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Immunology and Infection

पीढ़ी, प्रवर्धन, और पुनः संयोजक श्वसन Syncytial वायरस के टाइट्रेट

Published: April 4, 2019 doi: 10.3791/59218
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 2, 1,3, 1,3
1UMR 1173 Institut national de la santé et de la recherche médicale (INSERM), Université de Versailles St. Quentin, 2UR892 Institut national de la recherche agronomique (INRA), Unité de virologie et immunologie moléculaires, 3Assistance Publique–Hôpitaux de Paris (AP-HP), Hôpital Ambroise Paré, Laboratoire de Microbiologie

Summary

हम पैदा करने और आनुवंशिक रूप से संशोधित श्वसन बहुकेंद्रकी वायरस (rsvs) और rsvs के लिए एक अनुकूलित पट्टिका परख प्रवर्धित करने के लिए एक विधि का वर्णन । हम दो पुनः संयोजक वायरस है कि क्रमशः RSV प्रतिकृति और RSV समावेशन निकायों और शामिल निकायों के लाइव विश्लेषण की मात्रा का परिमाण की अनुमति बनाने के द्वारा इस प्रोटोकॉल वर्णन-जुड़े granules गतिशीलता ।

Abstract

पुनः संयोजक वायरस का उपयोग बुनियादी या लागू विषाणु विज्ञान में महत्वपूर्ण हो गया है । रिवर्स आनुवंशिकी एक अत्यंत शक्तिशाली प्रौद्योगिकी साबित हो गया है, दोनों को वायरल प्रतिकृति तंत्र को समझने के लिए और एंटीवायरल अध्ययन या टीके के लिए विकास मंच प्रदान करते हैं । एक नकारात्मक-किनारा आरएनए वायरस जैसे एक श्वसन बहुकेंद्रकी वायरस (rna) के लिए एक रिवर्स आनुवंशिक प्रणाली के निर्माण और हेरफेर, तथापि, नाजुक बनी हुई है और विशेष जानकारी की आवश्यकता है । RSV जीनोम एक एकल-किनारा, नकारात्मक के बारे में 15 केबी कि दोनों वायरल आरएनए प्रतिकृति और transcription के लिए एक टेंपलेट के रूप में कार्य करता है की भावना RSV है । हमारे रिवर्स आनुवंशिकी प्रणाली मानव RSV लंबे तनाव जीनोम (HRSV) की एक cDNA प्रतिलिपि का उपयोग करता है । इस cdna, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से cdnas एंकोडिंग पोलीमरेज़ परिसर के वायरल प्रोटीन (एल, पी, एन, और M2-1), T7 पोलीमरेज़ नियंत्रण दृश्यों के तहत व्यक्तिगत अभिव्यक्ति वैक्टर में रखा जाता है । इन तत्वों के अभिकर्मक बीएसआर में-T7/5 कोशिकाओं, जो stably polymerase T7 व्यक्त करते हैं, कोशिकाद्रव्यी प्रतिकृति और रीकॉम्बियंट rsv के प्रतिलेखन की अनुमति देता है, आनुवंशिक रूप से संशोधित virions को जंम दे रही है । एक नया RSV, जो सेल की सतह पर मौजूद है और BSRT7/5 के कल्चरल सुपरनैंट में वायरल प्रवर्धन के लिए ह्यूमन HEp-2 कोशिकाओं को संक्रमित करने के लिए इकट्ठा होता है । प्रवर्धन के दो या तीन राउंड वायरल स्टॉक प्राप्त करने के लिए आवश्यक हैं जिनमें 1 x 106 से 1 x 107 पट्टिका बनाने वाली इकाइयां (pfu)/ml. इष्टतम कटाई, ठंड, और वायरल स्टॉक के टाइट्रेट के लिए तरीके यहां विस्तार से वर्णित हैं । हम यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल दो पुनः संयोजक वायरस क्रमशः मुक्त ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (gfp) (rsv-gfp) या वायरल m2-1 को gfp (rsv-m2-1-gfp) के लिए संगलित व्यक्त बनाकर पेश किया । Rsv प्रतिकृति और rsv-M2-1-GFP वायरल संरचनाओं की कल्पना करने के लिए rsv-GFP का उपयोग करने के लिए कैसे दिखाएँ, साथ ही लाइव कोशिकाओं में वायरल प्रोटीन गतिशीलता, वीडियो माइक्रोस्कोपी तकनीकों का उपयोग करके.

Introduction

मानव RSV दुनिया भर में शिशुओं में तीव्र श्वसन तंत्र के संक्रमण के लिए अस्पताल में भर्ती का प्रमुख कारण है1। इसके अलावा, RSV इंफ्लूएंजा के लिए तुलनीय वयस्कों में एक पर्याप्त रोग बोझ के साथ जुड़ा हुआ है, अस्पताल में भर्ती और बुजुर्ग2में मृत्यु के बोझ के अधिकांश के साथ । कोई टीके या विशिष्ट rsv के खिलाफ अभी तक उपलब्ध एंटीवायरल कर रहे हैं, लेकिन नई दवाओं का वादा3,4विकास में हैं । जटिलता और rsv गुणा के परिमाणन की तकनीकों का भारीपन एंटीवायरल या टीके के लिए खोज में बाधा वर्तमान काफी प्रयासों के बावजूद । इन विट्रो में RSV गुणा का परिमाणन आम तौर पर श्रमसाध्य, समय लेने वाले, और महंगी विधियों पर आधारित होता है, जो माइक्रोस्कोपी द्वारा साइटोआथिक प्रभाव के विश्लेषण में अधिकांशतः मिलकर बनता है, immunostaining, पट्टिका कमी assays, मात्रात्मक रिवर्स transcriptase (qRT)-polymerase श्रृंखला प्रतिक्रिया (पीसीआर), और एंजाइम से जुड़े immunosorbent परख परीक्षण । संशोधित जीनोम के साथ वायरस और इस तरह के GFP के लिए उन कोडिंग के रूप में रिपोर्टर जीन, व्यक्त, इस तरह की स्क्रीनिंग के लिए और अधिक उपयुक्त हैं । स्वचालित प्लेट पाठकों के उपयोग के लिए युग्मित, रिपोर्टर जीन-पुनः संयोजक वायरस ले जाने के मानकीकरण और उच्च थ्र्पुट प्रयोजनों के लिए इन assays और अधिक उपयुक्त बना सकते हैं ।

आरएसवी एक ढंक हुआ, nonsegmented नकारात्मक-भावना आरएनए वायरस है कि न्यूमोविरिडी परिवार के Orthopneumovirus वंश के अंतर्गत आता है, आदेश mononegavirales5। Rsv जीनोम एक एकल-भूग्रस्त, नकारात्मक के बारे में 15 केबी, जो 3 ' और 5 ' हाथ पैरों पर एक noncoding क्षेत्र में शामिल है की भावना rsv है नेता और ट्रेलर और 10 transअपंग इकाइयों 11 प्रोटीन एंकोडिंग । जीन का आदेश निम्नानुसार है: 3 '-NS1, NS2, N, P, M, SH, G, F, M2 (M2-1 और M2-2 प्रोटीन के लिए एंकोडिंग) और L-5 '. जीनोमिक आरएनए को न्यूनाभिकोप्रोटीन एन द्वारा पैक किया जाता है । एक टेम्पलेट के रूप में encapsidated जीनोमिक आरएनए का उपयोग करते हुए, वायरल आरएनए-निर्भर आरएनए पॉलीमरेज़ (Rna) प्रतिलेखन और वायरल आरएनए की प्रतिकृति सुनिश्चित करेगा । वायरल rdrp बड़े प्रोटीन एल जो न्यूक्लिओटाइड पोलीमरेज़ गतिविधि प्रति से किया जाता है से बना है, इसके अनिवार्य cofactor फॉस्फोप्रोटीन पी और M2-1 प्रोटीन जो एक वायरल ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर के रूप में कार्य करता है6. संक्रमित कोशिकाओं में, आरएसवी समावेशन निकायों (आईबीएस) नामक साइटोप्लास्मिक समावेशन के गठन को प्रेरित करता है । Morphologically समान कोशिकाद्रव्यी समावेशन कई मोनोनेगाविरेलीज7,8,9,10के लिए मनाया गया है । रेबीज वायरस पर हाल ही में किए गए अध्ययन, vesicular stomatitis वायरस (vsv), इबोला वायरस, और rsv ने दिखाया कि वायरल आरएनए संश्लेषण ibs में होता है, जो इस प्रकार वायरल कारखानों के रूप में माना जा सकता8,9,11, 12. वायरस कारखानों rna और वायरल वायरल आरएनए संश्लेषण के लिए आवश्यक प्रोटीन ध्यान केंद्रित करने और भी सेलुलर प्रोटीन होते हैं13,14,15,16, 17. आईबीएस आइबी-एसोसिएटेड ग्रैनुल्स (ibs) नामक एक कार्यात्मक उपडिब्बे का प्रदर्शन करते हैं, जो M2-1 प्रोटीन के साथ नए संश्लेशित नवजात वायरल एमआरएनए पर ध्यान देते हैं । IBAGs में जीनोमिक आरएनए और एल, पी, और एन का पता नहीं चला है । Ibags के अंदर छोटे गतिशील गोलाकार संरचनाएं है जो तरल organelles12के गुण दर्शाते हैं । वायरल गुणा में आईबीएल की केंद्रीय भूमिका के बावजूद, बहुत कम प्रकृति, आंतरिक संरचना, गठन, और इन वायरल कारखानों के संचालन के बारे में जाना जाता है ।

