Summary
Vi beskriver en metode for å generere og forsterke genetisk endret respiratorisk syncytial virus (RSVs) og en optimalisert plakk analysen for RSVs. Vi illustrerer denne protokollen ved å opprette to rekombinant virus som henholdsvis tillate kvantifisering av RSV replikering og live analyse av RSV inkludering organer og inkludering organer-assosiert granulater dynamikk.
Abstract
Bruk av rekombinant virus blitt avgjørende i grunnleggende eller anvendt virologi. Omvendt genetikk har vist seg for å være en ekstremt kraftig teknologi, både å dechiffrere viral replikasjon mekanismer og å studere antivirale eller gi utviklingsplattform for vaksiner. Bygging og manipulering av et omvendt genetisk system for en negativ-strand RNA virus som en respiratorisk syncytial virus (RSV), men fortsatt delikate og krever spesiell kunnskap. RSV genomet er en enkelt-strand, negativ-sense RNA ca 15 KB som fungerer som en mal for både viral RNA replikering og transkripsjon. Omvendt genetikk systemet bruker en cDNA kopi av menneskelig RSV lang stamme genomet (HRSV). Dette cDNA, samt cDNAs koding virale proteiner av polymerase komplekse (L, P, N og M2-1), plassert i individuelle uttrykk vektorer under T7 utvalg kontroll sekvenser. Hva disse elementene i BSR-T7/5 celler som stabilt express T7 utvalg, tillater cytoplasmatiske replikering og transkripsjon av rekombinant RSV, gir opphav til genetisk modifisert virions. En ny RSV, som finnes på celleoverflaten og kultur nedbryting BSRT7/5, er samlet for å infisere HEp-2 menneskeceller for viral forsterkning. To eller tre runder med forsterkning er nødvendig for å oppnå viral aksjer som inneholder 1 x 106 1 x 107 plakk-forming enheter (PFU) / mL. Metodene for optimal høsting, frysing og titrering viral aksjer er beskrevet her i detalj. Vi illustrerer protokollen presentert her ved å opprette to rekombinant virus henholdsvis uttrykke gratis grønn fluorescerende protein (GFP) (RSV-GFP) eller viral M2-1 del GFP (RSV-M2-1-GFP). Viser vi hvordan du bruker RSV-GFP for å kvantifisere RSV replikering og RSV-M2-1-GFP å visualisere viral strukturer, samt viral protein dynamikk i levende celler, ved hjelp av video mikroskopi teknikker.
Introduction
Menneskelige RSV er den ledende årsaken til sykehusinnleggelse for akutt luftveisinfeksjon i spedbarn verden1. I tillegg er RSV forbundet med en betydelig sykdomsbyrde hos voksne sammenlignes med influensa, med de fleste sykehusinnleggelse og dødelighet byrden i eldre2. Det er ingen vaksiner eller bestemte antivirale tilgjengelig ennå mot RSV, men lovende nye stoffer er i utvikling3,4. Kompleksiteten og tyngde teknikker for kvantifisering av RSV multiplikasjon hindre Søk etter antivirale eller vaksiner til tross for dagens betydelig innsats. Kvantifisering av RSV multiplikasjon i vitro er vanligvis basert på arbeidskrevende, tidkrevende og kostbare metoder, som består hovedsakelig i analyse av cytopathic effekten av plakk reduksjon, mikroskopi, immunostai-analyser, kvantitativ revers transkriptase (qRT)-polymerasekjedereaksjons (PCR) og enzym knyttet immunosorbent analysen tester. Virus med endrede genomer og uttrykke reporter gener, som de koding for GFP, er mer egnet for slike visninger. Kombinert bruk av automatiserte plate lesere, kan reporter gen-bærer rekombinant virus gjøre disse analyser mer egnet for standardisering og høy gjennomstrømming.
RSV er en innhyllet, nonsegmented negative-sense RNA virus som tilhører Orthopneumovirus slekten Pneumoviridae familie, ordre Mononegavirales5. RSV genomet er en enkelt-strand, negativ-sense RNA ca 15 KB, som inneholder et noncoding område på 3 og 5' ekstremiteter kalt leder og tilhenger og 10 transcriptional enheter koding 11 proteiner. Gener er organisert slik: 3-NS1, NS2, N, P, M, SH, G, F, M2 (koding for M2-1 og M2-2 proteiner) og L-5'. Den genomisk RNA er tett pakket av nucleoprotein N. bruke encapsidated genomisk RNA som en mal, viral RNA-avhengig RNA polymerase (RdRp) vil sikre transkripsjon og replikering av viral RNA. Viral RdRp består av store protein L som bærer nukleotid polymerase aktiviteten i seg selv, sin obligatorisk kofaktor fosfoprotein som P og M2-1 protein som fungerer som en viral transkripsjon faktor6. I infiserte celler induserer RSV dannelsen av cytoplasmatiske Inneslutninger kalt inkludering organer (IBs). Morphologically lignende cytoplasmatiske inclusions har observert flere Mononegavirales7,8,9,10. Nyere studier på rabiat virus, vesicular stomatitt virus (VSV), Ebolaviruset og RSV viste at viral RNA syntese oppstår i IBs, som kan dermed betraktes som viral fabrikker8,9,11, 12. virus fabrikkene konsentrere RNA og virale proteiner kreves for viral RNA syntese og også inneholde mobilnettet proteiner13,14,15,16, 17. IBs viser en funksjonell subcompartment kalt IB-assosiert granulater (IBAGs), som konsentrere det nylig synthetized begynnende viral mRNA sammen med M2-1 protein. Den genomisk RNA og L, P og N gjenkjennes ikke i IBAGs. IBAGs er små dynamisk sfærisk strukturer inne IBs som viser egenskapene for flytende organeller12. Til tross for den sentrale rollen av IBs i viral multiplikasjon, er svært lite kjent om naturen, intern struktur, formasjon og drift av disse viral fabrikker.
Uttrykket i genomet til en poliovirus fra en cDNA aktivert produksjonen av den første smittsomme viral klone i 198118. For enkelt-strandet negative RNA-virus var det ikke før 1994 at produksjonen av første Rabiat virus etter transfection av plasmider i celler19 fant sted. Den første plasmider-baserte omvendt genetisk systemet for RSV ble utgitt i 199520. Omvendt genetikk har ført til store fremskritt innen virologi. Muligheten til å innføre endringer i viral genomet har gitt kritisk innsikt i replikering og patogenesen av RNA-virus. Denne teknologien har også mye lettere utviklingen av vaccines ved at bestemte demping gjennom målrettet rekke modifikasjoner. Genova endringer slik at en rask kvantifisering av viral multiplikasjon sterkt forbedret antiviral screening og studie av deres virkemåte.
