Summary
我们描述了一种生成和扩增转基因呼吸道合胞病毒 (Rsv) 的方法和 Rsv 的优化斑块检测方法。我们通过创建两种重组病毒来说明这一协议, 它们分别允许对 RSV 复制进行定量, 并对 RSV 包涵体和包涵体相关颗粒动力学进行实时分析。
Abstract
重组病毒的使用已成为基础或应用病毒学的关键。反向遗传学已被证明是一项极其强大的技术, 既可以破译病毒复制机制, 也可以研究抗病毒药物, 也可以为疫苗提供开发平台。然而, 为呼吸合胞病毒 (RSV) 等负链 RNA 病毒构建和操作反向遗传系统仍然很微妙, 需要特殊的专门知识。RSV 基因组是一种单链、负感 RNA, 约为 15 kb, 可作为病毒 RNA 复制和转录的模板。我们的反向遗传学系统使用人类 RSV 长株基因组 (HRSV) 的 cDNA 拷贝。这种 cDNA, 以及编码聚合酶复合物 (L、P、N 和 M2-1) 病毒蛋白的 Cdna, 被放置在 T7 聚合酶控制序列下的单个表达载体中。这些元素在 BSR-T展望5细胞中的转染, 稳定地表达 T7 聚合酶, 使重组 RSV 的细胞质复制和转录, 从而产生转基因病毒。一种新的 RSV, 存在于细胞表面和 bsrt75 的培养上清液中, 聚集在感染人 HEp-2 细胞进行病毒扩增。需要两轮或三轮扩增, 以获得含有 1 x10 6 至 1 x 10 7 斑块形成单元的病毒储存量。本文详细介绍了病毒库存的最佳收获、冷冻和滴定方法。我们通过创建两种分别表示游离绿色荧光蛋白 (RSV-GFP) 或病毒 M2-1 融合到 GFP (RSV-M1-GFP) 的重组病毒来说明本文所介绍的协议。我们展示了如何使用 RSV-GFP 量化 RSV 复制和 RSV-M1-GFP 可视化病毒结构, 以及病毒蛋白动态的活细胞, 通过视频显微镜技术。
Introduction
人 RSV 是全世界婴儿急性呼吸道感染住院的主要原因1。此外, RSV 与成人的疾病负担相当, 与流感相当, 老年人的住院和死亡负担大多为2。目前还没有针对 rsv 的疫苗或特定的抗病毒药物, 但有希望的新药正在开发中 3,4。RSV 乘法定量技术的复杂性和繁重程度阻碍了寻找抗病毒药物或疫苗的工作, 尽管目前作出了相当大的努力。RSV 体外增殖的定量一般是基于费力、耗时、昂贵的方法, 主要是通过显微镜、免疫染色、斑块还原量、定量等方法对细胞病理效应进行分析。逆转录酶 (qRT)-聚合酶链反应 (PCR) 和酶联免疫吸附试验。具有修饰基因组和表示记者基因的病毒, 如 GFP 编码的病毒, 更适合于此类筛选。结合自动化平板阅读器的使用, 记者基因携带重组病毒可以使这些检测更适合标准化和高通量的目的。
RSV 是一种包覆的、非分段的负感 RNA 病毒, 属于肺炎家族的正交肺炎病毒属, 顺序mononegavirales5。RSV 基因组是一种单链、负感 RNA, 约为 15 kb, 它包含一个位于 3 ' 和 5 ' 末端的非编码区域, 称为 "引线" 和 "预告片", 以及10个编码11蛋白的转录单元。基因顺序如下: 3 '-NS1、NS2、N、p、M、SH、g、f、M2 (m2-1 和 M2-2 蛋白编码) 和 L-5 '。基因组 RNA 由核蛋白 N 紧密包装, 以包塞化基因组 RNA 为模板, 病毒 rna 相关 RNA 聚合酶 (RdRp) 将确保病毒 RNA 的转录和复制。病毒 Rrp 由携带核苷酸聚合酶活性的大蛋白 L、其强制性辅因子磷蛋白 P 和作为病毒转录因子6的 m2-1 蛋白组成。在受感染的细胞中, RSV 诱导细胞质体内含物的形成, 称为包涵体 (IBs)。在几个mononegavirales7,8, 9,10中观察到了类似的形态类似的细胞质内含物。最近关于狂犬病毒、泡状口炎病毒 (vsv)、埃博拉病毒和 rsv 的研究表明, 病毒 rna 合成发生在 ibs 中, 因此可以被视为病毒工厂8,9,11,12. 病毒工厂集中了病毒 rna 合成所需的 rna 和病毒蛋白, 还含有细胞蛋白 13、14、15、16、17. ibs 表现出一个称为 IB-associated 颗粒 (iba) 的功能亚隔间, 该亚隔间集中了新合成的新生病毒 mrna 以及 mRNA 蛋白。在 Ibag 中没有检测到基因组 Rna 和 L、P 和 N。Ibag 是 IBs 内部的小动态球状结构, 表现为液体细胞器12的性质。尽管 IBs 在病毒增殖中发挥着核心作用, 但对这些病毒工厂的性质、内部结构、形成和运营了解甚少。
来自 cDNA 的脊髓灰质炎病毒基因组的表达使 1981年18年首次感染病毒克隆得以产生.对于单链阴性 RNA 病毒, 直到1994年才产生第一种狂犬病病毒, 然后将质粒转染成细胞19 。1995年20年公布了第一个基于血浆的 rsv 反向遗传系统.反向遗传学在病毒学领域取得了重大进展。在病毒基因组中引入特定修饰的可能性为 RNA 病毒的复制和发病机制提供了重要的见解。这项技术还通过有针对性的一系列修改, 使疫苗的开发能够产生具体的衰减。基因组修饰允许快速定量的病毒增殖大大改善了抗病毒筛选和研究其作用模式。
