يصف لنا طريقة لتوليد وتضخيم وراثيا تعديل فيروسات الجهاز التنفسي المخلوي (رسفس) ومقايسة البلاك أمثل رسفس. يمكننا توضيح هذا البروتوكول عن طريق إنشاء اثنين من الفيروسات المؤتلف على التوالي تسمح بالتحديد الكمي للنسخ المتماثل RSV ويعيش تحليل RSV إدراج الهيئات وديناميات حبيبات إدراج الهيئات المرتبطة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
جيل، والتضخيم، ومعايرة المؤتلف من فيروسات الجهاز التنفسي المخلوي
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
استخدام فيروسات المؤتلف أصبح عاملاً حاسما في علم الفيروسات الأساسية أو التطبيقية. وقد ثبت علم الوراثة العكسي لتكون عبارة عن تقنية قوية للغاية، سواء لفك آليات النسخ المتماثل الفيروسية أو لدراسة الأدوية المضادة للفيروسات أو توفير منصة تطوير اللقاحات. البناء والتلاعب بنظام الجينية العكسية لسلبية-حبلا فيروسات الرنا مثل فيروس المخلوي تنفسي (RSV)، ومع ذلك، تظل حساسة ويتطلب دراية خاصة. هو الجينوم RSV رنا طاق واحد، والشعور السلبي من حوالي 15 كيلوبايت، يعمل كقالب للنسخ المتماثل للجيش الملكي النيبالي الفيروسية والنسخ. لدينا نظام الوراثة عكس يستخدم نسخة كدنا RSV سلالة طويلة المجين البشري (هرسف). يتم وضع هذا كدنا، فضلا عن كدناس ترميز البروتينات الفيروسية من بوليميريز المعقدة (ل، ف، ن، و M2-1)، في ناقلات التعبير الفردي تحت T7 بوليميريز تسلسلات تحكم. تعداء هذه العناصر في زنزانات فرقة البحث-T7/5، التي تعبر عن ستابلي T7 بوليميريز، يسمح بالنسخ المتماثل هيولى والنسخ من RSV المؤتلف، مما أدى إلى فيريونس المعدلة وراثيا. وتجمع RSV جديدة، التي موجودة على سطح الخلية وفي المادة طافية الثقافة BSRT7/5، لتصيب الإنسان HEp-2 الخلايا للتضخيم الفيروسية. اثنين أو ثلاث جولات من التضخيم مطلوبة للحصول على الأرصدة الفيروسي الذي يحتوي على 1 × 106 و 1 × 107 اللوحة تشكيل وحدات (بفو)/مل. أساليب للأمثل الحصاد، وتجميد، ومعايرة الأرصدة الفيروسية موضحة هنا بالتفصيل. نحن توضيح البروتوكول المعروضة هنا بإنشاء اثنين من الفيروسات المؤتلف على التوالي التعبير عن البروتين الفلورية الخضراء الحرة (بروتينات فلورية خضراء) (RSV-التجارة والنقل) أو الفيروسي M2-1 حشو للتجارة والنقل (RSV-M2-1-التجارة والنقل). ونحن تبين كيفية استخدام RSV-التجارة والنقل للتحديد الكمي للنسخ المتماثل RSV و RSV-M2-1-التجارة والنقل لتصور الهياكل الفيروسية، فضلا عن ديناميات الفيروسية البروتين في الخلايا الحية، باستخدام تقنيات الفحص المجهري الفيديو.
المقدمة
RSV البشرية هو السبب الرئيسي لدخول المستشفى لعدوى الجهاز التنفسي الحادة في الأطفال الرضع في جميع أنحاء العالم1. وبالإضافة إلى ذلك، يرتبط RSV عبء مرض كبيرة في البالغين مماثلة للأنفلونزا، مع معظم المستشفيات وعبء وفيات المسنين2. لا تتوفر أي اللقاحات أو الأدوية المضادة للفيروسات محددة حتى الآن ضد RSV، لكن الواعدة عقاقير جديدة في التنمية3،4. التعقيد والخفة لتقنيات القياس الكمي للضرب RSV تعرقل البحث عن الأدوية المضادة للفيروسات أو اللقاحات على الرغم من الجهود الكبيرة الحالية. ويستند التقدير الكمي للضرب RSV في المختبر عموما على طرق شاقة وتستغرق وقتاً طويلاً ومكلفة، التي....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1-المواد من إعداد
- شراء وسائل الإعلام الخلية (تعديل المصل انخفاض وسائط الإعلام، وسائل الإعلام الأساسية الدنيا [MEM]، 10 × الفنزويلية، ودولبيكو المتوسطة النسر [دميم])، كاشف تعداء، وميكروكريستالاين سيليولوز (انظر الجدول للمواد).
