Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Üretimi, güçlendirme ve titrasyon rekombinant solunum sinsisyal virüs

Published: April 4, 2019 doi: 10.3791/59218
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 2, 1,3, 1,3
1UMR 1173 Institut national de la santé et de la recherche médicale (INSERM), Université de Versailles St. Quentin, 2UR892 Institut national de la recherche agronomique (INRA), Unité de virologie et immunologie moléculaires, 3Assistance Publique–Hôpitaux de Paris (AP-HP), Hôpital Ambroise Paré, Laboratoire de Microbiologie

Summary

Biz üretmek için bir yöntem tanımlamak ve genetik olarak yükseltecek solunum sinsisyal virüs (RSVs) ve bir en iyi duruma getirilmiş plak tahlil RSVs için değiştirilebilir. Biz bu protokolü sırasıyla miktar RSV çoğaltma izin ve analiz RSV dahil organları ve granül dahil organları ilişkili dynamics canlı iki rekombinant virüs oluşturarak göstermektedir.

Abstract

Rekombinant virüs kullanımı temel veya uygulamalı Viroloji çok önemli olmuştur. Ters genetik hem viral çoğaltma mekanizması çözmeye ve antiviral ilaçlar ya da aşılar için geliştirme platformu sağlamak için son derece güçlü bir teknoloji olduğu kanıtlanmış. İnşaat ve bir negatif iplikçikli RNA virüsü gibi solunum sinsisyal virüs (RSV) için ters bir genetik sistemi by pass iddiası ancak, hassas kalır ve özel bilgi birikimi gerektirir. RSV genomu yaklaşık 15 KB hem viral RNA ve transkripsiyonu için bir şablon olarak hizmet veren bir tek iplikçikli, negatif anlamda RNA büyüktür. Ters genetik sistemimiz insan RSV uzun zorlanma genom (HRSV) cDNA kopyasını kullanır. Bu cDNA yanı sıra viral proteinlerin polimeraz karmaşık kodlama cDNAs (L, P, N ve M2-1), bireysel ifade vektörel çizimler T7 polimeraz kontrol dizilerini altında yer alır. Bu unsurların stabil T7 polimeraz hızlı, BSR-T7/5 hücrelerdeki transfection sitoplazmik ve rekombinant RSV transkripsiyonu için genetik olarak değiştirilmiş virions sebebiyet veren sağlar. Hücre yüzeyinde ve kültür süpernatant BSRT7/5, yeni bir RSV viral amplifikasyon için insan HEp-2 hücreleri enfekte için toplanıyor. Amplifikasyon iki veya üç mermi 1 x 106 -1 x 107 plak oluşturan birimler (PFU) içeren viral hisse senetleri almaları gerektiğini / mL. En uygun hasat, donma ve viral stoklarının titrasyon için yöntemler burada ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Biz burada iki rekombinant virüs ücretsiz yeşil flüoresan protein (GFP) (RSV-GFP) sırasıyla ifade oluşturma tarafından sunulan Protokolü göstermek veya viral M2-1 GFP (RSV-M2-1-GFP) erimiş. RSV GFP RSV çoğaltma ve RSV-M2-1-viral yapılarını gibi viral protein dynamics canlı hücrelerdeki video mikroskobu teknikleri kullanarak görselleştirmek için GFP ölçmek için nasıl kullanılacağını gösterir.

Introduction

İnsan RSV bebekler dünya çapında1' yatış akut solunum yolu enfeksiyonu için önde gelen nedenidir. Buna ek olarak, RSV erişkinlerde grip için karşılaştırılabilir ile hastaneye yatış ve mortalite yükü yaşlı2' deki en önemli hastalık yükü ile ilişkilidir. Var hiçbir aşı ya da belirli antiviral ilaçlar kullanılabilir RSV karşı ama umut verici henüz yeni ilaçlar çoğu geliştirme3,4' te. Karmaşıklığı ve miktar RSV çarpma teknikleri ağırlık antiviral ilaçlar veya geçerli önemli çabalara rağmen aşılar için arama engel. RSV çarpma tüp bebek miktar genellikle çoğunlukla cytopathic etkisi analizinde mikroskobu, immunostaining, plak azaltma tarafından deneyleri, nicel grafiklerden zahmetli, zaman alıcı ve pahalı yöntemler üzerinde dayanır ters transkriptaz (qRT)-Polimeraz zincir tepkimesi (PCR) ve enzim bağlı immunosorbent assay testleri. Virüs genleri değiştirilmiş ve bu gibi muhabir gen ifade ile GFP için kodlama, böyle gösterimleri için daha uygundur. Otomatik Plaka okuyucu kullanmak için birleştiğinde, muhabir gen taşıyan rekombinant virüsler bu deneyleri standardizasyon ve yüksek üretilen iş amaçları için daha uygun hale getirebilirsiniz.

RSV bir saran, nonsegmented olumsuz anlamda RNA Pneumoviridae aile, sipariş Mononegavirales5 Orthopneumovirus cins ait virüstür. RSV genomu yaklaşık 15 kodlamayan bölge lideri ve römork ve 11 protein kodlama 10 transkripsiyon birim adı verilen 3' ve 5' ekstremitelerde, içeren KB, tek iplikçikli, negatif anlamda RNA büyüktür. Genlerin aşağıdaki gibi sıralanır: 3'-NS1, NS2, N, P, M, SH, G, F, M2 (M2-1 ve M2-2 proteinler için kodlama) ve L-5'. Genomik RNA nükleoprotein N. kullanma encapsidated genomik RNA bir şablon olarak tarafından sıkıca paketlenmiş, viral RNA'ya bağımlı RNA polimeraz (RdRp) transkripsiyon ve çoğaltma viral RNA'ın sağlayacaktır. Viral RdRp başına nükleotit polimeraz etkinlik taşıyan büyük protein L oluşmaktadır, onun zorunlu kofaktör Fosoprotein P ve viral transkripsiyonu işlevleri M2-1 protein6faktör. Enfekte hücrelerde, RSV dahil organları (IBS) adı verilen sitoplazmik kapanımlar oluşumuna neden olmaktadır. Morfolojik benzer sitoplazmik kapanımlar birkaç Mononegavirales7,8,9,10için gözlemledim. Kuduz virüsü, vesicular Stomatit virüs (VSV), Ebola virüsü ve viral RNA sentezi böylece viral fabrikalar8,9,11, kabul edilebilir IBS içinde oluştuğunu gösterdi RSV son çalışmalar 12. virüs fabrika RNA ve viral proteinler viral RNA sentezi için gerekli konsantre ve hücresel proteinler13,14,15,16, da içeren 17. IBS sergilemek hangi konsantre IB ilişkili granül (IBAGs) denilen bir fonksiyonel subcompartment yeni synthetized yeni doğmakta olan viral mRNA M2-1 protein ile birlikte. Genomik RNA ve L, P ve N IBAGs algılanmaz. IBAGs küçük dinamik küresel sıvı organelleri12özelliklerini sergileyen IBS içinde yapılardır. Merkezi rolü IBS rağmen viral çarpma, doğa, iç yapısı, oluşumu ve viral Bu fabrikaların işleyişi hakkında çok az bilinir.

İfade bir cDNA sayfasından poliovirus genomunun 198118ilk bulaşıcı viral klon üretimini etkin. Tek iplikçikli negatif RNA virüsleri, 1994'e kadar plazmid transfection hücreleri19 takip ilk bir kuduz virüsü üretimi gerçekleşti değildi. Plazmid tabanlı ters genetik için ilk sistemi RSV 199520dakika sonra yayımlandı. Ters genetik Viroloji alanında önemli gelişmeler yol açmıştır. Viral genom içine belirli değişiklikler tanıtma imkanı çoğaltma ve RNA virüsleri patogenezinde önemli anlayışlar sağlamıştır. Bu teknoloji da büyük ölçüde aşıların geliştirilmesi hedeflenen değişiklikler dizi belirli zayıflama izin vererek kolaylaştırdı. Viral çarpma hızlı bir miktar büyük ölçüde izin genom değişiklikler antiviral tarama ve eylem onların modu çalışma geliştirilmiş.