एक cDNA से एक पोलियोवायरस के जीनोम की अभिव्यक्ति १९८१18में पहली संक्रामक वायरल क्लोन के उत्पादन में सक्षम है । एकल फंसे नकारात्मक आरएनए वायरस के लिए, यह १९९४ तक नहीं था कि एक पहली रेबीज वायरस के उत्पादन में plasmids के अभिकर्मक के बाद19 कोशिकाओं में जगह ले ली. आरएसवी के लिए पहला प्लाज्मिड आधारित रिवर्स जेनेटिक सिस्टम १९९५20में प्रकाशित किया गया था । रिवर्स आनुवंशिकी विषाणु विज्ञान के क्षेत्र में प्रमुख अग्रिमों के लिए नेतृत्व किया है । वायरल जीनोम में विशिष्ट संशोधनों को शुरू करने की संभावना प्रतिकृति और आरएनए वायरस के रोगजनन में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान की गई है । इस प्रौद्योगिकी ने भी संशोधनों की लक्षित श्रृंखला के माध्यम से विशिष्ट क्षीणन की अनुमति देकर टीकों के विकास में काफी मदद की है । जीनोम वायरल गुणा की एक तेजी से परिमाणन की अनुमति बहुत एंटीवायरल स्क्रीनिंग और कार्रवाई के अपने मोड के अध्ययन में सुधार संशोधन ।

हालांकि पहले से वर्णित है, प्राप्त आनुवंशिक रूप से संशोधित RSVs नाजुक बनी हुई है । यहां, हम विवरण एक प्रोटोकॉल पुनः संयोजक HRSV के दो प्रकार बनाने के लिए, क्रमशः RSV-GFP या RSV-M2-1-GFP व्यक्त । इस प्रोटोकॉल में, हम अभिकर्मक नए पुनः संयोजक वायरस बचाव की जरूरत की स्थिति का वर्णन है, साथ ही उनके प्रवर्धन उच्च titer के साथ वायरल स्टॉक प्राप्त करने के लिए, reproducible प्रयोग के लिए उपयुक्त । रिवर्स जेनेटिक्स ' वैक्टर प्रति ' का निर्माण यहां नहीं बताया गया है । हम इष्टतम कटाई और वायरल स्टॉक की ठंड के लिए तरीकों का वर्णन करते हैं । सबसे सही तरीका वायरल संक्रामक कणों यों तो करने के लिए पट्टिका परख रहता है । कोशिकाओं का विश्लेषण निलंबन के धारावाहिक dilutions से संक्रमित है और एक उपरिशायी है कि supernatant में मुक्त वायरल कणों के प्रसार को प्रतिबंधित के साथ इंसेबटेड हैं । ऐसी स्थितियों में, वायरस केवल समीपस् थ कोशिकाओं को संक्रमित करेगा जो प्रत् येक आरंभिक संक्रामक कण के लिए एक "पट्टिका" बनाते हैं । पारंपरिक rsv अनुमापन में परख, पट्टिकाएं immunostaining और सूक्ष्म अवलोकन के तहत गिना द्वारा पता चला रहे हैं । यह विधि महंगी और समय लेने वाली है । यहां हम एक RSV पट्टिका परख के लिए एक बहुत ही सरल प्रोटोकॉल का उपयोग microक्रिस्टलीय सेलुलोस ओवरले है कि नग्न आंखों को दिखाई पट्टिकाओं के गठन के लिए सक्षम बनाता है वर्णित है । हम बताएंगे कि कैसे RSV-GFP RSV प्रतिकृति को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और, इस प्रकार, एंटीवाइरल्स के प्रभाव को मात्रा । रिवर्स आनुवंशिकी और लाइव इमेजिंग प्रौद्योगिकी के संयोजन, हम कैसे RSV-M2-1-GFP वैज्ञानिकों लाइव कोशिकाओं में M2-1 की कल्पना करने के लिए और आईबीएल के रूप में intracellular वायरल संरचनाओं, की गतिशीलता का पालन करने की अनुमति देता है प्रदर्शन ।

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Protocol

1. सामग्री की तैयारी

  1. खरीद सेल मीडिया (कम सीरम मीडिया, ंयूनतम आवश्यक मीडिया [मेम], 10x मेम, और Dulbecco के संशोधित ईगल के माध्यम [DMEM]), ट्रांसफेक्शन अभिकर्मक, और माइक्रोक्रिस्टलीय सेलुलोस ( सामग्री की मेजदेखें) ।
  2. रिवर्स आनुवंशिकी के लिए निम्नलिखित वैक्टर प्राप्त करें: जीनोमिक सदिश (ओं) और अभिव्यक्ति वैक्टर एन प्रोटीन और पोलीमरेज़ जटिल प्रोटीन एंकोडिंग । जीनोमिक वैक्टर में rsv-gfp (p-rsv-gfp) और rsv-m2-1gfp (p-rsv-m2-1gfp) का पूर्ण cdna जीनोम शामिल है, जो जीवाणु T7 rsv पोलीमरेज़ (T7 pol) प्रमोटर से डाउनस्ट्रीम है । अभिव्यक्ति वैक्टर (p-N, p-P, p-L, और p-M2-1) के रूप में नामित N, P, L, या M2-1 डाउनस्ट्रीम T7 pol के कोडिंग अनुक्रम होते हैं (देखने के लिए प्लाज्मिड constructs के बारे में विवरण के लिए रिनचेवल एट अल.12 और Rameix-वेल्टी एट अल.21
  3. एक वातावरण में और अभिकर्मक और संक्रमण के लिए एक सेल संस्कृति के लिए मीडिया तैयार करते हैं । 10% भ्रूण बछड़ा सीरम (FCS) के साथ 2 मिमी L-glutamine पूरक के साथ DMEM का प्रयोग करें, १,००० इकाइयों/एमएल पेनिसिलिन, और 1 मिलीग्राम/मिलीलीटर स्ट्रेप्टोमाइसिन (या एंटीबायोटिक दवाओं के बिना) और 2 मिमी L-glutamine के साथ मेम 0%, 2%, या 10% FCS, १,००० इकाइयों/एमएल पेनिसिलिन, और 1 मिलीग्राम/ स्ट्रेप्टोमाइसिन, निम्नलिखित प्रोटोकॉल में "पूर्ण माध्यम" के रूप में नामित.
  4. BSRT7/522 सेल प्राप्त करें और 1 से 2 x 106 कक्षों/एमएल में 10% डाइमेथिल सल्फोक्साइड (डीएमसो) के साथ पूर्ण माध्यम में स्टाक करें । तरल नाइट्रोजन में सेल स्टॉक का संरक्षण । एेसी-2 कोशिकाएं प्राप्त करें । Culture BSRT7/5 कोशिकाओं में पूरा DMEM और एेसी-2 कोशिकाओं में पूर्ण मेम में ३७ डिग्री सेल्सियस और 5% सह2 एक वातावरण में ।
  5. एक बाँझ वातावरण में एक 10x RSV संरक्षण समाधान (०.५ मीटर HEPES और 1 एम MgSO4 [पीएच ७.५] पानी में) तैयार करते हैं ।
  6. एक उल्टे प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप प्राप्त GFP प्रतिदीप्ति माप के साथ संगत और लाइव इमेजिंग के साथ संगत अगर यह एक संक्रमण की निगरानी के लिए आवश्यक है । RSV-GFP प्रतिकृति के quantitation के लिए GFP प्रतिदीप्ति माप के साथ संगत एक microplate रीडर प्राप्त करें ।

2. बचाव और पुनः संयोजक वायरस के पहले पारित

नोट: एक वातावरण में सभी निंन चरणों का पालन, एक वर्ग द्वितीय सुरक्षा कैबिनेट का उपयोग कर ।

