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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

Erzeugung, Verstärkung und Titration von rekombinanten Respiratory Syncytial Viren

Published: April 4, 2019 doi: 10.3791/59218
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 2, 1,3, 1,3
1UMR 1173 Institut national de la santé et de la recherche médicale (INSERM), Université de Versailles St. Quentin, 2UR892 Institut national de la recherche agronomique (INRA), Unité de virologie et immunologie moléculaires, 3Assistance Publique–Hôpitaux de Paris (AP-HP), Hôpital Ambroise Paré, Laboratoire de Microbiologie

Summary

Wir beschreiben eine Methode zur Erzeugung und Verstärkung genetisch modifiziert respiratory syncytial Viren (RSV) und eine optimierte Plaque-Assay für RSV. Wir veranschaulichen dieses Protokolls durch die Schaffung von zwei rekombinanter Viren, die Quantifizierung der RSV-Replikation ermöglichen bzw. live-Analyse des RSV Einschlusskörperchen und Einschlusskörperchen-assoziierten Granulat Dynamik.

Abstract

Der Einsatz von rekombinanten Viren ist entscheidend in der Basis- oder angewandte Virologie geworden. Reverse Genetik ist nachgewiesen worden, werden eine extrem leistungsfähige Technologie, sowohl virale Replikationsmechanismen zu entschlüsseln und zu studieren antivirale Medikamente oder Impfstoffe Entwicklungsplattform vorsehen. Den Bau und die Manipulation von einem reverse genetische System für einen negativ-Strang RNA-Virus wie ein respiratory syncytial Virus (RSV), allerdings bleibt zart und erfordert spezielles Know-how. Der RSV-Genom ist eine Single-Strang, negativen Sinn RNA von ca. 15 kb, die als Vorlage für die virale RNA-Replikation und Transkription dient. Unser reverse Genetik-System nutzt eine cDNA-Kopie des RSV lange Belastung Humangenoms (HRSV). Diese cDNA sowie cDNAs Codierung virale Proteine der komplexen Polymerase (L, P, N und M2-1) befinden sich in einzelnen Expressionsvektoren unter T7 Polymerase Steuersequenzen. Die Transfektion dieser Elemente in BSR-T7/5 Zellen, die stabil T7 Polymerase ausdrücken, ermöglicht die zytoplasmatischen Replikation und Transkription der rekombinanten RSV zu gentechnisch veränderten Virionen. Eine neue RSV, die an der Zelloberfläche und in der Kultur Überstand des BSRT7/5 vorliegt, ist versammelt, um menschliche HEp-2 Zellen für virale Verstärkung zu infizieren. Zwei oder drei Runden der Verstärkung sind erforderlich, um virale Bestände mit 1 x 106 bis 1 x 107 Plaque-bildenden Einheiten (PFU) / mL. Methoden für die optimale Ernte, Einfrieren und Titration der viralen Bestände sind hier ausführlich beschrieben. Wir illustrieren das Protokoll hier vorgestellten durch die Schaffung von zwei rekombinanter Viren bzw. Ausdruck freies grünes fluoreszierendes Protein (GFP) (RSV-GFP) oder viralen M2-1 mit GFP (RSV-M2-1-GFP) verschmolzen. Wir zeigen, wie mithilfe von RSV-GFP um RSV-Replikation und der RSV-M2-1-GFP viralen Strukturen sowie virale Proteindynamik in lebenden Zellen visualisieren mit Videomikroskopie Techniken zu quantifizieren.

Introduction

Menschlichen RSV ist die führende Ursache der Hospitalisierung für akute Infektion der Atemwege in Säuglinge weltweit1. RSV ist darüber hinaus mit einer erheblichen Krankheitslast bei Erwachsenen vergleichbar mit Grippe, mit die meisten Krankenhausaufenthalt und Sterblichkeit in der ältere2Belastung verbunden. Gibt es keine Impfstoffe oder spezifische antivirale Medikamente noch gegen RSV, aber vielversprechende neue Medikamente sind in Entwicklung3,4. Die Komplexität und die Schwere der Techniken der Quantifizierung der RSV Multiplikation erschweren die Suche nach antivirale Medikamente oder Impfstoffe trotz erheblicher Anstrengungen. Die Quantifizierung der RSV Multiplikation in-vitro-basiert im Allgemeinen auf teure, mühsame und zeitraubende Methoden bestehen vor allem in der Analyse des zytopathischen Effekts durch Plaque-Reduzierung, Mikroskopie, Immunostaining Assays, quantitative (qRT) Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und Enzym-linked Immunosorbentprobe Tests zu bestimmen. Viren mit modifizierten Genomen und mit dem Ausdruck Reporter-Gene, wie die Codierung für die GFP, eignen sich eher für solche Vorführungen. Gekoppelt an die Verwendung von automatisierten Platte Leser, machen Reporter-gen tragenden rekombinante Viren diese Assays für Standardisierung und Hochdurchsatz-Zwecke besser geeignet.

RSV ist eine behüllte, nonsegmented negativen Sinne RNA-Virus, das gehört zur Gattung der Pneumoviridae Familie, Ordnung Mononegavirales5 Orthopneumovirus . Der RSV-Genom ist eine Single-Strang, negativen Sinn RNA von ca. 15 kb, enthält eine forensisches Region an den 3' und 5' Extremitäten genannt Führer und Anhänger und 10 transkriptionelle Einheiten 11 Proteine codieren. Die Gene sind wie folgt sortiert: 3'-NS1, NS2, N, P, M, SH, G, F, M2 (M2-1 und M2-2 Proteine kodieren) und L-5 ". Die genomische RNA ist fest Nucleoprotein N. Using Encapsidated genomische RNA als Vorlage verpackt, virale RNA-abhängige RNA-Polymerase (Trichothecene) Transkription und Replikation der viralen RNA zu gewährleisten. Virale Trichothecene besteht aus der großen Protein L trägt die Nukleotid-Polymeraseaktivität schlechthin, seine obligatorische Cofaktor Phosphoprotein P und das M2-1-Protein, das Funktionen wie eine virale Transkription Faktor6. In infizierten Zellen induziert RSV die Bildung von zytoplasmatischen Einschlüssen Einschlusskörperchen (IBs) genannt. Morphologisch ähnliche zytoplasmatischen Einschlüssen sind für mehrere Mononegavirales7,8,9,10beobachtet worden. Neuere Untersuchungen zu den Tollwut-Virus, vesikuläre Stomatitis-Virus (VSV) und Ebola-Virus RSV hat gezeigt, dass virale RNA-Synthese tritt in IBs, die somit als virale Fabriken8,9,11, angesehen werden kann 12. Virus Fabriken konzentrieren die RNA und virale Proteine für virale RNA-Synthese benötigt und enthalten auch zelluläre Proteine13,14,15,16, 17. IBs weisen eine funktionale Subkompartiment genannt IB-assoziierten Granulat (IBAGs), die sich darauf konzentrieren die neu dazu im Entstehen begriffenen viralen mRNA zusammen mit dem M2-1-Protein. Die genomische RNA und die L, P und N werden in IBAGs nicht erkannt. IBAGs sind kleine dynamische kugelförmigen Strukturen im Inneren IBs, die die Eigenschaften des flüssigen Organellen12aufweisen. Trotz der zentralen Rolle von IBs in virale Vermehrung ist sehr wenig über Natur, interne Struktur, Entstehung und Betrieb dieser viralen Fabriken bekannt.

Der Ausdruck des Genoms des Poliovirus aus einer cDNA aktiviert die Produktion des ersten ansteckende virale Klons in 198118. Für negative einzelsträngigen RNA-Viren fand es nicht bis 1994 die Produktion eines ersten Tollwut-Virus nach Transfektion von Plasmiden in Zellen19 statt. Das erste Plasmid-basierte reverse genetische System für RSV erschien 199520. Reverse Genetik führten zu großen Fortschritten auf dem Gebiet der Virologie. Die Möglichkeit der Einführung von spezifischen Änderungen in das virale Genom hat kritische Einblicke in die Replikation und Pathogenese von RNA-Viren zur Verfügung gestellt. Diese Technologie hat die Entwicklung von Impfstoffen auch erheblich erleichtert, indem es spezifische Dämpfung durch gezielte Reihe von Modifikationen erlaubt. Genom Änderungen erlauben eine schnelle Quantifizierung der viralen Vermehrung erheblich verbessert die antivirale Screening und Untersuchung von ihrer Wirkungsweise.