Daha önce açıklanan rağmen genetiği değiştirilmiş RSVs alma hassas kalır. Burada, iki tür rekombinant HRSV, sırasıyla RSV GFP veya RSV-M2-1-GFP ifade oluşturmak için bir protokol ayrıntılı. Bu protokol için yeni rekombinant virüsler gibi yüksek titresi, tekrarlanabilir Hollow'a için uygun ile viral stokları elde etmek için onların amplifikasyon kurtarmak için gerekli transfection koşulları tanımlamak. Ters genetik vektörel çizimler inşaat başına burada açıklanmıyor. En uygun hasat ve viral stokları dondurulması için yöntemleri açıklanmaktadır. Viral enfeksiyon parçacıklar ölçmek için en doğru yöntemi plak tahlil kalır. Hücreleri analiz süspansiyon seri dilutions ile enfekte ve süpernatant ücretsiz viral parçacıkların Difüzyon yasaklayan bir bindirme ile inkübe. Bu şartlar altında virüs sadece ilk her bulaşıcı parçacık için bir "plak" oluşturan bitişik hücreleri enfekte edecek. Geleneksel RSV titrasyon assay olarak, plaklar immunostaining tarafından ortaya ve mikroskobik gözlem altında sayılır. Bu yöntem pahalı ve zaman alıcı. Burada çok basit bir protokol plaklar çıplak gözle görünür oluşumu sağlar Mikrokristalin selüloz bindirme kullanılarak RSV plak tahlil için açıklanan. RSV GFP ölçü RSV çoğaltma ve böylece, için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir antiviral ilaçlar etkisini ölçmek. Ters genetik ve canlı görüntüleme teknolojisi birleştiren, biz nasıl bilim adamları IBS gibi viral hücre içi yapılar dinamikleri takip etmek ve M2-1 canlı hücrelerdeki görselleştirmek için RSV-M2-1-GFP sağlar göstermek.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. malzeme hazırlama

  1. Satın cep medya (düşük serum medya, en az temel medya [MEM] 10 x MEM ve Dulbecco kartal orta [DMEM] değiştirilmiş'ın), transfection reaktif ve Mikrokristalin Selüloz (bkz: Malzemeler tablo).
  2. Aşağıdaki vektörel çizimler için ters genetik elde etmek: genomik vector(s) ve N protein ve polimeraz karmaşık proteinleri kodlama ifade vektörel çizimler. Genomik vektörel çizimler bakteriyofaj T7 RNA polimeraz (T7 pol) organizatörü üzerinden tam cDNA genom RSV-GFP (p-RSV-GFP) ve RSV-M2-1GFP (p-RSV-M2-1GFP) aşağı içerir. İfade vektörel çizimler (p olarak belirlenmiş-N, p -P, p-L ve p-M2-1) kodlama dizisini N, P, L veya M2-1 aşağı T7 pol içeren (Rincheval ve ark.12 ve Rameix-Welti vd.21 plazmid yapıları ile ilgili ayrıntılar için bakınız).
  3. Medya ve transfection ve enfeksiyon için bir hücre kültüründe steril bir ortam hazırlayın. % 10 fetal buzağı serum (FCS), 1000 adet/mL penisilin ve 1 mg/mL streptomisin (veya olmadan antibiyotik) kullanım DMEM 2 mM L-glutamin ile desteklenmiş ve MEM ile 2 mM L-glutamin % 0, % 2 veya % 10 FCS, 1000 adet/mL penisilin ve 1 mg/mL ile desteklenmiş streptomisin, aşağıdaki iletişim kuralındaki "tam orta" olarak belirlenmiş.
  4. BSRT7/522 hücreleri elde etmek ve hisse senetleri ile % 10 Dimetil sülfoksit (DMSO) 1-2 x 106 hücre/mL, takıma tam orta yapmak. Sıvı azot hücre hisselerinde tasarrufu. HEp-2 hücreleri elde edilir. Kültür BSRT7/5 hücrelerde tam DMEM ve 37 ° C ve % 5 CO2 steril bir ortamda tam MEM hücrelerde HEp-2.
  5. 10 x RSV koruma çözeltilerine (0,5 M HEPES ve 1 M MgSO4 [pH 7,5] su) steril bir ortam hazırlayın.
  6. Bir ters Floresans mikroskobu GFP Floresans ölçümleri ile uyumlu ve uyumlu bir enfeksiyon izlemek gerekirse canlı görüntüleme ile elde edilir. RSV GFP çoğaltma Nefelometri için GFP Floresans ölçümleri ile uyumlu bir Mikroplaka okuyucu elde edilir.

2. kurtarma ve ilk rekombinant virüs geçirilmesi

Not: Aşağıdaki adımları kullanarak bir sınıf II Emanet dolabı steril bir ortamda gerçekleştirin.

  1. Transfection, önceki gün BSRT7/5 hücre kültürünü süspansiyon 5 x 105 hücre/mL tam orta yapmak. Hücre süspansiyon 6-şey plaka bir kuyu başına 2 mL dağıtın. Kurtarılmayı virüs başına bir şey ve bir ek iyi negatif kontrolü için hazır olun. 37 ° C ve % 5 CO2plaka kuluçkaya. Hücrelerin % 80-%90 izdiham ertesi gün olduğundan emin olun.
  2. Ters genetik vektörel çizimler (Kimden adım 1.2) p-RSV-GFP ve p çöz-RSV-M2-1-GFP, yanı sıra p-N, p -P, p-L ve p-M2-1. 1 µg p-N ve p -P, p 0,5 µg kurtarmaya her virüs için karışımı-L, p 0,25 µg-M2-1 ve p-RSV (GFP veya M2-1 GFP) bir tüp 1,25 µg.
    Not: Farklı ifade vektörel çizimler N, P, L ve M2-1 için kullanılabilir; Ancak, proteinler arasındaki oran muhafaza edilmesi gerekir. Negatif kontrol ile boş bir vektör p-RSV vektör değiştirerek gerçekleştirin.
  3. Transfection reaktif üreticisinin protokol sonrası transfection için devam (tablo malzemeleri görmek).
    1. İndirimli serum orta 250 µL karışık vektörler ekleyin. Başka bir tüp içinde düşük serum orta 250 µL transfection reaktif 10 µL sulandırmak. Yavaşça girdap hem tüpler ve 5 dk. hem de içeriğini tüpler ve oda sıcaklığında 20 dk bekleyin Mix bekleyin.
    2. İndirimli serum orta 1 mL BSRT7/5 hücrelerle durulama ve MEM ile % 10 FCS olmadan antibiyotik iyi başına 1,5 mL dağıtmak. 2.3.1. adımda anlatılan kuluçka tamamlanıncaya kadar gerekirse, 37 ° C ve % 5 CO2 kuluçkaya.
    3. 500 µL 20 dk kuluçka süresi bittiğinde bir de 2.3.1. adımda hazırlanan transfection karışımı ekleyin. Hücreleri kuluçka 37 ° C ve % 5 CO2 3 gün boyunca yerleştirin. Hücre kültür orta transfection sırasında değiştirmeyin.
  4. GFP floresan (488 nm, uyarma) ve emisyon 515-535 nm, 20 x büyütme 1 adlı bir ters floresan mikroskop altında gözlemlemek x kurtarma verimliliği izlemek için günlük, GFP kullanarak filtre uygulama.
  5. Transfection sonra ikinci gününde hücreleri kurtarıldı virüs ilk geçiş için tohum. HEp-2 hücre, 5 x 105 hücre/mL tam orta bir süspansiyon hazırlamak. Hücre süspansiyon 6-şey plaka (virüs kurtarma ve bir negatif kontrol için başına bir de) bir kuyu başına 2 mL dağıtın.
  6. Transfection, transfected BSRT7/5 6-şey plaka her şey sıfırdan hücrelerde üçüncü gününde farklı bir kazıyıcı her şey için kullanıyor. Her iyi içeriği (hücreleri ve süpernatant) steril 2 mL microcentrifuge tüp içine aktarın. Girdap her tüp şiddetle için en az 30 s hücre zarlarında kurtarıldı virüsü serbest bırakmak için.
    Not: Bu geçiş 0 (P0) kurtarılan virüsü (şekil 1) karşılık gelir.
  7. Taze viral P0 süspansiyon kurtarıldı virüs ilk amplifikasyon gerçekleştirmek için kullanın.
    1. HEp-2 6-şey plaka kültür ortamından numaralı seribaşı önceki gün Kaldır (bkz. Adım 2,5) ve hızlı bir şekilde (Kimden adım 2.6) P0 süspansiyon iyi başına 500 µL ekleyin. HEp-2 plaka 37 ° C 2 h için yumuşak ajitasyon için bkz: testere rocker üzerinde yerleştirin.
    2. Kaldırmak ve inoculum 500 µL atın ve 2 mL % 2 FCS ile MEM ekleyin. 37 ° C ve % 5 CO2 plaka için 3 gün kuluçkaya. Bu kurtarıldı virüsler (şekil 1) ilk geçiş (P1) üretecektir.
  8. 1/10 / 10 x RSV koruma çözümü (0,5 M HEPES ve 1 M MgSO4 [pH 7,5]) hacmi kalan P0 süspansiyon (Adım 2.6) ekleyin. Girdap mikrotüpler 5 s ve aliquot için şiddetle kriyojenik tüpler içeriğinde alkol dayanıklı etiketleri ile Etiketlenmiş. Tüpler için en az 1 h-80 ° C'de precooled alkol bırakın ve onlara-80 ° C'de depolayın
  9. P0 hisse senedi titre (bkz. Adım 2.6) kurtarılan her virüs (Mikrokristalin selüloz titrasyon için 4 bölümüne bakın).
  10. Enfeksiyon izlemek için günde 1 x 20 x büyütme, bir ters floresan mikroskop altında P0 süspansiyon ile GFP floresan (488 nm, uyarma) ve emisyon 515-535 nm, HEp-2 hücre enfekte gözlemlemek. Aydınlık alan mikroskop altında küçük syncytia görünümünü gözlemlemek ve hücre RSV cytopathogenic etkisi (CPE) yansıtan dekolmanı (bkz. Şekil 2).
  11. Ne Floresans ne de CPE 2-3 gün sonra görünür durumdaysa kurtarma başarısız olduğunu unutmayın.
  12. Günde 3 veya 4 2.6. adımda açıklandığı gibi ilk geçiş (P1) toplamak. Kısacası, hücreleri kazımak, hücreler ve süpernatant birlikte, onları, örnek 2.8, aliquot adımda anlatıldığı gibi koruma çözümü eklemek ve Don o girdap toplamak.
  13. (Bkz: Bölüm 4 titrasyon tahlil için) titre ve ilk geçiş (amplifikasyon için 3 bölümüne bakın) yükseltmek.

