GFPHej (blå) cellpopulationer av lck:eGFP fisk. qRT-PCR-resultat visas som ± S.E.-faldig förändring vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 4: Analys av B-ALL rag2:hMYC; lck:eGFP transgen fisk. (A) topp: 6-månad-gammal rag2:hMYC; lck:eGFP fisk med B-ALL med hög exponeringsinställningen. Flödescytometrisk flödesanalyser av tumörceller isolerade från fisk kropp är identisk format till figur 2. (B) genuttryck i B-ALL god Jordbrukarsedlo (gröna porten i figur 4A), rag2:hMYC; lck:eGFP GFPHej tymocyter (blå porten i figur 3A), och T-ALL god JordbrukarsedHej celler (blå porten i figur 5A ). Uttryck för B (pax5, cd79a) och T (cd4)-specifika gener, lckoch god Jordbrukarsed. Resultaten är normaliserad till städning gener (β-aktin och eef1a1l1) och visas som ± s.ö. skala-faldig förändring bar = 20 mm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 5: Analys av blandade alla rag2:hMYC; lck:eGFP transgen fisk. (A) topp: 6 månader gamla rag2:hMYC; lck:eGFP fisk med mixed-ALL med hög exponeringsinställningen. Flödescytometrisk flödesanalyser av tumörceller isolerade från fisk kropp är identisk format till figur 2. (B), GFPHej (blå) och god Jordbrukarsedlo (grön) FACS grindar. Uttryck för B (pax5, cd79a) och T (cd4)-specifika gener, lckoch god Jordbrukarsed. Resultaten är normaliserad till städning gener (β-aktin och eef1a1l1) och visas som ± s.ö. skala-faldig förändring bar = 20 mm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi utvecklat och tillhandahåller ett protokoll för att isolera B-celler från lck:eGFP transgena Zebrafiskar, att lägga detta till andra D. rerio modeller med B-lineage etiketter3,4. Något överraskande, gick identifiering av GFPlo B celler i denna linje obemärkt sedan dess beskrivning år 2004. Allmänhet, lck anses vara T-cell-specifika6, men senare studier hittade oväntade lck uttryck av naturliga mördarceller och myeloida celler, såväl som i B-celler som visas här18,19. I samförstånd med vår upptäckt att Zebrafiskar B celler är god Jordbrukarsedlo, pre-B, naiv, och mogna B uttrycker celler hos människor också låga nivåer av LCK11,13.
På grund av de olika GFP-nivåerna i T och B celler av dessa fiskar, kan cellerna i båda linjerna nu isoleras från denna linje. Även om dessa djur har klassiskt använts för att studera thymic T-lymfocyter utveckling och spårning, visar vi att liknande studier är också möjliga med B-celler. Därför identifierar vi B-celler i tymus, njure benmärg och mjälte här, och i perifert blod och annorstädes i tidigare arbete11.
Igenkännande B-ALL i rag2:hMYC; LCK:eGFP fisk kräver ett skarpt öga, men med praktiken är okomplicerat. Nästa, välja vilken metod du använder för att rena alla celler är kritisk. Här presenterar vi två metoder: peritoneal wash och hela kroppen homogenisering. Peritoneal tvätt ger ett mycket lägre antal totala celler, men en mycket hög andel av GFP+ celler. Följaktligen, lite FACS tid krävs att minimera kostnaden. För nedströms tillämpningar, där totala avkastningen är mindre viktigt (t.ex. qRT-PCR), detta är effektivare. Alternativt hela kroppen homogenisering resulterar i större enda cellsuspensioner som innehåller många fler celler, men en lägre procentandel av celler blir GFP+. Således krävs mer FACS tid att samla samma antal GFP+ celler som med peritoneal tvätt, men miljoner fler celler kan renas. För efterföljande studier, där hög kapacitet är viktigt (t.ex. Western blot), detta kan uppväga den extra kostnaden. Dessutom, för alla studier fångar kroppens totala homogenisering mångfalden av cancerceller närvarande, mer korrekt representerar tumör heterogenitet. Även om inte listad i våra protokoll, är det också möjligt att dissekera enda GFP+ regioner/kroppsorgan från fisk med allt för homogenisering av malning i en petriskål, vilket minskar totala FACS tid och kostnad, besläktad med peritoneal tvätt.