Obwohl zuvor beschrieben, bleibt die Erlangung genetisch veränderten RSV zart. Hier zeigen wir ein Protokoll erstelle ich zwei Arten von rekombinanten HRSV, RSV-GFP oder RSV-M2-1-GFP bzw. zum Ausdruck zu bringen. In diesem Protokoll beschreiben wir die Transfektion Voraussetzungen für die neue rekombinanten Viren, sowie ihre Verstärkung zu viralen Aktien mit hoher Titer, geeignet für reproduzierbare Experimente zu retten. Der Bau der reversen Genetik Vektoren ist per se nicht beschrieben. Wir beschreiben Methoden für die optimale ernten und Einfrieren von viralen Bestände. Die genaueste Methode, infektiöse Viruspartikel zu quantifizieren bleibt Plaque-Assay. Zellen sind infiziert mit seriellen Verdünnungen der analysierten Suspension und inkubiert mit einem Overlay, das verbietet die Verbreitung von freien Viruspartikel im Überstand. Unter solchen Bedingungen wird der Virus nur zusammenhängende Zellen, aus denen eine "Tafel" für jedes erste infektiöse Partikel infizieren. In der konventionellen RSV-Titration-Assay sind Gedenktafeln von Immunostaining aufgedeckt und unter mikroskopischer Beobachtung gezählt. Diese Methode ist teuer und zeitaufwändig. Hier haben wir ein sehr einfaches Protokoll für eine RSV-Plaque-Assay mikrokristalline Cellulose verwenden, die es die Bildung von Plaques, die mit bloßem Auge sichtbar ermöglicht. Wir zeigen, wie RSV-GFP Maßnahme RSV Replikation und damit zum verwendet werden kann die Auswirkungen der antiviralen Medikamenten zu quantifizieren. Kombination von reverse Genetik und live-imaging-Technologie, zeigen wir Ihnen wie RSV-M2-1-GFP ermöglicht es Wissenschaftlern, M2-1 in lebenden Zellen zu visualisieren und die Dynamik der intrazellulären viralen Strukturen wie IBs zu folgen.

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Protocol

1. materielle Vorbereitung

  1. Zelle Medien zu kaufen (reduzierte Serum Medien, minimale unerlässlich [MEM] 10 x MEM und Dulbecco modifizierten Adlers Medium [DMEM]), Transfection Reagens und mikrokristalline Cellulose (siehe Tabelle der Materialien).
  2. Erhalten folgenden Vektoren für reverse Genetik: die genomische Vector(s) und die Codierung des N-Proteins und der Polymerase komplexe Proteine Expressionsvektoren. Die genomischen Vektoren enthalten das volle cDNA Genom der RSV-GLP (p-RSV-GFP) und der RSV-M2-1GFP (p-RSV-M2-1GFP) stromabwärts von Bakteriophagen T7-RNA-Polymerase (T7 Pol) Veranstalter. Die Expressionsvektoren (bezeichnet als p-N, p -P-p-L und p-M2-1) enthalten die kodierenden Sequenz von N, P, L oder M2-1 flussabwärts die T7-Pol (siehe Rincheval Et Al.12 und Rameix-Welti Et Al.21 Details bezüglich der Plasmid-Konstrukte).
  3. Bereiten Sie die Medien für eine Zellkultur in einer sterilen Umgebung und für die Transfektion und Infektion. Verwendung DMEM mit 2 mM L-Glutamin ergänzt mit 10 % fetalen Kälberserum (FCS), 1.000 Einheiten/mL Penicillin und 1 mg/mL Streptomycin (oder ohne Antibiotika) und MEM mit 2 mM L-Glutamin ergänzt mit 0 %, 2 % oder 10 % FCS, 1.000 Einheiten/mL Penicillin und 1 mg/mL Streptomycin, bezeichnet als "komplette Medium" in das folgende Protokoll.
  4. Erhalten Sie BSRT7/522 Zellen zu und Bestände in kompletten Medium mit 10 % Dimethyl Sulfoxid (DMSO) bei 1 bis 2 x 106 Zellen/mL ergänzt. Erhalten Sie die Zelle-Bestände in flüssigem Stickstoff. Erhalten Sie HEp-2 Zellen. Kultur-BSRT7/5-Zellen im kompletten DMEM und HEp-2 Zellen in komplette MEM bei 37 ° C und 5 % CO2 in einer sterilen Umgebung.
  5. Bereiten Sie eine 10 X RSV Erhaltung Lösung (0,5 M HEPES und 1 M MgSO4 [pH 7.5] in Wasser) in einer sterilen Umgebung.
  6. Erhalten Sie ein umgekehrtes Fluoreszenzmikroskop kompatibel mit GFP-Fluoreszenz-Messungen und kompatibel mit live imaging, wenn es notwendig ist, um eine Infektion zu überwachen ist. Erhalten Sie einen Mikrotestplatte Reader kompatibel mit GFP-Fluoreszenz-Messungen für die Quantifizierung der RSV-GFP-Replikation.

(2) Rettung und erste Passage der rekombinanten Virus

Hinweis: Führen Sie die folgenden Schritte in einer sterilen Umgebung, mit einer Klasse II Sicherheitsschrank.