3. kurtarıldı virüs amplifikasyon

Not: Aşağıdaki iletişim kuralı bir 75 cm2 şişe kurtarıldı virüs amplifikasyon açıklar. Gerekli birime ebatı ve enfeksiyon (MOI) gerekli çokluğu adapte. Tablo 1 birimleri farklı Şişeler için gösterir. Bir sınıf II Emanet dolabı steril bir ortamda tüm aşağıdaki adımları gerçekleştirin.

  1. HEp-2 hücre, 5 x 105 hücre/mL tam ortamda bir süspansiyon gün amplifikasyon önce hazırlayın. Hücre süspansiyon 75 cm2 şişe başına 15 mL dağıtmak ve 37 ° C ve % 5 CO2şişeler kuluçkaya. Yükseltmek için virüs başına bir şişe hazırlayın.
  2. Gün kuluçka başladıktan sonra hücrelerin % 80-%100 birleşmesi olduğunu denetleyin.
  3. Adımda 2.12 MEM olmadan FCS 50.000 PFU/mL (0.01 PFU/hücre bir MOI için karşılık gelen), 3 mL süspansiyon elde etmek için üzerinden viral süspansiyon sulandırmak.
  4. Orta kaldırın ve hızlı bir şekilde 3 mL viral süspansiyon ekleyin. 2s için yumuşak ajitasyon için bkz: testere rocker olarak 37 ° C'de şişeye koyun.
  5. Kaldırmak ve inoculum atın ve MEM % 2 FCS ile 15 mL ekleyin. 37 ° C ve % 5 CO2 ' de 2-4 gün için kuluçkaya.
  6. Hücre morfolojisi ve GFP floresan (488 nm, uyarma) ve emisyon 515-535 nm, 20 x büyütme, bir ters floresan mikroskop altında belgili tanımlık virüs hasat için doğru bir zaman tahmin etmek için kontrol edin. Bu genellikle ne zaman HEp-2 hücre tabakasının % 50-%80 48 ve 72 s postinfection arasında (özel dedektif) oluşur RSV CPE nedeniyle ilişkisi kesildi olduğunu unutmayın (bkz. şekil 3).
  7. Bir hücre kazıyıcı kullanarak tüm hücreleri kazı. Hücreleri ve süpernatant araya toplamak ve 50 mL santrifüj tüpü aktarabilirsiniz.
  8. 1/10 / 10 x RSV koruma çözümü (0.5 M HEPES ve 1 M MgSO4 [pH 7,5]) hacmi ekleyin. Girdap tüpler şiddetle için 5 s ve süspansiyon tarafından 5 dk aralıklarla 200 x gde açıklığa kavuşturmak.
  9. Süpernatant 50 mL tüp aktarın. Kısaca girdap ve aliquot kriyojenik tüpler süspansiyon alkol dayanıklı etiketleri ile Etiketlenmiş. Precooled-80 ° C alkol en az 1 h için tüplerde bırakın ve onlara-80 ° C'de depolayın
  10. Viral süspansiyon (bakınız Bölüm 4) titre aliquots birini çöz.

4. plak titrasyon tahlil

  1. 12-şey plakaları titrasyon titrasyon tahlil yapılmadan önce gün için hazırlamak (altı kuyuları ecek gerekli bir tüp şunun titre için). 1 mL, 5 x 105 hücre/mL tam orta HEp-2 hücrelerinin Wells'le tohum.
  2. Ertesi gün, steril Mikrokristalin selüloz süspansiyon (%2,4 [w/v] su) hazırlamak (tablo malzemeleri görmek).
    1. 2.4 g Mikrokristalin selüloz tozu 100 ml distile su, toz (genellikle 4 – 12 h) tam dağılmasına kadar standart bir manyetik karıştırıcı kullanarak dağıtmak. Otoklav 20 dk için 121 ° C'de süspansiyon ve kullanımdan önce oda sıcaklığında saklayın.
      Not: Bu koşullar altında süspansiyon 1 yıl boyunca stabildir.
    2. Steril bir ortamda çözüm açtıktan sonra 6 ay boyunca 4 ° C'de depolayın. Her zaman önce (el sallayarak veya vortexing) tarafından süspansiyon homojen olduğundan emin olmak için karıştırın.
  3. 2 hazırlamak MEM steril bir ortamda x. Ticari MEM 10 seyreltik steril su ile x ve L-glutamine, 1000 adet/mL penisilin ve 1 mg/mL streptomisin ekleyin. Seyreltme şiddetle çalkalanır ve 4 ° C'de saklayın
    Not: 4.4-4,10 steril bir ortamda bir sınıf II Emanet dolabı kullanma adımları.
  4. Altı tüpler (titrasyon tüpler) MEM FCS olmadan 900 µL başına titre için virüs içeren hazır olun. Virüs aliquots çözülme girdap onları şiddetle için 5 s ve transfer 100 µL ilk titrasyon için tüp.
  5. On kat seyreltme 6 gerçekleştirmek x, aşağıdaki gibi. Şunun için 900 μL orta ilk tüp 100 μL televizyonda kap koymak ve içeriğini vortexing tarafından bir kaç saniye karıştırın ekleyin. Pipet ucunda değiştirmek, orta ikinci tüp içinde 900 µL ilk seyreltme 100 µL eklemek, tüp ve girdap kap koymak. Yordamı altıncı tüp kadar yineleyin.
    Not: Her seyreltme için belgili tanımlık uç değiştirmek çok önemlidir.
  6. Virüs adı ve kat dilutions HEp-2 12-şey Tabaklarda yazmak. Onlar (Adım 4,9) boyama sırasında ayrılmış çünkü plaka ve kapağına eşleştirmek için bir işareti ekleyin. Orta plakalar kaldırmak ve bir seyreltme iyi başına 400 µL dağıtın. Plakalar için virüs adsorpsiyon için 2 h 37 ° C'de kuluçkaya.
    Not: Pipet ucu her inoculum arasında değiştirebilir veya düşükten en yüksek konsantrasyon aynı ucu ile devam edin. Aynı anda kurutma hücreleri önlemek için tabak (1-2) sınırlı bir dizi aşılamak.
  7. Mikrokristalin selüloz bindirme virüs adsorpsiyon (hazırlıksız hazırlık) sırasında hazırlamak. 100 mL düzeninin elde etmek için 10 mL % 2.4 Mikrokristalin selüloz süspansiyon, 2 x MEM 10 mL ve 80 mL MEM % 2 FCS ile karıştırın.
    1. 2 pH ayarlama renkli göstergesi takip MEM için yaklaşık 7,2 steril sodyum bikarbonat solüsyonu %7.5 x. Mikrokristalin selüloz süspansiyon ve MEM ekleyip kuvvetle karıştırın.
  8. 2 h kuluçka sonunda 2-3 mL düzeninin inoculum kaldırmadan 12-şey plakaları her şey için ekleyin. Yüksek viral titresi inoculums bitişik Wells'le kirlenmesini önlemek için dikkatli olun. 37 ° C ve % 5 CO2 plaka için 6 gün kuluçkaya. Plaka hareket etmiyor ve kuluçka kuluçka sırasında hareket etmiyor.
  9. Kristal violet çözüm (% 8 kristal violet [v/v], %2 formaldehit [v/v] ve % 20 etanol [v/v] su) kullanarak hücreleri, leke için devam edin.
    1. (Kristal violet yüzeyleri güçlü renkler) bir levha ile kabine Biyogüvenlik çalışma yüzeyini korumak.
    2. Yavaşça plakalara Mikrokristalin selüloz bindirme almak sallamak. Supernatants kaldırmak ve hücreleri 2 yıkama x 1 fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) x ile. Tek tek hücreleri kurutma önlemek için plakalar ele. 1-2 mL kristal violet çözeltisi ekleyin ve 10-15 dk. Kaldır sonraki plaka boyama için yeniden kullanılabilir çözüm bekleyin.
    3. Tabakalar ve kapaklar temiz çamaşır suyu, bir kaç saniye için bırakın ve sonra iyice musluk suyu ile yıkayın. Tabakalar ve kapakları çamaşır suyu tarafından dekontamine unutmayın.
    4. Plakalar ve kapakları kağıt havlu üzerine koyup koyup kuruyuncaya kadar bırakın. Plakayı bir ortam sıcaklığında su durulama sonra kuru ve oda sıcaklığında saklayın. Uzun depolama dönemleri (ay), tutmak için ışık rengi korumak için korumalı plakaları. Hücreleri onların renklendirme kaybederseniz, onlar tekrar kristal violet ile Boyanabilen olduğunu unutmayın.
  10. Virüs titreleri hesaplayın. Çıplak gözle görülebilir kuru plakaların Wells plaklar saymak. Farklı dilutions plaklar sayısı tutarlı (10 arasında faktörü her seyreltme) olup olmadığını denetleyin. Plaklar en kolay saymak için olduğunuz şey seçin. Plaklar karşı inoculum birim ve seyreltme sayısını değerlendirmek.
    Not: Şekil 4' te sağlanan örnek üzerinde 21 plaklar 10-5 seyreltme dikkate alınır. Bunlar bir titresi karşılık
    Equation
    Equation

