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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

Génération, Amplification et titrage du virus Syncytial respiratoires recombinants

Published: April 4, 2019 doi: 10.3791/59218
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 2, 1,3, 1,3
1UMR 1173 Institut national de la santé et de la recherche médicale (INSERM), Université de Versailles St. Quentin, 2UR892 Institut national de la recherche agronomique (INRA), Unité de virologie et immunologie moléculaires, 3Assistance Publique–Hôpitaux de Paris (AP-HP), Hôpital Ambroise Paré, Laboratoire de Microbiologie

Summary

Nous décrivons une méthode permettant de générer et amplifier les organismes génétiquement modifiés virus syncytiales respiratoires (RSVs) et un dosage de plaque optimisé pour RSVs. Nous illustrons ce protocole en créant deux virus recombinants qui sont respectivement permettent la quantification de la réplication de la RSV et analyse des corps d’inclusion de RSV et dynamiques associés à corps d’inclusion des granules en direct.

Abstract

L’utilisation de virus recombinants est devenu cruciale en virologie fondamentale ou appliquée. Génétique inverse s’est avérée pour être une technologie extrêmement puissante, tant pour décrypter les mécanismes de réplication virale et à étudier les antiviraux ou fournir la plate-forme de développement pour les vaccins. La construction et la manipulation d’un système génétique inverse pour un négatif-strand RNA virus comme un virus respiratoire syncytial (VRS), cependant, reste délicates et nécessite des savoir-faire spécial. Le génome de la RSV est un ARN monocaténaire, sens négatif d’environ 15 Ko qui sert de matrice pour viral replication RNA et transcription. Notre système de génétique inverse utilise une copie de cDNA du génome humain RSV souche longue (HRSV). Cet ADNc, mais aussi des CDNA codant pour des protéines virales de la polymérase complexe (L, P, N et M2-1), est placés dans des vecteurs d’expression individuelle en vertu de séquences de contrôle polymérase T7. La transfection de ces éléments dans les cellules de BSR-T7/5, qui expriment le stablement polymérase T7, permet la réplication cytoplasmique et la transcription de la RSV recombinante, donnant lieu à des virions génétiquement modifiées. Une nouvelle RSV, qui est présent à la surface cellulaire et dans le surnageant de culture de BSRT7/5, est recueillie pour infecter des cellules humaines de HEp-2 pour l’amplification virale. Deux ou trois rondes d’amplification sont nécessaires pour obtenir des stocks viraux contenant 1 x 106 à 1 x 107 unités de formation de plaques (PFU) / mL. Méthodes d’optimal de récolte, gel et titrage des stocks viraux sont décrites ici en détail. Nous illustrons le protocole présenté ici en créant deux virus recombinants exprimant respectivement gratuit protéine fluorescente verte (GFP) (RSV-GFP) ou virale M2-1 fusionnée à la GFP (RSV-M2-1-GFP). Nous montrons comment utiliser RSV-GFP pour quantifier la réplication RSV et la RSV-M2-1-GFP de visualiser les structures virales, ainsi que la dynamique de protéine virale dans des cellules vivantes, en utilisant des techniques de microscopie vidéo.

Introduction

VRS humaine est la principale cause d’hospitalisation chez les infections respiratoires aiguës dans les bébés dans le monde1. En outre, le VRS est associé à une morbidité importante dans comparable à la grippe, avec la plus grande partie de l’hospitalisation et la charge de mortalité dans les personnes âgées de2adultes. Il n’y aucun vaccins ou des antiviraux spécifiques disponibles encore contre RSV, mais promettant de nouveaux médicaments sont en développement3,4. La complexité et la lourdeur des techniques de quantification de la multiplication de la RSV font obstacle à la recherche d’antiviraux ou vaccins malgré des efforts considérables actuels. La quantification de la multiplication de RSV in vitro est généralement fondée sur des méthodes laborieux, longues et coûteux, qui consistent principalement en l’analyse de l’effet cytopathogène par microscopie, immunomarquage, réduction de la plaque essais, quantitatives la transcriptase inverse (EIR)-réaction en chaîne par polymérase (PCR) et les immuno-essais de dosage. Virus avec des génomes modifiés et exprimant des gènes rapporteurs, comme ceux codant pour la GFP, sont plus adaptés pour ces projections. Couplé à l’usage des lecteurs de plaques automatisé, virus recombinants porteurs de gène de journaliste peuvent faire ces dosages plus adapté à la normalisation et haut débit.

Le VRS est un virus à ARN sens négatif enveloppé, un qui appartient au genre Orthopneumovirus de la Pneumoviridae famille, ordre Mononegavirales5. Le génome de la RSV est un ARN monocaténaire, sens négatif d’environ 15 Ko, qui contient une région non codante aux extrémités 3' et 5' appelé Leader et remorque et 10 unités de transcriptionnelles codant des 11 protéines. Les gènes sont classés comme suit : 3'-NS1, NS2, N, P, M, SH, G, F, M2 (codant pour des protéines M2-1 et M2-2) et L-5'. L’ARN génomique est étroitement conditionné par la nucléoprotéine N. Using l’ARN génomique encapsidés comme gabarit, virale ARN polymérase ARN dépendante (RdRp) assurera la transcription et la réplication de l’ARN viral. RdRp virale est composé de la protéine grande L qui porte l’activité polymérase de nucléotide en soi, son cofacteur obligatoire la phosphoprotéine de P et la protéine M2-1 qui fonctionne comme une transcription virale facteur6. Dans les cellules infectées, RSV induit la formation d’inclusions cytoplasmiques appelées inclusions (IBs). Les inclusions cytoplasmiques morphologiquement semblables ont été observées pour plusieurs Mononegavirales7,8,9,10. Études récentes sur le virus rabique, virus de la stomatite vésiculaire (VSV), virus Ebola et RSV a montré que la synthèse de l’ARN virale s’effectue en IBs, qui peuvent ainsi être considérés comme usines virales8,9,11, 12. les usines de virus concentré l’ARN et des protéines virales requis pour la synthèse de l’ARN virale et contiennent également des protéines cellulaires13,14,15,16, 17. IBs présentent un plus fonctionnel appelé IB associées aux granules (IBAGs), qui concentrent la nouvellement synthétisée ARNm viral naissant ainsi que de la protéine M2-1. L’ARN génomique et le L, P et N ne sont pas détectés dans IBAGs. IBAGs sont de petites structures sphériques dynamiques à l’intérieur de l’ISB qui présentent les propriétés des organites liquide12. Malgré le rôle central de l’IBs dans la multiplication virale, on sait peu sur la nature, structure interne, formation et exploitation de ces usines virales.

L’expression du génome d’un poliovirus chez un ADNc a permis la production du premier clone virale infectieuse en 1981,18. Pour négatifs virus à ARN simple brin, ce n’est qu’en 1994 que la production d’un premier virus de la rage après transfection des plasmides dans les cellules19 a eu lieu. La première axée sur le plasmide inverse système génétique pour RSV a été publié en 1995,20. Génétique inverse ont conduit à des avancées majeures dans le domaine de la virologie. La possibilité d’introduire des modifications spécifiques dans le génome viral a fourni un aperçu critique de la réplication et la pathogenèse des virus à ARN. Cette technologie a également grandement facilité le développement de vaccins en permettant atténuation spécifique ciblés série de modifications. Modifications du génome qui permet un dosage rapide de multiplication virale grandement amélioré le contrôle antiviral et étude de leur mode d’action.