虽然前面描述过, 但获得转基因 Rsv 仍然很微妙。在这里, 我们详细介绍了一种创建两种类型的重组 HRSV 的协议, 分别表示 RSV-GFP 或 RSV-M1-GFP。在该协议中, 我们描述了抢救新的重组病毒所需的转染条件, 以及它们的扩增, 以获得高滴度的病毒库存, 适合可重复的实验。这里没有描述反向遗传学载体本身的构造。我们确实描述了最佳收集和冷冻病毒种群的方法。量化病毒感染颗粒最准确的方法仍然是斑块检测。细胞感染了连续稀释的分析悬浮液和孵育覆盖, 禁止扩散自由病毒颗粒在上清液。在这种情况下, 病毒只会感染连续的细胞, 形成每个初始传染性颗粒的 "斑块"。在传统的 RSV 滴定法中, 斑块通过免疫染色结果, 并在显微观察下计数。这种方法既昂贵又耗时。在这里, 我们描述了一个非常简单的协议 RSV 斑块检测使用微晶纤维素覆盖, 使斑块的形成可见肉眼。我们展示了如何使用 RSV-GFP 来测量 RSV 复制, 从而量化抗病毒药物的影响。结合反向遗传学和活体成像技术, 我们展示了 RSV-M1-GFP 如何允许科学家在活细胞中想象 M2-1, 并跟踪细胞内病毒结构的动态, 如 IBs。
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Protocol
1. 材料制备
- 购买细胞培养基 (减少血清培养基、最低必需培养基 [MEM]、10倍 MEM 和 Dulbecco 的改性鹰培养基 [DMEM])、转染试剂和微晶纤维素 (见材料表)。
- 获取反向遗传学的以下载体: 编码 n 蛋白和聚合酶复合蛋白的基因组载体和表达载体。基因组载体包含来自噬菌体 T7 rna 聚合酶 (tpol) 启动子下游的 RSV-推销 V-GFP (对 Rsv-m2-1gfp) 的全 cDNA 基因组。表达式向量 (指定为 p-N、P-N、P-N 和 P-m2-1) 包含 T7 pol 下游 n、P、L 或 M2-1 的编码序列 (关于质粒结构的详细信息, 请参见 Rincheval 等人12和Rameix-Welti等件).
- 准备培养基, 以便在无菌环境中进行细胞培养, 并进行转染和感染。使用 Dmem 与 2 mM l-谷氨酰胺补充10% 胎儿小牛血清 (FCS), 1, 000 unitsml 青霉素, 1 mgml 链霉素 (或不含抗生素) 和 MM, 含 2 mM l-谷氨酰胺, 辅以0%、2% 或10% 的 FCS、1, 000 Units/青霉素和 1 Mg/ml链霉素, 在以下协议中被指定为 "完整的介质"。
- 获得 CELLS/ML-22个细胞, 并在完整的培养基中添加10% 的二甲基亚硫酸 (dmso), 在1至 2 x10 6细胞。保存液氮中的细胞储备。获得 HEp-2 细胞。在无菌环境中, 在完全 Dmem 和 HEp-2 细胞中培养 bsrt"5 细胞, 在无菌环境中在完全 mem 中培养 bsrt" 5 细胞。
- 在无菌环境中制备 10倍 RSV 保护溶液 (0.5 M hepes 和 1 M MgSO4 [ph 7.5])。
- 获得与 GFP 荧光测量兼容的倒置荧光显微镜, 并在需要监测感染时与实时成像兼容。获取与 GFP 荧光测量兼容的微板读取器, 用于定量 RSV-GFP 复制。
2. 重组病毒的抢救和首次通过
请注意:在无菌环境中, 使用二级安全柜执行以下所有步骤。
- 在转染前一天, 在完全培养基中 5x10 5 细胞中悬浮 CELLS/ML 5 细胞.在6井板中, 每口井分配2毫升细胞悬浮液。准备一个很好的每病毒, 将被拯救和另一个井的负控制。在37°c 和 5% CO 2 下培育板材.检查细胞是否在第二天达到 80%-90% 的融合。
- 解冻反向遗传学载体 (从步骤 1.2) p-RSV-GFP 和 P-rsv-m1-gfp, 以及 p-N、p-P、p-L 和 p-m2-1。混合, 为每个病毒救援, 1 微克的 p-N 和 P-N, 0.5 微克的 P-N, 0.25 微克的 P-m2-1, 1.25 微克的 p-rsv (GFP 或 M2-1 GFP) 在管中。
请注意:N、P、L 和 M2-1 可以使用不同的表达向量;然而, 蛋白质之间的比例必须保持。通过用空向量替换 p-RSV 矢量来执行负控制。 -
按照转染试剂制造商的协议进行转染 (参见材料表)。
- 在混合载体中加入250μl 的减少血清培养基。在另一管中, 将转染试剂在250μl 的减少血清中稀释10μl。轻轻涡流两个管, 等待 5分钟, 混合两个管的内容物, 在室温下等待20分钟。
- 用1毫升的还原血清培养基冲洗 bsrt梅耶尔细胞, 用10% 的 FCS 分配 1.5 mL 的 ML, 而不需要抗生素。如有必要, 在37°c 和 5% CO 2 下孵育, 直到步骤2.3.1 中描述的孵育完成.