5. küçük müdahale RNA veya antiviral ilaçlar ile tedavi hücrelerdeki Viral çoğaltma izlemek için HRSV-GFP rekombinant virüs kullanımı

Not: Bir sınıf II Emanet dolabı kullanma steril bir ortamda 5.1 ve 5.2.5 hariç tüm adımları uygulayın.

  1. Hücresel gen RSV çarpma üzerinde susturmak etkisini izleme
    Not: Transfection iletişim kuralı üzerinde reaktif bağlıdır ( Tablo malzemelerigörmek).
    1. 96-şey plakaları GFP ölçüm için hazırlayın. İki gün önce tahlil, küçük müdahale RNA (siRNA), hazırlamak bir çözüm siRNA, 100 bir konsantrasyon içeren düşük serum medya nM ve 1/500 seyreltilmiş bir siRNA transfection reaktif. Oda sıcaklığında 30 dk için çözüm kuluçkaya.
    2. 5.1.1 (içinde nüsha) hazırlanan tabak wells 25 µL çözüm ekleyin. Tohum, 4 x 105 hücre/mL 3 x 105 hücre/mL son hücre konsantrasyonu elde etmek için antibiyotik olmadan tam orta A549 hücrelerinin bir süspansiyon, 75 µL Wells'le. 48 h 37 ° C ve % 5 CO2plaka kuluçkaya.
      Not: Son siRNA konsantrasyon 25'nm ve son transfection reaktif hacmi olduğunu 0.5 µL/iyi).
    3. Hücreleri aşağıdaki gibi bulaştırmak. Orta kuyulardan kaldırın. 50.000 PFU/mL 100 µL RSV GFP süspansiyon ekleyin ve 2 h 37 ° C ve % 5 CO2için kuluçkaya. Viral süspansiyon kaldırın ve DMEM % 2 FCS ve fenol red olmadan 100 µL ekleyin. 37 ° C ve % 5 CO2plaka kuluçkaya.
    4. 24 saat ve 48 h p.ı., Floresans ölçmek, bir spectrofluorometer kullanarak 488 ve 520 nm, uyarma ve emisyon boyları için sırasıyla ayarla (göreli floresan biriminde Floresans ifade edilir). Noninfected A549 hücreleri floresan ve arka plan düzeyleri için standartları olarak kullanın.
      Not: Hücreleri plaka kapak ölçme önce %4 paraformaldehyde (PFA) ile sabit olması gerekir.
  2. RSV GFP kullanarak uyuşturucu inhibisyon değerlendirilmesi
    1. 96-şey plakaları GFP ölçüm için hazırlayın. Tahlil, önceki gün bir süspansiyon HEp-2 hücre fenol red olmadan tam orta 5 x 105 hücre/mL, 100 µL Wells'le tohum.
    2. Test edilmiş bir seri seyreltme hazırlamak % 2 FCS ve antibiyotik (iyi başına 50 µL) ile tamamlanmaktadır MEM ilaçlar (Bu örnekte AZ4316). Bir viral süspansiyon MEM 10.000 PFU/mL, fenol red (iyi başına 50 µL) olmadan ve stromal vasküler faktörü (SVF) hazırlayın.
    3. Orta 96-şey HEp-2 yerinden kaldırmasını plaka ve uyuşturucu süspansiyon 50 µL ve viral süspansiyon (içinde nüsha) 50 µL ekleyin. Sahte bir enfeksiyon paralel olarak bir denetim olarak gerçekleştirin.
      Not: Uyuşturucu seyreltme ve viral süspansiyon sayfasındaki hücreleri eklemeden önce karışık olması veya ardışık olarak eklenebilir.
    4. 48 h 37 ° C ve % 5 CO2plaka kuluçkaya.
    5. 5.1.4. adımda açıklandığı gibi bir spectrofluorometer kullanarak Floresans ölçmek. Sahte enfekte HEp-2 hücreleri floresan arka plan düzeyleri için standartları olarak kullanın.

6. M2-1 yerelleşme Vivo RSV-M2-1-GFP rekombinant virüs ile karakterizasyonu

Not: Bir sınıf II Emanet dolabı kullanma steril bir ortamda 6.1 ve 6.2 numaralı adımları gerçekleştirin.

  1. HEp-2 hücre, 5 x 105 hücre/mL tam orta bir süspansiyon hazırlamak. Tohum 35 mm Petri kabına permeant CO2 ve adapte için hücre süspansiyon 1,5 mL görüntüleme yaşıyor.
  2. 3.3-3.5 adımlarda açıklandığı gibi enfeksiyon MOI 1, RSV-M2-1-GFP virüsle tohum sonra gün gerçekleştirmek (orta kaldırmak, 500 µL inoculum, 1 mL için eklemek ve 2 h için hafifçe sallayarak süre örneği 37 ° C'kuluçkaya; inoculum kaldırmak ve MEM 1,5 mL 2 ekleyin % FCS). 37 ° C ve % 5 CO2 hücreleri (IBS 10 h p.ı. görünmeye başlar) istenen kez kuluçkaya.
  3. 40 x 100 x hedeflere 37 ° C'de Sahne Alanı'nda enfekte hücreleri içeren Petri kabına koyarak önce ile donatılmış bir ters mikroskobu kuluçka odası Onceden. CO2 kaynağı açın ve odak stabilization için bekleyin.
  4. Fototoksisite en aza indirmek için bir düşük uyarma yoğunluğu ve görüntü frekansı (1 min başına 0.1 görüntü için) altında GFP uyumlu filtrelerle Imaging gerçekleştirin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bu çalışmada, floresan protein (Şekil 2) ifade rekombinant RSV virüs üretmek için detaylı bir protokol nitelendirdi. PRSV-GFP GFP gen P ile M arasında gen için daha önce yayımlanmış çalışma21kiraz gen açıklandığı gibi kullanılmaya başlandı. PRSV-M2-1-GFP, M2 gen dokunulmaz ve bir ek gen M2-1-GFP için kodlama SH ve G genler12arasında eklenmiş. İlk adım, belgili tanımlık virüs BSRT7/5 hücrelerdeki kurtarmak için karşılık gelen şekil 2Agösterilir. Yeşil floresan hücreleri küçük kümeleri görünür 72 h posttransfection RSV GFP ve RSV-M2-1-GFP kurtarmak için karşılık gelen Wells vardı. Floresan sinyal sitoplazma ve ücretsiz GFP ifadeye karşılık gelen çekirdeklerin RSV GFP enfekte hücrelerde gözlenen. Buna ek olarak, RSV-M2-1-GFP kurtarma küçük floresan sitoplazmik noktalar, IBS M2-1-GFP birikimi karşılık gelen gözlenen. Genellikle hiçbir CPE (syncytia, müstakil hücreleri) Bu adımda görülmektedir. Bunun tersi olarak, virüs amplifikasyon için karşılık gelen ikinci adımı, (ilk geçiş) HEp-2 hücreleri üzerinde CPE 72 h özel dedektif (şekil 2B), enfekte hücrelerde görünür oldu. Şekil 3A B güçlü CPE RSV enfeksiyonunun büyük syncytia, ya da değil, müstakil ve birçok yüzen hücreleri ile karakterize gösterilmektedir. Syncytia ve hücreleri parlak yeşil Floresans sergiledi. Şekil 3A arasında 24 ve 72 s özel dedektif RSV-M2-1-GFP virüs ile enfekte hücrelerde cytopathic efekti evrimi gösterir. Birkaç dağınık floresan hücreleri 24 h p.ı. tespit CPE olmadan görünür. Küçük syncytia (küme floresan hücreleri) ve birkaç müstakil hücreler/syncytia 48 h p.ı. büyük floresan syncytia ortaya çıkmaya başladı ve yüzen hücreleri 72 h p.ı. açıkça görünür