Bien que décrite précédemment, obtention d’organismes génétiquement modifiés RSVs reste délicate. Ici, nous détaillons un protocole pour créer deux types de recombinaison HRSV, exprimant respectivement RSV-GFP ou RSV-M2-1-GFP. Dans ce protocole, nous décrivons les conditions de transfection nécessaires pour secourir les nouveaux virus recombinants, ainsi que leur amplification afin d’obtenir des stocks viraux avec un titre élevé, adapté aux expérimentations reproductibles. La construction des vecteurs de la génétique inverse en soi n’est pas décrit ici. Nous décrivent les méthodes de récolte optimale et gel des stocks viraux. La méthode la plus précise pour mesurer les particules infectieuses virales reste essai de plaque. Cellules sont infectées par des dilutions successives de la suspension analysée et incubées avec une surcouche qui interdit la diffusion de particules virales libres dans le surnageant. Dans de telles conditions, le virus infectera seulement des cellules contiguës formant une « plaque » pour chaque particule infectieuse initial. Dans l’essai de titrage de RSV classique, les plaques sont révélés par immunomarquage et comptés sous observation microscopique. Cette méthode est coûteuse et fastidieuse. Ici, nous avons décrit un protocole très simple pour un essai de plaque RSV à l’aide de superposition de cellulose microcristalline qui permet la formation de plaques visibles à le œil nu. Nous montrons comment RSV-GFP permet de mesure RSV réplication et, partant, de quantifier l’impact des antiviraux. La combinaison génétique inverse et technologie de l’imagerie live, nous démontrons comment RSV-M2-1-GFP permet aux chercheurs de visualiser M2-1 dans des cellules vivantes et de suivre la dynamique des structures virales intracellulaires, comme IBs.

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Protocol

1. matérielle préparation

  1. Acheter des supports de la cellule (sérum réduit médias, minimales essentielles [MEM], 10 x MEM et Dulbecco de l’aigle modifié [DMEM]), réactif de transfection et cellulose microcristalline (voir Table des matières).
  2. Obtenir les vecteurs suivants de génétique inverse : la génomique vecteur (s) et les vecteurs d’expression codant pour la protéine N et les protéines complexe polymérase. Les vecteurs génomiques contiennent le génome complet cDNA du RSV-GFP (p-RSV-GFP) et du M2-RSV-1GFP (p-RSV-M2-1GFP) en aval de l’instigateur du bactériophage T7 RNA polymérase (pol T7). Les vecteurs d’expression (désigné comme p-N-p -P, p-L et p-M2-1) contient la séquence codante de N, P, L ou M2-1 en aval la pol T7 (voir Al. goudronneuse12 et al. Rameix-Welti21 pour plus de détails concernant les constructions de plasmide).
  3. Préparer les médias pour une culture de cellules dans un milieu stérile et pour la transfection et l’infection. Utilisation DMEM avec 2 mM de L-glutamine complétée avec 10 % de sérum de veau foetal (FCS), 1 000 unités/mL de pénicilline et la streptomycine 1 mg/mL (ou sans antibiotiques) et MEM avec 2 mM de L-glutamine additionné de 0 %, 2 %, soit 10 % de FCS, 1 000 unités/mL de pénicilline et 1 mg/mL streptomycine, désigné comme « milieu complet » dans le protocole suivant.
  4. Obtenir BSRT7/522 cellules et faire des stocks en milieu complet additionné de 10 % le diméthylsulfoxyde (DMSO) à 1 à 2 x 106 cellules/mL. Conserver les stocks de cellules dans l’azote liquide. Obtenir des cellules HEp-2. Culture BSRT7/5 cellules en DMEM complet et cellules HEp-2 en MEM complet à 37 ° C et 5 % de CO2 dans un environnement stérile.
  5. Préparer une solution de conservation du RSV 10 x (0,5 M HEPES et 1 M MgSO4 [pH 7.5] dans l’eau) dans un environnement stérile.
  6. Obtenir un microscope à fluorescence inversé compatible avec les mesures de fluorescence GFP et compatible avec l’imagerie direct s’il est nécessaire de surveiller une infection. Obtenir un lecteur de microplaques compatible avec les mesures de fluorescence GFP pour la quantification de la réplication de RSV-GFP.

2. le sauvetage et le premier Passage de Virus Recombinant

Remarque : Effectuez toutes les opérations suivantes dans un environnement stérile, à l’aide d’une classe de sécurité II.