  1. Machen Sie am Vortag Transfection eine Aussetzung der Zelllinie BSRT7/5 bei 5 x 105 Zellen/mL in kompletten Medium. Verteilen Sie 2 mL Zellsuspension pro Bohrloch in einer 6-Well-Platte. Bereiten Sie einen Brunnen pro Virus, das gerettet werden soll und eine weitere für negativ-Kontrolle. Inkubieren Sie die Platte bei 37 ° C und 5 % CO2. Überprüfen Sie, dass die Zellen an der Mündung eine 80 %-90 % am nächsten Tag.
  2. Fixierung der reversen Genetik Vektoren (aus Schritt 1.2) p-RSV-GFP und p-RSV-M2-1-GFP, sowie p-N, p -P-p-L und p-M2-1. Mix für jeden Virus, retten, 1 µg der p-N und p -P, 0,5 µg p-L, 0,25 µg p-M2-1 und 1,25 µg p-RSV (GFP oder M2-1 GLP) in einem Rohr.
    Hinweis: Verschiedenen Expressionsvektoren für M2-1, N, P und L können verwendet werden; jedoch ist das Verhältnis zwischen den Proteinen einzuhalten. Führen Sie die negative-Kontrolle den p-RSV-Vektor durch ein leerer Vektor ersetzen.
  3. Weiter zur Transfektion, nach der Transfektion Reagens Hersteller-Protokolls (siehe Tabelle der Materialien).
    1. Die gemischten Vektoren 250 µL reduzierte Serum Medium hinzufügen. Verdünnen Sie in einem anderen Gefäß 10 µL des Transfection Reagens in 250 µL reduzierte Serum-Medium. Sanft Wirbel sowohl Rohre und warten Sie 5 min. Mix den Inhalt beider Röhren und warten Sie 20 min bei Raumtemperatur.
    2. Spülen Sie die BSRT7/5-Zellen mit 1 mL reduzierte Serum Medium und verteilen Sie 1,5 mL MEM mit 10 % FCS ohne Antibiotika pro Bohrloch zu. Falls erforderlich, brüten Sie bei 37 ° C und 5 % CO2 bis die Inkubation in Schritt 2.3.1 beschriebenen abgeschlossen ist.
    3. Fügen Sie 500 µL der Transfektion Mischung im Schritt 2.3.1 auf eine gut vorbereitet, wenn die 20 min Inkubationszeit vorbei ist. Legen Sie die Zellen in den Inkubator bei 37 ° C und 5 % CO2 für 3 Tage. Ändern Sie nicht das Nährmedium der Zellen während der Transfektion.
  4. Beobachten, GFP-Fluoreszenz (Anregung bei 488 nm) und Emission bei 515 – 535 nm unter einem invertierten Fluoreszenzmikroskop mit 20 X Vergrößerung 1 X pro Tag, um die Effizienz der Rettung zu überwachen, über die GFP filtern.
  5. Am zweiten Tag nach der Transfektion Samen Sie die Zellen für den ersten Durchgang der geretteten Viren. Bereiten Sie eine Aussetzung der HEp-2 Zellen bei 5 x 105 Zellen/mL in kompletten Medium. 2 mL Zellsuspension pro Bohrloch in einer 6-Well-Platte (einen Brunnen pro Virus Rettungs-und eine Negativkontrolle) zu verteilen.
  6. Am dritten Tag der Transfektion, kratzen Zellen in jede Vertiefung der transfizierten BSRT7/5-6-Well-Platte verwenden verschiedenen Schaber für jedes gut. Übertragen Sie jedes gut Inhalte (Zellen und überstand) zu einem steril 2 mL Microcentrifuge Schlauch. Vortex jedes Rohr kräftig für mindestens 30 s, um die geretteten Virus aus der Zelle Membranen freisetzen.
    Hinweis: Dies entspricht 0 (P0) Durchgang des geretteten Virus (Abbildung 1).
  7. Verwenden Sie die frischen virale P0 Aussetzung die erste Verstärkung der geretteten Viren durchführen.
    1. Entfernen Sie das Kulturmedium von HEp-2-6-Well-Platte am Vortag ausgesät (siehe Punkt 2.5) und 500 µL der P0 Suspension (aus Schritt 2,6) pro Bohrloch schnell hinzufügen. Platzieren Sie die HEp-2-Platte bei 37 ° C auf eine Wippe Rocker für weiche Agitation für 2 h.
    2. Entfernen Sie und entsorgen Sie die 500 µL des Inokulums und 2 mL MEM mit 2 % FCS. 3 Tage inkubieren Sie die Platte bei 37 ° C und 5 % CO2 . Dies erzeugt den ersten Durchgang (P1) der geretteten Viren (Abbildung 1).
  8. Fügen Sie 1/10 des Volumens des 10 X RSV Erhaltung Lösung (0,5 M HEPES und 1 M MgSO4 [pH 7.5]) in die restlichen P0-Suspension (aus Schritt 2.6). Wirbel der Mikroröhrchen energisch für 5 s und aliquoten beschriftet den Inhalt in kryogenen Röhren mit alkoholbeständigem Tags. Tauchen Sie der Rohre für mindestens 1 h in Alkohol bei-80 ° C vorgekühlt und bei-80 ° c lagern
  9. Titrieren P0-Lager (siehe Punkt 2.6) von jedem geretteten Virus (siehe Abschnitt 4 für die mikrokristalline Cellulose-Titration).
  10. Beachten Sie, dass GFP Fluoreszenz (Anregung bei 488 nm) und Emission bei 515 – 535 nm der HEp-2 Zellen infiziert mit P0 Aussetzung unter einem invertierten Fluoreszenzmikroskop mit 20 X Vergrößerung 1 X pro Tag, um die Infektion zu überwachen. Das Aussehen der kleinen Syncytia unter dem Hellfeld-Mikroskop beobachten und Zell-Ablösung der RSV zytopathogenen Effekts (CPE) widerspiegelt (siehe Abbildung 2).
  11. Beachten Sie, dass die Rettung gescheitert ist, wenn weder die Fluoreszenz als auch die CPE nach 2 – 3 Tagen sichtbar ist.
  12. Holen Sie den ersten Durchgang (P1) am Tag 3 oder 4 wie unter Punkt 2.6 beschrieben. Kurz gesagt, kratzen Sie die Zellen, sammeln Sie die Zellen und überstand zusammen, Wirbel, die Erhaltung-Lösung wie unter Schritt 2.8, aliquoten Probe hinzufügen und Einfrieren.
  13. Titrieren Sie (siehe Abschnitt 4 für die Titration Assay) und verstärken Sie den ersten Durchgang (siehe Abschnitt 3 für die Amplifikation) zu.

3. Verstärkung der geretteten Viren

Hinweis: Das folgende Protokoll beschreibt die Verstärkung der geretteten Viren in einem 75 cm2 Kolben. Passen Sie die Flasche auf den benötigten Mengen und die erforderlichen Multiplizität der Infektion (MOI). Tabelle 1 zeigt Bände für verschiedene Fläschchen. Führen Sie die folgenden Schritte in einer sterilen Umgebung in einer Klasse II Sicherheitsschrank.

  1. Bereiten Sie eine Aussetzung der HEp-2 Zellen bei 5 x 105 Zellen/mL in kompletten Medium, am Tag vor der Verstärkung. Verteilen Sie 15 mL Zellsuspension pro 75 cm2 Fläschchen und inkubieren Sie die Fläschchen bei 37 ° C und 5 % CO2. Bereiten Sie eine Flasche pro Virus zu verstärken.
  2. Am Tag nach dem Beginn der Inkubation, überprüfen Sie, dass die Zellen 80 – 100 % Zusammenfluss.
  3. Verdünnen Sie die virale Suspension aus Schritt 2.12 in MEM ohne FCS eine 3 mL Suspension bei 50.000 PFU/mL (entsprechend einer MOI von 0,01 PFU/Zelle) zu erhalten.
  4. Entfernen Sie das Medium und fügen Sie schnell die virale 3 mL-Suspension hinzu. Legen Sie die Flasche bei 37 ° C auf eine Wippe Rocker für weiche Agitation für 2 h.
  5. Entfernen Sie und entsorgen Sie das Inokulum und 15 mL MEM mit 2 % FCS. 2 – 4 Tage bei 37 ° C und 5 % CO2 inkubieren.
  6. Überprüfen Sie die Zellmorphologie und GFP-Fluoreszenz (Anregung bei 488 nm) und Emission bei 515 – 535 nm unter einem invertierten Fluoreszenzmikroskop mit 20 X Vergrößerung um den richtigen Zeitpunkt zu ernten, die Viren zu schätzen. Beachten Sie, dass dies in der Regel bei 50 – 80 % der HEp-2 Zelle Schicht aufgrund der RSV-CPE getrennt wird, die zwischen 48 und 72 h Postinfection (PI) auftritt (siehe Abbildung 3).
  7. Kratzen Sie die Zellen, die mit einer Zelle Schaber. Sammeln Sie die Zellen und der Überstand zusammen und übertragen Sie sie auf eine 50 mL Zentrifugenröhrchen.
  8. Fügen Sie 1/10 des Volumens des 10 x RSV Erhaltung Lösung (0,5 M HEPES und 1 M MgSO4 [pH 7.5]). Wirbel der Rohre kräftig für 5 s und klären Sie die Aussetzung durch eine 5 min Zentrifugation bei 200 X g.
  9. Übertragen des Überstands in ein 50 mL-Tube. Vortex kurz und aliquoten Suspension in kryogenen Röhren mit alkoholbeständigem Tags gekennzeichnet. Tauchen Sie der Rohre in vorgekühlte-80 ° C Alkohol für mindestens 1 h und bei-80 ° c lagern
  10. Freigeben eines Aliquoten zu titrieren die virale Aussetzung (siehe Abschnitt 4).