  1. Transfection से पहले के दिन, 5 x 105 कोशिकाओं/एमएल में पूर्ण माध्यम में BSRT7/5 सेल लाइन का निलंबन कर । एक 6 खैर थाली में अच्छी तरह से प्रति सेल निलंबन के 2 मिलीलीटर वितरित करें । एक अच्छी तरह से प्रति वायरस है कि बचाया जा रहा है और नकारात्मक नियंत्रण के लिए एक अतिरिक्त अच्छी तरह से तैयार । प्लेट को ३७ डिग्री सेल्सियस और 5% सह2पर सेते हैं । जांच करें कि कोशिकाओं को एक 80%-90% संगम पर अगले दिन कर रहे हैं ।
  2. रिवर्स जेनेटिक्स वैक्टर को अनफ़्रीज़ करें (चरण १.२ से) p-RSV-GFP और p-RSV-M2-1-GFP, साथ ही p-N, p-P, p-L, and p-M2-1. एक ट्यूब में प्रत्येक वायरस से बचाव के लिए, पी-एन और पी-पी का 1 μg, पी-एल के ०.५ μg, पी-M2-1 के ०.२५ μg और पी-आरएसवी (जीएफपी या M2-1 जीएफपी) के १.२५ μg के लिए मिक्स करें ।
    नोट: N, P, L, और M2-1 के लिए भिन्न व्यंजक वैक्टर का उपयोग किया जा सकता है; तथापि, प्रोटीन के बीच अनुपात को बनाए रखना होगा । P-RSV वेक्टर एक रिक्त वेक्टर के साथ प्रतिस्थापित करके नकारात्मक नियंत्रण निष्पादित करें ।
  3. ट्रांसफेक्शन के लिए आगे बढ़ें, ट्रांसफेक्शन अभिकर्मक निर्माता के प्रोटोकॉल के बाद (सामग्री की तालिका देखें) ।
    1. मिश्रित वैक्टर के लिए कम सीरम मध्यम के २५० μL जोड़ें । एक और ट्यूब में, कम सीरम माध्यम के २५० μL में ट्रांफेक्शन अभिकर्मक के 10 μL पतला । धीरे दोनों ट्यूबों भंवर और 5 मिनट के लिए प्रतीक्षा करें । दोनों ट्यूबों की सामग्री मिश्रण और कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए प्रतीक्षा करें ।
    2. कम सीरम मध्यम के 1 मिलीलीटर के साथ BSRT7/5 कोशिकाओं कुल्ला और प्रति अच्छी तरह से एंटीबायोटिक दवाओं के बिना 10% FCS के साथ १.५ मिलीलीटर मेम वितरित । यदि आवश्यक हो, ३७ ° c पर सेते और 5% CO2 जब तक उष्मायन चरण 2.3.1 में वर्णित पूरा हो गया है ।
    3. एक अच्छी तरह से जब 20 मिनट ऊष्मायन समय खत्म हो गया है के लिए 2.3.1 कदम में तैयार अभिकर्मक मिश्रण के ५०० μl जोड़ें । इंयूबेटर में कोशिकाओं को ३७ डिग्री सेल्सियस पर रखें और 5% सह2 3 दिनों के लिए । ट्रांसफेक्शन के दौरान कोशिकाओं के कल्चर मीडियम को न बदलें ।
  4. जीएफपी फिल्टर का उपयोग करते हुए बचाव दक्षता की निगरानी करने के लिए 20x आवर्धन 1x प्रति दिन पर एक औंधा प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के तहत GFP प्रतिदीप्ति (४८८ एनएम पर उत्तेजन और 515-535 एनएम पर उत्सर्जन) का निरीक्षण करें ।
  5. दूसरे दिन के बाद transfection, बचाया वायरस के पहले पारित होने के लिए कोशिकाओं को बीज. पूर्ण माध्यम में 5 x 105 कोशिकाओं/एमएल में एेसी-2 कोशिकाओं का निलंबन तैयार करें । एक 6 अच्छी तरह से थाली (एक अच्छी तरह से बचाव और एक नकारात्मक नियंत्रण के लिए वायरस के अनुसार) में अच्छी तरह से प्रति सेल निलंबन के 2 मिलीलीटर वितरित करें ।
  6. Transfection के तीसरे दिन, एक अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए एक अलग खुरचना का उपयोग कर, transfection BSRT7/5 6-अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक कूप में खरोंच कोशिकाओं । एक बाँझ 2 मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में प्रत्येक अच्छी तरह से सामग्री (कोशिकाओं और supernatant) स्थानांतरण. भंवर प्रत्येक ट्यूब सख्ती से कम से 30 एस के लिए सेल झिल्ली से बचाया वायरस जारी करने के लिए ।
    नोट: यह (चित्र 1) बचाया वायरस के बीतने 0 (P0) के अनुरूप है ।
  7. बचाया वायरस का पहला प्रवर्धन करने के लिए ताजा वायरल P0 निलंबन का प्रयोग करें ।
    1. से संस्कृति मध्यम निकालें HEp-२ ६-अच्छी तरह से थाली से पहले दिन वरीयता प्राप्त (कदम २.५ देखें) और जल्दी से P0 निलंबन के ५०० μL (चरण २.६ से) प्रति अच्छी तरह से जोड़ें । 2 एच के लिए नरम आंदोलन के लिए एक देख-देखा घुमाव पर ३७ डिग्री सेल्सियस पर एेसी-2 थाली प्लेस ।
    2. निकालें और संरोप के ५०० μl त्यागें और 2% FCS के साथ मेम के 2 मिलीलीटर जोड़ें । प्लेट को ३७ डिग्री सेल्सियस पर सेते और 5% सह2 3 दिनों के लिए । यह बचाया वायरस के पहले मार्ग (P1) का उत्पादन होगा (चित्रा 1).
  8. 10x RSV संरक्षण समाधान (०.५ मीटर HEPES और 1 एम MgSO4 [पीएच ७.५]) शेष P0 निलंबन (चरण २.६ से) में की मात्रा का 1/10 जोड़ें । भंवर 5 एस के लिए तेजी से microtubes और शराब प्रतिरोधी टैग के साथ लेबल क्रायोजेनिक ट्यूबों में सामग्री aliquot । -८० डिग्री सेल्सियस पर शराब precooled में कम से कम 1 एच के लिए ट्यूबों विसर्जित, और उन्हें-८० डिग्री सेल्सियस पर स्टोर.
  9. P0 स्टॉक (देखें कदम २.६) प्रत्येक बचाया वायरस (माइक्रोक्रिस्टलीय सेलुलोस अनुमापन के लिए अनुभाग 4 देखें) ।
  10. संक्रमण की निगरानी करने के लिए 20x आवर्धन 1x प्रति दिन पर एक उल्टे प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के अंतर्गत एच0-2 कोशिकाओं के जीएफपी प्रतिदीप्ति (४८८ एनएम पर उत्तेजन और 515-535 एनएम पर उत्सर्जन) का निरीक्षण करें । एक brightfield माइक्रोस्कोप के तहत निरीक्षण छोटे syncytia और कोशिका टुकड़ी जो RSV साइटोथाजेनिक प्रभाव (सीपीई) को दर्शाता है की उपस्थिति ( चित्र 2देखें) ।
  11. ध्यान दें कि बचाव विफल हो गया है अगर न तो प्रतिदीप्ति और न ही सीपीई 2-3 दिनों के बाद दिखाई देता है ।
  12. चरण २.६ में वर्णित के रूप में 3 या 4 दिन में पहली यात्रा (P1) लीजिए । संक्षेप में, कोशिकाओं परिमार्जन, कोशिकाओं और supernatant एक साथ इकट्ठा, उंहें भंवर, चरण २.८ में वर्णित के रूप में संरक्षण समाधान जोड़ने के लिए, नमूना aliquot, और इसे फ्रीज ।
  13. Titrate (अनुमापन परख के लिए अनुभाग 4 देखें) और पहली यात्रा बढ़ाना (प्रवर्धन के लिए अनुभाग 3 देखें) ।

3. बचाया वायरस के प्रवर्धन

नोट: निम्नलिखित प्रोटोकॉल एक ७५ सेमी2 फ्लास्क में बचाए गए वायरस के प्रवर्धन का वर्णन करता है । आवश्यक मात्रा और संक्रमण की आवश्यकता बहुलता (MOI) के लिए कुप्पी आकार अनुकूलन । तालिका 1 विभिंन flasks के लिए खंड इंगित करता है । एक वातावरण में एक वर्ग द्वितीय सुरक्षा कैबिनेट में निंन चरणों का पालन करें ।

  1. 5 x 105 कोशिकाओं/एमएल में पूर्ण मध्यम, प्रवर्धन से पहले दिन में एक एेसी-2 कोशिकाओं का निलंबन तैयार करें । वितरित 15 मिलीलीटर सेल निलंबन प्रति ७५ सेमी2 कुप्पी और ३७ डिग्री सेल्सियस और 5% सह2पर कुप्पी सेते । एक कुप्पी प्रति वायरस को बढ़ाना करने के लिए तैयार ।
  2. दिन ऊष्मायन की शुरुआत के बाद, जांच करें कि कोशिकाओं 80%-100% संगामी हैं ।
  3. २.१२ के बिना मेम में कदम से वायरल निलंबन पतला ५०,००० PFU/mL पर 3 मिलीलीटर निलंबन प्राप्त करने के लिए (०.०१ PFU/सेल की एक MOI के अनुरूप) ।
  4. मध्यम निकालें और जल्दी से 3 एमएल वायरल जोड़ने के निलंबन । 2 ज के लिए नरम आंदोलन के लिए एक देख-देखा घुमाव पर ३७ डिग्री सेल्सियस पर फ्लास्क रखें ।
  5. निकालें और संरोप छोड़ दो और 2% FCS के साथ मेम के 15 मिलीलीटर जोड़ें । 2-4 दिनों के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस और 5% सह2 पर सेते ।
  6. सेल आकारिकी और gfp प्रतिदीप्ति की जाँच करें (उत्तेजना पर ४८८ एनएम और उत्सर्जन पर 515 – 535 एनएम) एक औंधा प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के तहत 20x आवर्धन क्रम में करने के लिए सही समय का अनुमान करने के लिए वायरस फसल. ध्यान दें कि यह आमतौर पर जब 50%-HEp-2 सेल परत के 80% RSV सीपीई कि ४८ और ७२ एच postinfection (पीएआर) के बीच होता है के कारण अलग है ( चित्रा 3देखें) ।
  7. सेल स्क्रैपर का उपयोग कर सभी कोशिकाओं को कुरेदना । दोनों कोशिकाओं और supernatant एक साथ ले लीजिए और उंहें एक ५० मिलीलीटर सेंट्रीफ्यूज ट्यूब के लिए स्थानांतरण ।
  8. 10x RSV संरक्षण समाधान की मात्रा का 1/10 जोड़ें (०.५ M HEPES और 1 M MgSO4 [pH ७.५]) । भंवर 5 एस के लिए तेजी से ट्यूबों और २०० एक्स जीपर एक 5 मिनट केंद्रापसारक द्वारा निलंबन स्पष्ट
  9. सुपरनैंट को ५० मिलीलीटर ट्यूब पर ट्रांसफर करें । भंवर संक्षेप में और शराब प्रतिरोधी टैग के साथ लेबल क्रायोजेनिक ट्यूबों में निलंबन aliquot । Precooled में ट्यूबों विसर्जित-८० ° c शराब के लिए कम से 1 एच और उंहें-८० डिग्री सेल्सियस पर दुकान ।
  10. वायरल निलंबन titrate करने के लिए एक aliquots के Unफ़्रीज़ (धारा 4 देखें) ।