- 当20分钟的孵育时间结束时, 在井 2.3.1, 将步进制备的转染混合物添加500Μl。将细胞置于37°c 和 5% CO2 的孵化器中 3天.在转染过程中, 不要改变细胞的培养基。
- 在倒置荧光显微镜下, 以每天10倍的放大倍率1x 的速度观察 GFP 荧光 (在 488 nm 时激发, 在 515–535 nm 处发射), 使用 GFP 过滤器监测救援效率。
- 在转染后的第二天, 将细胞播种, 使获救病毒首次通过。在全介质中准备 5x10 5 细胞的 HEp-2 细胞悬浮液.在6井板中分配每口井2毫升细胞悬浮液 (每口井每片病毒抢救一通)。
- 在转染的第三天, 转染 bsrt75 6 井板的每口井都有划伤细胞, 每口井使用不同的刮刀。将每个井的含量 (细胞和上清液) 转移到无菌的2毫升微离心管中。涡旋每个管大力为至少 30 s 释放获救的病毒从细胞膜。
请注意:这对应于获救病毒的第0段 (P0) (图 1)。 -
使用新鲜的病毒 P0 悬浮液来执行获救病毒的第一次放大。
- 从前一天播种的 HEp-6 孔板中取出培养基 (参见步骤 2.5), 并在每口井快速添加500Μl 的 P0 悬浮液 (从步骤 2.6)。将 Heup-2 板放在37°c 的锯摇杆上, 进行软搅拌2小时。
- 取出并丢弃500Μl 的接种器, 加入2毫升的 ML, 共 2% FCS。在37°c 和 5% co 2 下将板材加氢 3天 。这将产生获救病毒的第一个通道 (P1) (图 1)。
- 在剩余的 P0 悬浮液中加入 10倍 RSV 保护溶液 (0.5 M HEPES 和 1 M MgSO4 [ph 7.5]) 体积的一半 (从步骤2.6 开始)。在低温管内大力旋涡微管 5 s, 并在贴有耐醇标签的低温管内提取物。将管材浸泡在-80°c 的酒精中至少 1小时, 并将其保存在-80°c。
- 滴定每个获救病毒的 P0 库存 (见步骤 2.6) (微晶纤维素滴定见第4节)。
- 在倒置荧光显微镜下, 以每天2倍的放大倍率, 观察 HEp-2 细胞的 GFP 荧光 (在 488 nm 时激发, 在 515-535 nm 处发射), 以监测感染情况。在明亮场显微镜下观察反映 RSV 细胞致病性效应 (CPE) 的小合胞和细胞脱离的出现 (见图 2)。
- 请注意, 如果2-3天后既不可见荧光也看不到 CPE, 则救援失败。
- 如步骤2.6 所述, 在第3天或第4天收集第一个段落 (P1)。总之, 刮细胞, 收集细胞和上清液在一起, 使它们变涡, 添加步骤2.8 中描述的守恒溶液, 并将其冷冻。
- 滴定率 (关于滴定测定的见第4节), 并放大第一段 (放大见第3节)。
3. 被救病毒的放大
请注意:下面的协议描述了被拯救的病毒在75厘米2瓶中的放大。使烧瓶大小适应所需的容量和所需的感染多样性 (MOI)。表 1显示了不同烧瓶的卷。在二级安全柜中的无菌环境中执行以下所有步骤。
- 在放大的前一天, 在 5 x10 5 细胞的情况下, 准备一个 Hep-2 细胞的悬浮液。每75厘米2瓶分配15毫升的细胞悬浮液, 并在37°c 和 5% co 2 中孵育烧瓶.为每种病毒准备一个烧瓶进行放大。
- 在孵育开始后的第二天, 检查细胞是否为 80%-100% 融合。
- 在没有 FCS 的 ML 中稀释步骤2.12 中的病毒悬浮液, 在 50, 000 Puum/ml (相当于 0.01 puumeell 的 MOI) 处获得3毫升悬浮液。
- 取出培养基, 迅速添加3毫升病毒悬浮液。将烧瓶放在37°c 的锯齿摇杆上, 进行软搅拌2小时。
- 取出和丢弃接种器, 加入 15% mL, 共 2% FCS。在37°c 和 5% co 2 下孵化 2-4天 。
- 在20x 放大的情况下, 在反荧光显微镜下检查细胞形态和 GFP 荧光 (在 488 nm 时激发, 在 515–535 nm 处发射), 以估计捕获病毒的正确时间。请注意, 这通常是当50–80% 的 HEp-2 细胞层被分离, 由于 RSV CPE 发生在48至72小时后感染 (p. i.) (见图 3)。
- 用刮板刮伤所有的细胞。将细胞和上清液收集在一起, 并将它们转移到50毫升的离心管中。
- 添加 10倍 RSV 保护溶液 (0.5 M HEPES 和 1 M MgSO4 [ph 7.5]) 的体积的一半。在200Xg 处进行5分钟离心, 使管材大力涡流 5秒, 并澄清悬浮液.