(4) Plakette Titration Assay

  1. Bereiten Sie 12-Well Platten für die Titration am Tag vor der Titration-Assay durchgeführt wird (sechs Brunnen werden benötigt, um eine Tube Virus Titrieren). Samen der Brunnen mit 1 mL HEp-2 Zellen bei 5 x 105 Zellen/mL in kompletten Medium.
  2. Am nächsten Tag bereiten Sie eine sterile mikrokristalline Cellulose-Suspension (2,4 % [w/V] im Wasser) (siehe Tabelle der Materialien).
    1. Zerstreuen Sie 2,4 g mikrokristalline Cellulose Pulver in 100 mL destilliertem Wasser, mit einem standard Magnetrührer bis zur vollständigen Auflösung des Pulvers (in der Regel 4 – 12 h). Autoklaven die Aussetzung bei 121 ° C für 20 min und bei Raumtemperatur vor der Verwendung zu speichern.
      Hinweis: Unter solchen Bedingungen ist die Federung für 1 Jahr stabil.
    2. Nach dem Öffnen der Lösung in einer sterilen Umgebung, bewahren Sie es bei 4 ° C für 6 Monate. Mischen Sie die Suspension vor Gebrauch (per Hand zu schütteln oder vortexen) immer um sicherzustellen, dass sie homogen ist.
  3. Bereiten Sie die 2 x MEM in einer sterilen Umgebung. Verdünnen Sie kommerzielle MEM 10 X mit sterilem Wasser und L-Glutamin, 1.000 Einheiten/mL Penicillin und 1 mg/mL Streptomycin hinzufügen. Die Verdünnung kräftig schütteln und bei 4 ° c lagern
    Hinweis: Führen Sie Schritte 4.4 – 4.10 in einer sterilen Umgebung mit einer Klasse II Sicherheitsschrank.
  4. Bereiten Sie sechs Röhren 900 µL MEM ohne FCS pro Virus titriert werden (die Titration Röhren). Tauen Sie das Virus Aliquote Vortex Rohr sie energisch für 5 s und Transfer 100 µL, die erste Titration.
  5. Führen Sie eine zehnfache Verdünnung 6 X wie folgt. Fügen Sie 100 μL des Virus zu 900 μl Medium in der ersten Röhre setzen Sie die Kappe auf dem Rohr und dessen Inhalt durch Vortexen mischen, für ein paar Sekunden. Ändern Sie die Spitze auf die Pipette, 900 µL Medium in der zweiten Röhre 100 µL der ersten Verdünnung hinzu, setzen Sie die Kappe auf dem Rohr und Wirbel. Wiederholen Sie den Vorgang bis das sechste Rohr.
    Hinweis: Es ist sehr wichtig, die Tipp für jede Verdünnung zu ändern.
  6. Schreiben Sie das Virus Namen und die Falte Verdünnungen auf HEp-2-12-Well-Platten. Fügen Sie eine Markierung um die Platte und Deckel passen, weil sie getrennt werden können, während der Färbung (Schritt 4,9). Entfernen Sie das Medium aus den Platten und verteilen Sie 400 µL einer Verdünnung pro Bohrloch zu. Inkubieren Sie die Platten bei 37 ° C für 2 h, Virus Adsorption.
    Hinweis: Ändern Sie die Pipettenspitze zwischen jedem Inokulum oder gehen Sie vom niedrigsten zum höchsten Konzentration mit der gleichen Spitze. Impfen Sie eine limitierte Serie von Platten (1-2) gleichzeitig, um die Zellen trocknen zu vermeiden.
  7. Bereiten Sie die mikrokristalline Cellulose-Overlay während der Virus-Adsorption (Magistralrezeptur). Um 100 mL Overlay zu erhalten, mischen Sie 10 mL Suspension von 2,4 % mikrokristalline Cellulose, 10 mL 2 x MEM und 80 mL MEM mit 2 % FCS.
    1. Stellen Sie den pH-Wert des 2 x MEM auf rund 7,2 mit einer sterilen Natrium Bikarbonat-Lösung bei 7,5 %, nach der Farbindikator. Mikrokristalline Cellulose-Aufhängung und die MEM und mischen Sie kräftig.
  8. Am Ende der 2 h Inkubation geben Sie 2 bis 3 mL-Overlay in jedes 12-Well-Platten ohne das Inokulum zu entfernen. Achten Sie darauf, um die Kontamination der benachbarten Brunnen mit hohen virale Titer Befallsdruck zu vermeiden. 6 Tage inkubieren Sie die Platte bei 37 ° C und 5 % CO2 . Bewegen Sie die Platte nicht und bewegen Sie den Inkubator nicht während der Inkubation.
  9. Fahren Sie fort, die Zellen mit Kristallviolett-Lösung (8 % Kristallviolett [V/V], 2 % Formaldehyd [V/V], und 20 % Ethanol [V/V] in Wasser) zu beflecken.
    1. Schützen Sie die Arbeitsfläche der Biosicherheit Schrank mit einem Blatt (das Kristallviolett Farben stark Oberflächen).
    2. Schütteln Sie die Platten zum Ausziehen der mikrokristalline Cellulose-Overlay. Die Überstände entfernen und waschen Sie die Zellen 2 X mit 1 x Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS). Behandeln Sie die Platten eins nach dem anderen um die Zellen trocknen zu vermeiden. Geben Sie 1 – 2 mL Kristallviolett-Lösung hinzu und warten Sie 10-15 Minuten entfernen Sie die Lösung, die für das anschließende Platte beflecken wiederverwendet werden können.
    3. Tauchen Sie die Platten und Deckel in frischem Bleichmittel für ein paar Sekunden und dann waschen Sie sie gründlich mit Leitungswasser. Beachten Sie, dass die Platten und Abdeckungen durch das Bleichmittel dekontaminiert werden.
    4. Die Platten und Deckel auf Küchenpapier legen und trocknen lassen. Trocknen Sie die Platten bei einer Umgebungstemperatur nach Wasser spülen und bei Raumtemperatur lagern. Für längere Lagerung (Monate), halten die Platten geschützt vor Licht, die Farbe zu schützen. Beachten Sie, dass wenn die Zellen ihre Färbung verlieren, sie wieder mit Kristallviolett gefärbt werden können.
  10. Virus-Titer zu berechnen. Zählen Sie die Plaques in den Vertiefungen der Trockenplatten, die mit dem bloßen Auge sichtbar sind. Überprüfen Sie, dass die Zahl der Plaketten für die verschiedenen Verdünnungen kohärente (Faktor 10 zwischen jeder Verdünnung). Wählen Sie den Brunnen, an dem die Plaketten die am einfachsten sind zu zählen. Die Zahl der Plaketten gegen das Inokulum Volumen und die Verdünnung zu beurteilen.
    Hinweis: Auf das Beispiel in Abbildung 4sind 21 Plaketten an die 10-5 Verdünnung gezählt. Diese entsprechen einem Titer von
    Equation
    Equation

(5) die Verwendung von HRSV-GFP rekombinanten Virus Virusreplikation in Zellen mit kleinen interferierende RNA oder Virostatika behandelt zu überwachen

Hinweis: Führen Sie alle Schritte mit Ausnahme von 5.1 und 5.2.5 in einer sterilen Umgebung mit einer Klasse II Sicherheitsschrank.