  1. La veille de la transfection, préparer une suspension d’une lignée cellulaire BSRT7/5 à 5 x 105 cellules/mL dans le milieu complet. Distribuer 2 mL de suspension de cellules par puits dans une plaque 6 puits. Préparer un puits par des virus qui va être secourus et un puits supplémentaire pour le contrôle négatif. Incuber les plaques à 37 ° C et 5 % de CO2. Vérifiez que les cellules sont à une confluence de 80 à 90 % le lendemain.
  2. Dégeler les vecteurs (de l’étape 1.2) de la génétique inverse p-RSV-GFP et p-RSV-M2-1-GFP, ainsi que p-N-p -P, p-L et p-M2-1. Combinaison de chaque virus sauver, 1 µg de p-N et p -P, 0,5 µg de p-L, 0,25 µg de p-M2-1 et 1,25 µg de p-RSV (GFP ou GFP M2-1) dans un tube.
    Remarque : Vecteurs d’expression différents pour N, P, L et M2-1 peuvent être utilisés ; Toutefois, le rapport entre les protéines doit être maintenu. Effectuer le contrôle négatif en remplaçant le vecteur p-RSV avec un vecteur vide.
  3. Passez à la transfection, suivant le protocole du fabricant réactif transfection (voir Table des matières).
    1. Ajouter 250 µL de milieu de sérum réduit pour les vecteurs mixtes. Dans un autre tube, diluer 10 µL de réactif transfection dans 250 µL de milieu de sérum réduit. Doucement vortex tubes et attendre 5 min. mélanger le contenu des deux tubes et attendre 20 min à température ambiante.
    2. Rincer les cellules BSRT7/5 avec 1 mL de milieu de sérum réduit et distribuer 1,5 mL de MEM avec 10 % de FCS sans antibiotiques / puits. Si nécessaire, incuber à 37 ° C et 5 % de CO2 jusqu'à ce que l’incubation décrite à l’étape 2.3.1 est terminée.
    3. Ajouter 500 µL du mélange transfection préparé à l’étape 2.3.1 vers un puits lorsque le temps d’incubation de 20 min est terminée. Placer les cellules dans l’incubateur à 37 ° C et 5 % de CO2 pendant 3 jours. Ne modifiez pas le milieu de culture des cellules au cours de la transfection.
  4. Observer la fluorescence GFP (excitation à 488 nm) et l’émission à 515 – 535 nm sous un microscope à fluorescence inversé au grossissement x 20 1 x par jour pour surveiller l’efficacité de secours, à l’aide de la GFP filtrer.
  5. Le deuxième jour après la transfection, les semences des cellules pour le premier passage des virus secourues. Préparer une suspension de cellules HEp-2 à 5 x 105 cellules/mL dans le milieu complet. Distribuer 2 mL de suspension de cellules par puits dans une plaque de 6 puits (un puits par virus de sauvetage et un contrôle négatif).
  6. Le troisième jour de la transfection, les cellules gratter dans chaque puits de la plaque de 6 puits transfectée BSRT7/5, en utilisant un grattoir à différent pour chaque puits. Transférer le contenu de chaque bien (cellules et surnageant) dans un tube de microtubes stériles de 2 mL. Vortex chaque tube vigoureusement pendant au moins 30 s de libérer le virus sauvé de la membrane cellulaire.
    Remarque : Cela correspond au passage 0 (P0) du virus sauvé (Figure 1).
  7. Utiliser les frais en suspension virale P0 pour effectuer la première amplification des virus secourues.
    1. Enlever le milieu de culture de la plaque de 6 puits de HEp-2 graines la veille (voir l’étape 2.5) et rapidement ajouter 500 µL de la suspension de P0 (de l’étape 2.6) / puits. Placer la plaque de HEp-2 à 37 ° C sur une bascule de balançoire pour douce agitation pendant 2 h.
    2. Enlever et jeter les 500 µL d’inoculum et ajouter 2 mL de MEM avec 2 % FCS. Incuber les plaques à 37 ° C et 5 % de CO2 pendant 3 jours. Cela produira le premier passage (P1) des virus sauvés (Figure 1).
  8. Ajouter 1/10 du volume de solution de conservation x RSV 10 (0,5 M HEPES et 1 M MgSO4 [pH 7.5]) dans la suspension P0 restante (de l’étape 2.6). Vortex les microtubes vigoureusement pendant 5 s et partie aliquote le contenu dans des tubes cryogéniques étiquetés avec des tags antialcool. Plonger les tubes pendant au moins 1 h dans de l’alcool refroidi à-80 ° C et les stocker à-80 ° C.
  9. Titrer l’encours P0 (voir étape 2.6) de chaque virus sauvés (voir la section 4 pour le titrage de cellulose microcristalline).
  10. Observer la fluorescence GFP (excitation à 488 nm) et l’émission à 515 – 535 nm des cellules HEp-2 infectées par la suspension de P0 sous un microscope à fluorescence inversé à un grossissement de 20 x 1 x par jour pour contrôler l’infection. Observer sous un microscope à fond clair, l’apparition de petits syncytiums et détachement qui résulte de l’effet cytopathogène RSV (CPE) de la cellule (voir Figure 2).
  11. Notez que le sauvetage a échoué si fluorescence ni CPE est visible après 2 – 3 jours.
  12. Percevoir le premier passage (P1) au jour 3 ou 4 comme indiqué au point 2.6. En bref, gratter les cellules, recueillir les cellules et le surnageant ensemble, vortex, ajoutez la solution de conservation comme indiqué au point 2.8, aliquote de l’échantillon et le congeler.
  13. Titrer (voir la section 4 pour l’essai de titrage) et amplifient le premier passage (voir la section 3 pour l’amplification).

3. amplification des virus sauvés

Remarque : Le protocole suivant décrit l’amplification des virus sauvés dans une fiole de2 75 cm. Adapter la taille du ballon pour le volume nécessaire et la nécessaire multiplicité d’infection (MOI). Le tableau 1 indique les volumes pour différents ballons. Effectuez toutes les opérations suivantes dans un environnement stérile dans une classe de sécurité II.

  1. Préparer une suspension de cellules HEp-2 à 5 x 105 cellules/mL dans le milieu complet, le jour avant l’amplification. 15 mL de la suspension cellulaire par flacon de 75 cm2 de distribuer et incuber les flacons à 37 ° C et 5 % de CO2. Préparer une fiole par virus d’amplifier.
  2. Le jour après le début de l’incubation, vérifiez que les cellules sont confluents de 80 à 100 %.
  3. Diluer la suspension virale à l’étape 2.12 de MEM sans FCS pour obtenir une suspension de 3 mL à 50 000 UFP/mL (correspondant à un MOI de 0,01 PFU/cellule).
  4. Enlever le milieu et ajouter rapidement la suspension virale de 3 mL. Placer le ballon à 37 ° C sur une bascule de balançoire pour douce agitation pendant 2 h.
  5. Enlever et jeter l’inoculum et ajouter 15 mL de MEM avec 2 % FCS. Incuber à 37 ° C et 5 % de CO2 pour 2 à 4 jours.
  6. Vérifier la morphologie cellulaire et la fluorescence GFP (excitation à 488 nm) et l’émission à 515 – 535 nm sous un microscope à fluorescence inversé à un grossissement de 20 x afin d’estimer le bon moment pour récolter les virus. Notez que c’est généralement quand 50 % à 80 % de la couche de cellules HEp-2 est détachée en raison de la CPE RSV qui se produit entre 48 et 72 h après (p.i.) (voir la Figure 3).
  7. Grattez toutes les cellules à l’aide d’un grattoir de cellules. Rassembler les cellules et le surnageant et transférez-les dans un tube à centrifuger 50 mL.
  8. Ajouter 1/10 du volume des 10 x solution de conservation RSV (0,5 M HEPES et 1 M MgSO4 [pH 7.5]). Vortex les tubes vigoureusement pendant 5 s et clarifier la suspension par une centrifugation de 5 min à 200 x g.
  9. Transférer le surnageant dans un tube de 50 mL. Vortex brièvement et aliquote de la suspension dans des tubes cryogéniques étiquetés avec des tags antialcool. Plonger les tubes dans l’alcool rafraîchies-80 ° C pendant au moins 1 h et les stocker à-80 ° C.
  10. Libérer un des aliquotes de titrer la suspension virale (voir section 4).

