Summary
Hier introduceren we een methode van halfgeleider sequencing voor pre-implantatie genetische testen voor aneuploïdie (PGT-a) met de voordelen van korte doorlooptijd, lage kosten en hoge doorvoer.
Abstract
Chromosomale aneuploïdie, een van de belangrijkste oorzaken die leiden tot de arrestatie van embryonale ontwikkeling, implantatie falen of zwangerschaps verlies, is goed gedocumenteerd in menselijke embryo's. Preimplantatie genetische testen voor aneuploïdie (PGT-A) is een genetische test die de voortplantings resultaten aanzienlijk verbetert door chromosoomafwijkingen van embryo's te detecteren. Next-generation sequencing (NGS) biedt een hoge doorvoer en een kosteneffectieve aanpak voor genetische analyse en heeft klinische toepasbaarheid aangetoond in PGT-A. Hier presenteren we een snelle en laaggeprijsde NGS-methode op basis van halfgeleider-sequencing voor het screenen van aneuploïdie in embryo's. De eerste stap van de workflow is Whole genoom Amplification (WGA) van het biopsied embryo specimen, gevolgd door de bouw van sequentiëren bibliotheek, en opeenvolgende sequentiëren op het halfgeleider volgorde systeem. Over het algemeen kunnen voor een PGT-A-toepassing 24 samples worden geladen en gesequentieerd op elke chip die 60 − 80 miljoen leesbewerkingen genereert met een gemiddelde lengte van 150 basis paren. De methode biedt een verfijnd protocol voor het uitvoeren van sjabloon versterking en verrijking van sequentiëren bibliotheek, waardoor de PGT-A-detectie reproduceerbaar, hoge doorvoer, kostenefficiënt en tijdbesparend. De looptijd van deze halfgeleider-sequencer is slechts 2 − 4 uur, verkorting van de doorlooptijd van het ontvangen van monsters voor het uitgeven van rapporten in 5 dagen. Al deze voordelen maken deze test een ideale methode om chromosomale aneuploidies uit embryo's op te sporen en zodoende de brede toepassing ervan in PGT-A te vergemakkelijken.
Introduction
Het kiezen van levensvatbare embryo's van goede kwaliteit met normale chromosoom kopie nummers (euploïde) voor overdracht in geassisteerde reproductie helpt de zwangerschapsuitkomsten te verbeteren. Traditioneel wordt het gevestigde morfologische beoordelingssysteem op grote schaal gebruikt voor de evaluatie van embryo's vanwege de gemakkelijke beschikbaarheid en de niet-invasieve aard. Er is echter aangetoond dat morfologische beoordeling slechts beperkte informatie kan verschaffen over embryo kwaliteit1 en implantatie potentiaal2. Een fundamentele reden is het onvermogen om de chromosomale samenstelling van de embryo's te evalueren.
Chromosomale aneuploïdie (abnormaal kopie aantal chromosomen) is een van de belangrijkste oorzaken die tot embryonale ontwikkeling aanhouding, implantatie falen of zwangerschaps verlies leidt. Het optreden van aneuploïdie is goed gedocumenteerd in menselijke embryo's, waarbij 60% − 70% is opgenomen in het splijting-stadium embryo's3,4 en 50% − 60% in blastocysten5. Dit heeft tot op zekere hoogte bijgedragen tot het knelpunt bij het verbeteren van het zwangerschaps percentage van de behandeling in vitro fertilisatie (IVF), dat ongeveer 35% − 40%6,7heeft gehandhaafd. Daarom, het selecteren van euploïde embryo's voor overdracht wordt verondersteld te zijn gunstig voor het verbeteren van de resultaten van de zwangerschap. Hiertoe is een pre-implantatie genetische test voor aneuploïdie (PGT-A) verder ontwikkeld om de leefbaarheid van embryo's te onderzoeken aan de hand van genetische benaderingen. Er zijn toenemende aantallen gerandomiseerde gecontroleerde studies en cohort studies die de cruciale rol van PGT-A ondersteunen. Het is bewezen dat de toepassing van PGT-A vermindert de miskraam tarief en verhoogt de klinische zwangerschap tarief en implantatie tarief8, lopende zwangerschaps tarief en live geboortecijfer9.
Historisch gezien zijn er verschillende methoden toegepast in PGT-A, zoals fluorescentie in situ-hybridisatie (vissen), vergelijkende genomische hybridisatie (CGH), array-CGH en single nucleotide polymorfisme (SNP)-Microarray. Uit eerdere studies is gebleken dat PGT-A voor de splijter fase van embryo's door vissen resultaten oplevert die slecht consistent zijn met die welke zijn verkregen door uitgebreide chromosomale screening (CCS) van overeenkomstige blastocysten met 59273array-cgh of SNP-microarray5927310. Deze verschillen kunnen worden toegeschreven aan chromosomale mosaïsme, vis technische artefacten, of embryonale zelf correctie van chromosoomsegregatie fouten tijdens de ontwikkeling11. Het is alom erkend dat het gebruik van blastocyst trophectoderm (te) biopsieën voor array-gebaseerde PGT-A zoals array-cgh of SNP-Microarray effectief is voor het identificeren van de chromosomale onbalans in embryo's10,12. Onlangs biedt single-cell sequentiëren van de volgende generatie (NGS) een hoge doorvoer en een kosteneffectieve aanpak voor genetische analyse en heeft het klinische toepasbaarheid aangetoond in PGT-a13,14,15, waardoor het een veelbelovend alternatief voor de momenteel beschikbare methoden.
Hier presenteren we een snelle, robuuste en goedkope NGS-methode op basis van halfgeleider-sequencing voor het screenen van aneuploïdie in menselijke embryo's. De eerste stap van de workflow is Whole genoom Amplification (WGA) van het biopsied embryo specimen, met behulp van een WGA Kit met één cel, gevolgd door de bouw van sequentiëren bibliotheek, en opeenvolgende sequentiëren op het halfgeleider volgorde systeem.
Door het detecteren van de H+ -ionen die vrijkomen uit elke deoxyribonucleoside trifosfaat opname tijdens de DNA-strand synthese, draagt het systeem de chemische signalen (pH-verandering) over die door de halfgeleiderelementen worden opgevangen naar directe digitale gegevens , die verder worden geïnterpreteerd in DNA sequentie-informatie. Het elimineren van de eis voor dure optische detectie en complexe sequentie reacties, deze eenvoudige sequentie chemie vermindert de totale reagens kosten en verkort de sequentiëren looptijd in 2 − 4 uur16. Wat nog belangrijker is, op basis van de prestatiespecificaties van de fabrikant, kan het platform voor het sequentiëren van halfgeleider tot 15 GB aan sequentiegegevens genereren (afhankelijk van de kwaliteit van de bibliotheek) per run, wat aanzienlijk hoger is dan sommige van de andere sequencers produceren slechts ongeveer 3 − 4 GB gegevens (met 2 x 75 BP Lees lengte)17. In klinische toepassingen van PGT-A, dit platform kan bereiken 24 monsters per chip genereren tot 80.000.000 leest17 en ten minste 1.000.000 unieke leest van elk monster. De Lees diepte kan ervoor zorgen dat elk monster ten minste 0,05 x hele genoom dekking heeft. De bovenstaande voordelen van dit platform maken het een ideale screeningsmethode en faciliteren zo de brede toepassingen in PGT-A18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ethische goedkeuring werd verleend door de joint Chinese University of Hong Kong-New Territories East cluster klinisch onderzoek ethiek Commissie (referentienummer: 2010,432). Onderzoekslicentie werd goedgekeurd door de Raad voor menselijke voortplantings technologie van Hongkong (nummer R3004).