  1. Überwachung des Effekts der zellulären Gen-silencing auf RSV-Multiplikation
    Hinweis: Die Transfektion Protokoll hängt das Reagenz (siehe Tabelle der Materialien).
    1. Die GFP-Messung 96-Well Platten vorbereiten. Zwei Tage vor der Assay für gegebene kleine interferierende RNA (SiRNA), bereiten Sie eine Lösung der reduzierte Serum-Medien mit SiRNA in einer Konzentration von 100 nM und einer SiRNA Transfection Reagens verdünnt bei 1/500. Inkubieren Sie die Lösung für 30 min bei Raumtemperatur.
    2. Fügen Sie 25 µL der Lösung in die Vertiefungen der Platte in 5.1.1 (in dreifacher Ausfertigung) vorbereitet. Samen der Brunnen mit 75 µL aus einer Suspension von A549 Zellen 4 x 105 Zellen/ml in kompletten Medium ohne Antibiotika, um eine endgültige Zellkonzentration von 3 x 105 Zellen/mL zu erhalten. Inkubieren Sie die Platte für 48 h bei 37 ° C und 5 % CO2.
      Hinweis: Die endgültige SiRNA-Konzentration ist 25 nM und die endgültige Transfection Reagens Lautstärke ist 0,5 µL/Well).
    3. Wie folgt infizieren Sie die Zellen. Entfernen Sie das Medium aus dem Brunnen. Hinzufügen von 100 µL der RSV-GFP Aussetzung bei 50.000 PFU/mL und inkubieren Sie für 2 h bei 37 ° C und 5 % CO2. Entfernen Sie die virale Aussetzung zu und fügen Sie 100 µL DMEM mit 2 % FCS und ohne Phenol Rot hinzu. Inkubieren Sie die Platte bei 37 ° C und 5 % CO2.
    4. Bei 24 h und 48 h p.i., Messung der Fluoreszenz, legen Sie mithilfe eines Spectrofluorometer auf Anregung und Emission Wellenlängen von 488 und 520 nm bzw. (Fluoreszenz ist relative Fluoreszenz-Einheiten ausgedrückt). Verwenden Sie noninfected A549 Zellen als Standards für Fluoreszenz und Hintergrund.
      Hinweis: Die Zellen müssen mit 4 % Paraformaldehyd (PFA) behoben werden, bevor Sie messen sie ohne das Cover der Platte.
  2. Bewertung von der Droge-Hemmung mit RSV-GFP
    1. Die GFP-Messung 96-Well Platten vorbereiten. Samen Sie am Vortag der Assay die Brunnen mit 100 µL einer Suspension von HEp-2 Zellen bei 5 x 105 Zellen/mL in kompletten Medium ohne Phenol rot.
    2. Bereiten Sie eine serielle Verdünnung von den getesteten Medikamente (AZ4316 in diesem Beispiel) in MEM mit 2 % FCS und Antibiotika (50 µL pro Well) ergänzt. Bereiten Sie eine virale Suspension bei 10.000 PFU/mL in MEM ohne Stromazellen vaskulären Faktor (SVF) und Phenol-rot (50 µL pro Well).
    3. Entfernen Sie das Medium aus der 96-Well-HEp-2 Teller und 50 µL der Droge Suspension und 50 µL der viralen Suspension (in dreifacher Ausfertigung) hinzufügen. Durchführen Sie eine mock-Infektion als ein Steuerelement parallel.
      Hinweis: Medikament Verdünnung und virale Aussetzung können gemischt werden, bevor Sie sie auf die Zelle hinzufügen, oder sie können nacheinander hinzugefügt werden.
    4. Inkubieren Sie die Platte für 48 h bei 37 ° C und 5 % CO2.
    5. Messung der Fluoreszenz, mit einem Spectrofluorometer, wie in Schritt 5.1.4 beschrieben. Verwenden Sie Mock-infizierten HEp-2 Zellen als Standards für Fluoreszenz-Hintergrund-Niveaus.

6. Charakterisierung der M2-1 Lokalisierung In Vivo mit dem RSV-M2-1-GFP rekombinanten Virus

Hinweis: Führen Sie Schritte 6.1 und 6.2 in einer sterilen Umgebung, mit einer Klasse II Sicherheitsschrank.

  1. Bereiten Sie eine Aussetzung der HEp-2 Zellen bei 5 x 105 Zellen/mL in kompletten Medium. Samen 1,5 mL Zellsuspension in einem 35 mm Petrischale permeationsfähigen zu CO2 und angepasst für live-imaging.
  2. Führen Sie die Infektion am Tag nach der Aussaat mit dem RSV-M2-1-GFP-Virus bei MOI 1, wie in 3.3 – 3.5 beschrieben (entfernen Sie das Medium, 500 µL zu 1 mL Inokulum, und die Probe bei 37 ° C inkubieren, während sanft schütteln für 2 h; das Inokulum zu entfernen und hinzufügen 1,5 mL MEM mit 2 % FCS). Die gewünschte Zeit (IBs startet erscheinen ab 10 h p.i.) inkubieren Sie die Zellen bei 37 ° C und 5 % CO2 .
  3. Heizen Sie die Inkubation Kammer von einem inversen Mikroskop mit 40 X 100 X Zielen bei 37 ° C, vor dem Einsetzen der Petrischale mit infizierten Zellen auf der Bühne ausgestattet. Öffnen Sie die CO2 -Versorgung und Fokus Stabilisierung warten.
  4. Durchführen Sie Bildgebung mit GFP-kompatible Filter, unter einer niedrigen Intensität und Bild Erregerfrequenz (von 1 bis 0,1 Bild pro min) zur Minimierung von Phototoxizität.

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Representative Results

In dieser Arbeit beschrieben, ein detailliertes Protokoll zur Herstellung rekombinanter RSV-Viren mit dem Ausdruck eines fluoreszierenden Proteins (Abbildung 2). Im pRSV-GFP wurde das GFP-gen zwischen dem P und M gen eingeführt, wie für die Kirsche gen zuvor veröffentlichte Arbeit21beschrieben. In pRSV-M2-1-GFP das M2-gen war unangetastet gelassen und ein zusätzliches Gen Kodierung für M2-1-GFP zwischen SH und G Gene12eingefügt wurde. Der erste Schritt zur Rettung des Virus in BSRT7/5 Zellen, entsprechend ist in Abbildung 2Adargestellt. Kleine Gruppen von grün fluoreszierenden Zellen waren sichtbar 72 h Posttransfection in Brunnen, RSV-GFP und RSV-M2-1-GFP Rettung entspricht. Das Fluoreszenzsignal konnte im Zytoplasma und Zellkerne im RSV-GFP-infizierten Zellen, entspricht des Ausdrucks der freien GLP beobachtet werden. Im Gegensatz dazu konnte bei der RSV-M2-1-GFP-Rettung, fluoreszierende zytoplasmatischen Pünktchen beobachtet werden, M2-1-GFP Akkumulation in IBs entspricht. In der Regel wird bei diesem Schritt keine CPE (Syncytia, freistehende Zellen) beobachtet. Umgekehrt, während im zweiten Schritt entsprechend Virus Verstärkung (erster Durchgang) auf HEp-2 Zellen, CPE war sichtbar in infizierten Zellen bei 72 h p.i. (Abb. 2 b). Abbildung 3A B zeigt die starke CPE der RSV-Infektion zeichnet sich durch große Syncytia, freistehend oder nicht, und viele Einzelfeldern. Syncytia und Zellen ausgestellt hell grün fluoreszieren. Abbildung 3A zeigt die Entwicklung des zytopathischen Effekts zwischen 24 und 72 h p.i. in Zellen mit dem RSV-M2-1-GFP-Virus infiziert. Ein paar vereinzelte fluoreszierende Zellen waren sichtbar bei 24 h p.i. ohne eine nachweisbare CPE. Kleine Syncytia (Cluster von fluoreszierenden Zellen) und ein paar freistehende Zellen/Syncytia begann, bei 48 h p.i. große fluoreszierende Syncytia erscheinen und schwimmende Zellen waren deutlich sichtbar bei 72 h p.i.

Bilder von Plaque Titration Assay und virale Titer entspricht den gesamten Prozess der RSV-Produktion sind in Abbildung 5dargestellt. Durchführung der Plaque-Assay auf die negativ-Kontrolle, mit nur den Ausdruck Plasmiden von M2-1, N, P und L transfiziert ergab keine Gedenktafel an die niedrigsten Verdünnung. Die Titer der transfizierten Zellen entnommen wurden voraussichtlich über 100 PFU/mL liegen, wenn die Rettung effizient, war wie in Abbildung 5dargestellt. Dann erhöht die Titer über die Passagen zu 106– 107 PFU/mL in der Passage 1 oder 2 zu erreichen. Beachten Sie, dass die virale Titer zwischen beiden rekombinanten Viren ähnelten.