Selv om tidligere beskrevet, fortsatt skaffe genmodifiserte RSVs delikate. Her, detalj vi en protokoll for å opprette to typer rekombinant HRSV, henholdsvis uttrykke RSV-GFP eller RSV-M2-1-GFP. I denne protokollen beskrive vi hva betingelsene for å redde de nye rekombinant virusene, samt deres forsterkning å få viral aksjer med høy titer, egnet for reproduserbar experimentations. Byggingen av den omvendte genetikk vektorer beskrives sådan ikke her. Vi gjør beskrive metoder for optimal høsting og frysing av viral aksjer. Den mest nøyaktige metoden å kvantifisere viral smittsomme partikler forblir plakk analysen. Celler er infisert med føljetong fortynninger av analysert suspensjon og inkubert med overlegg som forbyr spredningen av gratis virus partikler i nedbryting. I slike forhold, vil viruset bare infisere sammenhengende celler danner en "plakk" for hver første smittsomme partikkel. I konvensjonell RSV titrering analysen, er plaketter avslørt av immunostaining og regnet under mikroskopisk observasjon. Denne metoden er dyrt og tidkrevende. Her beskrev vi en veldig enkel protokoll for RSV plakk analysen bruker mikrokrystallinsk cellulose overlegg som gjør at dannelsen av plaketter synlig for det blotte øye. Vi viser hvordan RSV-GFP kan brukes å mål RSV replikering, og dermed å kvantifisere effekten av antivirale midler. Kombinere omvendt genetikk og live bildeteknologi, viser vi hvordan RSV-M2-1-GFP tillater forskere å visualisere M2-1 i levende celler og følge dynamikken i intracellulær viral strukturer, for eksempel IBs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. materialet forberedelse
- Kjøpe cellen media (redusert serum media, minimum essential media [minne], 10 x MEM og Dulbecco modifiserte Eagle's medium [DMEM]), hva reagens, og mikrokrystallinsk cellulose (se Tabell for materiale).
- Få følgende vektorer for omvendt genetikk: genomic vector(s) og uttrykk vektorer koding N protein og polymerase komplekse proteiner. Genomic vektorer inneholder full cDNA genomet av RSV-GFP (p-RSV-GFP) og RSV-M2-1GFP (p-RSV-M2-1GFP) nedstrøms fra bacteriophage T7 RNA polymerase (T7 pol) Promotøren. Uttrykket vektorer (som p-N, p -P, p-L og p-M2-1) inneholder koding sekvensen av N, P, L eller M2-1 nedstrøms T7 pol (se Rincheval et al.12 og Rameix-Welti et al.21 for detaljer om plasmider konstruksjoner).
- Forberede medier for en cellekultur i et sterilt miljø og for hva og infeksjon. Bruk DMEM med 2 mM L-glutamin supplert med 10% fosterets kalv serum (FCS), 1000 enheter/mL penicillin og 1 mg/mL streptomycin (eller uten antibiotika) og MEM med 2 mM L-glutamin supplert med 0%, 2% eller 10% FCS, 1000 enheter/mL penicillin og 1 mg/mL Streptomycin, utpekt som "komplett medium" i følgende protokollen.
- Få BSRT7/522 celler og gjøre aksjer i fullstendig medium med 10% dimethyl sulfoxide (DMSO) på 1 til 2 x 106 celler/mL. Spare celle aksjer i flytende nitrogen. Få HEp-2 celler. Kultur BSRT7/5 celler i komplett DMEM og HEp-2 celler i fullstendig MEM på 37 ° C og 5% CO2 i et sterilt miljø.
- Forberede en 10 x RSV bevaring løsning (0,5 M HEPES og 1 M MgSO4 [pH 7.5] i vann) i et sterilt miljø.
- Få en invertert fluorescens mikroskop kompatibel med GFP fluorescens målinger og kompatibel med live imaging hvis det er nødvendig å overvåke en infeksjon. Få en microplate leser kompatibel med GFP fluorescens mål for kvantifisering av RSV-GFP replikering.
2. hjelpe og første passasje av rekombinant Virus
Merk: Utføre alle følgende trinn i et sterilt miljø, med en klasse II sikkerhet regjering.
- Dagen før transfection, foreta en suspensjon av BSRT7/5 celle linjen på 5 x 105 celler/mL i fullstendig medium. Distribuere 2 mL celle suspensjon per brønn i en 6-vel plate. Forberede en brønn per virus som skal reddes og en ekstra godt negativ kontroll. Inkuber platen på 37 ° C og 5% CO2. Kontroller at cellene er i en 80-90% samløpet neste dag.
- Frigi omvendte genetikk vektorer (fra trinn 1.2) p-RSV-GFP og p-RSV-M2-1-GFP, og p-N, p -P, p-L og p-M2-1. Mix, for hver virus å hjelpe, 1 µg p-N og p -P, 0,5 µg p-L, 0,25 µg p-M2-1 og 1,25 µg av p-RSV (GFP eller M2-1 GFP) i et rør.
Merk: Ulike uttrykk vektorer for N, P, L og M2-1 kan brukes; forholdet mellom proteiner har imidlertid opprettholdt. Utføre kontrollen negative ved å erstatte p-RSV vektor med en tom vektor. -
Videre til hva, etter hva reagens produsentens protokoll (se tabell for materiale).
- Legge til 250 µL av redusert serum medium blandet vektorer. I en annen tube, fortynne 10 µL av transfection reagensen i 250 µL av redusert serum medium. Forsiktig vortex både rør og vent 5 min. blanding innholdet i begge rør og vente på 20 min ved romtemperatur.
- Skyll BSRT7/5 cellene med 1 mL av redusert serum medium og distribuere 1,5 mL MEM med 10% FCS uten antibiotika per brønn. Eventuelt ruge på 37 ° C og 5% CO2 før den inkubering beskrevet i trinn 2.3.1 er fullført.
- Legg til 500 µL av transfection miksen forberedt i trinn 2.3.1 til et godt når 20 min incubation tiden er over. Plasser cellene i kuvøse på 37 ° C og 5% CO2 i 3 dager. Ikke endre kultur medium cellene under transfection.
- Observere GFP fluorescens (eksitasjon på 488 nm) og utslipp på 515-535 nm under en invertert fluorescens mikroskop på 20 x forstørrelse 1 x per dag til å overvåke hjelpe effektiviteten, bruker GFP filtrere.
- På den andre dagen etter transfection frø celler for første passering av reddet viruser. Forberede en suspensjon av HEp-2 celler på 5 x 105 celler/mL i fullstendig medium. Distribuere 2 mL celle suspensjon per brønn i en 6-vel plate (en vel per virus redning og en negativ kontroll).
- På den tredje dagen av transfection, scratch celler i hver brønn av transfekterte BSRT7/5 6-vel plate, bruker du en annen skraper for hver brønn. Overføre hver godt innhold (celler og nedbryting) inn i et sterilt 2 mL microcentrifuge rør. Vortex hver rør kraftig minst 30 s å løslate det reddet viruset fra cellemembraner.
Merk: Dette tilsvarer 0 (P0) tidens reddet viruset (figur 1). -
Bruke friske viral P0 suspensjon for å utføre første forsterkning av reddet viruser.
- Fjern kultur medium fra HEp-2 6-vel platen seeded dagen før (se trinn 2.5) og raskt legge til 500 µL av P0 suspensjon (fra trinn 2.6) per brønn. Plass platen HEp-2 på 37 ° C på en se-så rocker for myk agitasjon for 2T.
- Fjerne og forkaste de 500 µL av inoculum og Legg 2 mL MEM med 2% FCS. Inkuber platen på 37 ° C og 5% CO2 i 3 dager. Dette vil gi første passering (P1) av reddet virus (figur 1).
- Legge til 1/10 av volumet av 10 x RSV bevaring løsning (0,5 M HEPES og 1 M MgSO4 [pH 7.5]) i gjenværende P0 suspensjon (fra trinn 2.6). Vortex microtubes kraftig for 5 s og aliquot innholdet i Kryogenisk rør merket med alkoholmotstandig koder. Fordype rør minst 1t alkohol forkjøles og lagres ved-80 ° C, og lagre dem på-80 ° C.