4. plaque titrage dosage

  1. Préparer 12 plats pour le titrage le jour avant le test de titrage est réalisé (six puits seront requise pour titrer un tube de virus). Les semences des puits avec 1 mL de cellules HEp-2 à 5 x 105 cellules/mL dans le milieu complet.
  2. Le lendemain, préparer une suspension microcristalline stérile (2,4 % [p/v] dans l’eau) (voir la Table des matières).
    1. Disperse 2,4 g de poudre de cellulose microcristalline dans 100 mL d’eau distillée, à l’aide d’un agitateur magnétique standard, jusqu'à dissolution complète de la poudre (habituellement de 4 à 12 h). Autoclaver la suspension à 121 ° C pendant 20 min et conserver à température ambiante avant utilisation.
      Remarque : Dans ces conditions, la suspension est stable pendant 1 an.
    2. Après l’ouverture de la solution dans un environnement stérile, stockez-le à 4 ° C pendant 6 mois. Toujours mélanger la suspension avant de l’utiliser (en écriture tremblante ou vortex) pour vous assurer que c’est homogène.
  3. Préparer les 2 x MEM dans un environnement stérile. Diluer commercial MEM 10 x avec de l’eau stérile et ajouter L-glutamine, 1 000 unités/mL de pénicilline et la streptomycine 1 mg/mL. Vigoureusement la dilution et le stocker à 4 ° C.
    Remarque : Effectuez les étapes 4.4 – 4.10 dans un environnement stérile en utilisant une classe de sécurité II.
  4. Préparer six tubes contenant 900 µL de MEM sans FCS par virus à être titré (les tubes de titrage). Décongeler les aliquotes de virus, vortex eux vigoureusement pendant 5 s et transférer 100 µL au titrage du premier tube.
  5. Effectuer une dilution décuplé 6 x, comme suit. Ajouter 100 μL de virus à 900 μl de milieu dans le premier tube, mettre le bouchon sur le tube et mélanger son contenu au vortex pendant quelques secondes. Changer le cône sur la pipette, ajouter 100 µL de la première dilution à 900 µL de milieu dans le deuxième tube, mettre le bouchon sur le tube et vortex. Répétez la procédure jusqu'à ce que le tube de sixième.
    Remarque : Il est très important de changer le cône pour chaque dilution.
  6. Écrire le virus nom et des dilutions de pli sur les plaques de 12 puits de HEp-2. Ajouter une marque pour correspondre à la plaque et sa couverture car ils peuvent être séparés au cours de la coloration (étape 4,9). Retirer le support des plaques et distribuer 400 µL d’une dilution par puits. Incuber les plaques à 37 ° C pendant 2 h, pour l’adsorption du virus.
    Remarque : Changer l’embout de la pipette entre chaque inoculum ou passer du plus bas à la concentration la plus élevée avec le même embout. Ensemencer une série limitée de planches (1 à 2) en même temps pour éviter les séchage des cellules.
  7. Préparer la superposition de cellulose microcristalline lors de l’adsorption du virus (préparation extemporanée). Pour obtenir 100 mL de superposition, mélanger 10 mL de suspension microcristalline de 2,4 %, 10 mL de 2 x MEM et 80 mL de MEM avec 2 % FCS.
    1. Ajuster le pH de la 2 x MEM pour environ 7,2 avec une solution de bicarbonate de sodium stérile à 7,5 %, suite à l’indicateur de couleur. Ajouter la suspension microcristalline et la MEM et mélanger vigoureusement.
  8. À la fin de l’incubation de 2 h, ajouter 2 à 3 mL de superposition dans chaque loge des plaques de 12 puits sans enlever l’inoculum. Veillez à éviter la contamination des puits adjacents avec inocule titre viral élevé. Incuber les plaques à 37 ° C et 5 % de CO2 pendant 6 jours. Ne déplacez pas la plaque et ne déplacez pas l’incubateur durant l’incubation.
  9. Faire colorer les cellules, en utilisant une solution de cristal violet (violet de gentiane 8 % [v/v], 2 %, formaldéhyde [v/v] et [v/v] 20 % d’éthanol dans l’eau).
    1. Protéger la surface de travail de la biosécurité du cabinet avec une feuille (le violet de gentiane couleurs fortement les surfaces).
    2. Secouer doucement les plaques à décoller de la superposition de la cellulose microcristalline. Retirez les surnageants et laver les cellules 2 x avec 1 x solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Manipulez les plaques une par une afin d’éviter les cellules de séchage. Ajouter 1 à 2 mL de la solution de violet de gentiane et attendez 10 à 15 min. retirer la solution, qui peut être réutilisée pour la coloration de la plaque ultérieur.
    3. Immerger les plaques et les couvercles dans l’eau de Javel fraîche pendant quelques secondes et, ensuite, laver soigneusement avec l’eau du robinet. Notez que les plaques et les couvertures sont décontaminés par l’eau de Javel.
    4. Mettre les plaques et les couvercles sur du papier absorbant et laissez-les sécher. Sécher les plaques à une température ambiante après le rinçage de l’eau et les stocker à température ambiante. Pour les longues périodes d’entreposage (mois), garder les plaques à l’abri de la lumière pour protéger la couleur. Notez que si les cellules perdent leur coloration, elles peuvent être tachées nouveau cristal violet.
  10. Calculer les titres de virus. Compter les plaques dans les puits des plaques sèches, qui sont visibles à le œil nu. Vérifiez que le nombre de plaques des dilutions différentes est cohérente (facteur 10 entre chaque dilution). Choisissez le puits où les plaques sont les plus faciles à compter. Évaluer le nombre de plaques par rapport au volume de l’inoculum et la dilution.
    Remarque : Sur l’exemple fourni dans la Figure 4, 21 plaques sont comptés à la dilution de 10-5 . Ils correspondent à un titre de
    Equation
    Equation

5. l’utilisation de Virus Recombinant HRSV-GFP pour surveiller la réplication virale dans les cellules traitées avec les petits ARN interférents ou antiviraux

Remarque : Exécutez toutes les étapes sauf 5.1 et 5.2.5 dans un environnement stérile en utilisant une classe de sécurité II.

  1. Surveiller l’effet du gène cellulaire silencieux sur la multiplication de RSV
    Remarque : Le protocole de transfection dépend du réactif (voir Table des matières).
    1. Préparer les plaques à 96 puits pour la mesure de la GFP. Deux jours avant le dosage, pour compte tenu des petits ARN interférents (siARN), préparer une solution de support réduits de sérum contenant des siARN à une concentration de 100 nM et un réactif de transfection de siARN dilué au 1/500. Incuber la solution pendant 30 min à température ambiante.
    2. Ajouter 25 µL de la solution dans les puits de la plaque préparée en 5.1.1 (en triple exemplaire). Ensemencez les puits avec 75 µL d’une suspension de cellules A549 à 4 x 105 cellules/mL dans le milieu complet sans antibiotiques pour obtenir une concentration finale de cellule de 3 x 105 cellules/mL. Incuber les plaques pendant 48 h à 37 ° C et 5 % de CO2.
      Remarque : La concentration finale de siARN est 25 nM et le volume de réactif de transfection final est 0,5 µL/puits).
    3. Infectent les cellules comme suit. Retirer le support des puits. Ajouter 100 µL de la suspension de la RSV-GFP à 50 000 UFP/mL et incuber pendant 2 h à 37 ° C et 5 % de CO2. Supprimer la suspension virale et ajouter 100 µL de DMEM avec 2 % FCS et sans rouge de phénol. Incuber les plaques à 37 ° C et 5 % de CO2.
    4. À 24 h et 48 h p.i., mesurer la fluorescence, à l’aide d’un spectrofluorimètre définie sur des longueurs d’onde d’excitation et d’émission de 488 et 520 nm, respectivement (fluorescence est exprimée en unités de fluorescence relative). Utiliser des cellules A549 infectés comme étalons pour les niveaux de fluorescence et d’arrière-plan.
      Remarque : Les cellules doivent être fixés avec 4 % de paraformaldéhyde (PFA) avant de les mesurer sans le couvercle de la plaque.
  2. Évaluation de l’inhibition de la drogue à l’aide de RSV-GFP
    1. Préparer les plaques à 96 puits pour la mesure de la GFP. Le jour avant le dosage, les semences des puits avec 100 µL d’une suspension de cellules HEp-2 à 5 x 105 cellules/mL dans le milieu complet sans rouge de phénol.
    2. Préparer une dilution en série de la testé (AZ4316 dans cet exemple) de la drogue en MEM complété avec 2 % FCS et antibiotiques (50 µL / puits). Préparer une suspension virale à 10 000 UFP/mL en MEM sans facteur vasculaire stromal (SVF) et sans rouge de phénol (50 µL / puits).
    3. Retirer le support de la 96 puits HEp-2 plaque et ajouter 50 µL de la suspension de la drogue et 50 µL de la suspension virale (en triple exemplaire). Effectuer une infection simulée en parallèle comme un contrôle.
      Remarque : La dilution de la drogue et de la suspension virale peuvent être mélangés avant de les ajouter sur les cellules, ou ils peuvent être ajoutés dans l’ordre.
    4. Incuber les plaques pendant 48 h à 37 ° C et 5 % de CO2.
    5. Mesurer la fluorescence, à l’aide d’un spectrofluorimètre comme indiqué au point 5.1.4. Utiliser mock-infecté les cellules HEp-2 comme des normes pour les concentrations de fond de fluorescence.