4. पट्टिका टाइट्रेट करने की परख

  1. टाइट्रेट करने से पहले दिन टाइट्रेट करने के लिए 12-well प्लेट्स तैयार (छह कुओं वायरस के एक ट्यूब titrate करने के लिए आवश्यक हो जाएगा) किया जाता है । 5 x 105 कोशिकाओं/एमएल में पूर्ण माध्यम में 1 मिलीलीटर एेसी-2 कोशिकाओं के साथ कुओं को बीज/
  2. अगले दिन, एक बाँझ माइक्रोक्रिस्टलीय सेलुलोस सस्पेंशन (२.४% [w/v] पानी में) तैयार (सामग्री की तालिका देखें) ।
    1. आसुत जल की १०० मिलीलीटर में माइक्रोक्रिस्टलीय सेलुलोस पाउडर के २.४ ग्राम को फैलाने के लिए, एक मानक चुंबकीय विलोडक का उपयोग करते हुए, पाउडर का पूर्ण विघटन होने तक (सामान्यतः 4 – 12 ज) । ऑटोक्लेव 20 मिनट के लिए १२१ डिग्री सेल्सियस पर निलंबन और उपयोग करने से पहले कमरे के तापमान पर यह दुकान ।
      नोट: ऐसी शर्तों के तहत निलंबन 1 साल के लिए स्थिर है ।
    2. एक वातावरण में समाधान खोलने के बाद, इसे 6 महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर । हमेशा उपयोग करने से पहले निलंबन मिश्रण (हाथ मिलाते या vortexing द्वारा) सुनिश्चित करें कि यह सजातीय है ।
  3. एक बाँझ वातावरण में 2x मेम तैयार. पानी के साथ वाणिज्यिक मेम 10x पतला और एल-ग्लूटामाइन, १,००० इकाइयों/एमएल पेनिसिलिन, और 1 मिलीग्राम/एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन जोड़ें । कमजोर पड़ने तेजी से हिला और 4 डिग्री सेल्सियस पर यह दुकान ।
    नोट: चरण 4.4-4.10 एक वातावरण में एक वर्ग द्वितीय सुरक्षा कैबिनेट का उपयोग कर प्रदर्शन करते हैं ।
  4. छह ट्यूबों से युक्त मेम के ९०० μL तैयार करने के लिए प्रति वायरस FCS (टाइट्रेट करना ट्यूब) । गल वायरस aliquots, उंहें तेजी से 5 एस के लिए भंवर, और पहले टाइट्रेट ट्यूब के लिए १०० μL हस्तांतरण ।
  5. इस प्रकार के रूप में एक दस गुना कमजोर पड़ने 6x प्रदर्शन । पहले ट्यूब में मध्यम से ९०० μL के लिए वायरस के १०० μL जोड़ें, ट्यूब पर टोपी डाल दिया, और कुछ सेकंड के लिए vortexing द्वारा अपनी सामग्री मिश्रण । पिपेट पर टिप बदलें, दूसरी ट्यूब में मध्यम से ९०० μL के लिए पहली कमजोर पड़ने के १०० μL जोड़ें, ट्यूब पर टोपी डाल दिया, और भंवर । छठी ट्यूब तक प्रक्रिया को दोहराएं ।
    नोट: यह एक कमजोर पड़ने के लिए टिप बदलने के लिए बहुत महत्वपूर्ण है ।
  6. एेसी-२ १२-वेल प्लेट्स पर वायरस का नाम और फ़ोल्ड डिलिटियों को लिखें । थाली और उसके आवरण मैच के लिए एक निशान जोड़ें क्योंकि वे धुंधला (चरण ४.९) के दौरान अलग किया जा सकता है । प्लेट से मध्यम निकालें और अच्छी तरह से प्रति एक कमजोर पड़ने के ४०० μL वितरित । वायरस अधिशोषण के लिए 2 ज के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर प्लेटों को इनसेबेट करें ।
    नोट: प्रत्येक संरोप के बीच पिपेट टिप बदलने के लिए या एक ही टिप के साथ सबसे कम से अधिक एकाग्रता के लिए आगे बढ़ना । कोशिकाओं को सुखाने से बचने के लिए एक साथ (1 से 2) प्लेटों की एक सीमित श्रृंखला Inoculate ।
  7. वायरस अधिशोषण (अचिंतित तैयारी) के दौरान माइक्रोक्रिस्टलीय सेलुलोस ओवरले तैयार करें । ओवरले की १०० मिलीलीटर प्राप्त करने के लिए, 10 मिलीलीटर की २.४% माइक्रोक्रिस्टलीय सेलुलोस सस्पेंशन, 2x मेम की 10 मिलीलीटर, और 2% FCS के साथ ८० mL मेम का मिश्रण ।
    1. ७.५% पर एक बाँझ सोडियम बाइअरबोनेट समाधान के साथ लगभग ७.२ के लिए 2x मेम के पीएच समायोजित करें, रंग संकेतक के बाद. माइक्रोक्रिस्टलाइन सेलुलोस सस्पेंशन और मेम को जोड़ें और जोरदार मिलाएं ।
  8. 2 एच ऊष्मायन के अंत में, inoculum को हटाने के बिना 12-well प्लेटों के प्रत्येक अच्छी तरह से ओवरले के 2 से 3 मिलीलीटर जोड़ें । उच्च वायरल अनुमापांक inoculums के साथ आसन्न कुओं के संदूषण से बचने के लिए सावधान रहें । प्लेट को ३७ डिग्री सेल्सियस पर और 5% सह2 को 6 दिनों के लिए सेते हैं । उष्मायन के दौरान प्लेट को न ले जाएं और इनक्यूबेटर को न हिले ।
  9. क्रिस्टल वायलेट सॉल्यूशन (8% क्रिस्टल वायलेट [v/v], 2% फॉर्मलडिहाइड [v/v], और 20% एथेनॉल [v/v] पानी में) का उपयोग करते हुए, कोशिकाओं को दाग कर आगे बढ़ें ।
    1. एक चादर के साथ जैव सुरक्षा कैबिनेट के काम की सतह की रक्षा (क्रिस्टल बैंगनी दृढ़ता से रंग सतहों) ।
    2. धीरे से माइक्रोक्रिस्टलीय सेलुलोस ओवरले लेने के लिए प्लेटें हिला । Supernatants निकालें और 1x फॉस्फेट-buffered खारा (PBS) के साथ कोशिकाओं 2x धोने । एक के बाद एक प्लेट सुखाने कोशिकाओं से बचने के लिए संभाल । क्रिस्टल बैंगनी समाधान के 1-2 मिलीलीटर जोड़ें और 10-15 मिनट रुको. समाधान है, जो बाद थाली धुंधला के लिए पुन: उपयोग किया जा सकता है निकालें ।
    3. प्लेटों और lids ताजा ब्लीच में कुछ सेकंड के लिए विसर्जित कर दिया और फिर, नल का पानी के साथ उन्हें अच्छी तरह से धोने. ध्यान दें कि प्लेटें और कवर ब्लीच द्वारा दूषित हैं ।
    4. प्लेट और lids कागज तौलिए पर रखो और उंहें सूखी । पानी के बाद एक परिवेश के तापमान पर प्लेटें सूखी और उंहें कमरे के तापमान पर स्टोर । लंबे समय तक भंडारण अवधि (महीने) के लिए, रंग की रक्षा के लिए प्रकाश से संरक्षित प्लेटें रखें । ध्यान दें कि अगर कोशिकाओं को उनके रंगाई खो, वे फिर से दाग क्रिस्टल बैंगनी के साथ किया जा सकता है ।
  10. वायरस titers की गणना । सूखी प्लेटों के कुओं में पट्टिक की गिनती करें, जो नग्न नेत्रों से दिखाई दे रहे हों. जांच करें कि विभिंन dilutions के पट्टिक की संख्या सुसंगत है (कारक 10 प्रत्येक कमजोर पड़ने के बीच) । अच्छी तरह से जिस पर सजीले टुकड़े गिनती करने के लिए आसान कर रहे हैं चुनें । संरोप मात्रा और कमजोर पड़ने बनाम पट्टिक की संख्या का आकलन करें ।
    नोट: चित्रा 4में प्रदान की उदाहरण पर, 21 पट्टिक 10-5 कमजोर पड़ने पर गिना जाता है । ये एक टीट्यूड के अनुरूप
    Equation
    Equation

5. HRSV-GFP पुनः संयोजक वायरस का उपयोग कोशिकाओं में वायरल प्रतिकृति की निगरानी के लिए छोटे दखल RNA या एंटीवाइरल के साथ इलाज किया

नोट: ५.१ और 5.2.5 के अलावा सभी चरणों का पालन एक वातावरण में एक वर्ग द्वितीय सुरक्षा कैबिनेट का उपयोग कर ।