- Sjarmere P0 lager (se trinn 2.6) av hver reddet virus (se avsnitt 4 angående mikrokrystallinsk cellulose titrering).
- Observere GFP fluorescens (eksitasjon på 488 nm) og utslipp på 515-535 nm HEp-2 cellene infisert med P0 suspensjon under en invertert fluorescens mikroskop på 20 x forstørrelse 1 x per dag til å overvåke infeksjonen. Observere under brightfield mikroskop utseendet på små syncytia og celle avdeling som gjenspeiler RSV cytopathogenic effekten (CPE) (se figur 2).
- Merk at redning mislyktes hvis fluorescens verken CPE vises etter 2-3 dager.
- Innhente første passering (P1) i dag 3 eller 4 som beskrevet i trinn 2.6. I korthet, skrape cellene, samle celler og nedbryting sammen, vortex dem legge bevaring løsningen som beskrevet i trinn 2.8, aliquot prøven og Frys den.
- Sjarmere (se Seksjon 4 for titrering analysen) og forsterke første passering (se avsnitt 3 for forsterkning).
3. forsterkning av reddet virus
Merk: Følgende protokollen beskriver forsterkningen på reddet virus i en 75 cm2 kolbe. Tilpasse kolbe størrelsen til volumet nødvendig og nødvendige mangfoldet av infeksjon (MOI). Tabell 1 angir volumer for forskjellige flasker. Utføre alle følgende trinn i et sterilt miljø i en klasse II sikkerhet regjering.
- Forberede en suspensjon av HEp-2 celler på 5 x 105 celler/mL i fullstendig medium, dagen før forsterkning. Distribuere 15 mL av cellen suspensjon per 75 cm2 kolbe og ruge flasker på 37 ° C og 5% CO2. Forberede en kolbe per virus å forsterke.
- Dagen etter starten av inkubering, kontroller at cellene er 80%-100% confluent.
- Fortynne viral suspensjon fra trinn 2.12 i MEM uten FCS å få en 3 mL suspensjon på 50.000 PFU/mL (tilsvarende en MOI 0,01 PFU/cellen).
- Fjerne mediet og raskt legge 3 mL viral suspensjon. Plass kolbe på 37 ° C på en se-så rocker for myk agitasjon for 2T.
- Fjerne og forkaste inoculum og Legg 15 mL MEM med 2% FCS. Ruge på 37 ° C og 5% CO2 for 2-4 dager.
- Når de celle morfologi og GFP fluorescens (eksitasjon på 488 nm) og utslipp på 515-535 nm under en invertert fluorescens mikroskop på 20 x forstørrelse for å anslå riktig tidspunkt å høste virus. Merk at dette er vanligvis når 50%-80% av HEp-2 celle laget er koblet fra på grunn av RSV CPE mellom 48 og 72 h postinfection (pi) (se Figur 3).
- Skrape alle celler ved hjelp av en celle skraper. Samle både cellene og nedbryting og overføre dem til en 50 mL sentrifuge rør.
- Legg til 1/10 av volumet av 10 x RSV bevaring løsning (0,5 M HEPES og 1 M MgSO4 [pH 7.5]). Vortex rør godt i 5 s og avklare suspensjon av en 5 min sentrifugering 200 x g.
- Overføre nedbryting til en 50 mL tube. Vortex kort og aliquot merket suspensjon i Kryogenisk rør med alkoholmotstandig koder. Fordype rør i forkjøles-80 ° C alkohol for minst 1 h og lagre dem på-80 ° C.
- Frigi en av dele å sjarmere viral suspensjon (se Seksjon 4).
4. plakk titrering analysen
- Forberede 12-vel plater titrering dagen før titrering analysen utføres (seks brønner vil bli pålagt å sjarmere en tube virus). Frø brønnene med 1 mL av HEp-2 celler på 5 x 105 celler/mL i fullstendig medium.
-
Neste dag, forberede en steril mikrokrystallinsk cellulose suspensjon (2.4% [w/v] i vann) (se tabell for materiale).
- Spre 2.4 g mikrokrystallinsk cellulose pulver i 100 mL destillert vann, med en standard magnetisk rørestang, til komplett oppløsning av pulver (vanligvis 4 12 h). Autoclave suspensjon 121 ° c for 20 min og oppbevare det ved romtemperatur før bruk.
Merk: Under slike forhold er suspensjon stabil for 1 år. - Etter åpning løsningen i et sterilt miljø, lagrer du den på 4 ° C i 6 måneder. Alltid blande suspensjon før bruk (med hånden å risting eller vortexing) at det er homogent.
- Spre 2.4 g mikrokrystallinsk cellulose pulver i 100 mL destillert vann, med en standard magnetisk rørestang, til komplett oppløsning av pulver (vanligvis 4 12 h). Autoclave suspensjon 121 ° c for 20 min og oppbevare det ved romtemperatur før bruk.
- Forberede 2 x MEM i et sterilt miljø. Fortynne kommersielle MEM 10 x med sterilt vann og L-glutamin, 1000 enheter/mL penicillin og 1 mg/mL streptomycin. Rist fortynning kraftig og lagre den på 4 ° C.
Merk: Utfør trinnene 4.4-4.10 i et sterilt miljø med en klasse II sikkerhet regjering. - Forberede seks rør som inneholder 900 µL av MEM uten FCS per virus å være titreres (titrering rør). Tine virus-dele vortex dem kraftig for 5 s og overføre 100 µL til den første titrering rør.
- Utføre en tidoblet fortynning 6 x, som følger. Legg 100 μL virus til 900 μL medium i første røret, sett lokket på røret og blande innholdet av vortexing i noen sekunder. Endre spissen på pipette, legge til 100 µL av første fortynning 900 µL av medium i andre røret, sett lokket på røret og vortex. Gjenta til sjette røret.
Merk: Det er svært viktig å endre spissen for hver fortynning. - Skrive virus navn og brett fortynninger på HEp-2 12-vel platene. Legge til et merke å matche platen og forsiden fordi de kan skilles under fargingen (trinn 4,9). Fjerne mediet fra platene og distribuere 400 µL av en fortynning per brønn. Inkuber platene på 37 ° C 2 h, for virus adsorpsjon.
Merk: Endre pipette spissen mellom hver inoculum eller fortsette fra laveste til høyeste konsentrasjonen med samme spissen. Vaksinere en begrenset serie av plater (1 til 2) samtidig for å unngå cellene tørking. -
Forberede mikrokrystallinsk cellulose overlegg under virus opptak (extemporaneous forberedelse). For å få 100 mL overlegg, bland 10 mL 2.4% mikrokrystallinsk cellulose suspensjon, 10 mL av 2 x MEM, og 80 mL MEM med 2% FCS.
- Justere pH av 2 x MEM til rundt 7.2 med en bakteriefri natriumbikarbonat løsning på 7,5%, etter indikatoren farge. Legg mikrokrystallinsk cellulose suspensjon og MEM og bland kraftig.
- På slutten av den 2t inkubering, tilsett 2 til 3 mL overlegg hver brønn av 12-vel platene uten å fjerne inoculum. Være forsiktig for å unngå forurensning av tilstøtende med høy viral titer inoculums. Inkuber platen på 37 ° C og 5% CO2 for 6 dager. Ikke Flytt platen og ikke flytte inkubator under inkubasjon.