Plak titrasyon tahlil ve viral titreleri RSV üretim tüm süreç için karşılık gelen resimleri şekil 5' te gösterilmektedir. Plak tahlil N, P, L ve M2-1, sadece ifade Plasmid'ler ile transfected negatif kontrol performans, en düşük fiyat seyreltme hiçbir plak saptandı. Transfected hücrelerden elde edilen titreleri kurtarma verimli, şekil 5' te gösterildiği gibi olsaydı 100 PFU/mL üzerinde olması bekleniyor. Daha sonra titreleri 106–107 PFU/mL'de geçiş 1 veya 2 ulaşmak için pasajlar üzerinde arttı. Viral titreleri arasında iki rekombinant virüs benzer olduğunu unutmayın.

Hücreler viral protein (N) veya iki hücresel proteinler (inosin-5'-monofosfattır dehidrogenaz [IMPDH] ve gliseraldehit 3'-fosfat dehidrojenaz [GAPDH]) mRNA hedefleme siRNA ile transfected. Hücreler ile nontargeting siRNA Ayrıca transfected. Şekil 6 RSV çarpma RSV GFP virüs siRNA tedavi hücreleri üzerinde kullanarak izleme göstermektedir. Güçlü bir GFP sinyal (şekil 6A) gözlendi ve ölçülen (şekil 6B) kontrol hücreleri üzerinde nontargeting siRNA ile transfected veya hücreleri ile siRNA GAPDH mRNA karşı transfected. Buna ek olarak, GFP ifade enfekte hücreleri N veya IMPDH hedefleyen siRNA ifade azalma. 48 h p.ı., RSV GFP enfekte hücrelerde GFP floresan sinyal olarak daha önce gösterdiği viral dozla kiraz (RSV-Cherry)21ifade benzer rekombinant RSV için korelasyon ki doğrulanmadı unutmayın. Uyuşturucu verimliliği RSV çarpma üzerinde değerlendirmek için HEp-2 hücreleri RSV-GFP ile çeşitli ilaç konsantrasyonları huzurunda 48 h için bulaşmış. Biz, (kandan hücrelere gözlenen bir sinyal oldu) arka plan gürültü ulaştı, GFP sinyal güçlü bir düşüş görülmektedir Şekil 7' de gösterildiği gibi bir artan ilaç konsantrasyonu huzurunda. Gözlenen IC50 AZD4316 için yaklaşık 4 oldu nM, için yaklaşık EC50 yayımlanan benzer 2-40 nM karşı farklı HRSV suşları23. IBS ve IBAGs RSV M2 1 GFP sayesinde canlı hücrelerdeki dinamiklerini analiz şekil 8 ve 9 şekil (ve film 1 ve Film 2) gösterilir. IBS daha büyük bir küresel dahil şekillendirme mobil küresel yapıları sigorta mümkün görünür. IBAGs çok dinamiktir. Onlar büyümek, küçük IBAGs büyük IBAGs, içine sigorta oluşumu ile sürekli Montaj-Demontaj devir geçmesi ve sonra kaybolur.

Plaka veya cep şişesi Bir gün önce tohumlari için HEp-2 hücreleri Orta hacmi (mL) Virüs Inoculum hacmi (mL)
150 cm2 şişe 15 x 106 30 5
75 cm2 şişe 7.5 x 106 15 3
25 cm2 şişe 2.5 x 106 5 1
6-şey plaka 1 x 106 2 0,5

Tablo 1: Hücreleri ve farklı şişeler içinde kullanmak için inoculum birim sayısı.

Figure 1
Şekil 1: kurtarma ve amplifikasyon adımları şematik gösterim. N, P, L, M2-1 ve RSV antigenomic RNA'ın ifade vektör transfection BSRT5/7 hücrelere (kurtarma). Antigenomic RSV RNA'ın ve N, P, L ve M2-1, mRNA ifade T7 RNA polimeraz tarafından. N, P, L ve M2-1 proteinler çoğaltmak ve genomik RNA viral çarpma döngüsü başlatılıyor, uyarlamak. Yeni viral parçacıkların üretilmektedir ve çarpma, veren P0 yükselmeye. Kurtarma (P0) hasat virüs sonra HEp-2 hücreleri daha yüksek bir titresi viral süspansiyon (P1) üretmek için güçlendirilmiş (güçlendirme). Bu o zaman viral hisse senedi almak için güçlendirilmiş. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2: CPE ve floresan desen RSV GFP ve RSV-M2-1-GFP kurtarma sırasında gözlenen. (A)BSRT5/7 hücreleri belirtildiği şekilde ters genetik vektörleri ile transfected ve faz kontrast ve floresan görüntüleri 72 h posttransfection alınmıştır. Negatif kontrol (negatif Ctrl) hücreleri ters genetik vektör olmadan ifade vektörel çizimler N, P, L ve M2-1 ile transfected karşılık gelir. (B) HEp-2 hücreleri transfected BSRT5/7 hücrelerden (sıfır geçiş, 72 h posttransfection) hasat virüs ile enfekte ve görüntüleri 72 h postinfection alınmıştır. Gösterilen temsilcisi alanlarında görüntülerdir; Ölçek çubuğu 100 µm =. Kutulu alanı büyütme içinde gösterilen hücre içine alır; Ölçek çubuğu 20 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: Evrim ve CPE ve floresan rekombinant RSV amplifikasyon sırasında gözlenen. HEp-2 hücreleri, 0.01 PFU/hücre 72 h için MOI(a)RSV-M2-1-GFP veya (B) RSV-GFP ilk geçiş ile bulaşmış. Faz kontrast ve floresan görüntüleri 24 h, 48 h ve 72 h postinfection alındı. Gösterilen bir temsilcisi alanı görüntülerdir; Ölçek çubuğu 100 µm =. Kutulu alanı büyütme içinde gösterilen hücre içine alır; Ölçek çubuğu 20 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4: plak tahlil kullanılarak RSV titresi belirlenmesi. (A)bir 12-şey plaka plak titrasyon tahlil sonuçlarını. Bir viral stok seri dilutions ile enfekte altı kuyuları gösterilir. Dilutions 10 tabanında logaritmasını içinde gösterilir. Üç ilk dilutions ile enfekte hücreleri tüm ayrılır. Plaka numaraları ile 10-4, 10-5, ve 10-6 dilutions tutarlı görülmektedir. (B) plak numaralandırma (sarı numaraları) Illustration. Yeşil yıldız çizikleri hücre katmanı üzerinde gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 5
Şekil 5: titrasyon kurtarıldı ve güçlendirilmiş şunun. HEp-2 hücreleri (görüntüleri kuyuları tamamını göster) bir 12-şey plaka üzerinde denenecektir farklı pasajlar adlı plak fenotipleri RSV GFP ve RSV-M2-1-GFP. Sonraki pasajlar titreleri tabloda gösterilmiştir. Temsilcisi veri gösterilir. Dilutions viral stoklarının bir 10 tabanında logaritmasını gösterilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 6
Şekil 6: RSV GFP ifade RSV N veya IMPDH hedefleyen siRNA tarafından inhibisyonu. A549 hücreleri kontrol nontargeting siRNA (NT) (ışık mavi çubuk) ile tedavi veya siRNA GAPDH (mavi çubuk), RSV N (turuncu çubuk) veya IMPDH2 (yeşil bar) 48 h için hedefleme ve RSV-GFP 0,05 PFU/hücre bir MOI, o zaman bulaşmış. Yeşil floresan 48 h postinfection okundu. (A)48 h p.ı., Resimler üzerinde görüldüğü gibi siRNA ile tedavi, RSV GFP enfekte hücreleri temsilcisi görüntülerini. Ölçek çubuğu = 100 µm. (B) bilgilerse nüsha gerçekleştirilen iki bağımsız deney ortalama ± SD. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 7
Şekil 7: RSV GFP çarpma AZD4136 bileşik tarafından inhibisyonu. 96-şey plakaları HEp-2 hücreleri RSV-GFP 0,05 PFU/hücre AZD4316 bileşik seri dilutions huzurunda bir MOI, veya denetim DMSO ile bulaşmış. Yeşil Floresans 48 h p.ı. nüsha gerçekleştirilen iki bağımsız deney ortalama ± SD verilerdir, okundu. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 8
Şekil 8: floresan protein M2-1-GFP HEp 2-enfeksiyonlu hücrelerdeki zaman atlamalı mikroskobu tarafından tuttuğundan IBS dinamiklerini analiz. 18 h p.ı. hücreler, her 5 dakikada 5 h için 37 ° C'de ısıtılmış odasında floresan mikroskop ile görüntüsü IBS floresan (yeşil) M2-1-GFP barındırdıkları ve çekirdekleri Höchst (mavi) ile lekeli çünkü. Beyaz okları füzyon geçiren IBS gösterir. Ölçek çubuğu 10 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 9
Şekil 9: IBAGs zaman atlamalı mikroskobu tarafından RSV-M2-1-GFP-enfekte hücrelerde dinamiklerini analiz. 18 h p.ı. hücreleri ile 37 ° C'de ısıtılmış odasında floresan mikroskop görüntüsü M2-1-GFP protein yeşil Floresans tarafından görüntülenmiştir. Beyaz okları IBAGs füzyonu geçiren IBS gösterir. Ölçek çubuğu 5 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Movie 1
Film 1: In vivo analizi RSV-M2-1-GFP HEp 2-enfeksiyonlu hücrelerdeki IBS dinamiği. 18 h p.ı. hücreler, her 5 dakikada 5 h için 37 ° C'de ısıtılmış odasında floresan mikroskop ile görüntüsü Ölçek çubuğu 10 µm =. Çıkan film 7 kare/s (fps) gösterir. Bu videoyu izlemek için lütfen buraya tıklayın. (İndirmek için sağ tıklatın.)