  1. RSV गुणा पर सेलुलर जीन साइलेंसिंग के प्रभाव की निगरानी
    नोट: अभिकर्मक प्रोटोकॉल अभिकर्मक पर निर्भर करता है ( सामग्री की तालिकादेखें).
    1. GFP माप के लिए ९६-well प्लेट्स तैयार करें । परख के दो दिन पहले, छोटे दखल आरएनए (sirna) के लिए, कम सीरम मीडिया का एक समाधान तैयार १०० एनएम की एकाग्रता और एक सिरना अभिकर्मक अभिकर्मक पर 1/500 में पतला सिरना युक्त । कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए समाधान सेते ।
    2. 5.1.1 में तैयार प्लेट के कुओं में घोल के 25 μL जोड़ें (triplicate में). 3 x 105 कोशिकाओं/एमएल के अंतिम सेल एकाग्रता प्राप्त करने के लिए एंटीबायोटिक दवाओं के बिना पूर्ण माध्यम में 4 x 105 कोशिकाओं/एमएल में A549 कोशिकाओं के निलंबन के ७५ μl के साथ कुओं बीज । ३७ डिग्री सेल्सियस और 5% सह2पर ४८ एच के लिए थाली सेते ।
      नोट: अंतिम सिरना एकाग्रता 25 एनएम है और अंतिम ट्रांसफेक्शन अभिकर्मक मात्रा ०.५ μL/
    3. कोशिकाओं को इस प्रकार संक्रमित करता है । कुएं से मीडियम हटा दें । ५०,००० PFU/mL और 2 ज के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस और 5% सह2में १०० ΜL RSV-gfp निलंबन के जोड़ें । वायरल निलंबन निकालें और 2% FCS के साथ और phenol लाल के बिना DMEM के १०० μL जोड़ें । प्लेट को ३७ डिग्री सेल्सियस और 5% सह2पर सेते हैं ।
    4. पर 24 एच और ४८ एच पी, प्रतिदीप्ति उपाय, एक स्पेक्ट्रोफ्लोमीटर की उत्तेजना और उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य के लिए सेट का उपयोग ४८८ और ५२० एनएम, क्रमशः (प्रतिदीप्ति सापेक्ष प्रतिदीप्ति इकाइयों में व्यक्त किया जाता है) । प्रतिदीप्ति और पृष्ठभूमि स्तर के लिए मानकों के रूप में noninfected A549 कोशिकाओं का प्रयोग करें ।
      नोट: प्लेट कवर के बिना उन्हें मापने से पहले कोशिकाओं को 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) के साथ निर्धारित करने की आवश्यकता है ।
  2. RSV-GFP का उपयोग कर दवा निषेध का मूल्यांकन
    1. GFP माप के लिए ९६-well प्लेट्स तैयार करें । परख से पहले दिन, १०० के साथ कुओं बीज-5 x 105 कोशिकाओं में एक निलंबन की HEp-2 कोशिकाओं/फीनॉल लाल बिना पूर्ण माध्यम में एमएल ।
    2. 2% FCS और एंटीबायोटिक दवाओं (अच्छी तरह से प्रति ५० μL) के साथ पूरित मेम में परीक्षण दवाओं (AZ4316 इस उदाहरण में) के एक धारावाहिक कमजोर पड़ने की तैयारी । एक वायरल निलंबन तैयार १०,००० PFU/एमएल में मेम में बिना stromal नाड़ी कारक (SVF) और बिना phenol लाल (अच्छी तरह से प्रति ५० μL).
    3. ९६-well एेसी-2 थाली से मध्यम निकालें और नशीली दवाओं के निलंबन के ५० μL और वायरल निलंबन के ५० μL (triplicate में) जोड़ें । एक नियंत्रण के रूप में समानांतर में एक नकली संक्रमण प्रदर्शन ।
      नोट: दवा कमजोर पड़ने और वायरल निलंबन उंहें कोशिकाओं पर जोड़ने से पहले मिलाया जा सकता है, या वे sequentially जोड़ा जा सकता है ।
    4. ३७ डिग्री सेल्सियस और 5% सह2पर ४८ एच के लिए थाली सेते ।
    5. कदम 5.1.4 में वर्णित के रूप में एक स्पेक्ट्रोफ्लोरोमीटर का उपयोग कर, प्रतिदीप्ति उपाय. प्रतिदीप्ति पृष्ठभूमि स्तर के लिए मानकों के रूप में मॉक-संक्रमित एेसी-2 कोशिकाओं का प्रयोग करें ।

6. RSV-M2-1-GFP पुनः संयोजक वायरस के साथ Vivo में M2-1 स्थानीयकरण के लक्षण वर्णन

नोट: चरण ६.१ और ६.२ एक वातावरण में, एक वर्ग द्वितीय सुरक्षा कैबिनेट का उपयोग कर निष्पादित करें ।

  1. पूर्ण माध्यम में 5 x 105 कोशिकाओं/एमएल में एेसी-2 कोशिकाओं का निलंबन तैयार करें । बीज १.५ मिलीलीटर सेल निलंबन के एक ३५ मिमी पेट्री डिश में2 सह करने के लिए permeant और लाइव इमेजिंग के लिए अनुकूलित ।
  2. संक्रमण के दिन rsv-M2-1-gfp वायरस के साथ MOI 1, के रूप में चरण 3.3 – 3.5 (मध्यम निकालें, में वर्णित के साथ बोने के बाद प्रदर्शन ५०० μl 1 मिलीलीटर संरोप के लिए, और जब धीरे 2 ज के लिए मिलाते हुए ३७ डिग्री सेल्सियस पर नमूना सेते; संरोप को हटाने और 2 % FCS) । कोशिकाओं को ३७ डिग्री सेल्सियस पर और 5% CO2 वांछित समय के लिए (आईबीएस 10 एच पीआई से प्रदर्शित करने के लिए शुरू कर देंगे) ।
  3. Preheat एक उल्टे ३७ डिग्री सेल्सियस पर 100x उद्देश्यों के लिए 40x से सुसज्जित माइक्रोस्कोप के ऊष्मायन चैंबर, पेट्री मंच पर संक्रमित कोशिकाओं युक्त पकवान रखने से पहले । सीओ2 की आपूर्ति खोलें और फोकस स्थिरीकरण के लिए प्रतीक्षा करें ।
  4. Phototoxicity को कम करने के लिए एक कम उत्तेजन तीव्रता और छवि आवृत्ति (1 से ०.१ छवि प्रति मिनट) के तहत, GFP-संगत फिल्टर के साथ इमेजिंग प्रदर्शन ।

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Representative Results

इस काम में, हम एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन (चित्रा 2) को व्यक्त करने के लिए पुनः संयोजक rsv वायरस का उत्पादन करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन किया । PRSV-GFP में, GFP जीन पी और एम जीन के बीच शुरू किया गया था, के रूप में चेरी जीन के लिए पहले प्रकाशित काम21में वर्णित है । पीएसवी-एम2-1-जीएफपी में एम2 जीन अछूता रह गया था और एम2-1-जीएफपी के लिए एसएच और जी जीन12के बीच एक अतिरिक्त जीन कोडिंग डाली गई थी । पहला कदम, BSRT7/5 कोशिकाओं में वायरस के बचाव के लिए इसी, चित्रा 2Aमें दिखाया गया है । RSV-GFP और RSV-M2-1-GFP बचाव के लिए इसी कुओं में हरी फ्लोरोसेंट कोशिकाओं के छोटे समूहों दिखाई ७२ एच posttransfection थे । फ्लोरोसेंट संकेत RSV में कोशिका द्रव्य और नाभिक दोनों में देखा जा सकता है-GFP-संक्रमित कोशिकाओं, मुक्त GFP की अभिव्यक्ति के लिए इसी. इसके विपरीत, आरएसवी-M2-1-जीएफपी बचाव में, छोटे फ्लोरोसेंट साइटोप्लास्मिक डॉट्स, आईबीएल में M2-1-जीएफपी संचय के अनुरूप मनाया जा सकता है । आमतौर पर कोई सीपीई (syncytia, अलग कोशिकाओं) इस कदम पर मनाया जाता है । इसके विपरीत, दूसरे चरण के दौरान, एचईपी-2 कोशिकाओं पर वायरस प्रवर्धन (प्रथम मार्ग) के अनुरूप, सीपीई ७२ एच पीआई (चित्रा 2B) पर संक्रमित कोशिकाओं में दिखाई दे रहा था । चित्रा 3A , बी rsv संक्रमण के मजबूत सीपीई से पता चलता है, बड़े syncytia द्वारा विशेषता, अलग या नहीं, और कई अस्थाई कोशिकाओं । Syncytia और कोशिकाओं दोनों उज्ज्वल हरी प्रतिदीप्ति का प्रदर्शन किया । चित्र 3A Rsv-M2-1-gfp वायरस से संक्रमित कोशिकाओं में 24 और ७२ एच पीआई के बीच साइटोआथिक प्रभाव के विकास को दर्शाता है । कुछ बिखरे फ्लोरोसेंट कोशिकाओं को एक detectable सीपीई बिना 24 एच पीआई में दिखाई दे रहे थे । छोटे syncytia (फ्लोरोसेंट कोशिकाओं के समूह) और कुछ अलग कोशिकाओं/syncytia ४८ एच पीआई बड़े फ्लोरोसेंट syncytia और फ़्लोटिंग कोशिकाओं पर प्रदर्शित करने के लिए शुरू में स्पष्ट रूप से दिख रहे थे ७२ एच पीआई

पट्टिका अनुमापन परख और वायरल rsv उत्पादन की पूरी प्रक्रिया को इसी अनुमापन के चित्र चित्र 5में दिखाए जाते हैं । नकारात्मक नियंत्रण पर पट्टिका परख प्रदर्शन, N, पी, एल, और M2-1 के केवल अभिव्यक्ति plasmids के साथ transfected, सबसे कम कमजोर पड़ने पर कोई पट्टिका से पता चला । ट्रांसफेक्टेड कोशिकाओं से प्राप्त टीटर्स को १०० PFU/mL से ऊपर होने की आशा थी, यदि बचाव कुशल था, जैसा कि चित्रा 5में दिखाया गया है । फिर, titers मार्ग पर वृद्धि हुई, तक पहुंचने के लिए 106-107 pfu/ ध्यान रखें कि वायरल टाइटर्स दो रिकम्वर्जेंट वायरसों के बीच समान थे ।