- 将上清液转移到50毫升管中。在贴有耐醇标签的低温管内, 有旋涡和悬浮液。将管浸入预冷-80°c 酒精中至少 1小时, 并将其存放在-80°c。
- 解冻其中一个等价物, 以滴定病毒悬浮液 (见第4节)。
4. 斑块滴定法
- 在进行滴定试验的前一天准备12孔板进行滴定 (需要6口井滴定一管病毒)。在完全培养基中, 用1毫升的 HEp-2 细胞在 5 x10 5 细胞中播种。
-
第二天, 准备无菌微晶纤维素悬浮液 (在水中为 2.4%) (见材料表)。
- 在100毫升的蒸馏水中, 使用标准的磁性搅拌器, 将2.4 克的微晶纤维素粉末分散, 直到粉末完全溶解 (通常为4–12小时)。在121°c 下对悬浮液进行20分钟的高压灭菌, 并在使用前将其存放在室温下。
请注意:在这种情况下, 悬浮液稳定1年。 - 在无菌环境中打开溶液后, 将其保存在4°c 下6个月。使用前一定要混合悬挂 (握手或涡旋), 以确保它是均匀的。
- 在100毫升的蒸馏水中, 使用标准的磁性搅拌器, 将2.4 克的微晶纤维素粉末分散, 直到粉末完全溶解 (通常为4–12小时)。在121°c 下对悬浮液进行20分钟的高压灭菌, 并在使用前将其存放在室温下。
- 在无菌环境中准备 2x MEM。用无菌水稀释商用 MEM 10倍, 加入 l-谷氨酰胺、1, 000 unitsml 青霉素和 1 mgmml 链霉素。用力摇晃稀释剂, 并将其存放在4°c。
请注意:使用二级安全柜, 在无菌环境中执行步骤4.4–4.10。 - 制备6管含有900μl 的 MEM, 每个病毒不需要 FCS 滴定 (滴定管)。解冻病毒的等价物, 使它们强烈旋转 5秒, 并将100Μl 转移到第一滴定管。
- 执行十倍稀释 6倍, 如下所示。在第一管中加入100μl 病毒到900μl 培养基中, 将瓶盖放在试管上, 并通过涡流混合其内容物几秒钟。更换移液器上的尖端, 在第二管中将第一稀释的100μl 添加到900μl 介质中, 将盖放在管上, 然后产生涡旋。重复此过程, 直到第六管。
请注意:每次稀释都要改变尖端是非常重要的。 - 写在 HEp-12 孔板上的病毒名称和褶皱稀释。添加一个标记, 以匹配板及其盖, 因为它们可能在染色过程中被分离 (步骤 4.9)。从板材中取出培养基, 每口稀释一次, 共分配400Μl。在37°c 下将板材培养 2小时, 以便吸附病毒。
请注意:改变每个接种器之间的移液器尖端, 或以相同的吸头从最低浓度到最高浓度。同时接种一系列有限的盘子 (1 至 2), 以避免细胞干燥。 -
在病毒吸附过程中准备微晶纤维素覆盖 (即兴制备)。为了获得100毫升的覆盖, 将2.4% 的微晶纤维素悬浮液、2x ML 的 10 mL 和 mL 的 80 mL 与2% 的 FCS 混合。
- 按照颜色指示器, 将 2x MEM 的 pH 值调整到7.2 左右, 采用无菌碳酸氢钠溶液, 为7.5%。加入微晶纤维素悬浮液和 MEM, 大力搅拌。
- 在2小时孵育结束时, 在不摘除接种物的情况下, 在12孔板的每口井中添加2至3毫升的覆盖。请注意, 避免污染邻近的井与高病毒滴度接种。在37°c 和 5% co 2 下将板材加氢 6天 。在孵育过程中, 不要移动板, 也不要移动孵化器。
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继续染色细胞, 使用结晶紫罗兰色溶液 (8% 结晶紫罗兰色 [v/v], 2% 甲醛 [v/v] 和20% 乙醇 [v/v] 在水中)。
- 用一张纸 (水晶紫罗兰色强烈颜色表面) 保护生物安全柜的工作表面。
- 轻轻摇晃盘子, 脱下微晶纤维素覆盖层。取出上清液, 用1x 磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 清洗细胞2倍。一个接一个地处理盘子, 以避免细胞干燥。加入1–2毫升的水晶紫罗兰色溶液, 等待10–15分钟, 取出溶液, 可重复使用, 以便随后进行板染色。
- 将盘子和盖子浸入新鲜漂白剂中几秒钟, 然后用自来水彻底清洗。请注意, 这些盘子和盖子是由漂白剂净化的。
- 把盘子和盖子放在纸巾上, 让它们干。在水冲洗后, 在环境温度下擦干盘子, 并在室温下储存。在较长的存储时间 (月) 内, 保持板材不受光线的影响, 以保护颜色。请注意, 如果细胞失去了颜色, 它们可以再次染色与水晶紫罗兰色。
- 计算病毒滴度。数一数干板井中的斑块, 肉眼可以看到这些斑块。检查不同稀释的斑块数量是否一致 (每次稀释之间的因子 10)。选择斑块最容易计数的井。评估斑块的数量与接种量和稀释。
请注意:在图 4提供的示例中, 在10-5 稀释时计算出21个斑块。这些对应于一个滴度
5. HRSV-GFP 重组病毒在小干扰 rna 或抗病毒药物治疗细胞中监测病毒复制
请注意:使用二级安全柜执行除5.1 和无菌环境中的所有步骤5.2.5。
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细胞基因沉默对 RSV 增殖影响的监测
注: 转染协议取决于试剂 (请参见材料表)。- 准备96孔板用于 GFP 测量。在检测前两天, 对于给予小干扰 RNA (siRNA), 在浓度为 100 nM 的情况下制备含有 siRNA 的减少血清培养基溶液, 并在 1.5 500 稀释的 siRNA 转染试剂。在室温下将溶液生也就是30分钟。
- 在 5.1.1 (一式三份) 制备的板材井中加入25Μl 的溶液。在没有抗生素的全培养基中, 用 A549 细胞悬浮液的 75Μl在不使用抗生素的情况下种子, 最终获得 3 x-5细胞浓度。在37°c 和 5% co 2 下将板材培育 48小时.
请注意:最终 siRNA 浓度为 25 nM, 最终转染试剂体积为0.5μl·井)。 - 按如下方式对单元格进行注入。从井里取出介质。在 50, 000 pusuml 中加入100μl 的 RSV-GFP 悬浮液, 在37°c 和 5% CO 2 处孵育 2小时.去除病毒悬浮液, 加入100μl 的 DMEM, 含2% 的 FCS, 不含苯酚红色。在37°c 和 5% CO 2 下培育板材.