-
Fortsette stain cellene, bruker crystal violet løsning (8% crystal violet [v/v], 2% formaldehyd [v/v] og 20% etanol [v/v] i vann).
- Beskytte arbeidet overflaten for biosikkerhet kabinett med et ark (den crystal violet sterkt farger overflater).
- Forsiktig risting platene å ta av mikrokrystallinsk cellulose overlegget. Fjerne supernatants og vask cellene 2 x 1 x fosfat-bufret saltvann (PBS). Håndtere platene enkeltvis for å unngå cellene tørking. Legg til 1-2 mL av crystal violet løsningen og vente 10-15 min. fjerne løsningen, som kan gjenbrukes for påfølgende plate flekker.
- Fordype platene og lokk i frisk blekemiddel i noen sekunder, og deretter vaske dem grundig med vann fra springen. Merk at platene og dekker er dekontaminert av blekemiddel.
- Sett platene og lokk på papirhåndklær og la dem tørke. Tørr platene på en omgivelsestemperatur etter vann rense og lagre dem ved romtemperatur. For lenge lagring perioder (måneder), holde platene beskyttet mot lyset å beskytte fargen. Merk at hvis cellene mister sin farge, de kan være farget igjen med crystal fiolett.
- Beregne virus titers. Telle plaketter i brønnene av tørr platene, som er synlig for det blotte øye. Kontroller at antall plaketter av ulike fortynninger sammenhengende (faktor 10 mellom hver fortynning). Velg brønnen som plaketter er den enkleste å telle. Vurdere antall plaketter versus inoculum volumet og fortynning.
Merk: I eksemplet i Figur 4telles 21 plaketter på 10-5 fortynning. Dette tilsvarer en titer av
5. Bruk av HRSV-GFP rekombinant Virus å overvåke Viral replikasjon i cellene behandlet med lite forstyrrende RNA eller antivirale
Merk: Utføre alle skritt bortsett fra 5.1 og 5.2.5 i et sterilt miljø med en klasse II sikkerhet regjering.
-
Overvåke effekten av mobilnettet genet silencing på RSV multiplikasjon
Merk: Hva protokollen er avhengig av reagens (se Tabell for materiale).- Forberede 96-brønns plater GFP målingen. To dager før analysen, for gitt lite forstyrrende RNA (siRNA), forberede en løsning av redusert serum mediet som inneholder siRNA i en konsentrasjon av 100 nM og en siRNA transfection reagens utvannet på 1/500. Inkuber løsningen for 30 min ved romtemperatur.
- Legg til 25 µL av løsningen brønnene av platen i 5.1.1 (i tre eksemplarer). Ætt brønner med 75 µL av en suspensjon av A549 celler på 4 x 105 celler/mL i fullstendig medium uten antibiotika for å få en siste celle konsentrasjon av 3 x 105 celler/mL. Inkuber platen i 48 timer på 37 ° C og 5% CO2.
Merk: Siste siRNA konsentrasjonen er 25 nM og endelige transfection reagens volumet er 0,5 µL/godt). - Infisere cellene som følger. Fjerne mediet fra brønnene. Legg 100 µL av RSV-GFP suspensjon på 50.000 PFU/mL og ruge 2 h 37 ° C og 5% CO2. Fjern viral suspensjon og legge 100 µL av DMEM med 2% FCS og uten fenol red. Inkuber platen på 37 ° C og 5% CO2.
- 24 timer og 48 h p.i., måler fluorescensen, bruker en spectrofluorometer satt til eksitasjon og utslipp bølgelengder av 488 og 520 nm, henholdsvis (fluorescens uttrykkes i relativ fluorescens enheter). Bruk noninfected A549 celler som standarder for fluorescens og bakgrunn.
Merk: Cellene må fikses med 4% paraformaldehyde (PFA) før måle dem uten plate dekselet.
-
Vurdering av narkotika hemming bruker RSV-GFP
- Forberede 96-brønns plater GFP målingen. Dagen før analysen, frø brønner med 100 µL av en suspensjon av HEp-2 celler på 5 x 105 celler/mL i fullstendig medium uten fenol red.
- Forberede en seriell fortynning av den testet narkotika (AZ4316 i dette eksemplet) i MEM supplert med 2% FCS og antibiotika (50 µL per brønn). Forberede en viral suspensjon på 10.000 PFU/mL i MEM uten stromal vaskulær faktor (sendinger) og uten fenol rød (50 µL per brønn).
- Fjerne mediet fra 96-brønns HEp-2 plate og legge til 50 µL av narkotika suspensjon og 50 µL av viral suspensjon (i tre eksemplarer). Utføre en uekte infeksjon parallelt som en kontroll.
Merk: Stoffet fortynning og viral suspensjon kan blandes før du legger dem på cellene, eller de kan legges sekvensielt. - Inkuber platen i 48 timer på 37 ° C og 5% CO2.
- Måle fluorescens, bruker en spectrofluorometer som beskrevet i trinn 5.1.4. Bruke uekte-infiserte HEp-2 celler som standarder for fluorescens bakgrunn nivåer.
6. karakterisering av M2-1 lokalisering i Vivo med RSV-M2-1-GFP rekombinant Virus
Merk: Utføre trinn 6.1 og 6.2 i et sterilt miljø, med en klasse II sikkerhet regjering.
- Forberede en suspensjon av HEp-2 celler på 5 x 105 celler/mL i fullstendig medium. Frø 1,5 mL av cellen suspensjon i 35 mm Petriskål permeant CO2 og tilpasset live bildebehandling.
- Utføre infeksjonen dagen etter seeding med RSV-M2-1-GFP virus MOI 1, som beskrevet i trinnene 3.3-3,5 (fjerne mediet, legge til 500 µL 1 mL av inoculum, og ruge prøven på 37 ° C mens forsiktig risting for 2t; fjerne inoculum og legge til 1,5 mL MEM med 2 % FCS). Inkuber cellene på 37 ° C og 5% CO2 for tiden (IBs starter vises fra 10t PI).
- Preheat inkubasjonstiden Mysteriekammeret en invertert mikroskop utstyrt med 40 x 100 x mål på 37 ° C før plassere Petriskål inneholder infiserte celler på scenen. Åpne CO2 tilbudet og vente til fokus stabilisering.
- Utføre tenkelig med GFP-kompatibelt filtre, under en lav eksitasjon intensitet og bilde frekvens (fra 1 til 0,1 bilder per min) for å minimere Phototoksisitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I dette arbeidet beskrev vi en detaljert protokoll for å produsere rekombinant RSV virus uttrykke et fluorescerende protein (figur 2). I pRSV-GFP, ble GFP genet innført mellom P og M genene, som kirsebær genet i tidligere utgitte verk21. I den pRSV-M2-1-GFP, M2 genet ble stående urørt og en ekstra genet koding for M2-1-GFP ble satt inn mellom SH og G gener12. Det første trinnet, tilsvarende til redning av viruset i BSRT7/5 celler, vises i figur 2A. Klaser med grønne fluorescerende celler var synlig 72 h posttransfection i brønner tilsvarer RSV-GFP og RSV-M2-1-GFP redning. Fluorescerende signalet kunne observeres i cytoplasma og kjerner i RSV-GFP-infiserte celler, tilsvarer uttrykket av den gratis GFP. Derimot i RSV-M2-1-GFP redning, kan små fluorescerende cytoplasmatiske prikker observeres, tilsvarer M2-1-GFP opphopning i IBs. Ingen CPE (syncytia, frittliggende celler) er vanligvis observert på dette trinnet. Omvendt, under det andre trinnet, tilsvarer virus forsterkning (første passasje) HEp-2 celler, CPE var synlig i infiserte celler på 72 h PI (figur 2B). Figur 3A B viser sterk CPE av RSV infeksjon, preget av store syncytia, frittstående eller ikke, og mange flytende celler. Både syncytia og cellene utstilt lyse grønne fluorescens. Figur 3A viser utviklingen av cytopathic effekten mellom 24 og 72 h PI i celler som er infisert med viruset RSV-M2-1-GFP. Noen spredte fluorescerende celler var synlig på 24 h p.i. uten en synlig CPE. Små syncytia (klyngen av fluorescerende celler) og noen frittstående celler/syncytia begynte å vises på 48t p.i. store fluorescerende syncytia og flytende celler var synlig på 72 h p.i.