6. caractérisation des M2-1 localisation In Vivo avec le Virus Recombinant RSV-M2-1-GFP

Remarque : Exécutez les étapes 6.1 et 6.2 dans un environnement stérile, à l’aide d’une classe de sécurité II.

  1. Préparer une suspension de cellules HEp-2 à 5 x 105 cellules/mL dans le milieu complet. Graine de 1,5 mL de la suspension cellulaire dans un 35 mm boîte de pétri perméants de CO2 et adaptées pour vivre d’imagerie.
  2. Effectuer l’infection le jour après l’ensemencement avec le virus RSV-M2-1-GFP au MOI 1, comme décrit aux points 3.3 à 3.5 (enlever le milieu, ajouter 500 µL à 1 mL de l’inoculum et incuber les échantillons à 37 ° C en agitant doucement pendant 2 h ; enlever l’inoculum et ajouter 1,5 mL de MEM avec 2 % FCS). Incuber les cellules à 37 ° C et 5 % de CO2 pendant le temps désiré (IBs commencera à apparaître depuis 10 h p.i.).
  3. Préchauffer la chambre d’incubation d’un microscope inversé équipé de 40 x 100 objectifs x à 37 ° C, avant de placer la boîte de pétri contenant les cellules infectées sur la scène. Ouvrez l’alimentation en CO2 et d’attendre pour la stabilisation de la mise au point.
  4. Effectuer d’imagerie avec des filtres de GFP-compatible, sous une fréquence d’excitation faible intensité et de l’image (de 1 à 0,1 image / min) pour minimiser la phototoxicité.

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Representative Results

Dans cet ouvrage, nous décrit un protocole détaillé pour produire des virus recombinants de RSV, exprimant une protéine fluorescente (Figure 2). Au pRSV-GFP, le gène de la GFP a été introduit entre les gènes P et M, comme pour le gène cerise en œuvre précédemment publiée21. Dans le pRSV-M2-1-GFP, le gène M2 a été laissé intact et un gène supplémentaire codant pour M2-1-GFP a été inséré entre SH et G gènes12. La première étape, correspondant à la rescousse du virus dans les cellules BSRT7/5, est montrée dans la Figure 2 a. Petits amas de cellules fluorescentes vertes ont été posttransfection h 72 visible dans les puits correspondant à un sauvetage RSV-GFP et RSV-M2-1-GFP. Le signal fluorescent a pu être observé dans le cytoplasme et de noyaux dans les cellules infectées par RSV-GFP, correspondant à l’expression de la GFP gratuite. En revanche, dans le sauvetage de RSV-M2-1-GFP, petits points cytoplasmiques fluorescents pourraient être respectés, correspondant à l’accumulation de M2-1-GFP dans IBs. Généralement aucun ECP (syncytium, cellules individuelles) n’on observe à cette étape. À l’inverse, au cours de la deuxième étape, correspondant à une amplification du virus (premier passage) sur cellules HEp-2, le CPE a été visible dans les cellules infectées à 72 h p.i. (Figure 2 b). Figure 3 a B montre la forte CPE de l’infection par le VRS, caractérisé par la grandes syncytiums, jumelées ou non et de nombreuses cellules flottants. Syncytiums et les cellules exposées à fluorescence vert vif. La figure 3 montre l’évolution de l’effet cytopathique entre 24 et 72 h p.i. dans les cellules infectées par le virus RSV-M2-1-GFP. Quelques cellules fluorescentes dispersées étaient visibles à p.i. 24h sans un CPE détectable. Petits syncytiums (amas de cellules fluorescentes) et quelques cellules/syncytiums détachés a commencé à apparaître au grand fluorescent syncytiums de 48 h p.i. et cellules flottantes étaient clairement visibles à 72 h p.i.

Photos de plaque titrage dosage et des titres viraux correspondant à l’ensemble du processus de production du RSV sont indiqués à la Figure 5. Réalisation de l’essai de plaque sur le témoin négatif, transfecté avec seulement des plasmides d’expression de N, P, L et M2-1, a révélé aucune plaque à la dilution la plus faible. Les titres obtenus par les cellules transfectées étaient censés être au-dessus de 100 UFP/mL si le sauvetage a été efficace, comme illustré à la Figure 5. Ensuite, les titres a augmenté au fil des passages, pour atteindre 106– 107 UFP/mL au passage 1 ou 2. Notez que les titres viraux étaient similaires entre les deux virus recombinants.

Les cellules ont été transfectées avec des siARN ciblant l’ARNm d’une protéine virale (N) ou de deux protéines cellulaires (inosine-5'-monophosphate déshydrogénase [IMPDH] et glycéraldéhyde 3'-phosphate déshydrogénase [GAPDH]). Aussi, cellules ont été transfectées avec des siARN nontargeting. La figure 6 illustre le contrôle de la multiplication de RSV à l’aide de virus RSV-GFP sur cellules traitées siRNA. Un signal fort de la GFP a été observé (Figure 6 a) et mesurée (Figure 6 b) sur les cellules contrôle transfectées avec des siARN nontargeting ou cellules transfectées avec le siARN contre l’ARNm GAPDH. En revanche, l’expression de la GFP a été diminuée dans les cellules infectées exprimant les siARN ciblant N ou IMPDH. Notez que nous avons vérifié que le signal fluorescent GFP dans les cellules infectées par RSV-GFP à 48h p.i. était corrélé à la dose virale tel que démontré précédemment pour une semblable RSV recombinant exprimant Cherry (RSV-Cherry)21. Afin d’évaluer l’efficacité de la drogue sur la multiplication de RSV, cellules HEp-2 ont été infectés par RSV-GFP pendant 48 h en présence de diverses concentrations du médicament. Nous avons observé une forte diminution du signal GFP, qui atteint le bruit de fond (il y avait un signal observé sur les cellules non infectées), en présence d’une concentration accrue de drogues, comme illustré à la Figure 7. L’IC50 observée pour AZD4316 a été d’environ 4 nM, semblable à la CE50 publiées d’environ 2 à 40 nM contre différents HRSV souches23. L’analyse de la dynamique de l’IBs et IBAGs dans les cellules vivantes, grâce à RSV-M2-1-GFP, sont indiquées dans la Figure 8 et Figure 9 (et Movie 1 et 2 de film). IBs apparaissent comme des structures sphériques mobiles capables de fusionner, formant une plus grande inclusion sphérique. IBAGs sont très dynamiques. Ils subissent des cycles de montage-démontage continue avec la formation de petits IBAGs qui poussent, fusible en grandes IBAGs et puis disparaissent.