कोशिकाओं को एक वायरल प्रोटीन (एन) या दो सेलुलर प्रोटीन (inosine-5'-monopफॉस्फेट डिहाइड्रोजनेज [impdh] और ग्लिसरल्डिहाइड 3 '-फॉस्फेट डिहाइड्रोजनेज [gapdh]) की एमआरएनए लक्ष्यीकरण के साथ transfected थे । कोशिकाओं को भी गैर लक्ष्यीकरण siRNA के साथ transfected थे । चित्र 6 , सिरना-उपचारित कोशिकाओं पर RSV-gfp वायरस का उपयोग करके rsv गुणन की निगरानी दिखाता है । एक मजबूत जीएफपी सिगनल (चित्र 6A) देखा गया था और नियंत्रण कक्षों पर मापा गया (चित्र 6a) जिसे गैर-लक्ष्यीकरण सिरना या कोशिकाओं ने गप्ध मृणा के विरुद्ध सिरना के साथ transfected किया था । इसके विपरीत, जीएफपी एक्सप्रेशन को सिरना लक्ष्यीकरण N या IMPDH व्यक्त करते हुए संक्रमित कोशिकाओं में कम किया गया था । ध्यान दें कि हम सत्यापित है कि GFP RSV में फ्लोरोसेंट संकेत-GFP-48h पीआई में संक्रमित कोशिकाओं वायरल खुराक के साथ सहसंबद्ध किया गया था के रूप में पहले एक समान पुनः संयोजक RSV (RSV-चेरी)21को व्यक्त करने के लिए प्रदर्शन । RSV गुणन पर दवा दक्षता का आकलन करने के लिए, एेसी-2 कोशिकाएँ विभिन्न औषध सांद्रता की उपस्थिति में ४८ h के लिए RSV-GFP से संक्रमित थीं । हम GFP संकेत है, जो पृष्ठभूमि शोर तक पहुंच की एक मजबूत कमी मनाया (वहां एक संकेत था असंक्रमित कोशिकाओं पर देखा), एक वृद्धि हुई दवा एकाग्रता की उपस्थिति में, के रूप में चित्र 7में दिखाया गया है । AZD4316 के लिए मनाया IC50 के बारे में 4 एनएम, अलग HRSV उपभेदों23के खिलाफ के बारे में 2-40 एनएम के प्रकाशित EC50 के समान था । जीवित कोशिकाओं में आईबीएस और Ibs की गतिशीलता का विश्लेषण, RSV-M2-1-GFP के लिए धन्यवाद, चित्रा 8 और चित्रा 9 में दिखाया गया है (और फिल्म 1 और फिल्म 2). IBs एक बड़ा गोलाकार समावेशन बनाने, फ्यूज करने में सक्षम मोबाइल गोलाकार संरचनाओं के रूप में दिखाई देते हैं । IBAGs बहुत गतिशील हैं । वे छोटे IBAGs है कि बढ़ती है, बड़े IBAGs में फ्यूज के गठन के साथ लगातार विधानसभा disassembly चक्र से गुजरना, और फिर गायब हो जाते हैं ।

प्लेट या फ्लास्क एेसी-2 कोशिकाएं पहले दिन बोये जाने के लिए मध्यम मात्रा (एमएल) वायरस Inoculum मात्रा (एमएल)
१५० सेमी2 फ्लास्क 15 x 106 30 5
७५ सेमी2 फ्लास्क ७.५ x 106 15 3
25 सेमी2 फ्लास्क २.५ x 106 5 1
6-कूप प्लेट 1 x 106 2 ०.५

तालिका 1: विभिंन flasks में उपयोग करने के लिए कक्षों और संरोप वॉल्यूम की संख्या ।

Figure 1
चित्रा 1: बचाव और प्रवर्धन चरणों का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व । N, P, L, M2-1, और RSV एंटीजीनोमिक RSV BSRT5/7 कोशिकाओं (बचाव) में अभिव्यक्ति सदिश का Transfection । T7 RSV polymerase द्वारा एन, पी, एल और एम2-1 की एमआरएनए के एंटीजीनोमिक RSV आरएनए की अभिव्यक्ति । एन, पी, एल, और M2-1 प्रोटीन की नकल और जीनोमिक आरएनए टाइप, एक वायरल गुणा चक्र की शुरुआत । नए वायरल कणों का उत्पादन और गुणा कर रहे हैं, P0 को जंम दे रही है । बचाव (P0) से काटा गया वायरस तो एेसी-2 कोशिकाओं पर प्रवर्धित होता है कि एक उच् चतर स् टीटर वायरल सस्पेंशन (P1) (प्रवर्धन) का उत् पादन करें । यह तो वायरल स्टॉक प्राप्त करने के लिए प्रवर्धित है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: सीपीई और प्रतिदीप्ति के पैटर्न RSV-gfp और RSV-M2-1-जीएफपी के बचाव के दौरान मनाया । (क) BSRT5/7 कोशिकाओं को रिवर्स जेनेटिक्स ' वैक्टर ' के रूप में दर्शाया गया था, और चरण-कंट्रास्ट और प्रतिदीप्ति छवियों को ७२ ज प्रसविसंक्रमण पर लिया गया था । ऋणात्मक नियंत्रण (Neg Ctrl) रिवर्स आनुवंशिक सदिश के बिना N, P, L, और M2-1 के अभिव्यक्ति वैक्टर के साथ transfected कोशिकाओं से मेल खाती है । (ख) एचईपी-2 प्रकोष्ठों को संक्रमित BSRT5/7 कोशिकाओं (शून्य मार्ग, ७२ ज पोस्टट्रांसफेक्शन) से काटा गया वायरस से ग्रस्त किया गया था और ७२ एच पोस्टइंफेक्शन की छवियां ली गई थीं । दिखाए गए चित्र प्रतिनिधि फ़ील्ड्स के हैं; स्केल बार = १०० μm । बॉक्स्ड क्षेत्र आवर्धन में दर्शाए गए कक्ष पडते हैं; स्केल बार = 20 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: सीपीई के विकास और प्रतिदीप्ति पुनः संयोजक RSV के प्रवर्धन के दौरान मनाया । एेसी-2 कोशिकाएं ०.०१ PFU/कोशिकाओं की एक MOI पर संक्रमित थीं (a) Rsv-M2-1-gfp या (B) RSV-gfp के पहले मार्ग के साथ ७२ h के लिए । चरण-कंट्रास्ट और प्रतिदीप्ति छवियां 24 h, ४८ h, और ७२ h postinfection में ली गईं । दिखाए गए चित्र एक प्रतिनिधि फ़ील्ड के हैं; स्केल बार = १०० μm । बॉक्स्ड क्षेत्र आवर्धन में दर्शाए गए कक्ष पडते हैं; स्केल बार = 20 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: RSV टिटर का निर्धारण पट्टिका परख का उपयोग कर । (क) एक 12-कूप प्लेट में पट्टिका अनुमापन परख के परिणाम । एक वायरल स्टॉक के सीरियल dilutions से संक्रमित छह कुओं दिखाया जाता है । एक आधार-10 लघुगणक में फैलाव दर्शाया गया है । तीन पहली dilutions से संक्रमित कोशिकाओं सब अलग हैं । 10-4, 10-5 और 10-6 के साथ स्वीकार्य पट्टिका संख्या संगत हैं । (ख) पट्टिका गणना (पीला संख्या) का चित्रण । हरे रंग का तारा कोशिका परत पर खरोंच को इंगित करता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्र 5: एक बचाया और प्रवर्धित वायरस की टाइट्रेट करना । पट्टिका RSV-GFP और RSV-M2-1-GFP के विभिंन पैसेज पर एक 12-well थाली में एेसी-2 कोशिकाओं पर असाए के phenotypes (छवियों कुओं की संपूर्णता दिखाने के लिए) । बाद के मार्ग के तीतरों को सारणी में दर्शाया गया है । प्रतिनिधि डेटा दिखाए जाते हैं । वायरल शेयरों की कमजोरियां एक आधार-10 लघुगणक में दर्शाई गई हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्र 6: rsv-GFP अभिव्यक्ति की सिरना लक्ष्यीकरण Rsv एन या IMPDH द्वारा निषेध । A549 कोशिकाओं नियंत्रण nontargeting siRNA (NT) (लाइट ब्लू बार) या siRNA लक्ष्यीकरण गफध (ब्लू बार), RSV एन (नारंगी बार), या IMPDH2 (ग्रीन बार) ४८ के लिए एच के साथ इलाज किया गया और फिर RSV-GFP से संक्रमित ०.०५ PFU की एक MOI/ हरे प्रतिदीप्ति ४८ एच postinfection में पढ़ा था । (क) आरसीवी-जीएफपी-संक्रमित कोशिकाओं के 48h pi में प्रतिनिधि छवियों, के रूप में चित्र पर देखा sirna के साथ इलाज किया । स्केल बार = १०० μm । (ख) आंकडे़, दो स्वतंत्र प्रयोगों के माध्य ± एसडी हैं जो तीन प्रतियों में निष्पादित किए जाते हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 7
चित्र 7: AZD4136 यौगिक द्वारा RSV-GFP गुणा का निषेध । ९६ में HEp-2 कोशिकाओं-अच्छी तरह से प्लेटें RSV से संक्रमित थे ०.०५ PFU के एक MOI में GFP/सेल AZD4316 यौगिक या नियंत्रण DMSO के धारावाहिक dilutions की उपस्थिति में । हरी प्रतिदीप्ति ४८ एच पीआई डेटा में पढ़ा था दो स्वतंत्र प्रयोगों के माध्य ± एसडी triplicate में प्रदर्शन कर रहे हैं. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 8
चित्रा 8: समय चूक माइक्रोस्कोपी द्वारा एेसी-2-संक्रमित कोशिकाओं में फ्लोरोसेंट प्रोटीन M2-1-GFP ट्रैकिंग द्वारा आईबीएस की गतिशीलता का विश्लेषण । 18 एच पीआई में, कोशिकाओं को एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के साथ 5 एच के लिए हर 5 मिनट imaged थे, ३७ डिग्री सेल्सियस पर गर्म एक चैंबर में । आईबीएल फ्लोरोसेंट (हरी) हैं, क्योंकि वे M2-1-GFP होस्ट करते हैं, और नाभिक Hoechst (नीला) के साथ दाग रहे हैं । सफेद तीर IBs फ्यूजन से गुजर संकेत मिलता है । स्केल बार = 10 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 9
चित्रा 9: RSV में IBAGs की गतिशीलता का विश्लेषण-M2-1-GFP-संक्रमित कोशिकाओं समय चूक माइक्रोस्कोपी द्वारा । 18 एच पीआई में, कोशिकाओं एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के साथ imaged थे, एक चैंबर में ३७ डिग्री सेल्सियस पर गर्म । M2-1-gfp प्रोटीन हरी प्रतिदीप्ति द्वारा कल्पना था । सफेद तीर IBs के एक विलय के दौर से गुजर संकेत Ibs । स्केल बार = 5 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Movie 1
Movie 1: in VIVO RSV में IBs की गतिशीलता का विश्लेषण-M2-1-एचईपी-2-संक्रमित कोशिकाओं में GFP । 18 एच पीआई में, कोशिकाओं प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के साथ 5 एच के लिए हर 5 मिनट imaged थे, एक चैंबर में ३७ डिग्री सेल्सियस पर गर्म । स्केल बार = 10 μm । परिणामी चलचित्र 7 फ़्रेम/s (fps) दिखाती है । कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें । (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें.)

Movie 2
मूवी 2: में RSV में IBAGs की गतिशीलता का vivo विश्लेषण-M2-1-GFP-संक्रमित कोशिकाओं । 18 एच पीआई में, कोशिकाओं ३७ डिग्री सेल्सियस पर गर्म एक चैंबर में, प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के साथ 3 एच और ४० मिनट के लिए हर 5 मिनट imaged थे । स्केल बार = 2 μm । परिणामस्वरूप फिल्म 4 एफपीएस से पता चलता है । कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें । (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें.)

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Discussion

यहां हम पांच plasmids से पुनः संयोजक RSVs के बचाव की एक विधि मौजूद है, और उनके प्रवर्धन । वायरस के जीनोम में हेरफेर करने की क्षमता के लिए परिवर्तन का परीक्षण और एक अतिरिक्त जीन या एक टैग वायरल प्रोटीन व्यक्त करने के लिए वायरोलॉजी अनुसंधान में क्रांतिकारी बदलाव किया है । Rsv हम वर्णित है और इस लेख में एक उदाहरण के रूप में इस्तेमाल एक वायरस एक रिपोर्टर जीन व्यक्त, rsv-gfp (अप्रकाशित), और एक M2-1 एक gfp टैग12के लिए संगलित प्रोटीन व्यक्त करता है । RSV बचाव चुनौतीपूर्ण है और अभ्यास की आवश्यकता है । अभिकर्मक दक्षता महत्वपूर्ण है, अभिकर्मक अभिकर्मक और अभिकर्मक प्रोटोकॉल के एक पूर्व अनुकूलन के एक बुद्धिमान चयन पर निर्भर करता है । जीवाणु T7 पीओएल व्यक्त कोशिकाओं का उपयोग अनिवार्य है क्योंकि वायरल cDNA अनुप्रवाह आनुवंशिक सदिश के अधिकांश में T7 पीओएल प्रमोटर रखा गया है । एक विकल्प के लिए एक वैक्कीनिया सहायक वायरस से T7 pol व्यक्त है । हालांकि, stably T7 pol व्यक्त कोशिकाओं का उपयोग दो वायरस को अलग करने की आवश्यकता से बचा जाता है और बचाव के साथ गोशीतला के संभावित हस्तक्षेप रोकता है । यह सबसे अधिक बचाव दक्षता सुनिश्चित करने के लिए संरोप ठंड के बिना रिवर्स आनुवंशिक (P0 करने के लिए P1) के पहले पारित करने के लिए महत्वपूर्ण है । इसका तात्पर्य यह है कि MOI नियंत्रित नहीं है । हालांकि, इस कदम पर, titers बहुत कम रहते हैं, पहली यात्रा के लिए एक कम MOI में जिसके परिणामस्वरूप । उच्च संक्रामक titers (106-107 pfu/एमएल) के साथ Rsv स्टॉक प्राप्त करने के लिए, यह एक मजबूत सीपीई के लिए प्रतीक्षा करने के लिए और कोशिकाओं को वायरल कणों को इकट्ठा करने के लिए कोशिकाओं परिमार्जन करने के लिए महत्वपूर्ण है । इस स्टडी में टीटर्स ने ९६ एच पीआई के बाद वृद्धि नहीं की वायरल सस्पेंशन का फास्ट कूलिंग हाई टिटर्स को बनाए रखने के लिए जरूरी है । इसके बजाय एक सूखी बर्फ/इथेनॉल मिश्रण में या तरल नाइट्रोजन में विसर्जन द्वारा प्राप्त किया जा सकता है-८० डिग्री सेल्सियस पर-शराब precooled में एक विसर्जन के द्वारा । संरक्षण समाधान के अतिरिक्त-८० डिग्री सेल्सियस पर वायरस निलंबन की एक लंबी स्थिरता सुनिश्चित करेगा । -८० डिग्री सेल्सियस पर भंडारण महत्वपूर्ण है, के बाद से वायरस जल्दी से जब-20 डिग्री सेल्सियस या तरल नाइट्रोजन में संग्रहीत अपनी संक्रामकता नुकसान होगा । हम एेसी-2 कोशिकाओं है, जो RSV बढ़ने के लिए सबसे लोकप्रिय सेल लाइन है पर RSV प्रवर्धन वर्णित है, लेकिन यह भी कई अंय विट्रो में सेल लाइनों पर कुशलता से विकसित करने में सक्षम है । ध्यान दें, तथापि, कि Vero कोशिकाओं पर वृद्धि जी अभिव्यक्ति24में एक परिवर्तन में परिणाम हो सकता है ।

हम एक माइक्रोक्रिस्टलीय सेलुलोस ओवरले का उपयोग कर rsv के पट्टिका अनुमापन के एक बहुत ही सरल प्रोटोकॉल का वर्णन किया । सभी टाइट्रेट करने के लिए assays के रूप में, यह उच्च अनुमापन निलंबन के साथ संदूषण के प्रति संवेदनशील है, सावधान हेरफेर की आवश्यकता होती है । पारंपरिक आरएसवी टाइट्रेट एगारोस या कार्बोक्सिमेथिल सेलुलोस (सीएमसी) ओवरले का उपयोग करते हैं और टिटर निर्धारण के लिए प्रतिरक्षा और सूक्ष्मदर्शी टिप्पणियों की आवश्यकता होती है । इम्यूनोविसरण ग्रेड एगारोस का प्रयोग करते हुए एक प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है, जो25इम्यूनोडाइंग के बिना पट्टिकाओं के प्रत्यक्ष दृश्य को सक्षम बनाता है । हालांकि, एेसी-2 कोशिकाएं एक गर्म आगार ओवरले के प्रति बहुत संवेदनशील होती हैं, जो इस प्रोटोकॉल को कई वायरस titrations के लिए उपयोग करने में कठिन बनाती है (उदा., एक बहुत गर्म ओवरले कोशिका परत को नष्ट कर देता है); दूसरी ओर, जब यह काफी गर्म नहीं है, यह पहली थाली वितरण के बाद जम जाता है । एक पट्टिका परख के लिए माइक्रोक्रिस्टलीय सेलुलोस का उपयोग पहले matrosovich एट अल द्वारा वर्णित किया गया है । एक इंफ्लूएंजा एक वायरस अनुमापन परख26के लिए । इसके कम चिपचिपापन के लिए धन्यवाद, माइक्रोक्रिस्टलाइन सेलुलोज सेलुलोस ओवरले को बांटना आसान है और थाली कुओं से हटाने के लिए, यह ९६-well प्लेटों के साथ संगत बना रही है । यह, इस प्रकार, विशेष रूप से सीरम विज्ञानी अध्ययन और दवा संवेदनशीलता विश्लेषण के लिए अनुकूलनीय है । ध्यान दें कि चूंकि माइक्रोक्रिस्टलीय सेलुलोस को गर्म करने की आवश्यकता नहीं है, इसलिए दवाओं को ओवरले में आसानी से शामिल किया जा सकता है । तथापि, यह महत्वपूर्ण है कि प्लेटें अभी भी ऊष्मायन के दौरान पूरी तरह से बनी हुई हैं; अंयथा, बड़े धूमकेतु के आकार का फोकी गोल पट्टिक के बजाय फार्म का होगा । पट्टिका रहस्योद्घाटन क्रिस्टल बैंगनी का उपयोग सस्ते और सरल है, लेकिन इस समाधान विषाक्त है और ठीक से निपटा जाना है । समाधान के पुनर्चक्रण की सीमा बर्बाद उत्पादन । इसके अलावा, इस विधि सेल monolayer नुकसान है कि झूठी सफेद धब्बे है कि वायरल पट्टिक नहीं कर रहे है के रूप में प्रकट होता है के लिए संवेदनशील है । एक उदाहरण चित्र 4 (हरा सितारा) में दिखाया गया है । इस पूर्वाग्रह को रोकने के लिए, 1) कोशिकाओं को scratching या सेल monolayer निस्तब्धता से बचने के लिए सावधानी के साथ नियंत्रित किया जाना है, 2) आकांक्षा और वितरण हमेशा एक ही स्थान पर एक ज्ञात क्षेत्र के लिए क्षति को दरकिनार करने के लिए किया है, और 3) झूठी सफेद धब्बे की पहचान की जा सकती है उनके आकार के लिए धंयवाद (गोलाकार नहीं), उनके तेज किनारों, और उनकी स्थिति । हम पहले21,26के रूप में पहले प्रकाशित avicel आर सी ५८१, का इस्तेमाल किया । हालांकि, RC ५८१ अब उपलब्ध नहीं है, और हम सफलतापूर्वक इसे RC ५९१ द्वारा प्रतिस्थापित । अन्य कोशिका/वायरस जोड़ों के लिए इस परख अनुकूलन करने के लिए, माइक्रोक्रिस्टलीय सेलुलोस की एकाग्रता वायरस और कोशिकाओं के आधार पर निर्धारित किया जाना है । बहुत अधिक माइक्रोक्रिस्टलीय सेलुलोस कोशिकाओं के लिए विषाक्त हो सकता है और छोटे पट्टिक के लिए नेतृत्व, बहुत कम माध्यम में वायरस के प्रसार के लिए नेतृत्व करेंगे ।

हम rsv-gfp वायरस के उपयोग के दो उदाहरण का वर्णन करने के लिए आरएसवी गुणन की निगरानी: एक एंटीवायरल दवा की उपस्थिति में या जब एक सेलुलर प्रोटीन मुंह बंद । हमने यह दर्शाया कि जीएफपी सिग्नल वायरल गुणा के साथ सहसंबद्ध है । यहां प्रस्तुत विधि वास्तविक समय में वायरल गुणा के उदासीन मूल्यांकन की अनुमति देता है । यह वैज्ञानिकों को आसानी से एक एंटीवायरल दवा की IC50 निर्धारित करने के लिए सक्षम बनाता है, के रूप में चित्र 7में दिखाया गया है । महत्वपूर्ण बात, यह माप मध्यम या ब्रॉडबैंड में उपयोग के लिए अनुकूलनीय है, विशेष रूप से रासायनिक पुस्तकालयों की स्क्रीनिंग के लिए । यह रिपोर्टर-व्यक्त वायरस भी सेलुलर प्रोटीन अभिव्यक्ति का एक मॉडुलन के वायरस गुणा पर प्रभाव का आकलन करने के लिए उपयोगी हो सकता है. आरएनए हस्तक्षेप एक जैविक प्रक्रिया है जिसके द्वारा एक विशिष्ट एमआरएनए को सिरना द्वारा अपनी विशिष्ट मान्यता का पालन करते हुए अपमानित किया जाता है, इस प्रकार यह कम या आदर्श रूप में, इसी प्रोटीन की अभिव्यक्ति को समाप्त27। यहां दिए गए उदाहरण में, RSV-GFP-संक्रमित कोशिकाओं में GFP सिग्नल तीव्रता की निगरानी करके, हमने वायरल न्यूक्सेकोसिड (एन) एमआरएनए या RSV गुणन पर होस्ट इंपध एमआरएनए की साइलेंसिंग के प्रभाव का आकलन किया । IMPDH2 एक प्यूरीन bioसंश्लेषित एंजाइम है कि एक दर को उत्प्रेरक-28imp से ग्वानीन न्यूक्लियोटाइड के de नोवो biosynthetic की दिशा में कदम सीमित है । इस प्रकार यह इन्ट्राकोशिक ग्वानीन न्यूक्लिओटाइड पूल का एक नियामक है । इस तरह के रूप में रिबाविरैन, आरएनए वायरस, rna संक्रमण29,30,31सहित पर निरोधात्मक प्रभाव डालती impdh अवरोधकों, । के रूप में चित्र 6में दिखाया गया है, impdh अभिव्यक्ति के निषेध वायरल गुणा impdh के रूप में gfp संकेत की कमी से संकेत दिया, rsv विकास पर ribavirin के प्रभाव नकल उतार । वैसे तो वायरल गुणा वायरल एन प्रोटीन को टारगेट कर सिरना की मौजूदगी में ही लगभग समाप्त कर दिया जाता है । इस परिणाम के बाद से उंमीद की थी siRNA N प्रोटीन को लक्षित करने के लिए वायरल nucleocapsid विधानसभा को रोकने की उंमीद थी और दृढ़ता से वायरल प्रतिकृति३२ख़राब साबित । नेबुलाइजेशन द्वारा इन सिरना के प्रशासन स्वस्थ वयस्कों३३में rsv द्वारा बाद संक्रमण हिचकते । N या IMPDH siRNA का प्रभाव गप्ध अभिव्यक्ति के निषेध के बाद से विशिष्ट है, एक नियंत्रण जीन के रूप में चुना है, के रूप में nontargeting सिरना की तुलना में वायरल गुणा ख़राब नहीं है । ध्यान दें कि किसी भी स्थिति में कोई कोशिका विषाक्तता नहीं पाई गई । एक साथ लिया, इन परिणामों के यहां प्रस्तुत की रणनीति मांय है, जो ऊपर हो सकता है उच्च थ्रौपुट स्क्रीनिंग के लिए स्केल siRNA पुस्तकालयों या अंय पीटकर तरीकों, जैसे CRISPR के रूप में-Cas9 प्रौद्योगिकी३४।

पुनः संयोजक वायरस एक फ्यूजन फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त शक्तिशाली उपकरण का प्रतिनिधित्व करने के लिए वायरल प्रोटीन और वायरल संरचनाओं गतिशीलता का अध्ययन । एक फ्लोरोसेंट M2-1 प्रोटीन व्यक्त RSV IBs की गतिशीलता और Ibs के अवलोकन में सक्षम बनाता है । IBs, जो RSV वायरल कारखानों के रूप में माना जा सकता है, गोलाकार गतिशील संरचनाओं के रूप में दिखाई देते हैं । वे बड़े गोलाकार संरचनाओं (चित्रा 8 और 1 फिल्म) बनाने के लिए एक साथ फ्यूज करने में सक्षम हैं । इन आंकड़ों का सुझाव है कि RSV IBs तरल organelles, जो रेबीज वायरस३५के लिए वर्णित किया गया है के समान हैं । Ibags के अंदर एक उपडिब्बे का प्रतिनिधित्व करते हैं, जिसमें वायरल एमआरएनए और M2-1 प्रोटीन ध्यान केंद्रित, जैसे जीनोमिक आरएनए, नाभिक, और polymerase, केवल Ibags12के बाकी हिस्सों में मौजूद हैं । वीडियो माइक्रोस्कोपी प्रयोगों से पता चलता है कि IBAGs बहुत गतिशील संरचनाओं तरल गुणों का प्रदर्शन कर रहे हैं (चित्र 9 और 2 फिल्म). इन्हें द्रव-द्रव प्रावस्था संक्रमण से उत्पन्न द्रव डिब्बों के रूप में माना जा सकता है ।

आनुवंशिक रूप से हेरफेर वायरस की संभावना अपने गुणन और दवाओं के लिए उनकी संवेदनशीलता के दोनों तंत्र का अध्ययन करने के लिए पसंद का एक उपकरण बना रहता है । रिवर्स आनुवंशिकी अब वायरोलॉजी के "शास्त्रीय तकनीकों" के भाग के रूप में माना जा सकता है । हालांकि, RSV जैसे कुछ वायरस के लिए यह दुरूह रहता है । यही कारण है कि इस प्रोटोकॉल विस्तार से सफलतापूर्वक बचाव और पुनः संयोजक RSVs बढ़ाना करने के लिए चरणों का वर्णन करता है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखक AZD4316 दवा प्रदान करने के लिए AstraZeneca आर & D बोस्टन, एमए, यूएसए, से डॉ Qin यू धंयवाद । लेखक ScanR ओलिंप माइक्रोस्कोप है, जो क्षेत्र Ile-de-फ्रांस (मंद एक स्वास्थ्य) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था तक पहुंचने के लिए Cymages मंच के आभारी हैं । लेखक INSERM और Versailles सेंट-Quentin विश्वविद्यालय से समर्थन स्वीकार करते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
35 mm µ dish for live cell imaging Ibidi 81156
A549 ATCC ATCC CCL-185
Avicel RC-591 FMC BioPolymer Avicel RC-591 Technical and other information on Avicels is available at http://www.fmcbiopolymer.com. Store at room temperature. Protocol in step 4 is optimized for this reagent.
BSRT7/5 not commercially available See reference 22. Buchholz et al. 1999
Crystal violet solution Sigma HT90132
Fluorescence microscope for observations Olympus IX73 Olympus microscope
Fluorescence microscope for videomicroscopy Olympus ScanR Olympus microscope
HEp-2 ATCC ATCC CCL-23
HEPES ≥99.5% Sigma H3375
L-Glutamine (200 mM) ThermoFisher Scientific 25030024
LIPOFECTAMINE 2000 REAGENT ThermoFisher Scientific 11668019 Protocol in step 2.3. is optimized for this reagent.
MEM (10x), no glutamine ThermoFisher Scientific 11430030
MEM, GlutaMAX Supplement ThermoFisher Scientific 41090-028
MgSO4 ReagentPlus, ≥99.5% Sigma M7506
Opti-MEM I Reduced Serum Medium ThermoFisher Scientific 51985-026
Paraformaldehyde Aqueous Solution, 32%, EM Grade Electron Microscopy Sciences 15714
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) ThermoFisher Scientific 15140122
Plasmids not commercially available See reference 21. Rameix-Welti et al. 2014
See Saw Rocker VWR 444-0341
Si RNA GAPDH Dharmacon ON-TARGETplus siRNA
D-001810-10-05		 SMARTpool and 3 of 4 individual siRNAs designed by Dharmacon.
Si RNA IMPDH2 Dharmacon ON-TARGETplus siRNA IMPDH2 Pool- Human
L-004330-00-0005		 SMARTpool of 4 individual siRNAs designed by Dharmacon.
Individual references and sequences
J-004330-06: GGAAAGUUGCCCAUUGUAA;
J-004330-07: GCACGGCGCUUUGGUGUUC;
J-004330-08: AAGGGUCAAUCCACAAAUU;
J-004330-09: GGUAUGGGUUCUCUCGAUG;
Si RNA RSV N Dharmacon ON-TARGETplus custom siRNA UUCAGAAGAACUAGAGGCUAU and UUUCAUAAAUUCACUGGGUUA
SiRNA NT Dharmacon ON-TARGETplus Non-targeting Pool
SiRNA transfection reagent Dharmacon DharmaFECT 1 Ref: T-2001-03 Protocol in steps 5.1.and 5.1.2 are optimized for this reagent.
Sodium Bicarbonate 7.5% solution ThermoFisher Scientific 25080094
Spectrofluorometer Tecan Tecan infinite M200PRO

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References

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Bouillier, C., Rincheval, V., Sitterlin, D., Blouquit-Laye, S., Desquesnes, A., Eléouët, J. F., Gault, E., Rameix-Welti, M. A. Generation, Amplification, and Titration of Recombinant Respiratory Syncytial Viruses. J. Vis. Exp. (146), e59218, doi:10.3791/59218 (2019).

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