Bilder av plakk titrering analysen og viral titers tilsvarer hele prosessen med RSV produksjon er vist i figur 5. Utføre plakk analysen på negative kontrollen, transfekterte med bare uttrykk plasmider N, P, L og M2-1, viste ingen plakett på laveste fortynning. Titers fra transfekterte cellene var ventet å være over 100 PFU/mL om redning var effektivt, som vist i figur 5. Deretter titers økt passasjer, å nå 106– 107 PFU/mL ved passering 1 eller 2. Merk at viral titers var lignende mellom to rekombinant virus.
Cellene ble transfekterte med siRNA målretting mRNA av en viral protein (N) eller to mobilnettet proteiner (inosine-5'-monofosfat dehydrogenase [IMPDH] og glyceraldehyde 3-fosfat dehydrogenase [GAPDH]). Cellene ble også transfekterte med nontargeting siRNA. Figur 6 viser overvåking av RSV multiplikasjon bruker RSV-GFP virus på siRNA-behandlet celler. Et sterkt signal om GFP ble observert (figur 6A) og målt (figur 6B) på kontroll celler transfekterte med nontargeting siRNA eller transfekterte celler med siRNA mot GAPDH mRNA. Derimot ble GFP uttrykket redusert i infiserte celler uttrykke siRNA målretting N eller IMPDH. Merk at vi bekreftet at GFP fluorescerende signalet i RSV-GFP-infiserte celler på 48t PI var korrelert med viral dosen som tidligere demonstrert for en lignende rekombinant RSV uttrykke Cherry (RSV-kirsebær)21. For å vurdere narkotika effektivitet på RSV multiplikasjon, var HEp-2 celler infisert med RSV-GFP for 48 timer i nærvær av ulike narkotika konsentrasjoner. Observerte vi en sterk nedgang på GFP signalet, som nådde bakgrunnsstøyen (det var et signal observert på infisert celler), i nærvær av en økt narkotika konsentrasjon, som vist i figur 7. De observerte IC50 for AZD4316 var ca 4 nM, lik den publiserte EC50 på ca 2-40-nM mot ulike HRSV stammer23. Analyse av dynamikken i IBs og IBAGs i levende celler, takket være RSV-M2-1-GFP, er vist i Figur 8 og figur 9 (og filmen 1 og Movie 2). IBs vises som mobile sfærisk strukturer kunne sikring, danner en større sfærisk inkludering. IBAGs er svært dynamisk. De gjennomgår kontinuerlig montering-demontering sykluser med dannelse av små IBAGs som vokser, sikring i store IBAGs, og deretter forsvinner.
| Platen eller kolbe | HEp-2 celler å være seeded dagen før | Middels volum (mL) | Virus Inoculum volum (mL) |
| 150 cm2 kolbe | 15 x 106 | 30 | 5 |
| 75 cm2 kolbe | 7.5 x 106 | 15 | 3 |
| 25 cm2 kolbe | 2.5 x 106 | 5 | 1 |
| 6-vel plate | 1 x 106 | 2 | 0,5 |
Tabell 1: Antall celler og inoculum volum til bruk i forskjellige flasker.
Figur 1: skjematisk fremstilling av punktene hjelpe og forsterkning. Hva av uttrykket vektoren av N, P, L, M2-1 og RSV antigenomic i BSRT5/7 celler (Rescue). Uttrykk antigenomic RSV RNA og mRNA N, P, L og M2-1, av T7 RNA polymerase. N, P, L og M2-1 proteiner replikere og transkribere genomisk RNA, starte en viral multiplikasjon syklus. Nye virus partikler produseres og multiplisere, gir opphav til P0. Viruset høstet fra redning (P0) er så forsterkes på HEp-2 celler til å produsere en høyere titer viral suspensjon (P1) (forsterkning). Dette forsterkes deretter for å få viral aksjer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: CPE og mønster av fluorescens observert under redde RSV-GFP og RSV-M2-1-GFP. (A) BSRT5/7 celler ble transfekterte med den omvendte genetikk vektorer som angitt, og fase kontrast og fluorescens bilder ble tatt på 72 h posttransfection. Kontrollen negative (Neg Ctrl) tilsvarer celler transfekterte med uttrykk vektorer av N, P, L og M2-1 uten omvendt genetisk vektoren. (B) HEp-2 celler var infisert med viruset høstet fra transfekterte BSRT5/7 cellene (null passering, 72 h posttransfection) og bilder ble tatt 72 h infisert datamaskinen. Bildene som vises er representativt feltene. Skala bar = 100 µm. Eske området omslutter celler vises i forstørrelse; Skala bar = 20 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: utviklingen av CPE og fluorescensen observert under forsterkning av rekombinant RSV. HEp-2 celler var infisert på en MOI 0,01 PFU/celler 72 h med første passering av (A) RSV-M2-1-GFP eller (B) RSV-GFP. Fase kontrast og fluorescens bilder ble tatt på 24 timer, 48 timer og 72 h infisert datamaskinen. Bildene som vises er et representativt felt; Skala bar = 100 µm. Eske området omslutter celler vises i forstørrelse; Skala bar = 20 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: bestemmelse av RSV titer bruker plakk analysen. (A) resultatene av plakk titrering analysen i en 12-vel plate. Seks brønnene infisert med føljetong fortynninger av en viral lager vises. Fortynninger angis i en logaritmen med grunntall 10. Celler som er infisert med de tre første fortynninger er alle koblet fra. Plakk tallene observert med 10-4, 10-5, og 10-6 fortynninger er konsekvent. (B) illustrasjon av plakk opplistingen (gul tall). Grønne stjernen angir riper på cellen laget. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Serine reddet og forsterket virus. Plakk fenotyper RSV-GFP og RSV-M2-1-GFP på ulike passasjer assayed på HEp-2-celler i en 12-vel plate (bildene viser helheten av brønnene). Titers av de påfølgende avsnittene vises i tabellen. Representant dataene vises. Fortynninger av viral aksjer er angitt i en logaritmen med grunntall 10. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: Hemming av RSV-GFP uttrykket av siRNA målretting RSV N eller IMPDH. A549 celler ble behandlet med kontroll nontargeting siRNA (NT) (lys blå søyle) eller siRNA målretting GAPDH (blå søyle), RSV N (oransje linjen) eller IMPDH2 (grønn linje) for 48 timer og deretter infisert med RSV-GFP på en MOI 0,05 PFU/cellen. Den grønne fluorescensen ble lest på 48 timer postinfection. (A) representant bilder av RSV-GFP-infiserte celler på 48t p.i., behandlet med siRNA sett på bildene. Skala bar = 100 µm. (B) Data er gjennomsnittlig ± SD to uavhengige eksperimenter utført i tre eksemplarer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7: Hemming av RSV-GFP mellom AZD4136 sammensatte. HEp-2 celler i 96-brønnen platene var infisert med RSV-GFP på en MOI 0,05 PFU/cellen i nærvær av føljetong fortynninger av AZD4316 sammensatte eller kontroll DMSO. Den grønne fluorescensen ble lest på 48t PI er gjennomsnittlig ± SD to uavhengige eksperimenter utført i tre eksemplarer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 8: analyse av dynamikken i IBs ved å spore fluorescerende protein M2-1-GFP i HEp-2-infiserte celler av tid forfalle mikroskopi. På 18 h p.i., ble celler fotografert hver 5 min 5 h med en fluorescens mikroskop, i et kammer oppvarmet på 37 ° C. IBs er fluorescerende (grønn) fordi de vert M2-1-GFP, og kjerner er farget med Hoechst (blå). Hvite pilene viser IBs gjennomgår fusion. Skala bar = 10 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 9: analyse av dynamikken i IBAGs i RSV-M2-1-GFP-infiserte celler av tid forfalle mikroskopi. På 18 h p.i., ble celler fotografert med en fluorescens mikroskop, i et kammer oppvarmet på 37 ° C. M2-1-GFP protein var visualisert ved grønne fluorescens. Hvite pilene viser IBs gjennomgår en blanding av IBAGs. Skala bar = 5 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Film 1: In vivo analyse av dynamikken i IBs i RSV-M2-1-GFP i HEp-2-infiserte celler. På 18 h p.i., ble celler fotografert hver 5 min 5 h med fluorescens mikroskop, i et kammer oppvarmet på 37 ° C. Skala bar = 10 µm. Resulterende filmen viser 7 rammer/s (fps). Vennligst klikk her å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)
Movie 2: In vivo analyse av dynamikken i IBAGs i RSV-M2-1-GFP-infiserte celler. På 18 h p.i., ble celler fotografert hver 5 min for 3 h og 40 minutter med fluorescens mikroskop, i et kammer oppvarmet på 37 ° C. Skala bar = 2 µm. Resulterende filmen viser 4 fps. Vennligst klikk her å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her presenterer vi en metode for redning av rekombinant RSVs fra fem plasmider, og deres forsterkning. Muligheten til å manipulere genomet av virus har revolusjonert virologi forskning for å teste mutasjoner og uttrykke en ekstra genet eller et merket viral protein. RSV vi har beskrevet og brukes som et eksempel i denne artikkelen er et virus uttrykke en reporter genet, RSV-GFP (upublisert) og uttrykker en M2-1 protein smeltet sammen til en GFP kode12. RSV redning er utfordrende og krever praksis. Hva effektiviteten er kritisk, avhengig av et klokt valg av hva reagensen og en tidligere optimalisering av transfection protokollen. Bruk av celler som uttrykker den bacteriophage T7 pol er obligatorisk fordi den viral cDNA plasseres nedstrøms T7 pol arrangøren i de fleste omvendt genetisk vektoren. Et alternativ er å uttrykke den T7 pol fra vaccinia hjelper virus. Men bruk av celler som uttrykker stabilt T7 pol unngår nødvendigheten av å skille de to virusene og forhindrer mulig forstyrrelser av vaccinia med redning. Det er viktig å utføre første passering av den omvendte genetisk (P0 til P1) uten å fryse inoculum for å sikre maksimal redning effektivitet. Dette innebærer at MOI ikke kontrolleres. På dette trinnet beholdes imidlertid titers svært lav, noe som resulterer i en lav MOI for første passering. For å få RSV aksjer med høy smittsomme titers (106– 107 PFU/mL), er det viktig å vente på en sterk CPE og skrape cellene for å samle de virus partiklene knyttet til cellene. I denne studien økte titers ikke etter 96 h p.i. Rask kjøling av viral suspensjon er viktig å opprettholde høy titers. I stedet kan for ved en nedsenkning i alkohol forkjøles og lagres ved-80 ° C, dette også oppnås ved nedsenkning i en tørris/etanol blanding eller i flytende nitrogen. Tillegg av bevaring løsningen vil sikre en lengere stabilitet av virus suspensjon på-80 ° C. Lagring-80 ° c er avgjørende siden viruset vil raskt tapet sitt infectivity lagret på 20 ° C eller i flytende nitrogen. Vi beskrev RSV forsterkning på HEp-2 celler, som er mest populære cellen linje å vokse RSV, men det er også i stand til å vokse effektivt på flere andre linjer i vitro. Vær oppmerksom på at veksten på Vero celler kan resultere i endring i G uttrykk24.
Vi beskrev en veldig enkel protokoll av plakk Serine RSV bruker en mikrokrystallinsk cellulose overlegg. Som for alle titrering analyser er det følsom for forurensning med høy titer suspensjoner, krever forsiktig manipulasjon. Konvensjonelle RSV titrering analyser bruker agarose eller carboxymethyl cellulose (CMC) overlegg og krever immunostai- og mikroskopiske observasjoner for titer vilje. En protokoll som immunodiffusion klasse agarose har blitt beskrevet muliggjør direkte visualisering av plaketter uten immunostai-25. Imidlertid HEp-2 celler er svært følsomme for en oppvarmet agar overlegg, som gjør denne protokollen vanskelig å bruke for flere virus titrations (f.eks en også het overlegg ødelegger celle laget); derimot, når det er ikke varmt nok, stivner det etter første plate fordelingen. Bruk av mikrokrystallinsk cellulose for en plakett analysen har blitt først beskrevet av Matrosovich et al. for en influensa A virus titrering analysen26. Takket være dens lav viskositet er mikrokrystallinsk cellulose overlegg lett å dispensere og fjerne fra platen brønner, som gjør den kompatibel med 96-brønns plater. Det er derfor spesielt tilpasses serologisk studier og narkotika følsomhetsanalyser. Merk at siden mikrokrystallinsk cellulose ikke trenger å være oppvarmet, narkotika kan enkelt innarbeides i overlegg. Det er imidlertid viktig at platene forbli perfekt fortsatt under incubation; ellers vil store kometen-formet foci danne i stedet for runde plaketter. Plakk åpenbaring bruker crystal violet er billig og enkel, men denne løsningen er giftig og har å bli avhendet. Resirkulering av løsningen begrenser avfallsproduksjon. Dessuten, denne metoden er følsom for celle monolayer skade som skulle vises som falske hvite flekker som ikke er viral plaketter. Ett eksempel er vist i Figur 4 (grønn stjerne). For å forhindre denne skjevhet, 1) celler må håndteres med forsiktighet for å unngå riper eller rødme celle monolayer, 2) aspirasjon dispensing alltid har gjort på samme sted til circumscribe skaden til et kjent område og 3) falske hvite flekker kan identifiseres Takk til deres form (ikke sfærisk), deres skarpe kanter og sin posisjon. Vi først brukt Avicel RC 581, som tidligere utgitt21,26. Imidlertid RC 581 er ikke lenger tilgjengelig, og vi erstattet det av RC 591. For å tilpasse denne analysen til andre cellen/virus par, har konsentrasjonen av mikrokrystallinsk cellulose bestemmes avhengig av viruset og cellene. For mye mikrokrystallinsk cellulose kan være giftig for celler og fører til små plaketter, for lite vil føre til spredningen av viruset i mediet.