- 在24小时和48小时的时间里, 使用光谱荧光计测量荧光, 分别设置为488和520纳米的激发和发射波长 (荧光以相对荧光单位表示)。使用未感染的 A549 细胞作为荧光和背景水平的标准。
请注意:细胞需要用4% 的甲醛 (PFA) 固定, 然后在没有板盖的情况下测量。
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RSV-GFP 药物抑制的评价
- 准备96孔板用于 GFP 测量。在检测前一天, 将 Hhep-2 细胞悬浮液的100μl 的井在 5 x 10 5 细胞的完全培养基中播种, 而不使用苯酚红色。
- 准备在 MEM 中连续稀释被测试的药物 (本例为 AZ4316), 辅以2% 的 FCS 和抗生素 (每口井 50μl)。在没有基质血管因子 (SVF) 和不含苯酚红色 (每口50微米) 的 MEM 中, 在 10, 000 Pu\ ml 处制备病毒悬浮液。
- 从96孔 HEp-2 板上取出培养基, 加入50Μl 的药物悬浮液和50μl 的病毒悬浮液 (一式三份)。作为控件并行执行模拟感染。
请注意:药物稀释和病毒悬浮液可以混合在细胞上, 也可以按顺序添加。 - 在37°c 和 5% co 2 下将板材培育 48小时.
- 测量荧光, 使用光谱仪荧光计, 如步骤5.1.4 中所述。使用模拟感染 HEp-2 细胞作为荧光背景水平的标准。
6. RSV-M1-GFP 重组病毒在体内 M2-1 局部化的表征
请注意:在无菌环境中, 使用二级安全柜执行步骤6.1 和6.2。
- 在全介质中准备 5x10 5 细胞的 HEp-2 细胞悬浮液.种子1.5 毫升的细胞悬浮液在一个35毫米培养皿的渗透, 并为二氧化碳,并适应现场成像。
- 如第 3.3-3.5 步所述, 在 MOI 1 用 rsv-m1-gfp 病毒播种后第二天进行感染 (取出培养基, 在1毫升接种器中添加 500Μl, 在37°c 孵育样品, 轻轻晃动 2小时; 取出接种物, 用2加入 1.5 mL% FCS)。在所需时间内, 在37°c 和 5% CO 2下培养细胞 (ibs 将从晚上10点开始出现)。
- 在37°c 条件下预热装有40x 至100x 目标的倒置显微镜的孵化室, 然后将含有受感染细胞的培养皿放置在舞台上。打开 CO2电源, 等待焦点稳定。
- 使用与 gfp 兼容的滤波器在低激发强度和图像频率 (每分钟1到0.1 图像) 下进行成像, 以最大限度地降低光毒性。
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Representative Results
在这项工作中, 我们描述了一个详细的协议, 以产生表达荧光蛋白的重组 RSV 病毒 (图 2)。在全球同步转法中, GFP 基因是在 P 基因和 M 基因之间引入的, 这在先前发表的研究21中对樱桃基因进行了描述。在 Prsv-m1-gfp 中, M2 基因没有被触及, 并在 SH 和 G 基因12之间插入了 m1-gfp 的附加基因编码。第一步与 bsrt毒5个细胞中病毒的抢救相对应,如图 2 a所示。在与 RSV-GFP 和 RSV-M1-GFP 救援相对应的井中, 可在72小时后观察到小群绿色荧光细胞。在接受 Rsv-gfp 感染的细胞的细胞质和细胞核中都可以观察到荧光信号, 这与游离 GFP 的表达相对应。相反, 在 RSV-M1-GFP 救援中, 可以观察到小的荧光细胞质点, 相当于 IBs 中的 M1-gfp 积累。通常在这一步中没有观察到 CPE (合胞、分离细胞)。相反, 在第二步, 对应于 HEp-2 细胞上的病毒扩增 (第一通道), CPE 在感染细胞中可见, 在72小时的时间里, 时间为 72小时 (图 2b)。图 3 a, B表现为 RSV 感染的强 cpe, 其特点是有大的合胞, 分离与否, 以及许多漂浮细胞。合胞和细胞均表现出明亮的绿色荧光。图 3A显示了感染 RSV-M1-GFP 病毒的细胞中细胞病理效应在24小时至72h 之间的演变。在24小时内, 在没有检测到 CPE 的情况下, 可以看到一些分散的荧光细胞。小的合胞 (荧光细胞簇) 和几个分离的细胞/合胞开始出现在48小时的时候, 大的荧光合胞和漂浮的细胞在72小时可见。
斑块滴定法的图片和与 RSV 生产全过程相对应的病毒滴度如图 5所示。对阴性对照进行斑块检测, 仅用 N、P、L 和 M2-1 的表达质粒转染, 在最低稀释时无斑块。如果抢救有效, 从转染细胞中获得的滴度预计将超过 100 Puum/l, 如图 5所示。然后, 滴度增加在段落, 达到 106-107 pu l 在段落1或 2.请注意, 两种重组病毒的病毒滴度相似。
细胞转染用 siRNA 靶向病毒蛋白 (N) 或两种细胞蛋白 (肌苷-5 '-单磷酸脱氢酶 [IMPDH] 和甘油醛 3 '-磷酸脱氢酶 [GAPDH]) 的 mRNA。细胞也被转染与非靶向 siRNA。图 6显示了使用 RSV-GFP 病毒对 sirna 处理的细胞进行 RSV 增殖的监测。在非靶向 siRNA 转染的对照细胞或用 sirna 转染的细胞对 Gapdh mrna 进行了观察和测量的强 transfected 信号 (图 6a)。相反, GFP 在表达 sirna 的 Nrna 靶向 N 或 IMPDH 的受感染细胞中的表达减少。请注意, 我们证实, 在 Rsv-gfp 感染细胞中, GFP 荧光信号在 48小时/小时与病毒剂量相关, 如先前类似的重组 RSV 表示樱桃 (Rsv-chry)21所示。为了评估 RSV 增殖的药物效率, HEp-2 细胞在不同药物浓度的情况下被 RSV-GFP 感染48小时。我们观察到 GFP 信号在药物浓度增加的情况下, 达到背景噪声 (在未感染的细胞上观察到信号) 的强烈下降, 如图 7所示。观测到的 AZD4316 的 IC50 约为 4 nM, 类似于针对不同 HRSV 菌株23的约 2-40 nm 的 Ec50。图 8和图 9 (电影1和电影2) 显示了对活细胞中 Ibs 和 ibag 动态的分析. IBs 表现为能够融合的移动球状结构, 形成更大的球形夹杂物。Ibag 是非常动态的。它们经历连续的组装拆卸周期, 形成小的 Ibag, 生长, 融合成大的 Ibag, 然后消失。
| 板材或烧瓶 | 将在前一天播种的 HEp-2 细胞 | 中体积 (毫升) | 病毒接种量 (毫升) |
| 150厘米2瓶 | 15 x 106 | 30 | 5 |
| 75厘米2瓶 | 7.5 x 106 | 15 | 3个 |
| 25厘米2瓶 | 2.5 x 106 | 5 | 1 |
| 6孔板 | 1 x 106 | 2 | 0。5 |
表 1: 不同烧瓶中使用的细胞数量和接种量。
图 1: 救援和放大步骤的原理图表示.将 N、P、L、M2-1 和 RSV 抗原基因组 rna 的表达载体转染为 BSRT\ 7 细胞 (抢救)。通过 T7 RNA 聚合酶表达抗原组 RSV rna 和 n、P、l 和 mRNA 的 mRNA。N、P、L 和 M2-1 蛋白复制和转录基因组 RNA, 引发病毒增殖周期。新的病毒粒子产生并繁殖, 产生 P0。然后在 HEp-2 细胞上扩增从抢救 (P0) 中提取的病毒, 以产生更高的滴度病毒悬浮液 (P1) (放大)。然后将其放大以获得病毒库存。请点击这里查看此图的较大版本.