Thymic GFP uttryck i lck:eGFP fisk visade att GFP är upptäckas så tidigt som 5 dpf6. Våra studier här utfördes på vuxna fiskar 3 månader eller äldre, och visar att vid denna ålder, B-celler är rikligt förekommande i njure benmärg och mjälte, men T-celler är sällsynta. Senare studier med fisk i olika åldrar kommer att behöva bestämma om T-celler är vanligare vid olika tidpunkter. Likaså, vid 3 månader, T-celler är berikad med bräss, men ett betydande antal thymic B-celler är också närvarande. Om dessa lymfocyter populationer varierar vid olika åldrar är för närvarande okänd, men sammantaget thymic fluorescens bleknar i lck:eGFP fisk början könsmognad (~ 3 månader), så det är troligt att T cell nummer minskar med stigande ålder, och B-celler kan också. Likaså när GFPlo B celler kolonisera är Zebrafiskar bräss för närvarande okänd. Använder lck:eGFP fisk, är det nu möjligt att övervaka thymic B och T-cell utveckling, tillströmning, efflux och specifika kineticsen av dessa händelser. Sådana frågor är dessutom även relevanta för andra anatomiska platser där B-celler finns, till exempel njure benmärg, mjälte, blod och tarmen (inga data anges).
Förutom B-cell utvecklande studier hittade vi nyligen B-ALL i lck:eGFP; rag2:hMYC dubbel-transgen fisk11. Transgena rag2:hMYC var kända för att inducera T-ALL10 men B-ALL hade gått okända. På grund av den höga penetrans av denna onkogen, båda typerna av alla är utbredd i dessa fiskar och många fiskar faktiskt utvecklas både alla typer samtidigt11. Eftersom B-ALL är god Jordbrukarsedlo, medan T-ALL är god JordbrukarsedHej, låter varierande GFP uttryck dessa två enheter att vara isolerad av FACS, även när förekommer i samma djur (figur 5A). Avgörande, i både normala och maligna lymfocyter visar qRT-PCRresults att god Jordbrukarsedlo och god JordbrukarsedHej celler konsekvent motsvarar till den B - och T-härstamningar, respektive (figur 2 och figur 3).
Den outnyttjade potentialen i lck:eGFP fisk var central för detta arbete, belyser det faktum att många redan existerande transgena linjerna sannolikt har nytta bortom deras avsedda ändamål. Här presenterar vi ett nytt protokoll för att isolera T och B celler från D. rerio med transgena lck:eGFP, öppnar dörren för nya prövningsläkemedel vägar om normala och maligna B-lymfocyter. Resultaten av sådana studier kommer utan tvekan åter vitalisera vad har redan varit en värdefull resurs till blodbildning, lymphopoiesis och cancer biologi fält.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar någon intressekonflikt.
Acknowledgments
Vi vill tacka Megan Malone-Perez för Zebrafiskar vård och OUHSC flöde flödescytometri kärnan. Detta arbete stöds av bidrag från Hyundai Hope på hjul, Oklahoma Center för befordran av vetenskap och teknik (HRP-067), en NIH/NIGMS INBRE pilotprojekt utmärkelse (P20 GM103447). JKF innehar den E.L. & Thelma Gaylord begåvad stol i pediatrisk hematologi-onkologi i Children's Hospital Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 µm mesh | Sefar Filter technology | 7050-1220-000-13 | |
| 5 mL Polystyrene round-Bottom tube with cell-strainer cap | Falcon Corning Brand | 352235 | |
| 50 mL conical tube | VWR international | 525-0448 | |
| AZ APO 100 Fluorescent microscope | Nikon | ||
| Cytoflex | Beckman Coulter | ||
| DS-Qi1MC camara | Nikon | ||
| Ethyl 3-aminobenzoate methansesulfonate; MS-222 | Sigma | E-10521 | |
| FACSJazz | BD Biosciences | ||
| Fetal bovine Serum | Thermo Fisher | 10437028 | |
| FlowJo v10.2 | FlowJo, LLC | ||
| lck:eGFP | See Langeneu et al., 2004 | ||
| NIS Elements software | Nikon | Version 4.13 | |
| Penicilin-Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Pestle micro-tube homogenizers | Electron Microscopy Sciences | 64788-20 | |
| Plastic Transfer pippetes | |||
| rag2:hMYC-ER | See Gutierrez et al., 2011 | ||
| RPMI Media 1640 1x | Life Technologies | 11835-030 |
References
- Paik, E. J., Zon, L. I.