Movie 2
Movie 2: In vivo analizi IBAGs RSV-M2-1-GFP-enfekte hücrelerde dinamiği. 18 h p.ı. hücreler, her 5 min için 3 saat 40 dak 37 ° C'de ısıtılmış odasında floresan mikroskop ile görüntüsü Ölçek çubuğu 2 µm =. Çıkan film 4 fps gösterir. Bu videoyu izlemek için lütfen buraya tıklayın. (İndirmek için sağ tıklatın.)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Burada rekombinant RSVs beş plazmid gelen kurtarma yöntemi ve onların amplifikasyon mevcut. Virüs genomu işleme yeteneği mutasyon test etmek ve ek bir gen veya etiketli bir viral protein hızlı Viroloji araştırma devrim yarattı. RSV biz açıklanan ve bu makaledeki örnek bir muhabir gen, RSV-GFP (yayınlanmamış) ve bir M2-1 protein bir GFP etiketi12' ye erimiş ifade ifade bir virüs olduğu gibi kullanılabilir. RSV kurtarmak zordur ve pratik gerektirir. Transfection verimlilik, transfection reaktif akıllıca bir seçim ve transfection iletişim kuralı önceki bir duruma getirilmesi bağlı olarak önemlidir. Viral cDNA T7 pol organizatörü ters genetik vektör çoğunda aşağı akım yerleştirilir çünkü bakteriyofaj T7 pol ifade hücreleri kullanımı zorunludur. T7 pol vaksinia yardımcı virüs ifade etmek için bir alternatiftir. Ancak, stabil T7 pol ifade hücreleri kullanımı iki virüs ayıran gerekliliğini önler ve kurtarma ile vaksinia olası girişim engeller. Maksimal kurtarma verimliliği sağlamak için inoculum donma olmadan ters genetik (P0 P1 için) ilk geçiş işlemi yapılması önemlidir. Bu MOI kontrol edilmez anlamına gelir. Ancak, bu adımda titreleri çok düşük, düşük MOI ilk geçiş için sonuçlanan kalır. RSV stokları yüksek bulaşıcı titreleri (106–107 PFU/mL) ile elde etmek için güçlü bir CPE için beklemek ve hücrelere bağlı viral parçacıkların toplamak için hücreleri kazımak için önemlidir. Bu çalışmada, 96 h p.ı. sonra titreleri artmamıştır Viral askıya hızlı soğutma yüksek titreleri korumak önemlidir. Bunun yerine,-80 ° C'de precooled alkol bir daldırma tarafından bu da daldırma bir kuru buz/etanol karışımında veya sıvı azot elde. Koruma çözüm ek virüs süspansiyon-80 ° C'de daha uzun bir istikrarı sağlayacaktır Depolama-80 ° C'de önemlidir beri virüs hızla onun infektivite-20 ° c veya sıvı azot saklandığında kaybı olacak. RSV büyümeye en popüler hücre kültürünü olan RSV amplifikasyon HEp-2 hücreleri, açıkladığımız ama verimli bir şekilde çok sayıda diğer hücre satırlarda tüp bebek büyümeye yapabiliyor. Ancak, Vero hücreleri üzerinde büyüme G ifade24bir değişiklik neden olabileceğini unutmayın.

Biz plak titrasyon Mikrokristalin selüloz bindirme kullanılarak RSV, çok basit bir protokol nitelendirdi. Tüm titrasyon deneyleri gelince bu kirlenme ile yüksek titresi süspansiyonlar, dikkatli işleme gerektiren duyarlıdır. Geleneksel RSV titrasyon deneyleri özel veya carboxymethyl Selüloz (CMC) bindirmeleri kullanın ve immunostaining ve mikroskopik gözlemler titresi belirlenmesi için gerektirir. İmmunodiffusion sınıf özel bir iletişim kuralı'nı etkinleştirme plaklar immunostaining25olmadan doğrudan görselleştirme tarif edilmiştir. Ancak, HEp-2 Bu iletişim kuralı için birden çok virüs titrations kullanmak zor yapar bir ısıtmalı agar kaplaması için çok hassas hücrelerdir (örneğin, çok sıcak bir yer paylaşımı hücre katmanı yok eder); Öte yandan, bu yeterince sıcak değil olduğunda, sonra ilk plaka dağıtım katılaşır. Mikrokristalin selüloz kullanımı bir plak tahlil için bir grip A virüs titrasyon tahlil26için ilk Matrosovich vd tarafından tanımlanmıştır. Düşük viskozite sayesinde, Mikrokristalin selüloz bindirme dağıtmak için ve 96-şey plakaları ile uyumlu hale getirmek plaka kuyulardan kaldırmak için kolaydır. Böylece, özellikle uyarlanabilir serolojik çalışmalar ve uyuşturucu duyarlılık analizleri olduğunu. Mikrokristalin selüloz ısıtmalı olabilir gerekmez beri uyuşturucu kolayca yer paylaşımlı yansıtılması unutmayın. Bu, ancak, tabakları kuluçka sırasında tamamen hareketsiz kalması önemlidir; Aksi takdirde, büyük kuyruklu yıldız şeklindeki foci yerine yuvarlak plaklar oluşturacak. Kristal violet kullanarak plak vahiy ucuz ve basit, ama bu çözüm toksik ve düzgün bertaraf edilecek vardır. Çözümü geri dönüşüm atık üretimi sınırlar. Ayrıca, bu yöntem viral plaklar olmayan yanlış beyaz noktalar görünür hücre monolayer zarar duyarlıdır. Bir örnek şekil 4 ' te (yeşil yıldız) gösterilir. Bu önyargı önlemek için 1) hücrelerin tırmalama veya hücre monolayer, 2) aspirasyon kızarma önlemek için dikkatli bir şekilde ele alınması ve her zaman dağıtımı var aynı noktada bir bilinen alan hasar kısıtlamak için yapılan, ve 3) yanlış beyaz noktalar tespit edilmesi onların şekil (küresel), keskin kenarlarına ve konumlarını sayesinde. Biz ilk önceden yayınlanmış21,26Avicel RC 581, kullanılır. Ancak, RC 581 artık mevcuttur ve başarıyla RC 591 tarafından değiştirildi. Bu tahlil diğer hücre/virüs çiftler için uyarlamak için virüs ve hücreleri bağlı olarak belirlenecek Mikrokristalin selüloz konsantrasyonu vardır. Difüzyon orta şunun için hücreleri ve küçük plaklar, yol çok az sağlayacaktır için çok fazla Mikrokristalin selüloz toksik olabilir.