Vi beskrev to eksempler på bruk av RSV-GFP virus å overvåke RSV multiplikasjon: i nærvær av en antiviral stoffet eller stanse en mobilnettet protein. Vi har vist at GFP signalet er korrelert med viral multiplikasjon. Metoden som presenteres her gir uanstrengt evalueringen av viral multiplikasjon i sanntid. Det gjør at forskerne å enkelt finne IC50 av en antiviral stoffet, som vist i figur 7. Dette målet er viktigere, kan tilpasses for bruk i middels eller bredbånd, spesielt for screening av kjemiske biblioteker. Dette reporter-uttrykke viruset kan også være nyttig å vurdere effekten på virus multiplikasjon av en modulering av mobilnettet protein uttrykk. RNA-interferens er en biologisk prosess der en bestemt mRNA er degradert etter sin innpassing av siRNA, dermed redusere, eller ideelt sett avskaffe uttrykk for de tilsvarende protein27. I eksempelet her ved å overvåke GFP signal intensiteten i RSV-GFP-infiserte celler, vurdert vi effekten av silencing av viral nucleocapsid (N) mRNA eller verten IMPDH mRNA på RSV multiplikasjon. IMPDH2 er et purine biosyntetiske enzym som gir et hastighetsbegrensning skritt mot de novo biosyntesen av guanine nukleotider fra IMP28. Det er derfor en regulator intracellulær guanine nukleotid bassenget. IMPDH hemmere, som ribavirin, utøve hemmende effekt på RNA-virus, inkludert RSV infeksjon29,30,31. Som vist i figur 6, svekker hemming av IMPDH uttrykk viral multiplikasjon som indikert av reduksjon av GFP signalet, etterligne effekten av ribavirin på RSV vekst. Likeledes, viral multiplikasjon er nesten avskaffet i nærvær av siRNA målretting viral N protein. Dette resultatet var ventet siden siRNA målretting N protein var forventet å hindre viral nucleocapsid forsamling og har vist å sterkt svekke viral replikasjon32. Av disse siRNA av tåke hemmet påfølgende infeksjon RSV friske voksne33. Effekten av N eller IMPDH siRNA er spesifikk siden hemming av GAPDH uttrykket, valgt som en kontroll genet, svekke ikke viral multiplikasjon sammenlignet med det nontargeting siRNA. Merk at ingen celle toksisitet ble oppdaget omstendigheter. Til sammen validere disse resultatene strategien presenteres her, som kan bli opp skalert til høy gjennomstrømming screening siRNA biblioteker eller andre knockout metoder, som CRISPR-Cas9 teknologi34.
Rekombinant virus uttrykke en fusion fluorescerende protein representerer kraftige verktøy for å studere virale proteiner og viral strukturer dynamikk. RSV uttrykke et fluorescerende M2-1 protein kan observasjon av dynamikken av IBs og IBAGs. IBs, som kan anses som RSV viral fabrikker, vises som sfærisk dynamiske strukturer. De er kjøpedyktig smelter sammen til skjemaet større sfærisk strukturer (Figur 8 og film 1). Disse data tyder på at RSV IBs er flytende organelles, ligner det som har blitt beskrevet for rabiat virus35. IBAGs representerer en subcompartment innenfor IBs, viral mRNA og M2-1 proteinkonsentrat, som den genomisk RNA og nucleocapsid utvalg, finnes bare i resten av IBs12. Video mikroskopi eksperimenter viser at IBAGs er svært dynamisk strukturer viser flytende egenskaper (figur 9 og Movie 2). De kan betraktes som flytende avdelinger skyldes væske-flytende fase overgang.
Muligheten for genetisk manipulering virus forblir et redskap for valget å studere både mekanismer for deres multiplikasjon og deres følsomhet for narkotika. Omvendt genetikk kan anses nå som en del av den "klassiske" teknikker for virologi. Det er imidlertid krevende for noen virus, som RSV. Det er derfor denne protokollen beskriver i detalj hvordan å redde og forsterke rekombinant RSVs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takker Dr. Qin Yu fra AstraZeneca R & D Boston, MA, USA, for å gi AZD4316 stoffet. Forfatterne er takknemlig til Cymages plattform for tilgang til ScanR Olympus mikroskopet, som ble støttet av tilskudd fra regionen Ile-de-France (svak en helse). Forfatterne bekrefter støtte fra INSERM og Versailles Saint-Quentin universitetet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm µ dish for live cell imaging | Ibidi | 81156 | |
| A549 | ATCC | ATCC CCL-185 | |
| Avicel RC-591 | FMC BioPolymer | Avicel RC-591 | Technical and other information on Avicels is available at http://www.fmcbiopolymer.com. Store at room temperature. Protocol in step 4 is optimized for this reagent. |
| BSRT7/5 | not commercially available | See reference 22. Buchholz et al. 1999 | |
| Crystal violet solution | Sigma | HT90132 | |
| Fluorescence microscope for observations | Olympus | IX73 Olympus microscope | |
| Fluorescence microscope for videomicroscopy | Olympus | ScanR Olympus microscope | |
| HEp-2 | ATCC | ATCC CCL-23 | |
| HEPES ≥99.5% | Sigma | H3375 | |
| L-Glutamine (200 mM) | ThermoFisher Scientific | 25030024 | |
| LIPOFECTAMINE 2000 REAGENT | ThermoFisher Scientific | 11668019 | Protocol in step 2.3. is optimized for this reagent. |
| MEM (10x), no glutamine | ThermoFisher Scientific | 11430030 | |
| MEM, GlutaMAX Supplement | ThermoFisher Scientific | 41090-028 | |
| MgSO4 ReagentPlus, ≥99.5% | Sigma | M7506 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | ThermoFisher Scientific | 51985-026 | |
| Paraformaldehyde Aqueous Solution, 32%, EM Grade | Electron Microscopy Sciences | 15714 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| Plasmids | not commercially available | See reference 21. Rameix-Welti et al. 2014 | |
| See Saw Rocker | VWR | 444-0341 | |
| Si RNA GAPDH | Dharmacon | ON-TARGETplus siRNA D-001810-10-05 |
SMARTpool and 3 of 4 individual siRNAs designed by Dharmacon. |
| Si RNA IMPDH2 | Dharmacon | ON-TARGETplus siRNA IMPDH2 Pool- Human L-004330-00-0005 |
SMARTpool of 4 individual siRNAs designed by Dharmacon. Individual references and sequences J-004330-06: GGAAAGUUGCCCAUUGUAA; J-004330-07: GCACGGCGCUUUGGUGUUC; J-004330-08: AAGGGUCAAUCCACAAAUU; J-004330-09: GGUAUGGGUUCUCUCGAUG; |
| Si RNA RSV N | Dharmacon | ON-TARGETplus custom siRNA | UUCAGAAGAACUAGAGGCUAU and UUUCAUAAAUUCACUGGGUUA |
| SiRNA NT | Dharmacon | ON-TARGETplus Non-targeting Pool | |
| SiRNA transfection reagent | Dharmacon | DharmaFECT 1 Ref: T-2001-03 | Protocol in steps 5.1.and 5.1.2 are optimized for this reagent. |
| Sodium Bicarbonate 7.5% solution | ThermoFisher Scientific | 25080094 | |
| Spectrofluorometer | Tecan | Tecan infinite M200PRO |
References
- Shi, T., et al. Global, regional, and national disease burden estimates of acute lower respiratory infections due to respiratory syncytial virus in young children in 2015: a systematic review and modelling study. The Lancet. 390 (10098), 946-958 (2017).