Plaque ou fiole Cellules HEp-2 pour l’ensemencement la veille Volume moyen (mL) Volume d’Inoculum de virus (mL)
fiole de2 150 cm 15 x 106 30 5
fiole de2 75 cm 7,5 x 106 15 3
flacon de 25 cm2 2,5 x 106 5 1
plaque 6 puits 1 x 106 2 0,5

Tableau 1 : Nombre de cellules et le volume d’inoculum à utiliser dans des flacons différents.

Figure 1
Figure 1 : représentation schématique des étapes de sauvetage et amplification. Transfection du vecteur d’expression de l’ARN antigenomic N, P, L, M2-1 et RSV dans BSRT5/7 cellules (sauvetage). Expression de l’ARN RSV antigenomic et de l’ARNm de N, P, L et M2-1, par l’ARN polymérase T7. Les protéines M2-1, L, N et P répliquent et transcrivent l’ARN génomique, entamer un cycle de multiplication virale. Nouvelles particules virales sont produites et se multiplient, donnant naissance à la P0. Le virus récolté à la rescousse (P0) est alors amplifié sur cellules HEp-2 pour obtenir une suspension virale supérieure de titre (P1) (Amplification). C’est alors amplifié pour obtenir des stocks viraux. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : CPE et le patron de fluorescence observée lors du sauvetage de RSV-GFP et RSV-M2-1-GFP. (A) BSRT5/7 cellules ont été transfectées avec des vecteurs de la génétique inverse, comme il est indiqué, et des images à contraste de phase et de fluorescence ont été prises après 72 h posttransfection. Le contrôle négatif (Neg Ctrl) correspond aux cellules transfectées avec les vecteurs d’expression de N, P, L et M2-1 sans le vecteur génétique inverse. (B) les cellules HEp-2 ont été infectés par le virus récolté dans les cellules transfectées de BSRT5/7 (le zéro passage, posttransfection 72 h) et les images ont été prises 72 h postinfection. Les images montrées sont des champs représentatifs ; Echelle = 100 µm. La zone boxed renferme des cellules montrés dans le grossissement ; Echelle = 20 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Evolution de la CPE et la fluorescence observée au cours de l’amplification du VRS recombinante. Cellules HEp-2 ont été infectés à un MOI de 0,01 PFU/cellules pendant 72 h avec le premier passage de RSV-M2-1-GFP de (A) ou (B) RSV-GFP. Contraste de phase et de fluorescence des images ont été prises à 24h, 48 h et 72 h postinfection. Les images montrées sont d’un champ représentatif ; Echelle = 100 µm. La zone boxed renferme des cellules montrés dans le grossissement ; Echelle = 20 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : détermination du titre RSV à l’aide de l’essai de plaque. (A) les résultats de l’essai de titrage de plaque dans une plaque de 12 puits. Six puits infectés par des dilutions successives d’un seul stock virale sont indiqués. Les dilutions sont indiquées dans un logarithme en base 10. Cellules infectées par les trois premières dilutions sont toutes individuelles. Le nombre de plaques observées avec le 10-4, 10-5, et 10-6 dilutions sont compatibles. (B) Illustration de l’énumération de plaque (valeurs en jaune). L’étoile verte indique les rayures sur la couche de cellules. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : titrage d’un virus sauvé et amplifié. Phénotypes de la plaque de la RSV-GFP et RSV-M2-1-GFP dans les différents passages dosés sur cellules HEp-2 dans une assiette de 12 puits (les images montrent la totalité des puits). Les titres des passages ultérieurs sont indiquées dans le tableau. Des données représentatives sont indiquées. Les dilutions des stocks virus sont indiquées dans un logarithme en base 10. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : l’Inhibition de l’expression de la RSV-GFP de siARN ciblant RSV N ou IMPDH. Les cellules A549 ont été traitées avec le siARN nontargeting contrôle (NT) (barre bleu clair) ou siRNA ciblant GAPDH (barre bleue), RSV N (barre orange) ou IMPDH2 (barre verte) pendant 48 h et puis infectés par le RSV-GFP à un MOI de 0,05 PFU/cellule. La fluorescence verte a été lu 48 h après l’infection. (A) les images représentant des cellules infectées par RSV-GFP à 48 h p.i., traitées avec des siARN, comme on le voit sur les photos. Echelle = 100 µm. les données (B) sont la moyenne ± écart-type de deux expériences indépendantes, effectuées en trois exemplaires. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 7
Figure 7 : Inhibition de la multiplication de RSV-GFP par composé de AZD4136. Les cellules HEp-2 plaques de 96 puits étaient infectés par le RSV-GFP à un MOI de 0,05 PFU/cellule en présence de dilutions successives du composé AZD4316 ou contrôle DMSO. La fluorescence verte a été lu à 48 h p.i. que données sont la moyenne ± écart type des deux expériences indépendantes, effectuées en trois exemplaires. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 8
Figure 8 : analyse de la dynamique de l’IBs, grâce au suivi de la protéine fluorescente M2-1-GFP dans des cellules HEp-2-infecté par microscopie de laps de temps. À 18 h p.i., les cellules ont été photographiés toutes les 5 min pendant 5 h avec un microscope à fluorescence, dans une chambre chauffée à 37 ° C. L’IBs sont fluorescents (vert), parce qu’ils hébergent M2-1-GFP et les noyaux sont colorés avec Hoechst (bleu). Les flèches blanches indiquent IBs en cours de fusion. Echelle = 10 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 9
Figure 9 : analyse de la dynamique des IBAGs en RSV M2-1-GFP-cellules infectées par microscopie de laps de temps. À 18 h p.i., les cellules ont été photographiés avec un microscope à fluorescence, dans une chambre chauffée à 37 ° C. La protéine M2-1-GFP a été visualisée par fluorescence verte. Les flèches blanches indiquent IBs subissant une fusion de IBAGs. Echelle = 5 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Movie 1
Movie 1 : analyse In vivo de la dynamique d’IBs en RSV-M2-1-GFP dans les cellules infectées par HEp-2. À 18 h p.i., cellules ont été photographiés toutes les 5 min pendant 5 h avec le microscope à fluorescence, dans une chambre chauffée à 37 ° C. Echelle = 10 µm. Le film qui en résulte montre 7 images/s (fps). S’il vous plaît cliquez ici pour voir cette vidéo. (Clic droit pour télécharger.)