RSV çarpma izlemek için RSV GFP virüs kullanımı iki örnek açıkladığımız: bir antiviral ilaç varlığında veya hücresel protein susturmak. GFP sinyal viral çarpma ile korelasyon gösterdi. Burada sunulan yöntem viral çarpma zahmetsiz değerlendirilmesi gerçek zamanlı olarak sağlar. Şekil 7' de gösterildiği gibi kolayca bir antiviral ilaç IC50 belirlemek bilim adamları sağlar. Önemlisi, bu ölçüm orta veya geniş bant, özellikle kimyasal kitaplıkları ile taranması için kullanmak için adapte edilebilir. Bu muhabir ifade etmek virüs de virüs çarpma bir hücresel protein ifade bir modülasyon üzerindeki etkisini değerlendirmek yararlı olabilir. RNA müdahale sayede belirli bir mRNA kendi özel tanıma siRNA, böylece azaltarak veya ideal olarak, karşılık gelen protein27ifade kaldırılması düşer biyolojik bir süreçtir. Burada, GFP sinyal şiddeti RSV GFP enfekte hücreleri, izleme tarafından verilen örnekte viral nükleokapsid (N) mRNA veya ana bilgisayar IMPDH mRNA RSV çarpma üzerinde yalıtım etkisi değerlendirildi. IMPDH2 hızı sınırlaması doğru bir adım de novo sentezi, guanin nükleotid IMP28üzerinden tromboksan bir pürin biyosentetik enzimdir. Böylece hücre içi guanin nükleotid havuzunun bir düzenleyicisidir. Ribavirin gibi IMPDH inhibitörleri RNA virüsleri, RSV enfeksiyonu29,30,31dahil olmak üzere üzerinde inhibitör etkileri uygulamayın. Şekil 6' da gösterildiği gibi IMPDH ifade inhibisyonu RSV büyüme ribavirin etkilerini taklit GFP sinyal azaltma tarafından belirtildiği şekilde viral çarpma bozar. Aynı şekilde, viral çarpma viral N protein hedefleme siRNA varlığında hemen hemen kaldırıldı. N protein hedefleme siRNA viral nükleokapsid montaj önlemektir bekleniyordu ve güçlü viral çoğaltma32zarar kanıtlanmıştır beri bu sonucu bekleniyordu. Bu siRNA nebulization tarafından yönetim sağlıklı yetişkin33sonraki enfeksiyonunda RSV tarafından inhibe. N veya IMPDH siRNA etkisini kontrol gen seçilen GAPDH ifade inhibisyonu beri özgüdür, viral çarpma ile karşılaştırıldığında nontargeting siRNA zarar değil. Not hücre zehirlenmesi herhangi bir koşullarda algılandı. Birlikte ele alındığında, bu sonuçlar kadar yüksek üretilen iş siRNA kitaplıkları veya CRISPR-Cas9 teknoloji34gibi diğer nakavt yöntemleri kullanarak eleme ölçekli burada anlatılan strateji doğrulayın.

Rekombinant virüs bir füzyon floresan protein ifade viral proteinler ve viral yapıları dinamik eğitim için güçlü araçlar temsil eder. Bir floresan M2-1 protein ifade RSV gözlem dinamiklerinin IBS ve IBAGs sağlar. RSV viral fabrikalar düşünülebilir, IBS, küresel dinamik yapıları görünür. Onlar birlikte form daha büyük küresel yapıları için (şekil 8 ve film 1) sigorta edebiliyoruz. Bu veriler RSV IBS sıvı organelleri, ne kuduz virüsü35için tanımlanmıştır için benzer olduğunu göstermektedir. IBAGs bir subcompartment IBS, hangi viral mRNA ve M2-1 protein konsantresi, genomik RNA, nükleokapsid ve polimeraz gibi sadece IBS12kalan mevcut içinde temsil eder. Video mikroskobu deneyler IBAGs sıvı özellikleri (Şekil 9 ve Film 2) sergilenmesi çok dinamik yapıları olduğunu ortaya koyuyor. Sıvı-sıvı faz geçiş kaynaklanan sıvı bölmeleri olarak düşünülebilir.

Genetik olarak manipüle virüs olasılığı onların çarpma ve uyuşturucu için onların duyarlılık her iki mekanizmaları incelemek için Seçim aracı kalır. Ters genetik şimdi Viroloji "klasik" teknikleri bir parçası olarak düşünülebilir. Ancak, zorlu RSV gibi bazı virüsler için kalır. Bu yüzden bu protokolü başarılı bir şekilde kurtarmak ve rekombinant RSVs yükseltmek için gereken adımları ayrıntılı olarak anlatılmaktadır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

Yazarlar Dr Qin Yu AstraZeneca R & D Boston, MA, ABD AZD4316 uyuşturucu verdiğiniz için teşekkür ederiz. Yazarlar Cymages platforma erişim ScanR Olympus mikroskop için minnettarız tarafından desteklendiği bölgesinden Ile-de-France (LOŞ bir sağlık) verir. Yazarlar INSERM ve Versailles Saint-Quentin Üniversitesi destek kabul etmiş oluyorsunuz.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
35 mm µ dish for live cell imaging Ibidi 81156
A549 ATCC ATCC CCL-185
Avicel RC-591 FMC BioPolymer Avicel RC-591 Technical and other information on Avicels is available at http://www.fmcbiopolymer.com. Store at room temperature. Protocol in step 4 is optimized for this reagent.
BSRT7/5 not commercially available See reference 22. Buchholz et al. 1999
Crystal violet solution Sigma HT90132
Fluorescence microscope for observations Olympus IX73 Olympus microscope
Fluorescence microscope for videomicroscopy Olympus ScanR Olympus microscope
HEp-2 ATCC ATCC CCL-23
HEPES ≥99.5% Sigma H3375
L-Glutamine (200 mM) ThermoFisher Scientific 25030024
LIPOFECTAMINE 2000 REAGENT ThermoFisher Scientific 11668019 Protocol in step 2.3. is optimized for this reagent.
MEM (10x), no glutamine ThermoFisher Scientific 11430030
MEM, GlutaMAX Supplement ThermoFisher Scientific 41090-028
MgSO4 ReagentPlus, ≥99.5% Sigma M7506
Opti-MEM I Reduced Serum Medium ThermoFisher Scientific 51985-026
Paraformaldehyde Aqueous Solution, 32%, EM Grade Electron Microscopy Sciences 15714
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) ThermoFisher Scientific 15140122
Plasmids not commercially available See reference 21. Rameix-Welti et al. 2014
See Saw Rocker VWR 444-0341
Si RNA GAPDH Dharmacon ON-TARGETplus siRNA
D-001810-10-05		 SMARTpool and 3 of 4 individual siRNAs designed by Dharmacon.
Si RNA IMPDH2 Dharmacon ON-TARGETplus siRNA IMPDH2 Pool- Human
L-004330-00-0005		 SMARTpool of 4 individual siRNAs designed by Dharmacon.
Individual references and sequences
J-004330-06: GGAAAGUUGCCCAUUGUAA;
J-004330-07: GCACGGCGCUUUGGUGUUC;
J-004330-08: AAGGGUCAAUCCACAAAUU;
J-004330-09: GGUAUGGGUUCUCUCGAUG;
Si RNA RSV N Dharmacon ON-TARGETplus custom siRNA UUCAGAAGAACUAGAGGCUAU and UUUCAUAAAUUCACUGGGUUA
SiRNA NT Dharmacon ON-TARGETplus Non-targeting Pool
SiRNA transfection reagent Dharmacon DharmaFECT 1 Ref: T-2001-03 Protocol in steps 5.1.and 5.1.2 are optimized for this reagent.
Sodium Bicarbonate 7.5% solution ThermoFisher Scientific 25080094
Spectrofluorometer Tecan Tecan infinite M200PRO