- Kasheta, M., et al. Identification and characterization of T reg-like cells in zebrafish. Journal of Experimental Medicine. 214 (12), 3519-3530 (2017).
- Liu, X., et al. Zebrafish B Cell Development without a Pre-B Cell Stage, Revealed by CD79 Fluorescence Reporter Transgenes. Journal of Immunology. 199 (5), 1706-1715 (2017).
- Page, D. M., et al. An evolutionarily conserved program of B-cell development and activation in zebrafish. Blood. 122 (8), e1-e11 (2013).
- Schorpp, M., et al. Conserved functions of Ikaros in vertebrate lymphocyte development: genetic evidence for distinct larval and adult phases of T cell development and two lineages of B cells in zebrafish. Journal of Immunology. 177 (4), 2463-2476 (2006).
- Langenau, D. M., et al. In vivo tracking of T cell development, ablation, and engraftment in transgenic zebrafish. Proceedings of National Academy of Sciences U S A. 101 (19), 7369-7374 (2004).
- Trede, N. S., Langenau, D. M., Traver, D., Look, A. T., Zon, L. I. The use of zebrafish to understand immunity. Immunity. 20 (4), 367-379 (2004).
- Frazer, J. K., et al. Heritable T-cell malignancy models established in a zebrafish phenotypic screen. Leukemia. 23 (10), 1825-1835 (2009).
- Rudner, L. A., et al. Shared acquired genomic changes in zebrafish and human T-ALL. Oncogene. 30 (41), 4289-4296 (2011).
- Gutierrez, A., et al. Pten mediates Myc oncogene dependence in a conditional zebrafish model of T cell acute lymphoblastic leukemia. Journal of Experimental Medicine. 208 (8), 1595-1603 (2011).
- Borga, C., et al. Simultaneous B and T cell acute lymphoblastic leukemias in zebrafish driven by transgenic MYC: implications for oncogenesis and lymphopoiesis. Leukemia. , (2018).
- Haferlach, T., et al. Clinical utility of microarray-based gene expression profiling in the diagnosis and subclassification of leukemia: report from the International Microarray Innovations in Leukemia Study Group. Journal of Clinical Oncology. 28 (15), 2529-2537 (2010).
- Novershtern, N., et al. Densely interconnected transcriptional circuits control cell states in human hematopoiesis. Cell. 144 (2), 296-309 (2011).
- Menke, A. L., Spitsbergen, J. M., Wolterbeek, A. P., Woutersen, R. A. Normal anatomy and histology of the adult zebrafish. Toxicology Pathology. 39 (5), 759-775 (2011).
- Gupta, T., Mullins, M. C. Dissection of organs from the adult zebrafish. Journal of Visualized Experiments. , (2010).
- Pruitt, M. M., Marin, W., Waarts, M. R., de Jong, J. L. O. Isolation of the Side Population in Myc-induced T-cell Acute Lymphoblastic Leukemia in Zebrafish. Journal of Visualized Experiments. (37), (2017).
- Traver, D., et al. Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants. Nature Immunology. 4 (12), 1238-1246 (2003).
- Carmona, S. J., et al. Single-cell transcriptome analysis of fish immune cells provides insight into the evolution of vertebrate immune cell types. Genome Research. 27 (3), 451-461 (2017).
- Tang, Q., et al. Dissecting hematopoietic and renal cell heterogeneity in adult zebrafish at single-cell resolution using RNA sequencing. Journal of Experimental Medicine. 214 (10), 2875-2887 (2017).