- Falsey, A. R., Hennessey, P. A., Formica, M. A., Cox, C., Walsh, E. E. Respiratory Syncytial Virus Infection in Elderly and High-Risk Adults. The New England Journal of Medicine. 352 (17), 1749-1759 (2005).
- DeVincenzo, J. P., et al. Activity of Oral ALS-008176 in a Respiratory Syncytial Virus Challenge Study. The New England Journal of Medicine. 373 (21), 2048-2058 (2015).
- DeVincenzo, J. P., et al. Oral GS-5806 Activity in a Respiratory Syncytial Virus Challenge Study. The New England Journal of Medicine. 371 (8), 711-722 (2014).
- Afonso, C. L., et al. Taxonomy of the order Mononegavirales: update 2016. Archives of Virology. 161 (8), 2351-2360 (2016).
- Collins, P. L., Hill, M. G., Cristina, J., Grosfeld, H. Transcription elongation factor of respiratory syncytial virus, a nonsegmented negative-strand RNA virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (1), 81-85 (1996).
- Hoenen, T., et al. Inclusion bodies are a site of ebolavirus replication. Journal of Virology. 86 (21), 11779-11788 (2012).
- Heinrich, B. S., Cureton, D. K., Rahmeh, A. A., Whelan, S. P. Protein expression redirects vesicular stomatitis virus RNA synthesis to cytoplasmic inclusions. PLoS Pathogens. 6 (6), e1000958 (2010).
- Lahaye, X., et al. Functional Characterization of Negri Bodies (NBs) in Rabies Virus-Infected Cells: Evidence that NBs Are Sites of Viral Transcription and Replication. Journal of Virology. 83 (16), 7948-7958 (2009).
- Kolesnikova, L., Mühlberger, E., Ryabchikova, E., Becker, S. Ultrastructural organization of recombinant Marburg virus nucleoprotein: comparison with Marburg virus inclusions. Journal of Virology. 74 (8), 3899-3904 (2000).
- Dolnik, O., Stevermann, L., Kolesnikova, L., Becker, S. Marburg virus inclusions: A virus-induced microcompartment and interface to multivesicular bodies and the late endosomal compartment. European Journal of Cell Biology. 94 (7-9), 323-331 (2015).
- Rincheval, V., et al. Functional organization of cytoplasmic inclusion bodies in cells infected by respiratory syncytial virus. Nature Communications. 8 (1), 563 (2017).
- Santangelo, P. J., Bao, G. Dynamics of filamentous viral RNPs prior to egress. Nucleic Acids Research. 35 (11), 3602-3611 (2007).
- Lifland, A. W., et al. Human Respiratory Syncytial Virus Nucleoprotein and Inclusion Bodies Antagonize the Innate Immune Response Mediated by MDA5 and MAVS. Journal of Virology. 86 (15), 8245-8258 (2012).
- Garcia, J., Garcia-Barreno, B., Vivo, A., Melero, J. A. Cytoplasmic inclusions of respiratory syncytial virus-infected cells: formation of inclusion bodies in transfected cells that coexpress the nucleoprotein, the phosphoprotein, and the 22K protein. Virology. 195 (1), 243-247 (1993).
- Brown, G., et al. Evidence for an association between heat shock protein 70 and the respiratory syncytial virus polymerase complex within lipid-raft membranes during virus infection. Virology. 338 (1), 69-80 (2005).
- Radhakrishnan, A., et al. Protein analysis of purified respiratory syncytial virus particles reveals an important role for heat shock protein 90 in virus particle assembly. Molecular & Cellular Proteomics. 9 (9), 1829-1848 (2010).
- Racaniello, V. R., Baltimore, D. Cloned poliovirus complementary DNA is infectious in mammalian cells. Science. 214 (4523), 916-919 (1981).
- Schnell, M. J., Mebatsion, T., Conzelmann, K. K. Infectious rabies viruses from cloned cDNA. The EMBO Journal. 13 (18), 4195-4203 (1994).
- Collins, P. L., et al. Production of infectious human respiratory syncytial virus from cloned cDNA confirms an essential role for the transcription elongation factor from the 5' proximal open reading frame of the M2 mRNA in gene expression and provides a capability for vaccine. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (25), 11563-11567 (1995).
- Rameix-Welti, M. -A., et al. Visualizing the replication of respiratory syncytial virus in cells and in living mice. Nature Communications. 5, 5104 (2014).
- Buchholz, U. J., Finke, S., Conzelmann, K. K. Generation of bovine respiratory syncytial virus (BRSV) from cDNA: BRSV NS2 is not essential for virus replication in tissue culture, and the human RSV leader region acts as a functional BRSV genome promoter. Journal of Virology. 73 (1), 251-259 (1999).
- Cianci, C., Meanwell, N., Krystal, M. Antiviral activity and molecular mechanism of an orally active respiratory syncytial virus fusion inhibitor. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 55 (3), 289-292 (2005).
- Derscheid, R. J., et al. Human respiratory syncytial virus memphis 37 grown in HEp-2 cells causes more severe disease in lambs than virus grown in vero cells. Viruses. 5 (11), 2881-2897 (2013).
- McKimm-Breschkin, J. L. A simplified plaque assay for respiratory syncytial virus - direct visualization of plaques without immunostaining. Journal of Virological Methods. 120, 113-117 (2004).
- Matrosovich, M., Matrosovich, T., Garten, W., Klenk, D. New low-viscosity overlay medium for viral plaque assays. Virology Journal. 7, 1-7 (2006).
- Novina, C. D., Sharp, P. A.
- Sintchak, M. D., Nimmesgern, E. The structure of inosine 5'-monophosphate dehydrogenase and the design of novel inhibitors. Immunopharmacology. 47 (2-3), 163-184 (2000).
- Beaucourt, S., Vignuzzi, M. Ribavirin: A drug active against many viruses with multiple effects on virus replication and propagation. Molecular basis of ribavirin resistance. Current Opinion in Virology. 8, 10-15 (2014).
- Hruska, J. F., Bernstein, J. M., Douglas, R. G., Hall, C. B. Effects of Ribavirin on Respiratory Syncytial Virus in vitro. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 17 (5), 770-775 (1980).
- Simões, E. A. F., et al. Past, Present and Future Approaches to the Prevention and Treatment of Respiratory Syncytial Virus Infection in Children. Infectious Diseases and Therapy. 7 (1), 87-120 (2018).
- Alvarez, R., et al. RNA interference-mediated silencing of the respiratory syncytial virus nucleocapsid defines a potent antiviral strategy. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (9), 3952-3962 (2009).
- DeVincenzo, J., et al. A randomized, double-blind, placebo-comtrolled study of an RNAi-based therapy directed against respiratory syncytial virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (19), 8800-8805 (2010).
- Zhou, Y., et al. High-throughput screening of a CRISPR/Cas9 library for functional genomics in human cells. Nature. 509 (7501), 487-491 (2014).
- Nikolic, J., et al. Negri bodies are viral factories with properties of liquid organelles. Nature Communications. 8 (1), 58 (2017).