Zellen wurden mit SiRNA, die Ausrichtung auf die mRNA ein virales Protein (N) oder zwei zelluläre Proteine (Inosin-5'-Monophosphate-Dehydrogenase [IMPDH] und Glyceraldehyde-3'-Phosphat-Dehydrogenase [GAPDH]) transfiziert. Zellen wurden auch mit nontargeting SiRNA transfiziert. Abbildung 6 zeigt die Überwachung der RSV Multiplikation mit RSV-GFP Virus auf SiRNA-behandelten Zellen. Ein starkes Signal der GFP wurde (Abb. 6A) beobachtet und gemessen (Abb. 6 b) auf Kontrollzellen transfiziert mit nontargeting SiRNA oder Zellen mit SiRNA gegen GAPDH mRNA transfiziert. Im Gegensatz dazu wurde die GFP Expression in infizierten Zellen, die mit dem Ausdruck SiRNA Ausrichtung auf N oder IMPDH verringert. Beachten Sie, dass wir überprüft, dass die GFP Fluoreszenzsignal in RSV-GFP-infizierten Zellen bei 48h p.i. mit der viralen Dosis wie zuvor für eine ähnliche rekombinante RSV mit dem Ausdruck Cherry (RSV-Kirsche)21korreliert war. Zur Beurteilung der Effizienz der Droge auf RSV Multiplikation, infiziert waren HEp-2 Zellen mit RSV-GLP für 48 h in Anwesenheit von verschiedenen Drogen-Konzentrationen. Wir beobachten eine starke Abnahme der GFP-Signal, das die Geräuschkulisse erreicht (es war ein Signal auf nicht infizierten Zellen beobachtet), in der Gegenwart eine höhere Wirkstoffkonzentration, wie in Abbildung 7dargestellt. Die beobachteten IC50 für AZD4316 war ca. 4 nM, ähnlich wie die veröffentlichten EC50 von etwa 2 bis 40 nM gegen verschiedene HRSV Stämme23. Die Analyse der Dynamik von IBs und IBAGs in lebenden Zellen, dank RSV-M2-1-GFP werden in Abbildung 8 und Abbildung 9 (und Film 1 und Film 2) angezeigt. IBs werden als mobile kugelförmigen Strukturen in der Lage, zu verschmelzen, bilden eine größeren kugelförmigen Aufnahme angezeigt. IBAGs sind sehr dynamisch. Sie durchlaufen kontinuierliche Montage-Demontage-Zyklen mit der Bildung von kleinen IBAGs, die wachsen, Sicherung in großen IBAGs, und dann verschwinden.

Platte oder Kolben HEp-2 Zellen, die am Vortag ausgesät werden Mittleres Volumen (mL) Virus Inokulum Volumen (mL)
150 cm2 Kolben 15 x 106 30 5
75 cm2 Kolben 7,5 x 106 15 3
25 cm2 Kolben 2.5 x 106 5 1
6-Well-Platte 1 x 106 2 0,5

Tabelle 1: Die Anzahl der Zellen und Inokulum Volumen in verschiedenen Flaschen verwenden.

Figure 1
Abbildung 1: Schematische Darstellung der Rettungs- und Verstärkung Schritte. Transfektion des Expressionsvektors N, P, L, M2-1 und RSV antigenomic RNA in BSRT5/7 Zellen (Rescue). Ausdruck von antigenomic RSV-RNA und die mRNA des M2-1, N, P und L durch die T7-RNA-Polymerase. Die M2-1, N, P und L Proteine zu replizieren und transkribieren die genomische RNA, initiieren einen virale Vermehrung-Zyklus. Neue Viruspartikel entstehen und sich vermehren, geben Anlass zu der P0. Das Virus von der Rettung (P0) geerntet wird dann verstärkt auf HEp-2 Zellen eine höhere Titer virale Suspension (P1) produzieren (Amplifikation). Dies wird dann verstärkt, um virale Bestände zu erhalten. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: CPE und das Muster der Fluoreszenz beobachtet während der Rettung von RSV-GFP und RSV-M2-1-GFP. (A) BSRT5/7 Zellen mit der reversen Genetik Vektoren transfiziert wurden, wie angegeben, und Phasenkontrast- und Fluoreszenz Bilder wurden bei 72 h posttransfection. Die negative-Kontrolle (Neg Ctrl) entspricht mit Expressionsvektoren von M2-1, N, P und L ohne die reverse genetische Vektor transfected Zellen. (B) HEp-2 Zellen waren infiziert mit dem Virus aus den transfizierten Zellen BSRT5/7 (die Null Passage, 72 h Posttransfection) geerntet und Bilder wurden 72 h postinfection. Die gezeigten Bilder sind von repräsentativen Bereichen; Maßstabsleiste = 100 µm. Die Box Bereich umschließt Zellen in Vergrößerung gezeigt; Maßstabsleiste = 20 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3: Entwicklung der CPE und die Fluoreszenz beobachtet, während die Verstärkung der rekombinanten RSV. HEp-2 Zellen wurden bei einer MOI von 0,01 PFU/Zellen 72 h mit den ersten Durchgang von (A) RSV-M2-1-GFP oder (B) RSV-GFP infiziert. Phasenkontrast- und Fluoreszenz Bilder wurden bei 24 h, 48 h und 72 h postinfection. Die gezeigten Bilder sind von einer repräsentativen Bereich; Maßstabsleiste = 100 µm. Die Box Bereich umschließt Zellen in Vergrößerung gezeigt; Maßstabsleiste = 20 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4: Ermittlung der RSV-Titer mit dem Plaque-Assay. (A) Ergebnisse des Plaque Titration Assays in einem 12-Well-Platte. Die sechs Brunnen mit seriellen Verdünnungen von einem viralen bestand infiziert werden angezeigt. Verdünnungen sind in einem Logarithmus Basis 10 angegeben. Mit den drei ersten Verdünnungen infizierte Zellen sind alle freistehend. Die Plakette Zahlen beobachtet mit den 10-410-5, und 10-6 Verdünnungen im Einklang stehen. (B) Darstellung der Plaque-Enumeration (gelbe Zahlen). Der grüne Stern zeigt Kratzer auf der Zellschicht. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 5
Abbildung 5: Titration eines geretteten und verstärkte Virus. Plaque Phänotypen der RSV-GFP und RSV-M2-1-GFP an den verschiedenen Stellen untersucht auf HEp-2 Zellen in einem 12-Well-Platte (die Bilder zeigen die Gesamtheit der Brunnen). Die Titer der nachfolgenden Passagen sind in der Tabelle dargestellt. Repräsentative Daten werden angezeigt. Verdünnungen der viralen Bestände sind in einem Logarithmus Basis 10 angegeben. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 6
Abbildung 6: Hemmung der RSV-GFP Expression von SiRNA Ausrichtung auf RSV N oder IMPDH. A549 Zellen wurden behandelt mit Steuerung nontargeting SiRNA (NT) (leichte blaue Balken) oder SiRNA targeting GAPDH (blauer Balken), RSV N (orangefarbener Balken) oder IMPDH2 (grüner Balken) für 48 h und dann mit RSV-GFP bei einer MOI von 0,05 PFU/Zelle infiziert. Die grünen Fluoreszenz wurde in 48 h Postinfection gelesen. (A) repräsentative Bilder der RSV-GFP-infizierten Zellen bei 48 h p.i., mit SiRNA behandelt, wie auf den Bildern zu sehen. Maßstabsleiste = 100 µm. (B) Daten sind der Mittelwert ± SD von zwei unabhängigen Experimenten in dreifacher Ausfertigung. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 7
Abbildung 7: Hemmung der RSV-GFP Multiplikation mit zusammengesetzten AZD4136. HEp-2 Zellen in 96-Well Platten wurden mit RSV-GFP bei einer MOI von 0,05 PFU/Zelle im Beisein von Verdünnungsreihen AZD4316 zusammengesetzte oder Kontrolle DMSO infiziert. Die grünen Fluoreszenz wurde bei 48 h p.i. gelesen, die Daten der Mittelwert ± SD von zwei unabhängigen Experimenten in dreifacher Ausfertigung sind. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 8
Abbildung 8: Analyse der Dynamik des Reizdarmsyndroms durch die Verfolgung des fluoreszierenden Proteins GFP 1 M2 in HEp-2-infizierte Zellen Zeit verfallen Mikroskopie. Um 18 h p.i. wurden Zellen alle 5 min für 5 h mit einem Fluoreszenzmikroskop in einer Kammer bei 37 ° c beheizt abgebildet. Die IBs sind fluoreszierend (grün), weil sie M2-1-GFP Gastgeber und Kerne sind mit Hoechst (blau) gefärbt. Die weißen Pfeile zeigen IBs Fusion unterziehen. Maßstabsleiste = 10 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 9
Abbildung 9: Analyse der Dynamik der IBAGs im RSV-M2-1-GFP-infizierten Zellen durch Zeit verfallen Mikroskopie. Um 18 h p.i. wurden Zellen mit einem Fluoreszenzmikroskop in einer Kammer bei 37 ° c beheizt abgebildet. Das M2-1-GFP-Protein wurde durch grüne Fluoreszenz sichtbar gemacht. Die weißen Pfeile zeigen IBs eine Verschmelzung von IBAGs unterziehen. Maßstabsleiste = 5 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Movie 1
Movie 1: In-vivo Analyse der Dynamik des Reizdarmsyndroms im RSV-M2-1-GFP im HEp-2-infizierte Zellen. Um 18 h p.i. wurden Zellen alle 5 min für 5 h mit Fluoreszenzmikroskop in einer Kammer bei 37 ° c beheizt abgebildet. Maßstabsleiste = 10 µm. Der daraus resultierende Film zeigt 7 Bilder/s (fps). Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzusehen. (Rechtsklick zum download)

Movie 2
Movie 2: In-vivo Analyse der Dynamik der IBAGs im RSV-M2-1-GFP-infizierten Zellen. Um 18 h p.i. wurden Zellen alle 5 min. 3 h und 40 min mit Fluoreszenzmikroskop in einer Kammer bei 37 ° c beheizt abgebildet. Maßstabsleiste = 2 µm. Der daraus resultierende Film zeigt 4 fps. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzusehen. (Rechtsklick zum download)

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Discussion

Hier präsentieren wir eine Methode zur Rettung des rekombinanten RSV aus fünf Plasmide und ihre Verstärkung. Die Fähigkeit zu manipulieren, das Genom der Viren revolutioniert Virologie-Forschung, um Mutationen zu testen und ein zusätzliches Gen oder ein tagged viral Protein ausdrücken. Der RSV haben wir beschrieben und als ein Beispiel in diesem Artikel ist ein Virus mit dem Ausdruck ein Reportergen, RSV-GLP (unveröffentlicht) und drückt eine M2-1-Protein mit einem GLP-Tag12verschmolzen. RSV-Rettung ist anspruchsvoll und erfordert Übung. Die Transfektion Effizienz ist entscheidend, je nach eine kluge Auswahl des Transfection Reagens und eine vorherige Optimierung des Protokolls Transfektion. Die Verwendung von Zellen, die mit dem Ausdruck der Bakteriophagen T7 Pol ist obligatorisch, da die virale cDNA stromabwärts der T7-Pol-Veranstalter in einem Großteil der reverse genetische Vektor platziert wird. Eine Alternative ist die T7-Pol von einem "Vaccinia" Helfervirus abzugeben. Jedoch die Verwendung von Zellen stabil mit dem Ausdruck der T7-Pol vermeidet die Notwendigkeit der Trennung der beiden Viren und verhindert mögliche Störungen der "Vaccinia" mit der Rettung. Es ist wichtig, den ersten Durchgang der reverse genetische (P0, P1) durchzuführen, ohne zu frieren das Inokulum um maximale Rettung Effizienz zu gewährleisten. Dies bedeutet, dass das Innenministerium nicht kontrolliert wird. Allerdings bleiben bei diesem Schritt die Titer sehr niedrig, was eine niedrige MOI für den ersten Durchgang. Um RSV Aktien mit hohen infektiöse Titer (106– 107 PFU/mL) zu erhalten, ist es wichtig zu warten, bis eine starke CPE und kratzen Sie die Zellen, um die virale Partikel angebracht zu den Zellen zu sammeln. In dieser Studie erhöhte Titer nicht nach 96 h p.i. Die schnelle Abkühlung der viralen Suspension ist wichtig, hohe Titer zu erhalten. Stattdessen kann der durch ein Eintauchen in Alkohol bei-80 ° C vorgekühlt dies auch durch Eintauchen in eine Trockeneis/Ethanol-Mischung oder in flüssigem Stickstoff erreicht werden. Die Zugabe der Erhaltung-Lösung gewährleistet eine längere Stabilität der Virus Suspension bei-80 ° C. Die Lagerung bei-80 ° C ist kritisch, da das Virus schnell Verlust wird seine Infektiosität bei-20 ° c oder in flüssigem Stickstoff gelagert. Wir beschrieben die RSV Verstärkung auf HEp-2 Zellen, die die beliebtesten Zellinie RSV wachsen, aber es ist auch in der Lage, effizient auf zahlreichen anderen Zelllinien in vitro wachsen. Beachten Sie jedoch, dass eine Veränderung in G Ausdruck24Wachstum auf Vero-Zellen führen kann.

Wir beschrieben ein sehr einfaches Protokoll der Plaque Titration der RSV eine mikrokristalline Cellulose verwenden. Alle Titration Assays ist empfindlich gegenüber Verunreinigungen mit hoher Titer Suspensionen, erfordern sorgfältige Manipulation. Konventionelle RSV Titration Assays verwenden Agarose oder Carboxymethylcellulose (CMC) Zellulose-Overlays und erfordern Immunostaining und mikroskopische Beobachtungen für die Titer-Bestimmung. Ermöglicht die direkte Visualisierung von Plaques ohne Immunostaining25ist ein Protokoll mit Immunodiffusion Klasse Agarose beschrieben worden. HEp-2 Zellen sind jedoch sehr empfindlich auf eine beheizte Agar-Overlay, die dieses Protokoll verwenden Sie für mehrere Virus Titrationen erschwert (z. B. eine zu heiße-Overlay zerstört die Zellschicht); auf der anderen Seite, wenn es nicht heiß genug ist, erstarrt es nach der ersten Platte-Verteilung. Die Verwendung von mikrokristalline Cellulose für einen Plaque-Assay wurde zuerst von Matrosovich Et Al. für eine Influenza-A-Virus Titration Assay26beschrieben. Dank seiner niedrigen Viskosität ist die mikrokristalline Cellulose Überlagerung leicht zu verzichten und von Platte Brunnen, so dass es kompatibel mit 96-Well Platten zu entfernen. Es ist daher besonders anpassungsfähig an serologischen Studien und Droge Sensitivitätsanalysen. Beachten Sie, dass die Medikamente da mikrokristalline Cellulose nicht beheizt werden muss, leicht in der Überlagerung integriert werden können. Es ist jedoch wichtig, dass die Platten ganz still während der Inkubation bleiben; Andernfalls werden große Komet-förmigen Brennpunkte statt Runde Plaketten bilden. Plaque-Offenbarung mit Kristallviolett ist billig und einfach, aber diese Lösung ist giftig und muss ordnungsgemäß entsorgt werden. Das recycling der Lösung schränkt Abfallproduktion. Darüber hinaus ist diese Methode für Monolage Zellschäden, die als falsche weiße Flecken erscheinen würde, die nicht virale Plaques sind empfindlich. Ein Beispiel ist in Abbildung 4 (grüner Stern) dargestellt. Um diese Verzerrung zu vermeiden, 1) Zellen mit Vorsicht zu vermeiden, kratzen oder Spülung der Zelle Monolage, 2) streben zu handhaben und Verzicht auf immer an der gleichen Stelle zu umschreiben, die Schäden an einem bekannten Bereich gemacht haben, und (3) falsche weiße Flecken identifiziert werden kann Dank ihrer Form (nicht sphärisch), deren scharfen Kanten und ihre Position. Wir haben zuerst Avicel RC 581, als zuvor veröffentlichten21,26. Jedoch die RC-581 ist nicht mehr verfügbar, und wir erfolgreich durch RC 591 ersetzt. Dieser Assay an andere Zelle/Virus-Paare anzupassen, hat die Konzentration von mikrokristalline Zellulose abhängig von dem Virus und die Zellen ermittelt werden. Zuviel mikrokristalline Cellulose kann giftig für Zellen und führen zu kleinen Plaketten, zu wenig führt zur Verbreitung des Virus in das Medium.

Wir beschrieben zwei Anwendungsbeispiele des RSV-GFP Virus RSV Multiplikation zu überwachen: in der Gegenwart eine antivirale Medikament oder wenn eine zelluläre Protein zum Schweigen zu bringen. Wir zeigten, dass das GFP-Signal mit virale Vermehrung korreliert ist. Die hier vorgestellte Methode ermöglicht die mühelose Evaluierung der virale Vermehrung in Echtzeit. Es kann Wissenschaftler die IC50 eine antivirale Medikament leicht zu bestimmen, wie in Abbildung 7dargestellt. Wichtig ist, ist dieses Maß anpassungsfähig für den Einsatz in Medium oder Breitband, vor allem für das Screening von chemischen Bibliotheken. Dieser Reporter exprimierenden Virus kann auch zur Beurteilung der Wirkung auf Virus Multiplikation einer Modulation der zellulären Proteinexpression nützlich. RNA-Interferenz ist ein biologischer Prozess, wobei eine spezifische mRNA im Anschluss an seine besondere Anerkennung durch SiRNA, abgebaut wird, wodurch oder, im Idealfall, Abschaffung des Ausdrucks des entsprechenden Proteins27. In dem Beispiel hier, durch die Überwachung der GFP Signalintensität im RSV-GFP-infizierten Zellen untersuchten wir die Auswirkungen von das Schweigen der virale Nukleokapsid (N) mRNA oder dem Host IMPDH mRNA auf RSV Multiplikation. IMPDH2 ist ein Purin biosynthetischen Enzym, das einen Bandbreitenbegrenzung Schritt in Richtung der de-Novo-Biosynthese von Guanin Nukleotide aus IMP28katalysiert. Es ist also ein Regulator der intrazellulären Guanin-Nukleotid-Pool. IMPDH-Inhibitoren, wie z. B. Ribavirin, üben hemmende Wirkungen auf RNA-Viren, einschließlich der RSV-Infektion29,30,31. Wie in Abbildung 6dargestellt, beeinträchtigt die Hemmung der IMPDH Ausdruck virale Vermehrung, wie durch die Reduktion des GFP-Signals, imitiert die Wirkung von Ribavirin auf RSV Wachstum gekennzeichnet. Ebenso wird die virale Vermehrung im Beisein von SiRNA Ausrichtung auf das virale Protein N fast abgeschafft. Dieses Ergebnis wurde erwartet, da SiRNA Ausrichtung des N-Proteins erwartet wurde, dass virale Nukleokapsid Versammlung zu verhindern und erweist sich als virale Replikation32stark beeinträchtigen. Die Verwaltung dieser SiRNA durch Vernebelung gehemmt, die nachfolgende Infektion durch RSV in gesunden Erwachsenen33. Die Wirkung von N oder IMPDH SiRNA ist seit der Hemmung des Ausdrucks GAPDH, gewählt als Kontrolle gen spezifisch, virale Multiplikation im Vergleich zu den nontargeting SiRNA nicht beeinträchtigt. Beachten Sie, dass keine Zelle Toxizität unter allen Bedingungen erkannt wurde. Zusammengenommen, bestätigen diese Ergebnisse die Strategie hier vorgestellten, die zum Hochdurchsatz-screening mit SiRNA-Bibliotheken oder andere Ko-Methoden, wie z. B. CRISPR-Cas9 Technologie34vergrößert werden konnte.

Rekombinante Viren, die mit dem Ausdruck einer fluoreszierenden Fusionsprotein repräsentieren leistungsfähige Werkzeuge, virale Proteine und viralen Strukturen Dynamik zu studieren. RSV mit dem Ausdruck eines fluoreszierenden Proteins M2-1 ermöglicht die Beobachtung der Dynamik von IBs und IBAGs. IBs, die als RSV virale Fabriken angesehen werden können, erscheinen als kugelförmige dynamische Strukturen. Sie sind in der Lage, miteinander zu verschmelzen, zu größeren kugelförmigen Strukturen (Abb. 8 und Film 1). Diese Daten deuten darauf hin, dass RSV IBs sind flüssige Organellen, ähnlich wie was für Tollwut-Virus35beschrieben ist. IBAGs repräsentieren eine Subkompartiment innen IBs, in der viralen mRNA und M2-1 Proteinkonzentrat, wie der genomischen RNA, das Nukleokapsid und die Polymerase sind nur in den Rest der IBs-12. Videomikroskopie Experimente zeigen, dass IBAGs sehr dynamische Strukturen, die Flüssigkeit Eigenschaften (Abbildung 9 und Movie 2) ausstellen. Sie können als flüssige Fächer durch flüssig-flüssig Phasenübergangs betrachtet werden.

Es bleibt die Möglichkeit genetisch manipulieren, Viren ein Werkzeug der Wahl, sowohl die Mechanismen der ihre Vermehrung und ihre Empfindlichkeit gegenüber Drogen zu studieren. Reverse Genetik könnte nun als Teil der "klassischen" Techniken der Virologie. Es bleibt jedoch für einige Viren, wie RSV anstrengend. Daher ist dieses Protokoll im Detail beschreibt die Schritte erfolgreich zu retten und rekombinanten RSV zu verstärken.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Die Autoren danken Dr. Qin Yu von AstraZeneca R & D Boston, MA, USA, für die Bereitstellung der AZD4316 Droge. Die Autoren sind dankbar für die Cymages-Plattform für den Zugriff auf die ScanR Olympus Mikroskop, das durch unterstützt wurde aus der Region Ile-de-France (DIM eine Gesundheit) gewährt. Die Autoren erkennen Unterstützung von INSERM und der Universität Versailles Saint-Quentin.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
35 mm µ dish for live cell imaging Ibidi 81156
A549 ATCC ATCC CCL-185
Avicel RC-591 FMC BioPolymer Avicel RC-591 Technical and other information on Avicels is available at http://www.fmcbiopolymer.com. Store at room temperature. Protocol in step 4 is optimized for this reagent.
BSRT7/5 not commercially available See reference 22. Buchholz et al. 1999
Crystal violet solution Sigma HT90132
Fluorescence microscope for observations Olympus IX73 Olympus microscope
Fluorescence microscope for videomicroscopy Olympus ScanR Olympus microscope
HEp-2 ATCC ATCC CCL-23
HEPES ≥99.5% Sigma H3375
L-Glutamine (200 mM) ThermoFisher Scientific 25030024
LIPOFECTAMINE 2000 REAGENT ThermoFisher Scientific 11668019 Protocol in step 2.3. is optimized for this reagent.
MEM (10x), no glutamine ThermoFisher Scientific 11430030
MEM, GlutaMAX Supplement ThermoFisher Scientific 41090-028
MgSO4 ReagentPlus, ≥99.5% Sigma M7506
Opti-MEM I Reduced Serum Medium ThermoFisher Scientific 51985-026
Paraformaldehyde Aqueous Solution, 32%, EM Grade Electron Microscopy Sciences 15714
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) ThermoFisher Scientific 15140122
Plasmids not commercially available See reference 21. Rameix-Welti et al. 2014
See Saw Rocker VWR 444-0341
Si RNA GAPDH Dharmacon ON-TARGETplus siRNA
D-001810-10-05		 SMARTpool and 3 of 4 individual siRNAs designed by Dharmacon.
Si RNA IMPDH2 Dharmacon ON-TARGETplus siRNA IMPDH2 Pool- Human
L-004330-00-0005		 SMARTpool of 4 individual siRNAs designed by Dharmacon.
Individual references and sequences
J-004330-06: GGAAAGUUGCCCAUUGUAA;
J-004330-07: GCACGGCGCUUUGGUGUUC;
J-004330-08: AAGGGUCAAUCCACAAAUU;
J-004330-09: GGUAUGGGUUCUCUCGAUG;
Si RNA RSV N Dharmacon ON-TARGETplus custom siRNA UUCAGAAGAACUAGAGGCUAU and UUUCAUAAAUUCACUGGGUUA
SiRNA NT Dharmacon ON-TARGETplus Non-targeting Pool
SiRNA transfection reagent Dharmacon DharmaFECT 1 Ref: T-2001-03 Protocol in steps 5.1.and 5.1.2 are optimized for this reagent.
Sodium Bicarbonate 7.5% solution ThermoFisher Scientific 25080094
Spectrofluorometer Tecan Tecan infinite M200PRO

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References

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Bouillier, C., Rincheval, V., Sitterlin, D., Blouquit-Laye, S., Desquesnes, A., Eléouët, J. F., Gault, E., Rameix-Welti, M. A. Generation, Amplification, and Titration of Recombinant Respiratory Syncytial Viruses. J. Vis. Exp. (146), e59218, doi:10.3791/59218 (2019).

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