图2:cpe 和在抢救 RSV-GFP 和 RSV-M1-GFP 过程中观察到的荧光模式.(A) 如图所示, 用反向遗传学载体转染 bsrtni 7 细胞, 在转染后72小时进行相反和荧光图像。负对照 (Neg Ctrl) 对应于在没有反向遗传载体的情况下, 用 n、P、L 和 M2-1 表达载体转染的细胞。(B) hep-2 细胞感染了从转染的 bsrt尚待7细胞 (零通道, 72小时转染后) 中感染的病毒, 并在感染后72小时拍摄图像。所显示的图像是代表性字段;刻度杆 = 100μm。盒装区域包含放大倍率显示的单元格;刻度栏 = 20μm. 请点击这里查看此图的较大版本.
图 3: 重组 RSV 扩增过程中观察到的 CPE 和荧光的演变.HEp-2 细胞在 0.01 Puu/细胞的 MOI 中感染 72小时, 第一次通过 (a) rsv-m1-gfp 或 (b) Rsv-gfp。在感染后24小时、48小时和72小时拍摄相位对比和荧光图像。所显示的图像是一个有代表性的字段;刻度杆 = 100μm。盒装区域包含放大倍率显示的单元格;刻度栏 = 20μm. 请点击这里查看此图的较大版本.
图 4: 用斑块法测定 RSV 滴度.(A) 12 孔板的斑块滴定试验结果。显示了六口被一种病毒性股票连续稀释感染的井。稀释用基-10 对数表示。感染了三种前稀释剂的细胞都是分离的。用 10-4、10-5和10-6稀释观察到的斑块数量是一致的。(B) 斑块枚举 (黄色编号) 的插图。绿色星表示电池层上的划痕。请点击这里查看此图的较大版本.
图 5: 获救和放大病毒的滴定.在12井板的 heup-2 细胞上检测的不同通道上的 Rsv-gfp 和 RSV-M1-GFP 的斑块表型 (图像显示了整个井)。随后段落的滴度如下表所示。将显示代表性数据。病毒的存货的稀释在基-10 对数被表明。请点击这里查看此图的较大版本.
图 6: siRNA 靶向 RSV n 或 IMPDH 抑制 RSV-GFP 表达.A549 细胞在 0.05 Psun 细胞的 Moi 上, 用针对 GAPDH (蓝棒)、RSV N (橙色酒吧) 或 IMPDH2 (绿色棒) 的对照法对 A549 细胞进行了48小时的治疗, 然后感染了 RSV-GFP。在感染后48小时内读取绿色荧光。(A) 在48小时的 Rsv-gfp 感染细胞的代表性图像, 用图片上看到的 sirna 处理。刻度杆 = 100μm (b) 数据是两个独立实验的平均值±sd, 共三份。请点击这里查看此图的较大版本.
图 7: AZD4136 化合物抑制 RSV-GFP 增殖.96孔板的 HEp-2 细胞在 AZD4316 化合物或对照 DMSO 连续稀释的情况下, 在 0.05 pusu 细胞的 MOI 处感染了 RSV-GFP。在每小时48小时读取绿色荧光的数据是两项独立实验的平均值±sd, 共三份。请点击这里查看此图的较大版本.
图 8: 通过时间间隔显微镜跟踪 Hep-2 感染细胞中的荧光蛋白 M1-gfp 对 IBs 动力学的分析.在 18小时, 用荧光显微镜在37°c 加热的室内, 每5分钟用荧光显微镜对细胞进行一次成像, 每次5小时。I b 是荧光的 (绿色), 因为它们承载着 M2-1-gfp, 而细胞核被知道有 Hoechst (蓝色)。白色箭头表示 IBs 正在进行融合。刻度栏 = 10μm. 请点击这里查看此图的较大版本.
图 9: 用时间间隔显微镜分析 RSV-M1-GFP 感染细胞中 Ibag 的动态.在 18小时, 用荧光显微镜在37°c 加热的室内对细胞进行成像。用绿色荧光对 M2-1-gfp 蛋白进行了可视化。白色箭头表示 IBs 正在经历 Ibag 的融合。刻度栏 = 5μm. 请点击这里查看此图的较大版本.
电影 1: 在体内分析 ibs 在 RSVA-M1-GFP 在 Hep-2 感染细胞中的动力学.在 18小时, 用荧光显微镜在37°c 加热的室内, 每5分钟对细胞进行一次成像, 时间为5小时。刻度杆 = 10μm。由此产生的电影显示了7个帧 (fps)。请点击这里观看此视频。(右键单击下载.