Movie 2
Movie 2 : analyse In vivo de la dynamique des IBAGs en RSV-M2-1-GFP-cellules infectées par. À 18 h p.i., cellules ont été photographiés toutes les 5 min pendant 3 h et 40 min en microscopie de fluorescence, dans une chambre chauffée à 37 ° C. Echelle = 2 µm. Le film qui en résulte montre 4 images par seconde. S’il vous plaît cliquez ici pour voir cette vidéo. (Clic droit pour télécharger.)

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Discussion

Nous présentons ici une méthode de sauvetage de recombinant RSVs de cinq plasmides et leur amplification. La possibilité de manipuler le génome du virus a révolutionné la recherche virologie afin de tester des mutations et exprimer un gène additionnel ou une protéine virale étiquetée. La RSV, nous avons décrit et utilisé comme un exemple de cet article est un virus exprimant un gène rapporteur, la RSV-GFP (inédit) et exprime une protéine M2-1 fusionnée à la GFP tag12. Sauvetage de RSV est un défi et exige la pratique. L’efficacité de la transfection est critique, selon un choix judicieux du réactif de transfection et une optimisation préalable du protocole de transfection. L’utilisation des cellules exprimant la pol de T7 bactériophage est obligatoire parce que l’ADNc viral est placé en aval du promoteur de pol T7 dans la plupart du vecteur génétique inverse. Une alternative consiste à exprimer la pol T7 d’un virus de la vaccine d’assistance. Cependant, l’utilisation de cellules exprimant de manière stable la pol T7 évite la nécessité de séparer les deux virus et empêche les interférences possibles de la vaccine à la rescousse. Il est important d’effectuer la première traversée de l’inverse génétique (P0 à P1) sans geler l’inoculum pour assurer une efficacité maximale de sauvetage. Cela implique que le MOI n’est pas contrôlée. Cependant, à cette étape, les titres restent très faibles, ce qui entraîne un faible MOI pour le premier passage. Pour obtenir des stocks de RSV avec des titres infectieux élevés (6– 10 107 UFP/mL), il est important d’attendre un CPE fort et à gratter les cellules afin de recueillir les particules virales attachés aux cellules. Dans cette étude, les titres n’ont pas augmenté après 96 h p.i. Le refroidissement rapide de la suspension virale est important de maintenir des titres élevés. Plutôt de par une immersion dans l’alcool refroidi à-80 ° C, cela peut aussi être réalisé par immersion dans un mélange de glace sèche/éthanol ou dans l’azote liquide. L’ajout de la solution de conservation permettra d’assurer une plus grande stabilité de la suspension virale à-80 ° C. Le stockage à-80 ° C est critique, puisque le virus va vite perte son infectiosité lorsqu’il est conservé à-20 ° C ou dans l’azote liquide. Nous avons décrit l’amplification RSV sur cellules HEp-2, qui est la plus populaire lignée cellulaire de croître RSV, mais il est également capable de croître efficacement sur nombreux autres lignées cellulaires in vitro. Notez, cependant, que la croissance sur des cellules Vero peut entraîner une altération dans l’expression de G24.

Nous avons décrit un protocole très simple de titration de la plaque de la RSV à l’aide d’une superposition de cellulose microcristalline. Comme pour tous les essais de titrage, il est sensible à la contamination avec des suspensions de titre élevé, qui nécessitent une manipulation minutieuse. Conventionnel RSV titrage dosages utilisent d’agarose ou carboxyméthyl superpositions de cellulose (CMC) et nécessitent un immunomarquage et observations microscopiques pour détermination du titre. Un protocole utilisant immunodiffusion grade d’agarose a été décrite en permettant la visualisation directe des plaques sans immunostaining25. Toutefois, les cellules HEp-2 sont très sensibles à une gélose chauffée, qui rend ce protocole difficile à utiliser pour plusieurs titrages de virus (p. ex., une superposition trop chaude détruit la couche de cellules) ; en revanche, quand il est ne pas assez chaud, elle se solidifie après la première distribution de plaque. L’utilisation de la cellulose microcristalline pour un dosage de la plaque a été tout d’abord décrite par Matrosovich et coll. pour une grippe A virus titrage dosage26. Grâce à sa faible viscosité, la superposition de cellulose microcristalline est facile à distribuer et à retirer du puits de la plaque, rendant compatibles avec les plaques de 96 puits. Ainsi, il est particulièrement adaptable à sérologiques études et analyses de sensibilité de drogues. Notez que les médicaments peuvent être incorporés dans la superposition puisque cellulose microcristalline n’a pas besoin d’être chauffé, facilement. Toutefois, il est important que les plaques de restent parfaitement immobile pendant l’incubation ; Sinon, gros foyers en forme de comète seront formera au lieu de plaques rondes. Révélation de plaque à l’aide de violet de gentiane est simple et peu coûteuse, mais cette solution est toxique et doit être correctement éliminés. Le recyclage de la solution limite la production de déchets. En outre, cette méthode est sensible aux dommages de monocouche de cellules qui apparaissent comme fausses taches blanches qui ne sont pas des plaques virales. Un exemple est illustré à la Figure 4 (étoile verte). Pour éviter ce biais, cellules 1) doivent être manipulées avec précaution pour éviter de rayer ou de rinçage de la monocouche cellulaire, 2) aspiration et distribution toujours ont fait au même endroit pour circonscrire les dégâts à un domaine connu, 3) fausses taches blanches peuvent être identifiées Grâce à leur forme (non sphérique), leurs arêtes vives et leur position. Tout d’abord, nous avons utilisé Avicel RC 581, comme précédemment publié21,26. Toutefois, le 581 RC n’est plus disponible, et nous avons remplacé avec succès par RC 591. Pour adapter ce test aux autres couples de cellule/virus, la concentration de cellulose microcristalline doit être déterminée selon le virus et les cellules. Trop cellulose microcristalline peut être toxique pour les cellules et conduit à petites plaques, trop peu conduira à la diffusion du virus dans le milieu.