1. hele genoom versterking
- Controleer vóór aanvang het volume van de magnetische kralen (tabel met materialen) om ervoor te zorgen dat er voor elk monster niet minder dan 135 μL (met een overmaat van 20%) is. Houd de magnetische kralen bij kamertemperatuur (RT) gedurende ten minste 30 min. bereid 720 μL (met een overschot van 20%) van 70% ethanol voor elk monster. Rust een thermische cycler (tafel met materialen) uit met een verwarmd deksel van 105 °c.
Opmerking: de nieuw bereide 70% ethanol (Inhoudsopgave) moet binnen 3 dagen worden gebruikt. - Monstervoorbereiding
Opmerking: in de routinematige praktijk, 5 tot 10 trophectoderm cellen van de blastocyst zijn biopsied volgens de praktijk richtlijn19.- Onderbreek biopsieën in 2 μL 1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) in één enkele 0,2 mL polymerase kettingreactie (PCR) buis.
- Draai de buis kort op een mini centrifuge voor 3 s om de druppels te verzamelen.
- Cellyse en extractie
- Ontdooi de celextractie buffer (tabel met materialen) en de extractie-enzym verdunningsbuffer (tafel van de materialen) op ijs, Vortex en draai kort op een mini centrifuge voor 3 s voor gebruik.
- Voeg 3 μL celextractie buffer toe aan elke buis vanaf stap 1.2.2.
- Bereid een 5 μL cellysismastermix voor elk monster door toevoeging van 4,8 μL extractie enzym verdunningsbuffer en 0,2 μL celextractie-enzym (tabel van materialen). Meng goed en ALIQUOT in elke buis van stap 1.3.2. Draai de tube zachtjes en spin op een mini centrifuge voor 3 sec.
Opmerking: tips mogen de vloeistof met de celvoorbeelden niet aanraken bij het toevoegen van de mastermix. - Incuberen de buis van stap 1.3.3 in de thermische cycler met verwarmde deksel. Voer het programma uit met de volgende instellingen: 10 min bij 75 °C, 4 min bij 95 °C, vasthouden bij 4 °C.
- Versterking
- Ontdooi de preamplificatie buffer (tafel van de materialen) op ijs, Vortex en draai kort op een mini centrifuge voor 3 s voor gebruik.
- Maak voor elk monster een 5 μL preamplificatie Master mix door toevoeging van 4,8 μL preamplificatie buffer en 0,2 μL preamplificatie enzym (tabel met materialen). Meng goed en ALIQUOT in elke buis uit stap 1.3.4. Draai de tube zachtjes en spin op een mini centrifuge voor 3 sec.
Opmerking: tips mogen de vloeistof met de DNA-samples niet aanraken bij het toevoegen van de mastermix. - Incuberen de buis in de thermische cycler met verwarmde deksel. Voer het programma uit met de vloeiende instellingen: 2 min bij 95 °C; 12 cycli voor 15 s bij 95 °C, 50 s bij 15 °C, 40 s bij 25 °C, 30 s bij 35 °C, 40 s bij 65 °C, 40 s bij 75 °C; vasthouden bij 4 °C.
- Versterking
- Ontdooi de versterkings buffer (tabel met materialen) op ijs, Vortex en draai kort op een mini centrifuge voor 3 s voor gebruik.
- Maak voor elk monster een versterkings hoofdmix van 60 μL met 25 μL versterkings buffer, 0,8 μL versterkings enzym (tabel met materialen) en 34,2 μL Nuclease vrij water voor WGA (Inhoudsopgave). Meng goed en ALIQUOT in elke buis van stap 1.4.3. Draai de tube zachtjes en spin op een mini centrifuge voor 3 sec.
- Incuberen de buis in de thermische cycler met verwarmde deksel. Voer het programma uit met de volgende instellingen: 2 min bij 95 °C; 14 cycli voor 15 s bij 95 °C, 1 minuut bij 65 °C, 1 minuut bij 75 °C; vasthouden bij 4 °C.
- Zuivering van de betreffende WGA producten
- Breng elk WGA-product van stap 1.5.3 over naar nieuwe buizen van 1,5 mL. Voeg 112,5 μL magnetische kralen toe aan elke buis. Vortex en incuberen bij RT gedurende 5 min.
Opmerking: Meng de magnetische kralen volledig voor gebruik. - Plaats de buisjes gedurende 3 minuten op een magnetische standaard (tabel met materialen) totdat het supernatant helder is. Gooi alle supernatant weg zonder de kralen te storen.
- Voeg 300 μL 70% ethanol toe aan elke buis. Draai elke buis 180 ° om de parels door het ethanol te laten rennen en terug te draaien naar de oorspronkelijke positie. Gooi alle supernatant weg nadat de kralen zijn afgewikkeld zonder de kralen te storen. Herhaal deze stap één keer.
Opmerking: Houd de buis op de magnetische standaard terwijl u de buis horizontaal draait. - Draai elke buis kort op een mini centrifuge voor 3 sec. plaats de buisjes op de magnetische standaard totdat de rest supernatant helder is. Gooi alle resterende supernatant weg zonder de kralen te storen. Lucht drogen de parels bij RT voor ongeveer 3 min.
- Verwijder de buizen van de magnetische standaard en hervat de gedroogde parels door toevoeging van 35 μL lage tris-EDTA (TE) buffer (tabel met materialen). Incuberen bij RT gedurende 5 min.
- Plaats de buisjes gedurende 3 minuten op de magnetische standaard totdat het supernatant helder is. Breng al het supernatant met het eikende DNA over naar nieuwe 1,5 mL buizen zonder de kralen te storen.
- Breng elk WGA-product van stap 1.5.3 over naar nieuwe buizen van 1,5 mL. Voeg 112,5 μL magnetische kralen toe aan elke buis. Vortex en incuberen bij RT gedurende 5 min.
2. kwaliteitscontrole van de WGA-producten
- Kwantificeer elk gezuiverd WGA-product uit stap 1.6.6 met een fluorometer assay (tabel met materialen) volgens de handleiding van de fabrikant waarbij 1 ΜL WGA-product als uitgangsmateriaal wordt gebruikt.
Opmerking: de geaccepteerde concentratie van het WGA-product is ≥ 10 ng/μL. Elk product onder deze drempelwaarde wordt niet aanbevolen om door te gaan naar de volgende stappen.
3. fragmentatie van WGA-producten
- Verwarm vóór het begin een droge blok verwarmer tot 37 °C. Bereid 6 μL (met een overschot van 20%) van 0,5 M EDTA voor elk monster. Op basis van de concentratie, aliquot 300 ng van het DNA van elk gezuiverd WGA-product in stap 1.6.6 naar nieuwe PCR-buizen van 0,2 mL en breng het volume naar 16 μL met Nuclease vrij water voor elke buis.
-
Fragmentatie
- Bereid een 4 μL dubbel gestrande DNA (dsDNA) fragmentatie reactiemengsel voor elk monster door 2 μL dsDNA-fragmentatie reactiebuffer (tabel met materialen) en 2 μl dsDNA-fragmentatie-enzymen (tabel metmaterialen) toe te voegen. Meng goed en ALIQUOT in elke buis uit stap 3,1. Vortex en draai kort op een mini centrifuge voor 3 s. incuberen de buisjes gedurende 25 minuten bij 37 °C in een thermische cycler met verwarmd deksel.
- Voeg onmiddellijk 5 μL 0,5 M EDTA toe aan elke buis. Meng goed door grondig en draai kort op een mini centrifuge voor 3 sec.
-
Zuivering en resuspensie
- Breng elk product van stap 3.2.2 over in nieuwe 1,5 mL tubes. Voeg 37,5 μL magnetische kralen toe aan elke buis. Meng door vertexing en incuberen op RT gedurende 5 min.
- Reinig de producten zoals beschreven in stap 1.6.2 naar stap 1.6.4.
- Elute elk gezuiverd product zoals beschreven in de stappen 1.6.5 en 1.6.6 door toevoeging van 32 μL laag-TE buffer.
4. bibliotheek constructie
-
Blunt- e ND r epairment, grootte selectie en zuivering
- Maak voor elk monster een 20 μL botte-end herstellings mengsel door toevoeging van 9,5 μL Nuclease vrij water, 10 μL 5x eind reparatie buffer (tabel met materiaalbuisjes uit stap 3.3.3. Vortex en draai kort op een mini centrifuge voor 3 sec.
- Voeg vanaf stap 4.1.1 50 μL magnetische kralen toe aan elke buis. Vortex en incuberen bij RT gedurende 5 min.
Opmerking: Meng de magnetische kralen volledig voor gebruik. - Plaats elke buis gedurende 3 minuten op de magnetische standaard totdat het supernatant helder is. Breng alle supernatant over naar nieuwe 1,5 mL tubes waar voor elk 25 μL magnetische kralen worden toegevoegd. Vortex de buisjes met het overgebrachte supernatant en inbroed bij RT gedurende 5 min.
- Reinig de producten in de geïnde buisjes zoals beschreven in stap 1.6.2 naar stap 1.6.4.
- Elute elk gezuiverd product zoals beschreven in de stappen 1.6.5 en 1.6.6 door toevoeging van 32 μL laag-TE buffer.
Opmerking: dit is een veilig stoppunt; het gezuiverde DNA uit deze stap is stabiel bij 4 °C gedurende niet meer dan 24 uur.
-
Adaptor l igatie en p urificatie
- Maak voor elk monster een 17 μL adapter ligatie mengsel door 10 μL Nuclease vrij water toe te voegen, 5 μL 10x ligase buffer (tabel met materialen), 1 μl P1-adapter (tabel metmaterialen) en 1 μl DNA-ligase (tabel metmaterialen). Meng goed door grondig voor 5 s en spin op een mini centrifuge voor 15 s, en ALIQUOT in elke buis uit stap 4.1.5.
- Voeg 1 μL adapters (tabel met materialen) toe aan elke buis uit stap 4.2.1 volgens het monster blad (aanvullend bestand: monster blad voor de ligatievan de adapter). Vortex en draai kort op een mini centrifuge voor 3 s. Inincuberen van de buisjes bij RT (20 − 25 °C) gedurende 20 min.
- Voeg vanaf stap 4.2.2 75 μL magnetische kralen toe aan elke buis. Meng door vertexing en incuberen op RT gedurende 5 min. Reinig vervolgens de producten zoals beschreven in stap 1.6.2 naar stap 1.6.4.
- Elute elk gezuiverd product zoals beschreven in stappen 1.6.5 en 1.6.6 door toevoeging van 15 μL laag-TE buffer. Breng al het supernatant met het eikende DNA over naar nieuwe 0,2 mL 8-Tube strips.
Opmerking: dit is een veilig stoppunt; het gezuiverde DNA uit deze stap is stabiel bij 4 °C gedurende niet meer dan 24 uur.
-
Versterking en zuivering
- Maak voor elk monster een versterkings Master van 50 μL, door toevoeging van 47,5 μL Super mix (tabel met materialen) en 2,5 μl primer mengsel (tabel met materialen). Meng goed door grondig en draai kort op een mini centrifuge, en ALIQUOT in de 0,2 ml 8-Tube strips uit stap 4.2.4.
- Vortex de strips voor 30 s en draai kort op een mini centrifuge voor 3 s. incureer de strips in de thermische cycler met verwarmde deksel. Voer het programma uit met de volgende instellingen: 20 min bij 72 °C; 5 min bij 95 °C; 10 cycli voor 15 s bij 95 °C, 15 s bij 62 °C, 1 minuut bij 70 °C; 5 min bij 70 °C; vasthouden bij 4 °C.
- Breng elk product van stap 4.3.2 over in nieuwe buizen van 1,5 mL. Voeg 97,5 μL magnetische kralen toe aan elke buis. Meng door grondig en inincuberen bij RT gedurende 5 min.
- Reinig de producten zoals beschreven in stap 1.6.2 naar stap 1.6.4.
- Elute elk gezuiverd product zoals beschreven in stap 1.6.5 en 1.6.6 door toevoeging van 25 μL laag-TE buffer.
5. kwaliteitscontrole en verdunning van de DNA-bibliotheek
- Kwantificeer elke bereide DNA-bibliotheek uit stap 4.3.5 door de fluorometer test volgens de handleiding van de fabrikant met 2 μL DNA-bibliotheek als uitgangsmateriaal.
- De geaccepteerde concentratie van de DNA-bibliotheek is ≥ 0,5 ng/μL en die van de positieve controle (tabel met materialen) is ≤ 15 ng/μl. Als de concentratie van de positieve controle te veel varieert van 15 ng/μL, herhaalt u de kwantificering van de positieve controle totdat de concentratie dicht bij 15 ng/μL ligt. Als de concentratie van de bibliotheek lager is dan 0,5 ng/μL, herstart dan de fragmentatie (sectie 3).
Opmerking: Zorg ervoor dat de concentratie van de positieve controle de geaccepteerde waarde bereikt voordat de DNA-bibliotheek wordt gekwantificeert. - Verdun elke bibliotheek tot 100 pmol door Nuclease vrij water toe te voegen. Voeg 1 μL bibliotheek toe aan n μL Nuclease vrij water; Bereken n met behulp van de onderstaande vergelijking:
waarbij Q de concentratie is van elke door de test van de fluor meter gemeten meting en C de concentratie van de positieve controle gemeten door de fluorometer test.
6. sequentiëren
- Maak vóór aanvang 48 μL (met een overmaat van 20%) van 1 M NaOH voor elk monster en één Nuclease-vrije 1,5 mL Tube. Ontdooi de Master Mix PCR-buffer (tabel met materialen) (2000 μL in volume) bij RT. Breng de bol-deeltjes (tabel metmaterialen) naar RT.
- Bibliotheek pooling
- Vortex elke verdunde bibliotheek van stap 5,3 en draai kort 4x op een mini centrifuge voor 3 s elke keer. Neem 5 μL van elke bibliotheek naar pool in de Nuclease-vrije 1,5 mL Tube. Vortex de Mixed Library en draai kort op een mini centrifuge voor 3 s.
- Emulsie PCR met behulp van een emulsie systeem
- Voeg 150 μL breek oplossing toe aan 2 nieuwe herstel buizen (tabel met materialen). Installeer de nieuwe herstel buizen, de herstel router en de versterkings plaat.
- Meng door de olie fles (tabel van de materialen) 3 keer te inverteren. Zorg ervoor dat zowel de olie-als de terugwinnings oplossing (tabel met materialen) ten minste 2/3 vol zijn.
- Vortex de Master Mix PCR buffer voor 30 s en draai kort op een mini centrifuge voor 3 s. Vortex de bol-deeltjes en de gemengde bibliotheek van stap 6.2.1 gedurende 1 minuut en draai kort op een mini centrifuge voor 3 s.
- Bereid een ligatie mengsel van 2400 μL door 172 μL Nuclease vrij water toe te voegen, 8 μL gemengde bibliotheek van stap 6.3.3, 120 μL enzym mengsel (tabel van de materialen) en 100 μL bol-deeltjes in de buis met 2000 μL Master Mix PCR-buffer.
- Stel een pipet in op 800 μL. Laad de ligatie-mix van stap 6.3.4 naar het reactie filter (tabel met materialen) via de voorbeeld poort. Gebruik een pipet van 1000P om 200 μL reactie olie toe te voegen aan het reactie filter.
- Selecteer het programma Proton: Ion Pi Hi-Q OT2 200 Kiten selecteer vervolgens Assisted om ervoor te zorgen dat het apparaat correct is ingesteld door de instructies op de monitor te volgen. Klik vervolgens op volgende om het programma te starten.
- Verrijking door een automatisch verrijkings systeem
- Wanneer het emulsie-PCR-programma is voltooid, klikt u op volgendeen vervolgens op Final spin om 10 minuten te draaien. Haal de 2 herstel buizen na het klikken op open deksel.
- Gooi de supernatant weg van de 2 terugwinnings buizen tot 100 μL in elke buis blijft en label dienovereenkomstig. Meng de oplossing goed en breng over naar een nieuwe 1,5 mL Tube.
- Voeg 200 μL Nuclease vrij water toe aan elke terugwinnings buis, spoel meerdere malen op en neer met pipetteren en breng alle oplossing naar de buis van 1,5 mL in stap 6.4.2. Herhaal de wasstap één keer.
- Voeg 200 μL Nuclease vrij water toe aan een van de terugwinnings buizen en spoel meerdere malen op en neer. Breng alle oplossingen over naar de andere herstel buis en was meerdere malen op en neer. Vervolgens, overdracht van alle oplossing naar dezelfde 1,5 mL buis uit stap 6.4.3. Vortex de 1,5 mL buis voor 30 s en centrifuge gedurende 8 min bij 15.500 x g.
Opmerking: het uiteindelijke totale volume van het emulsie PCR-product in deze stap moet ongeveer 1200 μL zijn. - Gooi het supernatant in de buis weg en houd 20 μL van het emulsie PCR-product. Voeg 80 μL resuspensie oplossing (tabel van de materialen) toe aan de buis. Meng door Pipetteer op en neer.
- Bereid een smelt oplossing van 320 μl voor elke chip door 280 μL polyethyleenglycol polyethyleenglycolsorbitaanmono monolauraatoplossing (tabel met materialen) en 40 μL van 1 M NaOH toe te voegen.
Opmerking: 1 M NaOH moet worden bewaard bij 4 °C of vers bereid. Vortex voor gebruik. - Vortex de buis met C1 kralen (tabel van de materialen) voor 30 s. Neem 100 μL C1 kralen naar een nieuwe buis van 1,5 mL. Plaats de buis van 1,5 mL op de magnetische standaard gedurende 2 minuten bij RT. Gooi alle supernatant weg nadat de parels zich hebben opgelost zonder de kralen te storen.
- Voeg 1 mL wasoplossing C1 (tabel met materialen) toe aan de buis vanaf stap 6.4.7. Vortex voor 30 s. plaats de buis gedurende 2 minuten op de magnetische stand op de RT. Gooi alle supernatant weg nadat de parels zich hebben opgelost zonder de kralen te storen. Respendeer de parels door toevoeging van 130 μL Bead Capture Solution (tabel met materialen).
-
Verrijkings systeem (ES) installatie
- Laad het monster (100 μL emulsie PCR-product) uit stap 6.4.5, de gewassen kralen (130 μL) uit stap 6.4.8, ES Wash Solution (300 μL) (tabel met materialen) en smelt oplossing (300 μl) van stap 6.4.6 in de 8-Tube strip. De volgorde van de lay-out is: monster (buis 1), gewassen kralen (buis 2), ES Wash-oplossing (buizen 3, 4, 5) en smelt oplossing (buis 7). Houd de buizen 6 en 8 leeg.
- Plaats de 8-Tube strip van stap 6.4.9.1 op de ES. Installeer een pipetpunt en een nieuwe 0,2 mL Tube en start het programma.
Opmerking: Zorg ervoor dat pipetteren normaal werkt.
- Was de bol-deeltjes nadat de verrijking is voltooid.
- Centrifugeer de 0,2 mL buis van stap 6.4.9.2 gedurende 5 min bij 15.500 x g. Gooi het supernatant weg en houd 10 μL van het verrijkings middel. Voeg 200 μL Nuclease vrij water toe aan de buis. Meng door vortexing.
- Centrifugeer de 0,2 mL buis van 5 min bij 15.500 x g. Gooi het supernatant weg en houd 10 μL van het verrijkings middel. Voeg 90 μL Nuclease vrij water toe aan de buis. Meng door vortexing.
- Voorbereiding van sjablonen
- Vortex de positieve controle en draai kort. Voeg 5 μL positieve controle toe aan de 100 μL-sjabloon (het verrijkings product uit stap 6.4.10.2). Vortex en centrifuge gedurende 5 min bij 15.500 x g. Gooi de supernatant weg en houd 10 μL van de sjabloon.
- Voeg 20 μL volgorde primer (tabel met materialen) en 15 μL gloei buffer (Inhoudsopgave) toe aan de sjabloon buis uit stap 6.5.1. Vortex de buis en draai kort op een mini centrifuge voor 3 s.
- Incuberen de buis van stap 6.5.2 in de thermische cycler met verwarmde deksel. Voer het programma uit met de volgende instellingen: 2 min bij 95 °C, 2 min bij 37 °C, vasthouden bij 4 °C.
- Voeg 10 μL laad buffer (tabel met materialen) toe aan de buis vanaf stap 6.5.3. Meng door Pipetteer op en neer.
- Sequencer-initialisatie
- Controleer de tankdruk van stikstofgas (totale druk ≥ 500 psi, Uitgangsdruk ≥ 10 psi, Optimum 20-30 psi). Top-up 100 mL gedeïoniseerd water (18,2 MΩ) C1 en C2 buizen (tabel van de materialen) en installeer ze op overeenkomstige C1 en C2 posities op de sequencer.
- Bereid W1 (32 μL van 1 M NaOH) en w3 (40 − 50 mL w3 buffer [Table of Materials]) oplossingen voor. Bereid W2-oplossing voor door 1920 mL gedeïoniseerd water (18,2 MΩ) toe te voegen, een hele fles W2-buffer (tabel met materialen) en 8 − 12 μL van 1 M NaOH, en 4 − 8 keer omkeren om te mengen.
Opmerking: omdat de waterkwaliteit geologisch varieert, past u het volume van 1 M NaOH zo nodig aan. De begin pH van W2 is 5,9 − 6,1 en het optimale bereik na afstelling is 7,4 − 7,6. Verander en installeer nieuwe reagens buizen en gebruik de laatste tijd gebruikte chip voor het wassen. - Bereid de 4 nieuwe lege buizen van de sequencing aanvulling Kit (tabel van de materialen). Label de 4 buisjes als dGTP, dCTP, dATP en dTTP, en voeg 70 μL dGTP, dCTP, dATP of dTTP (tabel metmaterialen) toe aan de corresponderende buis (D.w.z. 70 ΜL dgtp naar de buis met het label dgtp, enz.). Vortex de buizen voor gebruik. Installeer de buizen op de overeenkomstige posities die zijn aangegeven op de sequencer (tabel van de materialen).
- Chip Wash
- Was de chip (tabel van de materialen) eenmaal door het injecteren van 100 μL isopropanol in de laad put van de chip. Verwijder de verdreven vloeistof uit de tegenovergestelde put.
- Was de chip tweemaal door het injecteren van 100 μL Nuclease-vrij water in de laad put van de chip. Verwijder de verdreven vloeistof uit de tegenovergestelde put.
- Was de chip één keer door 100 μL 0,1 M NaOH in het laadgoed van de chip te injecteren. Verwijder de verdreven vloeistof uit de tegenovergestelde put. Incuberen bij RT gedurende 1 minuut.
- Was de chip eenmaal door het injecteren van 100 μL Nuclease-vrij water in de laad put van de chip. Verwijder de verdreven vloeistof uit de tegenovergestelde put.
- Was de chip twee keer door het injecteren van 100 μL isopropanol in de laad put van de chip. Verwijder de verdreven vloeistof uit de tegenovergestelde put. Droog door stikstof op de chip te blazen. Verwijderd houden van licht.
- Voorbeeld laden en sequentiëren
- Meng het 55 μL monster van stap 6.5.4 door het pipetteren op en neer en laad het monster in de laad put van de chip.
Opmerking: Houd de pipetpunt en de PCR-buis van 0,2 mL die in deze stap worden gebruikt. - Plaats de chip op de chip mini centrifuge (tabel met materialen) wanneer
- Maak twee nieuwe 1,5 mL tubes voor de gloei buffer en spoeloplossing. Bereid de 50% gloeien buffer voor door 500 μL gloei buffer en 500 μL Nuclease vrij water toe te voegen. Bereid de spoeloplossing voor door 500 μL gloeien buffer en 500 μL 100% 2-propanol toe te voegen.
- Bereid twee nieuwe buizen van 1,5 mL voor en bereid het schuimende mengsel voor door 49 μL 50% gloei buffer en 1 μL schuimende oplossing (tabel met materialen) in beide buisjes te mengen.
- Stel een pipet in op 100 μL. Maak bubbels door lucht in het schuimende mengsel te pipetteren van een van de twee buizen uit stap 6.8.4. Maak > 120 μL bubbels en blijf pipetteren totdat er geen uitstekende zichtbare bubbels te zien zijn. Plaats 120 μL bubbels in het laadgoed.
Opmerking: Zorg ervoor dat er geen uitstaande zichtbare bubbels zijn. Anders, start het over. - Overdracht van de buitensporige verdreven vloeistof van de uitgang goed van stap 6.8.5 naar het laden goed door pipetteren. Pipetteer geen bubbels. Centrifugeer de chip voor 30 s op de chip mini centrifuge.
- Herhaal stap 6.8.5 met behulp van de tweede buis met het schuimende mengsel uit stap 6.8.4.
- Voeg 55 μL van de 50% gloei buffer toe aan de buis van 0,2 mL die in stap 6.8.1 wordt gehouden. Gebruik de gehouden pipetpunt in stap 6.8.1 om op en neer te Pipetteer. Laad de gloei buffer van 55 μL in het laadruim. Centrifugeer de chip voor 30 s op de aangewezen chip mini centrifuge.
- Laad de spoeloplossing 100 μL in de chip die goed wordt geladen en gooi de verdreven vloeistof van de uitgang goed weg. Herhaal deze laad stap één keer.
Opmerking: als er bellen in de chip, verdrijven kleine bubbels door grote bubbels en spoelen doorspoelen oplossing. Dit kan worden bereikt door het pipetteren van 100 μL spoeloplossing en het verlaten van 5 μL lucht onder de spoeloplossing. Daarom zal lucht bij het pipetteren van de 105 μL in de chip een grote bubbel vormen die de kleine bubbels kan verdrijven, en vervolgens kan de grote bubbel worden uitgezet door de volgende spoeloplossing. - Laadt 100 μL van de 50% gloeien buffer in de spaan belading goed. Herhaal deze laad stap voor een totaal van 3 keer.
- Voeg 6 μL van het sequentie-enzym toe aan 60 μL van de 50% gloei buffer in een nieuwe tube van 1,5 mL. Meng door Pipetteer op en neer. Laad 65 μL van deze gemengde oplossing in het goed laden van de chip. Pipetteer langzaam om schuimvorming te voorkomen.
- Houd de chip uit de buurt van licht en incuberen op RT gedurende 5 minuten.
- Na de incubatie laadt u de chip onmiddellijk op de sequencer en klikt u op Start de sequentiëren uitvoeren op het scherm om de sequencing te starten.
Opmerking: de sequentiëren RAW-gegevens en kwaliteitscontrole bestanden worden automatisch naar het bedrijf geüpload voor gegevensanalyse.
- Meng het 55 μL monster van stap 6.5.4 door het pipetteren op en neer en laad het monster in de laad put van de chip.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Op basis van dit gewijzigde protocol werd het platform voor halfgeleider sequencing voor het eerst toegepast voor PGT-A. We testten op biopsieën van zowel de decolleté-stage blastomeres en blastocyst-stage embryo's. Er wordt gesuggereerd dat de biopsied cellen zo snel mogelijk een WGA ondergaan om eventuele afbraak van DNA te voorkomen. Een eerdere studie vergeleken de prestaties van verschillende WGA methoden en gaf aan dat de methode die we hier beschreven had de beste uniformiteit op de grootte van de bin van 100 KB20. Gezien de prestaties van zowel uniformiteit als mediaan absoluut Pairwise verschil (MAPD)21, werd deze WGA-methode gekozen voor PGT-A met behulp van de halfgeleider-sequencer. Door middel van een retrospectieve statistische analyse op 186 decolleté en 1135 blastocyst fase embryo's, hebben we geconstateerd dat de WGA-slagingspercentages 95,4% waren in blastomere monsters en 96,9% in blastocyst monsters (Figuur 1). De zuiveringsstap vóór de bibliotheek constructie als een maat selectieprocedure was cruciaal voor de sequentiëren van kwaliteit door grote DNA-fragmenten te vangen. Bovendien faciliteerde het de input hoeveelheid van 300 ng voor de bouw van de bibliotheek. De enzymatische fragmentatie methode stelde een efficiënte afschuiving van WGA-producten in ongeveer 160 BP.
Gegevensanalyse werd uitgevoerd met behulp van de Euclidische afstand en circulaire binaire segmentatie (EDCBS) analysesysteem. In-House validatie werd uitgevoerd om de robuustheid van dit bioinformatische algoritme te evalueren. We hebben een referentiedatabase opgericht die exclusief is voor PGT-A via sequencing 379 WGA-producten van 66-cellijnen met bekende karyotypes door een opslaglocatie van 100 KB te analyseren. Uit deze database is een referentiebereik afgebakend als de drempel voor het aanroepen van Copy Number variant (CNV) en 10 MB is ingesteld als de afsluit waarde voor het detectieniveau. Zowel gevoeligheid als specificiteit bereikte meer dan 99% bij deze drempel (tabel 1). In de toepassing voor PGT-A op embryo biopsieën werd de venstergrootte ingesteld op 400 KB met een schuifraam benadering om voldoende leesbewerkingen te bereiken. De kwaliteitscontrole (QC) van elk monster werd bepaald door unieke Lees-, MAPD-en standaarddeviatie van de Kopieer nummer variant (CNV ∙ SD). Monster na een van de drie indexen is gedefinieerd als QC-fout (figuur 2c). Interpretatie van chromosoom spreidings plots (Figuur 2a,B, D) werd uitgevoerd door gekwalificeerde genetici na een workflow door de geïdentificeerde CNV te vergelijken met Decipher, DGV of Clingen databases. Individuele discrepanties werden beheerst door een deskundige curatie procedure. Chromosomale afwijkingen werden gegroepeerd in aneuploïdie en mosaicisme in blastocyst monsters. De winst of het verlies van een afschrift binnen het bereik van 30% − 70% werd geclassificeerd als het dragen van mozaïek chromosomale samenstelling; anders zou het resultaat geïnterpreteerd worden als euploïdie of aneuploïdie. In deze studie, de euploïde tarieven waren 45,2% in blastomeres en 52,3% in blastocysts, die weergaf aan gepubliceerde gegevens22,23.
Figuur 1: demografische statistieken van 1321 embryo biopsieën getest met deze methode. (A) gegevens uit 186 decolleté-fase embryo's. B) gegevens over 1135 blastocyst-stage embryo's. WGA-succespercentages zijn meer dan 95% in beide soorten specimens. Volgordebepaling van de kwaliteitscontrole mislukt 3,4% in de groep Cleavage-stage en slechts 1,9% in de groep blastocyst-stage. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: representatieve resultaten van PGT-een klinische toepassing van het embryo voor de 23 paar chromosomen. Representatieve resultaten van (a) euploïdie; B) aneuploïdie (SEQ [GRCh37] (2) x3, (21) x3); C) sequentie QC mislukte steekproef als gevolg van CNV ∙ SD op 0,6571 (aanvaarding ≤ 0,4); D) gesegmenteerde mozaïek verwijdering (55%) van 4p 16.3 p 15.1 (29,50 MB). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| CNV-drempelwaarde | ||||||
| (-0,23, 0,20) | (-0,32, 0,26) | (-0,41, 0,32) | (-0,51, 0,37) | (-0,62, 0,43) | (-0,73, 0,48) | |
| Gevoeligheid | 100,00% | 100,00% | 100,00% | 100,00% | 98,30% | 96,02% |
| Specificiteit | 72,41% | 81,03% | 91,38% | 99,10% | 99,54% | 100,00% |
Tabel 1: gevoeligheid en specificiteit tussen de verschillende log R-verhoudingen door de halfgeleider-sequencer. Een totaal van 240 monsters met bekende euploïde karyotype resultaten werden getest door deze methode en aangeroepen bij verschillende log R verhoudingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Verschillend van andere sequentiëren chemici, de sequencer hier beschreven gebruikt halfgeleider voor de detectie van nucleotiden. De chip zelf is een elektronisch apparaat dat waterstof ionen detecteert door middel van polymerase-gedreven base incorporatie17, die 2 − 4 h sequentie tijd van het proton programma mogelijk maakt. Trouwens, de chip is een micro well chip die het mogelijk maakt de lokalisatie van een doelwit molecuul, die verschilt van de flowcell sequentie chemie door andere sequencer providers. Dit protocol is een aangepast protocol dat is geoptimaliseerd voor de toepassing van PGT-A. De optimalisatie omvat fragmentatie van versterkt DNA door de enzymatische methode in plaats van sonicatie om de kans op verontreiniging te verminderen, evenals de maat-selectie en het PCR-systeem voor betere prestaties met lagere kosten. Bovendien hebben we in de klinische setting een gevalideerde in-House pipeline gebruikt voor het aanroepen van varianten.
Er zijn belangrijke stappen om bewust te zijn van tijdens de praktijk. Ethanol voor zuivering moet worden vers bereid vóór het experiment, als een hoge concentratie van ethanol zou leiden tot onvoldoende wassen van besmette DNA terwijl een lage concentratie zou leiden tot verlies van doelwit DNA. De fluor meter moet worden gekalibreerd door de positieve controle met een bekende concentratie om de nauwkeurigheid te garanderen. Bovendien is een adequate belasting van het sjabloon cruciaal voor sequencing. Bubbels van de juiste grootte helpen om de sjabloon bol te duwen om in micro putten te vallen, maar te grote bubbels kunnen onvoldoende laden veroorzaken. Gebruikers kunnen het aantal voorbeelden (niet noodzakelijkerwijs 24) wijzigen om te worden gesequentieerd voor elke uitvoering. Er zijn 96 indexen ontworpen voor deze chip. Maar sequentiëren Lees diepte zal afnemen met het verhogen van samples per chip. Een van de meest voorkomende problemen is de lage concentratie van de bibliotheek, die kan worden toegeschreven aan een lage of slechte kwaliteit DNA-output van zuivering als gevolg van residuele ethanol of magnetische kralen, of het kraken van kralen zoals eerder vermeld. Een suboptimale DNA-output kan ook het gevolg zijn van een lage efficiëntie van PCR, die kan worden gecorrigeerd door voorzichtige bereiding van de Master mix met nauwkeurige monster ingangen en temperatuurcontrole van de thermische cyclers. Voor sequencing QC-mislukte monsters, zoals die met hoge CNV ∙ SD-waarden (figuur 2c), is het raadzaam om de monsters op een bioanalyzer voor grootte distributie analyse uitvoeren.
Een van de beperkingen van deze methode is de hogere False single-nucleotide belsnelheid in vergelijking met andere platforms. Het foutenpercentage is 1% in vergelijking met slechts 0,1% Indel vals-positief tarief door andere sequencers17. Dit is echter geen bepalende factor voor CNV calling of PGT-A analyse. In vergelijking met andere platformen minimaliseert de toepassing van het emulsie systeem operatieve discrepanties en Pipetteer fouten, waardoor de bibliotheek kwaliteit toeneemt. Dit is een significant voordeel van onze methode in vergelijking met andere platformen, omdat de dsDNA-concentratie zeer laag is en een nauwkeurige kwantificering vereist is voor de volgende groepsgewijze groepering. Onze methode introduceerde de kalibratie van fluorometer kwantificering met behulp van een standaard positieve controle om detectiefouten te regelen.
Als een platform met een hoge doorvoer met korte doorlooptijd is de halfgeleider-sequencer ideaal voor PGT-A en kan op grote schaal worden toegepast op IVF-patiënten met PGT-een klinische indicaties zoals gevorderde leeftijd voor moeders24jaar. Deleye et al. voerde parallelle sequencing van menselijke blastocysten uit om de prestaties van de halfgeleider-sequencer te vergelijken met andere sequencers25. Bovendien heeft deze PGT-A-Kit de "speciale goedkeuringsprocedure voor innovatieve medische hulpmiddelen" verkregen van de China Food and Drug Administration en is klinisch gebruikt voor duizenden embryo's. Qua kosten is de prijs van dit platform de helft van de prijs per Giga-basis in vergelijking met een ander algemeen gebruikt platform in de PGT-A-markt. De trophectoderm-cellen kunnen de genetische constitutie van het embryo26op betrouwbare wijze weergeven. Deze methode kan mogelijk worden ontwikkeld voor PGT voor monogene/enkelvoudige genziekten (PGT-M) als Treff et al. hebben aangetoond27. In hun model hebben ze 300 MB tot 1 GB doorvoer op PGT-M van 16 embryo biopsieën vergemakkelijkt en de resultaten vergeleken met twee conventionele PGT-M-methoden. Door 16 samples te vangen en te laden, bereikte hun methode ten minste 100x Lees diepte van het beoogde gebied en resulteerde in 100% betrouwbaarheid en reproduceerbaarheid27. De doorvoer van de halfgeleider sequencer door ons protocol kan oplopen tot 15 GB en er zijn 96 barcodes ontworpen; Daarom kan, indien toegepast op gerichte PGT-M, een aanzienlijk aantal embryonale biopsieën door één chip met een hoge lees diepte worden gesequentieerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Deze studie werd gesteund door het algemeen onderzoeksfonds (Ref nr. 14162417) uit Hong Kong, de National Natural Science Foundation of China (Ref nr. 81860272), het belangrijkste onderzoeksplan van de provinciale wetenschaps-en technologiestichting van Guangxi (Ref. AB16380219), en de China postdoctorale Science Foundation Grant (Ref. 2018M630993) uit China.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PCR tubes, 0.2 mL | Axygen | PCR-02D-C | |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | ThermoFisher | 15575020 | |
| PBS, pH 7.4, Ca2+ and Mg2+ free | ThermoFisher | 10010023 | |
| 1.0 M NaOH (1.0N) solution | SIGMA-ALDRICH | S2567 | For Melt-off solution. Molecular grade |
| Eppendorf LoBind Tubes, 1.5 mL | Fisher Scientific | 13-698-791 | |
| Ion Plus Fragment Library Kit | ThermoFisher | 4471252 | |
| ELGA PURELAB Flex 3 Water Purification System or Equivalent 18 MΩ water system |
ThermoFisher | 4474524 | |
| Ion Plus Fragment Library Kit | ThermoFisher | 4471252 | |
| PicoPLEX WGA Amplification buffer | Rubicon Genomics | R30050 | This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03. |
| PicoPLEX WGA Amplification enzyme | Rubicon Genomics | R30050 | This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03. |
| Ion OneTouch Amplification Plate | In kit: Ion OneTouch 2 Supplies (Part No. A26367). Extended kit component in Sheet 5 | ||
| Ion PI Annealing Buffer | |||
| MyOne Beads Capture Solution | |||
| Agilent 2100 Bioanalyzer instrument | Agilent | G2939AA | |
| Ion OneTouch Breaking Solution (black cap) | In kit: Ion PI Hi?Q OT2 Solutions 200 (Part No. A26429). Extended kit component in Sheet 5 | ||
| Dynabeads MyOne Streptavidin C1 | ThermoFisher | 65001 | |
| PicoPLEX WGA Cell extraction buffer | Rubicon Genomics | R30050 | This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-00. |
| PicoPLEX WGA Cell extraction enzyme | Rubicon Genomics | R30050 | This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03. |
| Ion PI Chip Kit v3 | ThermoFisher | A26771 | |
| Ion Chip Minifuge, 230 V | ThermoFisher | 4479673 | |
| Ion PI dATP | ThermoFisher | A26772 | |
| Ion PI dCTP | ThermoFisher | A26772 | |
| Ion PI dGTP | ThermoFisher | A26772 | |
| Ion Plus Fragment Library Kit | ThermoFisher | 4471252 | |
| Ion Plus Fragment Library Kit | ThermoFisher | 4471252 | |
| ThermoQ–Temperature Dry Bath | TAMAR | HB-T2-A | |
| NEBNext dsDNA Fragmentase | New England Biolabs | M0348L | |
| NEBNext dsDNA Fragmentase | New England Biolabs | M0348L | |
| Ion PI dTTP | ThermoFisher | A26772 | |
| Ion OneTouch 2 Instrument | ThermoFisher | INS1005527 | ThermoFisher Catalog number: 4474778. |
| Ion Plus Fragment Library Kit | ThermoFisher | 4471252 | |
| Ion One Touch ES | ThermoFisher | 8441-22 | ThermoFisher Catalog number: 4469495. Extended kit component in Sheet 5 |
| Ethanol | SIGMA-ALDRICH | 51976 | This can be replaced by any brand's molecular grade absolute ethanol. |
| PicoPLEX WGA Extraction enzyme dilution buffer | Rubicon Genomics | R30050 | This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-01. |
| PicoPLEX WGA Extraction enzyme dilution buffer | Rubicon Genomics | R30050 | This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-02. |
| Qubit 3.0 Fluorometer | ThermoFisher | Q33216 | This model has been replaced by Qubit 4 Fluorometer, Catalog number: Q33226. |
| Qubit ds DNA HS Assay kit | ThermoFisher | M2002-02 | |
| Qubit Assay Tubes | ThermoFisher | Q32856 | |
| Ion PI Foaming Solution | ThermoFisher | A26772 | |
| Index for barcoding of libraries | BaseCare | this is a in-house prepared index. Users can buy commercial product from ThermoFisher Ion Xpress Barcode Adapters Kits (Cat. No. 4474517) | |
| Ion PI Loading Buffer | ThermoFisher | A26772 | |
| Solid(TM) Buffer Kit-1X Low TE Buffer | ThermoFisher | 4389764 | |
| Agencour AMPure XP Kit | Beckman Coulter | A63880 | |
| DynaMag-2 magnet (magnetic rack) | ThermoFisher | 12321D | |
| Ion PI Master Mix PCR buffer | |||
| Sorvall Legend Micro 17 Microcentrifuge | Micro 17 | 75002430 | |
| Ion Plus Fragment Library Kit | ThermoFisher | 4471252 | |
| Nuclease-free water | ThermoFisher | AM9922 | This can be replaced by other brand. |
| PicoPLEX WGA Nuclease-free water | Rubicon Genomics | R30050 | This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03. |
| Ion OneTouch Oil bottle | Ion PI Hi?Q OT2 Solutions 200 (Part No. A26429). Extended kit component in Sheet 5 | ||
| Ion Plus Fragment Library Kit | ThermoFisher | 4471252 | Extended kit component in Sheet 3 |
| double-strand DNA standard | This is a in-house prepared DNA standard for calibration of Qubit before quantification of library. | ||
| PicoPLEX WGA Preamplification buffer | Rubicon Genomics | R30050 | This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03. |
| PicoPLEX WGA Preamplification enzyme | Rubicon Genomics | R30050 | This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03. |
| Library Amplification Primer Mix | ThermoFisher | 4471252 | Extended kit component in Sheet 3 |
| Ion OneTouch Reaction Filter | Extended kit component in Sheet 5 | ||
| Recovery Router | Extended kit component in Sheet 5 | ||
| Recovery Tubes | Extended kit component in Sheet 5 | ||
| ISP Resuspension Solution | |||
| Ion Proton | ThermoFisher | DA8600 | This model is imported by Da An Gene Co.,LTD. of Sun Yat-Sen University from ThermoFisher and has been certified by China Food and Drug Administration for clinical application. The catalog number in ThermoFisher is 4476610. |
| Ion PI Hi?Q Sequencing Polymerase | ThermoFisher | A26772 | |
| Ion PI Sequencing Primer | |||
| server for sequencer | Lenovo | T260 | |
| Ion PI Sphere Particles | |||
| Platinum PCR SuperMix High Fidelity | ThermoFisher | 4471252 | |
| Nalgene 25mm Syringe Filters | ThermoFisher | 724-2045 | Pore size: 0.45μm. Specifically for aqueous fluids. |
| Ion PI Hi?Q W2 Solution | ThermoFisher | A26772 | |
| Ion PI 1X W3 Solution | ThermoFisher | A26772 | |
| Ion OneTouch Wash Solution C1 | |||
| The Ion PGM Hi?Q View Sequencing Kit | ThermoFisher | A30044 | Extended kit component in Sheet 2 |
| Ion Plus Fragment Library Kit | ThermoFisher | 4471252 | Extended kit component in Sheet 3 |
| Ion PI Hi-Q Sequencing 200 Kit (1 sequencing run per initialization) | ThermoFisher | A26772 | Extended kit component in Sheet 4 |
| Ion PI Hi?Q OT2 200 Kit | ThermoFisher | A26434 | Extended kit component in Sheet 5 |
References
- Balaban, B., Urman, B. Effect of oocyte morphology on embryo development and implantation. Reproductive BioMedicine Online. 12 (5), 608-615 (2006).
- Capalbo, A., et al. Correlation between standard blastocyst morphology, euploidy and implantation: An observational study in two centers involving 956 screened blastocysts. Human Reproduction. 29 (6), 1173-1181 (2014).
- Magli, M. C., Gianaroli, L., Ferraretti, A. P.
- Trussler, J. L., Pickering, S. J., Ogilvie, C. M. Investigation of chromosomal imbalance in human embryos using comparative genomic hybridization. Reproductive BioMedicine Online. 8 (6), 701-711 (2004).
- Fragouli, E., et al. Cytogenetic analysis of human blastocysts with the use of FISH, CGH and aCGH: Scientific data and technical evaluation. Human Reproduction. 26 (2), 480-490 (2011).
- Calhaz-Jorge, C., et al. Assisted reproductive technology in Europe, 2013: Results generated from European registers by ESHRE. Human Reproduction. 32 (10), 1957-1973 (2017).
- Dyer, S., et al. International committee for monitoring assisted reproductive technologies world report: Assisted reproductive technology 2008, 2009 and 2010. Human Reproduction. 31 (7), 1588-1609 (2008).
- Dahdouh, E. M., Balayla, J., García-Velasco, J. A. Comprehensive chromosome screening improves embryo selection: A meta-analysis. Fertility and Sterility. 104 (6), 1503-1512 (2015).
- Chen, M., Wei, S., Hu, J., Quan, S. Can Comprehensive Chromosome Screening Technology Improve IVF/ICSI Outcomes? A Meta-Analysis. PloS One. 10 (10), e0140779 (2015).
- Northrop, L. E., Treff, N. R., Levy, B., Scott, J. T. SNP microarray-based 24 chromosome aneuploidy screening demonstrates that cleavage-stage FISH poorly predicts aneuploidy in embryos that develop to morphologically normal blastocysts. Molecular Human Reproduction. 16 (8), 590-600 (2010).
- Barbash-Hazan, S., et al. Preimplantation aneuploid embryos undergo self-correction in correlation with their developmental potential. Fertility and Sterility. 92 (3), 890-896 (2009).
- Fragouli, E., et al. Comprehensive cytogenetic analysis of the human blastocyst stage. Fertility and Sterility. 90 (11), S36 (2008).
- Fiorentino, F., et al. Development and validation of a next-generation sequencing-based protocol for 24-chromosome aneuploidy screening of embryos. Fertility and Sterility. 101 (5), 1375-1382 (2014).
- Fiorentino, F., et al. Application of next-generation sequencing technology for comprehensive aneuploidy screening of blastocysts in clinical preimplantation genetic screening cycles. Human Reproduction. 29 (12), 2802-2813 (2014).
- Wells, D., et al. Clinical utilisation of a rapid low-pass whole genome sequencing technique for the diagnosis of aneuploidy in human embryos prior to implantation. Journal of Medical Genetics. 51 (8), 553-562 (2014).
- Quail, M. A., et al. A tale of three next generation sequencingplatforms: comparison of Ion Torrent, PacificBiosciences and Illumina MiSeq sequencers. BMC Genomics. 13 (1), 1-13 (2012).
- Goodwin, S., McPherson, J. D., McCombie, W. R. Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies. Nature Reviews Genetics. 17 (6), 333-351 (2016).
- Bono, S., et al. Validation of a semiconductor next-generation sequencing-based protocol for preimplantation genetic diagnosis of reciprocal translocations. Prenatal Diagnosis. 35 (10), 938-944 (2015).
- Harton, G. L., et al. ESHRE PGD Consortium/Embryology Special Interest Groupbest practice guidelines for polar body and embryo biopsy for preimplantation genetic diagnosis/screening (PGD/PGS). Human Reproduction. 26 (1), 41-46 (2011).
- Liu, W. Q., et al. The performance of MALBAC and MDA methods in the identification of concurrent mutations and aneuploidy screening to diagnose beta-thalassaemia disorders at the single- and multiple-cell levels. Journal of Clinical Laboratory Analysis. 32 (2), 1-8 (2018).
- Zhang, X., et al. The comparison of the performance of four whole genome amplification kits on ion proton platform in copy number variation detection. Bioscience Reports. 37 (4), BSR20170252 (2017).
- Munné, S., Grifo, J., Wells, D. Mosaicism: “survival of the fittest” versus “no embryo left behind”. Fertility and Sterility. 105 (5), 1146-1149 (2016).
- Del Carmen Nogales, M., et al. Type of chromosome abnormality affects embryo morphology dynamics. Fertility and Sterility. 107 (1), 229-235 (2017).
- Harton, G. L., et al. ESHRE PGD consortium best practice guidelines for amplification-based PGD. Human Reproduction. 26 (1), 33-40 (2011).
- Deleye, L., et al. Shallow whole genome sequencing is well suited for the detection of chromosomal aberrations in human blastocysts. Fertility and Sterility. 104 (5), 1276-1285 (2015).
- Bielanska, M., Tan, S. L., Ao, A. Chromosomal mosaicism throughout human preimplantation development in vitro: incidence, type, and relevance to embryo outcome. Human Reproduction. 17 (2), Oxford, England. 413-419 (2002).
- Treff, N. R., et al. Evaluation of targeted next-generation sequencing-based preimplantation genetic diagnosis of monogenic disease. Fertility and Sterility. 99 (5), 1377-1384 (2013).