电影 2: RSV-M1-GFP 感染细胞中 Ibag 动力学的体内分析.在18小时的时间里, 用荧光显微镜在37°c 加热的室内中, 每5分钟成像一次细胞 3小时, 40分钟。刻度杆 = 2μm。生成的影片显示 4 fps。请点击这里观看此视频。(右键单击下载.
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Discussion
本文提出了一种从五种质粒中抢救重组 Rsv 并对其进行扩增的方法。操纵病毒基因组的能力使病毒学研究彻底改变了实验突变, 并表达了一个额外的基因或标记的病毒蛋白。我们在本文中描述并使用的 RSV 是一种病毒, 表达了记者基因, RSV-GFP (未出版), 并表达了一个 M2-1 蛋白融合到 GFP 标签12。RSV 救援具有挑战性, 需要练习。转染效率至关重要, 这取决于转染试剂的明智选择和转染协议的事先优化。使用表达噬菌体 T7 pol 的细胞是强制性的, 因为病毒 cDNA 被放置在 T7 pol 启动子的下游, 在大多数反向遗传载体。另一种方法是从疫苗辅助病毒中表达 T7 pol。然而, 使用细胞稳定表达 T7 pol 避免了分离这两种病毒的必要性, 并防止了疫苗可能干扰救援。重要的是要执行反向遗传 (P0 至 P1) 的第一通道, 而不冻结接种器, 以确保最大的救援效率。这意味着 MOI 不受控制。然而, 在这一步中, 滴度仍然很低, 导致第一个段落的 MOI 很低。为了获得具有高传染性滴度的 RSV 库存 (106-107 pu l), 重要的是等待强的 cpe, 并刮伤细胞以收集附着在细胞上的病毒颗粒.在这项研究中, 滴度在96小时后没有增加。病毒悬浮液的快速冷却对于保持高滴度很重要。而不是通过浸泡在酒精预浸在-80°c, 这也可以通过浸泡在干燥的冰/乙醇混合或液氮。添加保护溶液将确保病毒悬浮在-80°c 时的稳定性更长。在-80°c 下的储存是至关重要的, 因为病毒在-20°c 或液氮中储存时, 会迅速失去传染性。我们描述了在 HEp-2 细胞上的 RSV 扩增, 这是最流行的细胞系生长 RSV, 但它也能够在许多其他细胞系在体外有效生长。但是请注意, Vero 细胞上的生长可能会导致 G 表达24的改变。
我们描述了一个非常简单的协议, 使用微晶纤维素覆盖 RSV 的斑块滴定。至于所有的滴定检测, 它是敏感的污染与高滴度悬浮液, 需要仔细操作。传统的 RSV 滴定法使用琼脂糖或羧甲基纤维素 (CMC) 覆盖, 需要免疫染色和微观观察滴定法。描述了一种使用免疫扩散分级琼脂糖的治疗方案, 使斑块能够直接显示, 而无需免疫染色25。然而, HEp-2 细胞对加热琼脂覆盖非常敏感, 这使得该协议难以用于多种病毒滴定 (例如, 太热覆盖破坏细胞层);另一方面, 当它不够热的时候, 它在第一板块分布后就会凝固。Matrosovich 等人首次描述了使用微晶纤维素进行斑块检测的方法,用于甲型流感病毒滴定试验26。由于其低粘度, 微晶纤维素覆盖很容易分配和从板井中去除, 使其与96孔板兼容。因此, 它特别适用于血清学研究和药物敏感性分析。请注意, 由于微晶纤维素不需要加热, 药物可能很容易纳入覆盖。然而, 重要的是, 在孵化过程中, 板块保持完全静止;否则, 就会形成大的彗星状的焦点, 而不是圆形斑块。使用水晶紫罗兰色的斑块揭示是廉价和简单的, 但这种解决方案是有毒的, 必须适当处置。解决方案的回收利用限制了废物的产生。此外, 这种方法对细胞单层损伤很敏感, 这些损伤会出现作为不是病毒斑块的假白斑。图 4 (绿星) 显示了一个示例。为了防止这种偏差, 1) 细胞必须小心处理, 以避免划伤或冲洗细胞单层, (2) 抽吸和配药必须在同一地点进行, 以限制对一个已知区域的损害, (3) 可能会发现假白斑由于他们的形状 (不是球形), 他们尖锐的边缘, 和他们的位置。我们首先使用 avicel rn581, 因为之前出版了 21,26。然而, rr581 已不再可用, 我们成功地将其替换为 RC 581。为了使这一检测方法适应其他细胞病毒的结合, 必须根据病毒和细胞来确定微晶纤维素的浓度。过多的微晶纤维素可能对细胞有毒, 并导致小斑块, 过少会导致病毒在培养基中扩散。
我们描述了使用 RSV-GFP 病毒监测 RSV 增殖的两个例子: 在抗病毒药物存在或沉默细胞蛋白时。我们证明了 GFP 信号与病毒增殖有关。这里介绍的方法允许毫不费力地实时评估病毒乘法。它使科学家能够轻松地确定抗病毒药物的 IC50, 如图 7所示。重要的是, 这种测量可适应于在中型或宽带中使用, 特别是用于筛选化学图书馆。这种表达报告器的病毒也可能是有用的, 以评估细胞蛋白表达的调节对病毒增殖的影响。RNA 干扰是一个生物过程, 通过这种过程, 特定的 mRNA 在被 siRNA 特定识别后会降解, 从而减少或理想的情况下, 废除相应蛋白质27的表达。在这里给出的例子中, 通过监测 Rsv-gfp 感染细胞中的 GFP 信号强度, 我们评估了病毒核壳 (N) mRNA 或宿主 IMPDH mRNA 沉默对 RSV 增殖的影响。IMPDH2 是一种嘌呤生物合成酶, 它催化限制速率的步骤, 朝着 IMP28中的鸟嘌呤核苷酸的新生物合成方向发展。因此, 它是细胞内鸟嘌呤核苷酸池的调节剂。Impdh 抑制剂, 如利巴韦林, 对 rna 病毒有抑制作用, 包括 rsv 感染29,30,31。如图 6所示, 对 IMPDH 表达的抑制会削弱病毒增殖, 如 gfp 信号的减少所示, 类似利巴韦林对 RSV 生长的影响。同样, 病毒增殖几乎被废除在 siRNA 的存在, 针对病毒 N 蛋白。这一结果是意料之中的, 因为针对 N 蛋白的 siRNA 有望预防病毒核壳组装, 并已被证明会严重损害病毒复制32。通过雾化给这些 siRNA 抑制 RSV 随后感染健康的成年人33。N 或 IMPDH siRNA 的作用是特异性的, 因为作为对照基因选择的对 GAPDH 表达的抑制与非靶向 siRNA 相比, 不会损害病毒增殖。请注意, 在任何情况下都没有检测到细胞毒性。总之, 这些结果验证了这里提出的策略, 该战略可以通过 siRNA 库或其他淘汰赛方法 (如 CRISPR-CAS9 技术34) 扩大到高通量筛选。
表达融合荧光蛋白的重组病毒是研究病毒蛋白和病毒结构动力学的有力工具。RSV 表达荧光 M2-1 蛋白, 可观察 IBs 和 Ibag 的动力学。IBs, 这可以被认为是 RSV 病毒工厂, 出现作为球形动力结构。它们能够融合在一起形成更大的球形结构 (图 8和影片 1)。这些数据表明, RSV IBs 是液体细胞器, 类似于狂犬病毒35的描述。Iba 代表 IBs 内部的一个子隔间, 其中病毒 mRNA 和 mRNA 蛋白精矿 (如基因组 RNA、核壳和聚合酶) 仅存在于 IBs12的其余部分。视频显微镜实验表明, Ibag 是非常动态的结构, 显示液体特性 (图 9和电影 2)。它们可以被认为是液-液相变产生的液体隔间。
基因操纵病毒的可能性仍然是研究其繁殖机制及其对药物敏感性的首选工具。反向遗传学现在可以被认为是病毒学的 "经典" 技术的一部分。然而, 对于 RSV 等一些病毒来说, 这仍然是艰巨的。这就是为什么该协议详细介绍了成功抢救和放大重组 Rsv 的步骤。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者感谢来自美国马萨诸塞州波士顿 & 波士顿的秦宇博士提供了 AZD4316 药物。作者感谢 Cymages 平台, 以便访问 Scnr 奥林巴斯显微镜, 该显微镜得到了法兰西岛 (DIM one 健康) 地区的资助。作者感谢 INSERM 和凡尔赛圣昆廷大学的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm µ dish for live cell imaging | Ibidi | 81156 | |
| A549 | ATCC | ATCC CCL-185 | |
| Avicel RC-591 | FMC BioPolymer | Avicel RC-591 | Technical and other information on Avicels is available at http://www.fmcbiopolymer.com. Store at room temperature. Protocol in step 4 is optimized for this reagent. |
| BSRT7/5 | not commercially available | See reference 22. Buchholz et al. 1999 | |
| Crystal violet solution | Sigma | HT90132 | |
| Fluorescence microscope for observations | Olympus | IX73 Olympus microscope | |
| Fluorescence microscope for videomicroscopy | Olympus | ScanR Olympus microscope | |
| HEp-2 | ATCC | ATCC CCL-23 | |
| HEPES ≥99.5% | Sigma | H3375 | |
| L-Glutamine (200 mM) | ThermoFisher Scientific | 25030024 | |
| LIPOFECTAMINE 2000 REAGENT | ThermoFisher Scientific | 11668019 | Protocol in step 2.3. is optimized for this reagent. |
| MEM (10x), no glutamine | ThermoFisher Scientific | 11430030 | |
| MEM, GlutaMAX Supplement | ThermoFisher Scientific | 41090-028 | |
| MgSO4 ReagentPlus, ≥99.5% | Sigma | M7506 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | ThermoFisher Scientific | 51985-026 | |
| Paraformaldehyde Aqueous Solution, 32%, EM Grade | Electron Microscopy Sciences | 15714 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| Plasmids | not commercially available | See reference 21. Rameix-Welti et al. 2014 | |
| See Saw Rocker | VWR | 444-0341 | |
| Si RNA GAPDH | Dharmacon | ON-TARGETplus siRNA D-001810-10-05 |
SMARTpool and 3 of 4 individual siRNAs designed by Dharmacon. |
| Si RNA IMPDH2 | Dharmacon | ON-TARGETplus siRNA IMPDH2 Pool- Human L-004330-00-0005 |
SMARTpool of 4 individual siRNAs designed by Dharmacon. Individual references and sequences J-004330-06: GGAAAGUUGCCCAUUGUAA; J-004330-07: GCACGGCGCUUUGGUGUUC; J-004330-08: AAGGGUCAAUCCACAAAUU; J-004330-09: GGUAUGGGUUCUCUCGAUG; |
| Si RNA RSV N | Dharmacon | ON-TARGETplus custom siRNA | UUCAGAAGAACUAGAGGCUAU and UUUCAUAAAUUCACUGGGUUA |
| SiRNA NT | Dharmacon | ON-TARGETplus Non-targeting Pool | |
| SiRNA transfection reagent | Dharmacon | DharmaFECT 1 Ref: T-2001-03 | Protocol in steps 5.1.and 5.1.2 are optimized for this reagent. |
| Sodium Bicarbonate 7.5% solution | ThermoFisher Scientific | 25080094 | |
| Spectrofluorometer | Tecan | Tecan infinite M200PRO |
References
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