Nous avons décrit deux exemples d’utilisation du virus RSV-GFP pour surveiller la multiplication de la RSV : en présence d’un médicament antiviral ou quand faire taire une protéine cellulaire. Nous avons démontré que le signal de la GFP est corrélé avec la multiplication virale. La méthode présentée ici permet d’évaluer sans effort de la multiplication virale en temps réel. Il permet aux scientifiques de déterminer facilement la CI50 d’un médicament antiviral, comme illustré à la Figure 7. Ce qui est important, cette mesure est adaptable pour utilisation en milieu ou haut débit, en particulier pour le criblage de bibliothèques chimiques. Ce virus exprimant le journaliste peut également être utile pour évaluer l’effet sur la multiplication du virus d’une modulation de l’expression des protéines cellulaires. L’interférence ARN est un processus biologique par lequel un ARNm spécifique est dégradé suite à sa reconnaissance spécifique de siARN, réduisant ou, idéalement, abolissant l’expression des protéines correspondantes27. Dans l’exemple donné ici, en surveillant l’intensité du signal GFP dans les cellules infectées par RSV-GFP, nous avons évalué l’impact de la mise sous silence de la nucléocapside virale (N) ARNm ou l’hôte IMPDH ARNm sur la multiplication de la RSV. IMPDH2 est une enzyme biosynthétique de purine qui catalyse une étape limitante vers la biosynthèse de novo des nucléotides de la guanine de IMP28. C’est donc un régulateur de la piscine de nucléotide guanine intracellulaire. Inhibiteurs de l’IMPDH, tels que la ribavirine, exercent des effets inhibiteurs sur les virus à ARN, dont RSV infection29,30,31. Comme illustré à la Figure 6, l’inhibition de l’expression de l’IMPDH altère la multiplication virale comme indiqué par la réduction du signal GFP, imitant les effets de la ribavirine sur la croissance de la RSV. De même, la multiplication virale est presque abolie en présence de siARN ciblant la protéine virale de N. Ce résultat était attendu puisque siARN ciblant la protéine N était censée empêcher la nucléocapside virale Assemblée et s’est avéré pour fortement nuire à32de la réplication virale. L’administration de ces siARN par nébulisation inhibe l’infection subséquente par RSV dans les adultes en bonne santé,33. L’effet du siRNA N ou IMPDH est spécifique puisque l’inhibition de l’expression de GAPDH, choisie comme un gène contrôle, n’altère pas la multiplication virale par rapport à des siARN nontargeting. Notez qu’aucune toxicité cellulaire a été détectée dans toutes les conditions. Pris ensemble, ces résultats valident la stratégie présentée ici, qui pourrait faire jusqu'à évoluer à haut débit de dépistage à l’aide de siARN bibliothèques ou autres méthodes de masquage, comme CRISPR-Cas9 technologie34.

Des virus recombinants exprimant une protéine fluorescente fusion représentent des outils puissants pour étudier la dynamique de structures virales et de protéines virales. RSV exprimant une protéine fluorescente de M2-1 permet l’observation de la dynamique de l’IBs et de IBAGs. IBs, qui peuvent être considérées comme usines virales RSV, apparaissent comme des structures dynamiques sphériques. Ils sont capables de fusionner pour former des structures plus grandes sphérique (Figure 8 et 1 film). Ces données suggèrent que la RSV IBs sont des organites liquides, semblables à ce qui a été décrit pour la rage virus35. IBAGs représentent un plus à l’intérieur de l’IBs, dans lequel ARNm viral et M2-1 concentré de protéines, comme l’ARN génomique, la nucléocapside et la polymérase, ne sont présentes que dans le reste de l' IBs12. Vidéo microscopie expériences révèlent que IBAGs sont des structures très dynamiques présentant des propriétés liquides (Figure 9 et Movie 2). On peuvent considérer comme des compartiments liquides résultant de la transition de phase liquide-liquide.

La possibilité de manipuler génétiquement les virus reste un outil de choix pour étudier les mécanismes de leur multiplication et leur sensibilité aux médicaments. Génétique inverse pourrait considérer maintenant dans le cadre des techniques « classiques » de la virologie. Cependant, il reste difficile pour certains virus, comme la RSV. C’est pourquoi ce protocole décrit en détail les mesures pour sauver et amplifier recombinants RSVs avec succès.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Les auteurs remercient m. Qin Yu de AstraZeneca R & D Boston, MA, é.-u., pour fournir le médicament AZD4316. Les auteurs sont reconnaissants à la plateforme Cymages pour l’accès au microscope ScanR Olympus, qui était soutenu par des subventions de la région Ile-de-France (DIM ONE HEALTH). Les auteurs reconnaissent le soutien de l’INSERM et l’Université de Versailles Saint-Quentin.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
35 mm µ dish for live cell imaging Ibidi 81156
A549 ATCC ATCC CCL-185
Avicel RC-591 FMC BioPolymer Avicel RC-591 Technical and other information on Avicels is available at http://www.fmcbiopolymer.com. Store at room temperature. Protocol in step 4 is optimized for this reagent.
BSRT7/5 not commercially available See reference 22. Buchholz et al. 1999
Crystal violet solution Sigma HT90132
Fluorescence microscope for observations Olympus IX73 Olympus microscope
Fluorescence microscope for videomicroscopy Olympus ScanR Olympus microscope
HEp-2 ATCC ATCC CCL-23
HEPES ≥99.5% Sigma H3375
L-Glutamine (200 mM) ThermoFisher Scientific 25030024
LIPOFECTAMINE 2000 REAGENT ThermoFisher Scientific 11668019 Protocol in step 2.3. is optimized for this reagent.
MEM (10x), no glutamine ThermoFisher Scientific 11430030
MEM, GlutaMAX Supplement ThermoFisher Scientific 41090-028
MgSO4 ReagentPlus, ≥99.5% Sigma M7506
Opti-MEM I Reduced Serum Medium ThermoFisher Scientific 51985-026
Paraformaldehyde Aqueous Solution, 32%, EM Grade Electron Microscopy Sciences 15714
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) ThermoFisher Scientific 15140122
Plasmids not commercially available See reference 21. Rameix-Welti et al. 2014
See Saw Rocker VWR 444-0341
Si RNA GAPDH Dharmacon ON-TARGETplus siRNA
D-001810-10-05		 SMARTpool and 3 of 4 individual siRNAs designed by Dharmacon.
Si RNA IMPDH2 Dharmacon ON-TARGETplus siRNA IMPDH2 Pool- Human
L-004330-00-0005		 SMARTpool of 4 individual siRNAs designed by Dharmacon.
Individual references and sequences
J-004330-06: GGAAAGUUGCCCAUUGUAA;
J-004330-07: GCACGGCGCUUUGGUGUUC;
J-004330-08: AAGGGUCAAUCCACAAAUU;
J-004330-09: GGUAUGGGUUCUCUCGAUG;
Si RNA RSV N Dharmacon ON-TARGETplus custom siRNA UUCAGAAGAACUAGAGGCUAU and UUUCAUAAAUUCACUGGGUUA
SiRNA NT Dharmacon ON-TARGETplus Non-targeting Pool
SiRNA transfection reagent Dharmacon DharmaFECT 1 Ref: T-2001-03 Protocol in steps 5.1.and 5.1.2 are optimized for this reagent.
Sodium Bicarbonate 7.5% solution ThermoFisher Scientific 25080094
Spectrofluorometer Tecan Tecan infinite M200PRO

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Bouillier, C., Rincheval, V., Sitterlin, D., Blouquit-Laye, S., Desquesnes, A., Eléouët, J. F., Gault, E., Rameix-Welti, M. A. Generation, Amplification, and Titration of Recombinant Respiratory Syncytial Viruses. J. Vis. Exp. (146), e59218, doi:10.3791/59218 (2019).

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