- الحصول على ناقلات التالية لعلم الوراثة العكسي: vector(s) الجينوم وناقلات التعبير ترميز البروتين ن والبروتينات المعقدة بوليميراز. ناقلات الجينوم تحتوي على الجينوم الكامل كدنا RSV-التجارة والنقل (ف-RSV-التجارة والنقل) و RSV-M2-1GFP (ف-RSV-M2-1GFP) مجرى النهر من المروج بوليميراز (بول T7) T7 الحمض النووي الريبي عاثية. ناقلات التعبير (سمي فن، فع، ع-L، وف-M2-1) تحتوي على تسلسل الترميز ن، ف، ل، أو M2-1 المصب T7 pol (....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
في هذا العمل، يمكننا وصف بروتوكول مفصلاً لإنتاج فيروسات RSV المؤتلف معربا عن بروتين فلوري (الشكل 2). في برسف-التجارة والنقل، تم إدخال الجين التجارة والنقل بين الجينات ف وم، كما هو موضح للجينات الكرز في الأعمال المنشورة سابقا21. في برسف-م 2-1-التجارة والنقل، الجينات M2 يمسها وجينات إضافية الترميز م 2-1-التجارة والنقل تم إدراجها بين الجينات SH وز12. الخطوة الأولى، المقابلة لإنقاذ الفيروس في الخلايا BSRT7/5، ويظهر .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
هنا نقدم طريقة لإنقاذ المؤتلف رسفس من البلازميدات الخمسة، وعلى التضخيم. القدرة على التلاعب جينوم الفيروسات أحدث ثورة في بحوث علم الفيروسات لاختبار الطفرات والتعبير عن جينات إضافية أو بروتين فيروسي المعلمة. RSV لدينا وصف والمستخدمة كمثال في هذا المقال هو فيروس التعبير عن جين مراسل، RSV-بروتينات فلورية خضراء (غير منشور)، وتعرب عن تنصهر بروتين M2-1 ل علامة التجارة والنقل12. إنقاذ RSV تحديا وتتطلب الممارسة. كفاءة تعداء أمر بالغ الأهمية، اعتماداً على تشكيلة الحكمة من الكاشف تعداء وتحسين سابقة من بروتوك.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
شكر وتقدير
يشكر المؤلفون الدكتور تشين يو من استرا زينيكا R & D بوسطن، ماجستير، الولايات المتحدة الأمريكية، لتوفير الدواء AZD4316. الكتاب ممتنون لمنصة سيماجيس للوصول إلى المجهر أوليمبوس ScanR، الذي كان يدعمه المنح المقدمة من المنطقة القارسة (الصحة واحد خافت). الكتاب الاعتراف بدعم من INSERM وجامعة فرساي ساينتكوينتين.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 35 مم & طبق صغير لتصوير الخلايا الحية | Ibidi | 81156 | |
| A549 | ATCC | ATCC CCL-185 | |
| Avicel RC-591 | FMC BioPolymer | Avicel RC-591 | تتوفر المعلومات الفنية وغيرها من المعلومات حول Avicels على http://www.fmcbiopolymer.com. يحفظ في درجة حرارة الغرفة. تم تحسين البروتوكول في الخطوة 4 لهذا الكاشف. |
| BSRT7/5 | غير متوفر تجاريا | ، انظر المرجع 22. Buchholz et al. 1999 | |
| محلول بنفسجي كريستالي | مجهر سيجما | HT90132 | |
| فلوري للملاحظات | أوليمبوس | IX73 مجهر | |
| مجهر مضان للفحص المجهري | أوليمبوس | ScanR مجهر | |
| HEp-2 | ATCC | CCL -23 | |
| HEPES & GE ؛ 99.5٪ | Sigma | H3375 | |
| L-Glutamine (200 ملم) ThermoFisher | Scientific | 25030024 | |
| LIPOFECTAMINE 2000 REAGENT | ThermoFisher | Scientific 11668019 Protocol في الخطوة 2.3. تم تحسينه لهذا الكاشف. | |
| MEM (10x) ، بدون جلوتامين | ThermoFisher Scientific | 11430030 | |
| MEM ، مكمل GlutaMAX | ThermoFisher Scientific | 41090-028 | |
| MgSO4 Reagent Plus ، & ge ؛ 99.5٪ | Sigma | M7506 | |
| Opti-MEM I مصل متوسط | متوسط ThermoFisher Scientific | 51985-026 | |
| محلول مائي بارافورمالدهيد ، 32٪ ، | علوم المجهر الإلكتروني | EM 15714 | |
| البنسلين الستربتومايسين (10،000 وحدة / مل) | |||
| غير متوفرة | انظر المرجع 21. Rameix-Welti et al. 2014 | ||
| انظر Saw Rocker | VWR | 444-0341 | |
| Si RNA GAPDH | Dharmacon | ON-TARGETplus siRNA D-001810-10-05 | SMARTpool و 3 من 4 siRNAs فردية صممها Dharmacon. |
| Si RNA IMPDH2 | Dharmacon | ON-TARGETplus siRNA IMPDH2 Pool- Human L-004330-00-0005 | SMARTpool من 4 siRNAs فردية صممها Dharmacon. المراجع والتسلسلات الفردية J-004330-06: GGAAAGUUGCCCAUUGUAA; J-004330-07: GCACGGCGCUUUGGUGUUC ؛ J-004330-08: AAGGGUCAAUCCACAAAUU; J-004330-09: GGUAUGGGUUCUCUCGAUG; |
| Si RNA RSV N | Dharmacon | ON-TARGETplus مخصص siRNA | UUCAGAAGAACUAGAGGCUAU و UUUCAUAAAUUCACUGGGUUA |
| SiRNA NT | Dharmacon | ON-TARGETplus كاشف نقل SiRNA غير المستهدف للتجمع | |
| Dharmacon | DharmaFECT 1 المرجع: تم تحسين بروتوكول T-2001-03 | في الخطوتين 5.1.1.و 5.1.2 لهذا الكاشف. | |
| بيكربونات الصوديوم 7.5 ٪ محلول | ThermoFisher Scientific | 25080094 | |
| Spectrofluorometer | Tecan Tecan | M200PRO |
المراجع
- Shi, T., et al. Global, regional, and national disease burden estimates of acute lower respiratory infections due to respiratory syncytial virus in young children in 2015: a systematic review and modelling study. The Lancet. 390 (10098), 946-958 (2017).
- Falsey, A. R., Hennessey, P. A., Formica, M. A., Cox, C., Walsh, E. E.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