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shi, T., et al. Global, regional, and national disease burden estimates of acute lower respiratory infections due to respiratory syncytial virus in young children in 2015: a systematic review and modelling study. The Lancet. 390 (10098), 946-958 (2017).
  2. Falsey, A. R., Hennessey, P. A., Formica, M. A., Cox, C., Walsh, E. E. Respiratory Syncytial Virus Infection in Elderly and High-Risk Adults. The New England Journal of Medicine. 352 (17), 1749-1759 (2005).
  3. DeVincenzo, J. P., et al. Activity of Oral ALS-008176 in a Respiratory Syncytial Virus Challenge Study. The New England Journal of Medicine. 373 (21), 2048-2058 (2015).
  4. DeVincenzo, J. P., et al. Oral GS-5806 Activity in a Respiratory Syncytial Virus Challenge Study. The New England Journal of Medicine. 371 (8), 711-722 (2014).
  5. Afonso, C. L., et al. Taxonomy of the order Mononegavirales: update 2016. Archives of Virology. 161 (8), 2351-2360 (2016).
  6. Collins, P. L., Hill, M. G., Cristina, J., Grosfeld, H. Transcription elongation factor of respiratory syncytial virus, a nonsegmented negative-strand RNA virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (1), 81-85 (1996).
  7. Hoenen, T., et al. Inclusion bodies are a site of ebolavirus replication. Journal of Virology. 86 (21), 11779-11788 (2012).
  8. Heinrich, B. S., Cureton, D. K., Rahmeh, A. A., Whelan, S. P. Protein expression redirects vesicular stomatitis virus RNA synthesis to cytoplasmic inclusions. PLoS Pathogens. 6 (6), e1000958 (2010).
  9. Lahaye, X., et al. Functional Characterization of Negri Bodies (NBs) in Rabies Virus-Infected Cells: Evidence that NBs Are Sites of Viral Transcription and Replication. Journal of Virology. 83 (16), 7948-7958 (2009).
  10. Kolesnikova, L., Mühlberger, E., Ryabchikova, E., Becker, S. Ultrastructural organization of recombinant Marburg virus nucleoprotein: comparison with Marburg virus inclusions. Journal of Virology. 74 (8), 3899-3904 (2000).
  11. Dolnik, O., Stevermann, L., Kolesnikova, L., Becker, S. Marburg virus inclusions: A virus-induced microcompartment and interface to multivesicular bodies and the late endosomal compartment. European Journal of Cell Biology. 94 (7-9), 323-331 (2015).
  12. Rincheval, V., et al. Functional organization of cytoplasmic inclusion bodies in cells infected by respiratory syncytial virus. Nature Communications. 8 (1), 563 (2017).
  13. Santangelo, P. J., Bao, G. Dynamics of filamentous viral RNPs prior to egress. Nucleic Acids Research. 35 (11), 3602-3611 (2007).
  14. Lifland, A. W., et al. Human Respiratory Syncytial Virus Nucleoprotein and Inclusion Bodies Antagonize the Innate Immune Response Mediated by MDA5 and MAVS. Journal of Virology. 86 (15), 8245-8258 (2012).
  15. Garcia, J., Garcia-Barreno, B., Vivo, A., Melero, J. A. Cytoplasmic inclusions of respiratory syncytial virus-infected cells: formation of inclusion bodies in transfected cells that coexpress the nucleoprotein, the phosphoprotein, and the 22K protein. Virology. 195 (1), 243-247 (1993).
  16. Brown, G., et al. Evidence for an association between heat shock protein 70 and the respiratory syncytial virus polymerase complex within lipid-raft membranes during virus infection. Virology. 338 (1), 69-80 (2005).
  17. Radhakrishnan, A., et al. Protein analysis of purified respiratory syncytial virus particles reveals an important role for heat shock protein 90 in virus particle assembly. Molecular & Cellular Proteomics. 9 (9), 1829-1848 (2010).
  18. Racaniello, V. R., Baltimore, D. Cloned poliovirus complementary DNA is infectious in mammalian cells. Science. 214 (4523), 916-919 (1981).
  19. Schnell, M. J., Mebatsion, T., Conzelmann, K. K. Infectious rabies viruses from cloned cDNA. The EMBO Journal. 13 (18), 4195-4203 (1994).
  20. Collins, P. L., et al. Production of infectious human respiratory syncytial virus from cloned cDNA confirms an essential role for the transcription elongation factor from the 5' proximal open reading frame of the M2 mRNA in gene expression and provides a capability for vaccine. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (25), 11563-11567 (1995).
  21. Rameix-Welti, M. -A., et al. Visualizing the replication of respiratory syncytial virus in cells and in living mice. Nature Communications. 5, 5104 (2014).
  22. Buchholz, U. J., Finke, S., Conzelmann, K. K. Generation of bovine respiratory syncytial virus (BRSV) from cDNA: BRSV NS2 is not essential for virus replication in tissue culture, and the human RSV leader region acts as a functional BRSV genome promoter. Journal of Virology. 73 (1), 251-259 (1999).
  23. Cianci, C., Meanwell, N., Krystal, M. Antiviral activity and molecular mechanism of an orally active respiratory syncytial virus fusion inhibitor. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 55 (3), 289-292 (2005).
  24. Derscheid, R. J., et al. Human respiratory syncytial virus memphis 37 grown in HEp-2 cells causes more severe disease in lambs than virus grown in vero cells. Viruses. 5 (11), 2881-2897 (2013).
  25. McKimm-Breschkin, J. L. A simplified plaque assay for respiratory syncytial virus - direct visualization of plaques without immunostaining. Journal of Virological Methods. 120, 113-117 (2004).
  26. Matrosovich, M., Matrosovich, T., Garten, W., Klenk, D. New low-viscosity overlay medium for viral plaque assays. Virology Journal. 7, 1-7 (2006).
  27. Novina, C. D., Sharp, P. A. The RNAi revolution. Nature. 430 (6996), 161-164 (2004).
  28. Sintchak, M. D., Nimmesgern, E. The structure of inosine 5'-monophosphate dehydrogenase and the design of novel inhibitors. Immunopharmacology. 47 (2-3), 163-184 (2000).
  29. Beaucourt, S., Vignuzzi, M. Ribavirin: A drug active against many viruses with multiple effects on virus replication and propagation. Molecular basis of ribavirin resistance. Current Opinion in Virology. 8, 10-15 (2014).
  30. Hruska, J. F., Bernstein, J. M., Douglas, R. G., Hall, C. B. Effects of Ribavirin on Respiratory Syncytial Virus in vitro. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 17 (5), 770-775 (1980).
  31. Simões, E. A. F., et al. Past, Present and Future Approaches to the Prevention and Treatment of Respiratory Syncytial Virus Infection in Children. Infectious Diseases and Therapy. 7 (1), 87-120 (2018).
  32. Alvarez, R., et al. RNA interference-mediated silencing of the respiratory syncytial virus nucleocapsid defines a potent antiviral strategy. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (9), 3952-3962 (2009).
  33. DeVincenzo, J., et al. A randomized, double-blind, placebo-comtrolled study of an RNAi-based therapy directed against respiratory syncytial virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (19), 8800-8805 (2010).
  34. Zhou, Y., et al. High-throughput screening of a CRISPR/Cas9 library for functional genomics in human cells. Nature. 509 (7501), 487-491 (2014).
  35. Nikolic, J., et al. Negri bodies are viral factories with properties of liquid organelles. Nature Communications. 8 (1), 58 (2017).

Tags

İmmünoloji ve enfeksiyon sayı: 146 ters genetik respiratuvar sinsityal virüs enfeksiyon rekombinant virüs güçlendirme titrasyon etiket Floresan miktar video mikroskobu
Üretimi, güçlendirme ve titrasyon rekombinant solunum sinsisyal virüs
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bouillier, C., Rincheval, V.,… More

Bouillier, C., Rincheval, V., Sitterlin, D., Blouquit-Laye, S., Desquesnes, A., Eléouët, J. F., Gault, E., Rameix-Welti, M. A. Generation, Amplification, and Titration of Recombinant Respiratory Syncytial Viruses. J. Vis. Exp. (146), e59218, doi:10.3791/59218 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter