Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Halvleder sekvensering for præimplantations genetisk testning for Aneuploidy

Published: August 25, 2019 doi: 10.3791/59273
Automatic Translation
*1,2,3, *4, 5, 4, 4, 4, 6, 6, 4, 3,4
1Department of Genetics and Metabolism, Maternal and Child Health Hospital of Guangxi Zhuang Autonomous Region, 2Birth Defects Prevention and Control Institute of Guangxi Zhuang Autonomous Region, 3Shenzhen Research Institute, The Chinese University of Hong Kong, 4Department of Obstetrics and Gynaecology, The Chinese University of Hong Kong, 5State Key Laboratory of Microbial Metabolism, Joint International Research Laboratory of Metabolic and Developmental Sciences, School of Life Sciences and Biotechnology, Shanghai Jiao Tong University, 6Basecare Medical Device Co., Ltd
* These authors contributed equally

Summary

Her introducerer vi en halvleder sekvenserings metode til præimplantation af genetisk testning for aneuploidi (PGT-a) med fordelene ved kort turnaround-tid, lave omkostninger og høj gennemløb.

Abstract

Kromosomal aneuploidy, en af de vigtigste årsager til fosterudvikling anholdelse, implantation fiasko, eller graviditet tab, er blevet veldokumenteret i menneskelige embryoner. Præimplantations genetisk testning for aneuploidi (PGT-A) er en genetisk test, der forbedrer reproduktions resultaterne betydeligt ved at påvise kromosomale abnormaliteter af embryoner. Næste generations sekvensering (NGS) giver en høj gennemløb og omkostningseffektiv tilgang til genetisk analyse og har vist klinisk anvendelighed i PGT-A. Her præsenterer vi en hurtig og lavpris halvleder-baserede NGS-metode til screening af aneuploidi i embryoner. Det første trin i arbejdsprocessen er hele genomamplificeringen (WGA) af det biopsierede embryon præparat, efterfulgt af opførelse af sekvensering bibliotek, og efterfølgende sekvens på halvleder sekvensering system. Generelt, for en PGT-A ansøgning, 24 prøver kan indlæses og sekvenserede på hver chip genererer 60 − 80 millioner læser på en gennemsnitlig læse længde på 150 base par. Metoden giver en raffineret protokol til udførelse af skabelon forstærkning og berigelse af sekvensering bibliotek, hvilket gør PGT-en afsløring reproducerbar, høj gennemløb, omkostningseffektiv, og tidsbesparende. Køretiden for denne halvleder sequencer er kun 2 − 4 timer, forkorte turnaround tid fra at modtage prøver til at udstede rapporter i 5 dage. Alle disse fordele gør denne analyse til en ideel metode til påvisning af kromosomale aneuploidies fra embryoner og dermed lette dens brede anvendelse i PGT-A.

Introduction

Valg af levedygtige embryoner af god kvalitet med normale kromosom kopi numre (euploid) til overførsel i assisteret reproduktion hjælper med at forbedre graviditets resultater. Traditionelt anvendes det veletablerede morfologiske klassificeringssystem i vid udstrækning til embryo evaluering på grund af dets lette tilgængelighed og ikke-invasive natur. Det har imidlertid vist sig, at morfologisk vurdering kun kan give begrænsede oplysninger om embryo kvalitet1 og implantations potentialet2. En grundlæggende årsag er dens manglende evne til at evaluere den kromosomale sammensætning af embryonerne.

Kromosomal aneuploidi (unormalt kopiantal kromosomer) er en af de vigtigste årsager til fosterudvikling anholdelse, implantation fiasko eller graviditet tab. Forekomsten af aneuploidi er veldokumenteret i humane embryoner, idet den tegner sig for 60% − 70% i kavaler stadiet3,4 og 50% − 60% i blastocyster5. Dette har til en vis grad bidraget til flaskehalsen ved at forbedre Graviditetsraten for behandling af in vitro-befrugtning (IVF), som har ligget på omkring 35% − 40%6,7. Derfor, at vælge euploid embryoner til overførsel menes at være gavnlig for at forbedre graviditetsudfald. Til dette formål er præimplantations genetiske test for aneuploidi (PGT-A) blevet videreudviklet for at undersøge embryo levedygtighed ved hjælp af genetiske tilgange. Der er et stigende antal randomiserede kontrollerede forsøg og kohorteundersøgelser understøtter den afgørende rolle PGT-A. Det er blevet bevist, at anvendelsen af PGT-A nedsætter abort raten og øger den kliniske graviditetsrate og implantations hastigheden8, igangværende graviditetsrate og levende fødselsrate9.

Historisk set er der anvendt forskellige metoder i PGT-A, såsom fluorescens in situ-hybridisering (fisk), komparativ genomhybridisering (CGH), array-CGH og enkelt nucleotidpolymorfi (SNP)-mikroarray. Tidligere undersøgelser har vist, at PGT-A for kløver-stadiet embryoner af fisk giver resultater, der er dårligt konsistente med dem opnået ved omfattende kromosomal screening (CCS) af tilsvarende blastocyster ved hjælp af 59273array-CGH eller SNP-microarray5927310. Disse uoverensstemmelser kan tilskrives kromosom mosaisme, fisk tekniske artefakter, eller embryonale selv korrektion af kromosomale segregation fejl under udvikling11. Det har været almindeligt anerkendt, at ved hjælp af blastocyst trophectoderm (te) biopsier for array-baserede PGT-A såsom array-CGH eller SNP-microarray er effektiv til at identificere den kromosomale ubalance i embryoner10,12. For nylig giver den næste generation af enkeltceller (NGS) en høj overførselshastighed og en omkostningseffektiv metode til genetisk analyse og har vist klinisk anvendelighed i PGT-a13,14,15, hvilket gør det til en lovende alternativ til de aktuelt tilgængelige metoder.

Her præsenterer vi en hurtig, robust, og lavpris halvleder-baserede NGS-metode til screening af aneuploidi i menneskelige embryoner. Det første trin i arbejdsprocessen er hele genomamplifikation (WGA) af det biopsierede embryon præparat, ved hjælp af en enkelt celle WGA kit, efterfulgt af opførelse af sekvensering bibliotek, og efterfølgende sekvensering på halvleder sekvensering system.

Ved at detektere de H+ ioner, der frigives fra hver deoxyribonucleosid trifosfat inkorporering under DNA-streng syntese, overfører systemet de kemiske signaler (pH-ændring), som halvleder elementerne opfanger til direkte digitale data , som yderligere fortolkes i DNA-sekvens oplysninger. Eliminere kravet om dyre optisk detektion og komplekse sekvensering reaktioner, denne simple sekventering kemi reducerer samlede reagens omkostninger og forkorter sekventering køretiden i 2 − 4 timer16. Endnu vigtigere er, baseret på producentens ydeevnespecifikationer, halvleder sekvensering platform kan generere op til 15 GB sekvensering data (afhænger af kvaliteten af biblioteket) per Run, som er betydeligt højere end nogle af de andre sequencere producerer kun omkring 3 − 4 GB data (med 2 x 75 BP læse længde)17. I kliniske anvendelser af PGT-A, denne platform kan opnå 24 prøver pr chip genererer op til 80.000.000 læser17 og mindst 1.000.000 unikke læsninger af hver prøve. Læse dybden kan sikre, at hver prøve har mindst 0,05 x hel genom dækning. Ovennævnte fordele ved denne platform gør det til en ideel screeningmetode og dermed lette dens brede applikationer i PGT-en18.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Etisk godkendelse blev givet af det fælles kinesiske universitet i Hongkong — nye territorier East Cluster klinisk forskning etiske komité (reference nummer: 2010,432). Forsknings licens blev godkendt af Rådet om human reproduktiv teknologi i Hong Kong (nummer R3004).

1. hel genom forstærkning

  1. Før start skal du kontrollere mængden af magnetiske perler (tabel over materialer) for at sikre, at der ikke er mindre end 135 μl (med en 20% overskydende) for hver prøve. Opbevar de magnetiske perler ved stuetemperatur (RT) i mindst 30 min. Forbered 720 μL (med 20% overskydende) 70% ethanol for hver prøve. Udstyre en termisk variator (tabel over materialer) med opvarmet låg ved 105 °c.
    Bemærk: den nyligt fremstillede 70% ethanol (tabel over materialer) bør anvendes inden for 3 dage.
  2. Forberedelse af prøver
    Bemærk: i rutine praksis er 5 til 10 trophectoderm-celler i blastocyst biopsieret i henhold til praksis guideline19.
    1. Biopsier suspenderes i 2 μL 1x fosfat-bufferet saltvand (PBS) i en enkelt 0,2 mL polymerasekæde reaktion (PCR) tube.
    2. Drej kort røret på en mini centrifuge for 3 s for at samle dråberne.
  3. Cellelyse og ekstraktion
    1. Tø cellen ekstraktions buffer (tabel af materialer) og ekstraktions enzym fortyndingsbuffer (tabel over materialer) på is, vortex og kort spin på en mini centrifuge til 3 s før brug.
    2. Tilsæt 3 μL celle ekstraktions buffer til hvert rør fra trin 1.2.2.
    3. Der forberedes en 5 μL cellelyse Master Mix for hver prøve ved tilsætning af 4,8 μL ekstraktions enzym fortyndingsbuffer og 0,2 μL celle ekstraktions enzym (tabel over materialer). Bland godt og alikvot i hvert rør fra trin 1.3.2. Vend røret forsigtigt og drej kortvarigt på en mini centrifuge i 3 s.
      Bemærk: tip bør ikke berøre den væske, der indeholder celle prøverne, når du tilføjer masterblandingen.
    4. Inkuber røret fra trin 1.3.3 i den termiske variator med opvarmet låg. Kør programmet med følgende indstillinger: 10 min ved 75 °C, 4 min ved 95 °C, hold ved 4 °C.
  4. Præamplifikation
    1. Tø forforstærknings bufferen (tabel over materialer) på is, vortex, og drej kortvarigt på en mini centrifuge i 3 s før brug.
    2. Forbered en 5 μL præamplifikationmastermix for hver prøve ved at tilsætte 4,8 μL forforstærknings buffer og 0,2 μL præamplifikationenzym (tabel over materialer). Bland godt og alikvot i hvert rør fra trin 1.3.4. Vend røret forsigtigt og drej kortvarigt på en mini centrifuge i 3 s.
      Bemærk: spidser må ikke røre ved den væske, der indeholder DNA-prøverne, når masterblandingen tilføjes.
    3. Inkuber røret i den termiske variator med opvarmet låg. Kør programmet med de flydende indstillinger: 2 min ved 95 °C; 12 cyklusser for 15 s ved 95 °C, 50 s ved 15 °C, 40 s ved 25 °C, 30 s ved 35 °C, 40 s ved 65 °C, 40 s ved 75 °C; hold ved 4 °C.
  5. Forstærkning
    1. Tø forstærknings bufferen (tabel over materialer) på is, vortex, og drej kortvarigt på en mini centrifuge i 3 s før brug.
    2. Forbered en 60 μL forstærknings masterblanding for hver prøve ved at tilføje 25 μL forstærknings buffer, 0,8 μL amplifikationenzym (tabel over materialer) og 34,2 μl nuklease frit vand til WGA (tabel over materialer). Bland godt og alikvot i hvert rør fra trin 1.4.3. Vend røret forsigtigt og drej kortvarigt på en mini centrifuge i 3 s.
    3. Inkuber røret i den termiske variator med opvarmet låg. Kør programmet med følgende indstillinger: 2 min ved 95 °C; 14 cyklusser for 15 s ved 95 °C, 1 min ved 65 °C, 1 min ved 75 °C; hold ved 4 °C.
  6. Rensning af den over WGA-produkter
    1. Overfør hvert WGA-produkt fra trin 1.5.3 til nye 1,5 mL-rør. Tilsæt 112,5 μL magnetiske perler i hvert rør. Vortex og Inkuber ved RT i 5 min.
      Bemærk: Bland de magnetiske perler helt før brug.
    2. Anbring rørene på en magnetisk stander (tabel over materialer) i 3 minutter, indtil supernatanten er klar. Kassér alle supernatanten uden at forstyrre perlerne.
    3. Tilsæt 300 μL 70% ethanol til hvert rør. Drej hvert rør 180 ° for at lade perlerne løbe gennem ethanol og rotere tilbage til den oprindelige position. Kassér alle supernatanten efter perlerne har afgjort uden at forstyrre perlerne. Gentag dette trin én gang.
      Bemærk: hold røret på den magnetiske stander, mens røret drejes vandret.
    4. Drej kortvarigt hvert rør på en mini centrifuge i 3 s. Anbring rørene på den magnetiske stander, indtil den resterende supernatanten er klar. Kassér alle de resterende supernatanten uden at forstyrre perlerne. Lufttørre perlerne på RT i ca. 3 min.
    5. Fjern rørene fra den magnetiske stander, og resuspender de tørrede perler ved at tilsætte 35 μL lav Tris-EDTA (TE) buffer (tabel over materialer). Inkuber ved RT i 5 min.
    6. Anbring rørene på den magnetiske stander i 3 minutter, indtil supernatanten er klar. Overfør alle supernatanten indeholdende elueret DNA til nye 1,5 mL rør uden at forstyrre perlerne.

2. kvalitetskontrol af WGA-produkterne

  1. Kvantificer hvert renset WGA-produkt fra trin 1.6.6 ved hjælp af en fluorometer analyse (tabel over materialer) i henhold til producentens manual med 1 ΜL WGA-produkt som udgangsmateriale.
    Bemærk: den accepterede koncentration af WGA-produktet er ≥ 10 ng/μL. Ethvert produkt under denne tærskel anbefales ikke at gå videre til de næste trin.

3. fragmentering af WGA-produkter

  1. Før start, Forvarm en tør blok varmer til 37 °C. Forbered 6 μL (med 20% overskud) på 0,5 M EDTA for hver prøve. Baseret på koncentrationen, alikvot 300 ng af DNA fra hvert renset WGA-produkt i trin 1.6.6 til nye 0,2 ml PCR-rør og Bring volumen til 16 μl med nuklease frit vand for hvert rør.
  2. Fragmentering
    1. Forbered en 4 μL dobbeltstrenget DNA (dsDNA) fragmentering reaktion mix for hver prøve ved at tilføje 2 μL dsDNA fragmentering reaktionsbuffer (tabel over materialer) og 2 μl dsdna fragmentering enzymer (tabel over materialer). Bland godt og alikvot i hvert rør fra trin 3,1. Vortex, og drej kortvarigt på en mini centrifuge i 3 s. Inkuber rørene i 25 minutter ved 37 °c i en termisk variator med opvarmet låg.
    2. Tilsæt straks 5 μL 0,5 M EDTA til hvert rør. Bland godt ved vortexning og spin kort på en mini centrifuge til 3 s.
  3. Rensning og opblanding
    1. Overfør hvert produkt fra trin 3.2.2 til nye 1,5 mL-rør. Tilsæt 37,5 μL magnetiske perler til hvert rør. Bland med vertexing og Inkuber ved RT i 5 min.
    2. Rense produkterne som beskrevet fra trin 1.6.2 til trin 1.6.4.
    3. Elute hvert renset produkt som beskrevet i trin 1.6.5 og 1.6.6 ved at tilføje 32 μL lav-TE buffer.

4. biblioteksbygning

  1. Stump- e nd r epairment, størrelse udvælgelse og rensning
    1. Forbered et 20 μL stump-reparations miks for hver prøve ved at tilsætte 9,5 μL nuklease frit vand, 10 μL af 5x end Repair buffer (tabel over materialerøret fra trin 3.3.3. Vortex og spinde kort på en mini centrifuge i 3 s.
    2. Tilsæt 50 μL magnetiske perler til hvert rør fra trin 4.1.1. Vortex og Inkuber ved RT i 5 min.
      Bemærk: Bland de magnetiske perler helt før brug.
    3. Anbring hvert rør på den magnetiske stander i 3 minutter, indtil supernatanten er klar. Supernatanten overføres til nye 1,5 mL-rør, hvor der tilsættes 25 μL magnetiske perler for hver. Vortex rørene med den overførte supernatanten og inkuberes ved RT i 5 min.
    4. Rense produkterne i de inkuberede rør som beskrevet fra trin 1.6.2 til trin 1.6.4.
    5. Elute hvert renset produkt som beskrevet i trin 1.6.5 og 1.6.6 ved at tilføje 32 μL lav-TE buffer.
      Bemærk: Dette er et sikkert stoppunkt; det rensede DNA fra dette trin er stabilt ved 4 °C i højst 24 timer.
  2. Adapter l undersøgelses og p urificering
    1. Der forberedes et 17 μL adapter ligationmix for hver prøve ved tilsætning af 10 μL nuklease frit vand, 5 μL 10x ligasebuffer (tabel over materialer), 1 μl P1-adapter (tabel over materialer) og 1 μl DNA-ubiquitinligase (tabel overmaterialer). Bland godt ved vortexning for 5 s og spin på en mini centrifuge til 15 s, og alikvot i hvert rør fra trin 4.1.5.
    2. Tilsæt 1 μl adaptere (tabel over materialer) til hvert rør fra trin 4.2.1 i henhold til eksempel arket (supplerende fil: eksempelark til adapter ligering). Vortex, og drej kortvarigt på en mini centrifuge i 3 s. Inkubér rørene ved RT (20 − 25 °C) i 20 minutter.
    3. Tilsæt 75 μL magnetiske perler til hvert rør fra trin 4.2.2. Bland med vertexing og Inkuber ved RT i 5 min. Derefter rense produkterne som beskrevet fra trin 1.6.2 til trin 1.6.4.
    4. Elute hvert renset produkt som beskrevet i trin 1.6.5 og 1.6.6 ved at tilføje 15 μL lav-TE buffer. Alle supernatanten indeholdende elueret DNA overføres til nye 0,2 mL 8-rørs strimler.
      Bemærk: Dette er et sikkert stoppunkt; det rensede DNA fra dette trin er stabilt ved 4 °C i højst 24 timer.
  3. Forstærkning og rensning
    1. Forbered en 50 μL amplifikationmastermix for hver prøve ved at tilføje 47,5 μL super mix (tabel over materialer) og 2,5 μl primer mix (tabel over materialer). Bland godt ved vortexning, og drej kortvarigt på en mini centrifuge og alikvot i 0,2 ml 8-rørs strimlerne fra trin 4.2.4.
    2. Vortex strimlerne for 30 s og drej kort på en mini centrifuge til 3 s. Inkuber strimlerne i den termiske variator med opvarmet låg. Kør programmet med følgende indstillinger: 20 min ved 72 °C; 5 min. ved 95 °C; 10 cyklusser for 15 s ved 95 °C, 15 s ved 62 °C, 1 min ved 70 °C; 5 min. ved 70 °C; hold ved 4 °C.
    3. Overfør hvert produkt fra trin 4.3.2 til nye 1,5 mL rør. Tilsæt 97,5 μL magnetiske perler til hvert rør. Bland ved vortexning og Inkuber ved RT i 5 min.
    4. Rense produkterne som beskrevet fra trin 1.6.2 til trin 1.6.4.
    5. Elute hvert renset produkt som beskrevet i trin 1.6.5 og 1.6.6 ved at tilføje 25 μL lav-TE buffer.

5. kvalitetskontrol og fortynding af DNA-biblioteket

  1. Kvantificere hvert forberedt DNA-bibliotek fra trin 4.3.5 ved fluorometer analysen i henhold til producentens manual med 2 μL DNA-bibliotek som udgangsmateriale.
  2. Den accepterede koncentration af DNA-biblioteket er ≥ 0,5 ng/μL, og den positive kontrol (tabel over materialer) er ≤ 15 ng/μl. Hvis koncentrationen af den positive kontrol varierer for meget fra 15 ng/μL, gentages kvantificeringen af den positive kontrol, indtil koncentrationen er tæt på 15 ng/μL. Hvis koncentrationen af biblioteket er under 0,5 ng/μL, skal du genstarte fra fragmentering (afsnit 3).
    Bemærk: Sørg for, at koncentrationen af den positive kontrol når den accepterede værdi, før du kvantificerer DNA-biblioteket.
  3. Fortynd hvert bibliotek til 100 pmol ved tilsætning af nuklease frit vand. Tilsæt 1 μL bibliotek til n μl nuklease frit vand; Beregn n ved hjælp af ligningen nedenfor:
    Equation
    hvor Q er koncentrationen af hvert bibliotek målt ved fluorometer analysen, og C er koncentrationen af den positive kontrol målt ved fluorometer analysen.

6. sekvensering

  1. Før start, Forbered 48 μL (med en 20% overskydende) på 1 M NaOH for hver prøve og et nuklease frit 1,5 mL rør. Tø Master Mix PCR buffer (tabel over materialer) (2000 μl i volumen) ved rt. Bring kugle partikler (tabel over materialer) til rt.
  2. Samling af biblioteker
    1. Vortex hvert fortyndet bibliotek fra trin 5,3 og spin kort 4X på en mini centrifuge for 3 s hver gang. Tag 5 μL af hvert bibliotek for at samle det nuklease frie 1,5 mL-rør. Vortex det blandede bibliotek og spin kort på en mini centrifuge til 3 s.
  3. Emulsions PCR ved hjælp af et emulsions system
    1. Tilsæt 150 μL brydningens opløsning til 2 nye genvindings slanger (tabel over materialer). Installer de nye genvindings slanger, genoprettelses router og forstærknings plade.
    2. Bland ved at invertere olieflasken (tabel over materialer) 3 gange. Sørg for, at både olie-og genvindings opløsningen (tabel over materialer) er mindst 2/3 fuld.
    3. Vortex Master Mix PCR buffer til 30 s og spin kort på en mini centrifuge til 3 s. vortex kugle partikler og det blandede bibliotek fra trin 6.2.1 i 1 min. og drej kort på en mini centrifuge i 3 s.
    4. Forbered en 2400 μL ligations blanding ved at tilsætte 172 μL nuklease frit vand, 8 μL blandet bibliotek fra trin 6.3.3, 120 μL enzym blanding (tabel over materialer) og 100 μl kugle partikler til røret indeholdende 2000 μl Master Mix PCR buffer.
    5. Indstil en pipette til 800 μL. Læg ligations blandingen fra trin 6.3.4 til reaktions filteret (tabel over materialer) gennemprøve porten. Brug en 1000P-pipette til at tilsætte 200 μL reaktions olie til reaktions filteret.
    6. Vælg programmet proton: ion pi Hi-Q OT2 200 kit, og vælg derefter assisteret knap for at sikre, at enheden er konfigureret korrekt ved at følge instruktionerne på skærmen. Klik derefter på næste for at starte programmet.
  4. Berigelse ved et automatisk berignings system
    1. Når emulsions PCR-programmet er færdigt, skal du klikke på næsteog derefter klikke på sidste spin for at spinne i 10 minutter. Tag de 2 genvindings slanger ud efter at have klikket på åbent låg.
    2. Supernatanten kasseres fra de 2 genvindings slanger, indtil 100 μL forbliver i hvert rør, og etiketten er i overensstemmelse hermed. Bland opløsningen godt og Overfør til et nyt 1,5 mL rør.
    3. Tilsæt 200 μL nuklease frit vand til hvert genvindings slange, vask ved pipettering op og ned flere gange, og Overfør hele opløsningen til 1,5 mL røret i trin 6.4.2. Gentag vaske trinnet én gang.
    4. Tilsæt 200 μL nuklease frit vand til et af genvindings rørene, og vask ved pipettering op og ned flere gange. Overfør hele opløsningen til det andet genvindings rør og vask ved pipettering op og ned flere gange. Overfør derefter hele opløsningen til det samme 1,5 mL rør fra trin 6.4.3. Vortex 1,5 mL røret i 30 s og centrifugeres i 8 minutter ved 15.500 x g.
      Bemærk: det endelige totale volumen af emulsions PCR-produktet i dette trin skal være ca. 1200 μL.
    5. Supernatanten kasseres i røret, og 20 μL af emulsions PCR-produktet opbevares. Tilsæt 80 μl opblanding opløsning (tabel over materialer) til røret. Bland ved pipettering op og ned.
    6. Der fremstilles en 320 μL smelte opløsning for hver chip ved tilsætning af 280 μL polyethylenglycol sorbitanestere monolauratopløsning (tabel over materialer) og 40 ΜL 1 M NaOH.
      Bemærk: 1 M NaOH skal opbevares ved 4 °C eller frisk tilberedt. Vortex før brug.
    7. Vortex røret indeholdende C1 perler (tabel over materialer) for 30 s. Tag 100 μL C1 perler til et nyt 1,5 mL rør. Placer 1,5 mL-røret på den magnetiske stander i 2 minutter ved RT. Kassér alle supernatanten efter perlerne har afgjort uden at forstyrre perlerne.
    8. 1 mL vaskeopløsning C1 (tabel over materialer) tilsættes til røret fra trin 6.4.7. Vortex til 30 s. Anbring røret på den magnetiske stander i 2 minutter ved RT. Kassér alle supernatanten efter at perlerne har slået sig uden at forstyrre perlerne. Resuspendere perlerne ved at tilføje 130 μL perle Capture løsning (tabel over materialer).
    9. Berigelses system (ES) Setup
      1. Læg prøven (100 μL emulsion PCR produkt) fra trin 6.4.5, de vaskede perler (130 μL) fra trin 6.4.8, ES vaskeopløsning (300 μL) (tabel over materialer) og smelte opløsning (300 μl) fra trin 6.4.6 ind i 8-rørstrimlen. Layout rækkefølgen er: prøve (tube 1), vasket perler (tube 2), ES vask opløsning (rør 3, 4, 5), og smelte-off opløsning (tube 7). Hold rør 6 og 8 tomme.
      2. Placer 8-tube Strip fra trin 6.4.9.1 på ES. Installer en pipettespids og et nyt 0,2 mL rør, og start programmet.
        Bemærk: Sørg for, at pipettering fungerer normalt.
    10. Vask kugle partikler, efter at berigelsen er færdig.
      1. Centrifuger 0,2 mL-røret fra trin 6.4.9.2 i 5 minutter ved 15.500 x g. Supernatanten kasseres, og 10 μL af berignings produktet skal holdes. Tilsæt 200 μL nuklease frit vand til røret. Mix af vortexing.
      2. Centrifuger 0,2 mL røret fra 5 min ved 15.500 x g. Supernatanten kasseres, og 10 μL af berignings produktet skal holdes. Tilsæt 90 μL nuklease frit vand til røret. Mix af vortexing.
  5. Udarbejdelse af skabeloner
    1. Vortex den positive kontrol og spin kortvarigt. Tilsæt 5 μL positiv kontrol til 100 μL-skabelonen (berignings produktet fra trin 6.4.10.2). Vortex og centrifuge i 5 min ved 15.500 x g. Kassér supernatanten og Behold 10 μL af skabelonen.
    2. Tilsæt 20 μl sekventering primer (tabel over materialer) og 15 μl udglødning buffer (tabel over materialer) til skabelon røret fra trin 6.5.1. Vortex røret og drej kort på en mini centrifuge i 3 s.
    3. Inkuber røret fra trin 6.5.2 i den termiske variator med opvarmet låg. Kør programmet med følgende indstillinger: 2 min ved 95 °C, 2 min ved 37 °C, hold ved 4 °C.
    4. Tilsæt 10 μL indlæsnings buffer (tabel over materialer) til røret fra trin 6.5.3. Bland ved pipettering op og ned.
  6. Initialisering af sequencer
    1. Kontroller tank trykket af nitrogen gas (totalt tryk ≥ 500 PSI, udgangstryk ≥ 10 PSI, Optimum 20-30 PSI). Top-up 100 mL deioniseret vand (18,2 MΩ) til C1-og C2-rør (tabel over materialer) og installer dem til tilsvarende C1-og C2-positioner på sequenceren.
    2. Forbered W1 (32 μL af 1 M NaOH) og w3 (40 − 50 mL w3 buffer [tabel over materialer]) opløsninger. Forbered W2 opløsning ved tilsætning af 1920 mL deioniseret vand (18,2 MΩ), en hel flaske W2 buffer (tabel over materialer) og 8 − 12 μl af 1 M NaOH, og inverter 4 − 8 gange for at blande.
      Bemærk: da vandkvaliteten varierer geologisk, justeres lydstyrken på 1 M NaOH efter behov. Start-pH-værdien af W2 er 5,9 − 6,1, og det optimale område efter justering er 7,4 − 7,6. Ændre og installere nye reagensglas og bruge sidst brugte chip til vask.
    3. Forbered de 4 nye tomme rør fra sekventering supplement Kit (tabel over materialer). Mærk de 4 rør som dGTP, dCTP, dATP og dTTP, og tilsæt 70 μL dGTP, dCTP, dATP eller dTTP (tabel over materialer) til det tilsvarende rør (dvs. 70 ΜL dgtp til røret mærket som dgtp osv.). Vortex rørene før brug. Installer rørene på de tilsvarende positioner, der er angivet på sequenceren (tabel over materialer).
  7. Chip Wash
    1. Vask chippen (tabel over materialer) en gang ved at injicere 100 μl isopropanol i læsse brønden af chippen. Fjern den bort udviste væske fra den modsatte brønd.
    2. Vask chippen to gange ved at injicere 100 μL nuklease frit vand til indlæsnings brønden på chippen. Fjern den bort udviste væske fra den modsatte brønd.
    3. Vask chippen én gang ved at injicere 100 μL af 0,1 M NaOH i læsse brønden af chippen. Fjern den bort udviste væske fra den modsatte brønd. Inkuber ved RT i 1 min.
    4. Vask chippen én gang ved at injicere 100 μL nuklease frit vand i indlæsnings brønden af chippen. Fjern den bort udviste væske fra den modsatte brønd.
    5. Vask chippen to gange ved at injicere 100 μL isopropanol i indlæsnings brønden af chippen. Fjern den bort udviste væske fra den modsatte brønd. Tør ved at blæse kvælstof på chippen. Holdes væk fra lys.
  8. Prøve indlæsning og sekvensering
    1. Bland 55 μL prøve fra trin 6.5.4 ved pipettering op og ned og indlæse prøven til lastning brønd af chippen.
      Bemærk: hold pipettespidsen og 0,2 mL PCR-røret, der anvendes i dette trin.
    2. Placer chippen på chippen mini centrifuge (tabel over materialer), når
    3. Forbered to nye 1,5 ml rør til udglødning buffer og skyllevæske. Forbered 50% udglødning buffer ved at tilføje 500 μl udglødning buffer og 500 μl nuklease frit vand. Træk opløsningen forberedes ved tilsætning af 500 μl udglødning buffer og 500 μl 100% 2-propanol.
    4. Tilbered to nye 1,5 ml-rør og tilbereder skummende blanding ved at blande 49 μl 50% udglødning buffer og 1 μl skummende opløsning (tabel over materialer) i begge rør.
    5. Indstil en pipette til 100 μL. lav bobler ved at afpipettere luft i skumrings blandingen fra et af de to rør fra trin 6.8.4. Lav > 120 μL bobler, og hold pipettering, indtil der ikke kan ses fremragende synlige bobler. Læg 120 μL bobler i læsse brønden.
      Bemærk: Sørg for, at der ikke er nogen udestående synlige bobler. Ellers skal du starte forfra.
    6. Overfør den overdrevne væske fra afgangen godt fra trin 6.8.5 til læsse brønden ved pipettering. Undlad at pipettere bobler. Centrifuger chippen i 30 s på chippen mini centrifuge.
    7. Gentag trin 6.8.5 ved at bruge det andet rør, der indeholder skummende blanding fra trin 6.8.4.
    8. Tilsæt 55 μl af 50% udglødning buffer til 0,2 ml røret holdt i trin 6.8.1. Brug den holdte pipettespids i trin 6.8.1 til at pipettere op og ned. Læg alle 55 μl udglødning buffer til læsse brønden. Centrifuger chippen i 30 s på den udpegede chip mini centrifuge.
    9. Indlæs 100 μL skyllevæske i chippen, og kassér den bort udviste væske fra udgangs brønden. Gentag dette indlæsnings trin én gang.
      Bemærk: Hvis der er bobler i chippen, bør du udvise små bobler med store bobler og skylle med skylle opløsningen. Dette kan opnås ved pipettering 100 μL skylleopløsning og efterlader 5 μL luft under skylle opløsningen. Derfor, når Pipettering af 105 μL i chippen, vil luften danne en stor boble, der kan udvise de små bobler, og derefter kan den store boble udvises af følgende skylleopløsning.
    10. Indlæs 100 μl af 50% udglødning buffer i chippen lastning godt. Gentag dette indlæsnings trin i alt 3 gange.
    11. Der tilsættes 6 μl af sekvente Rings enzymet til 60 μl af 50% udglødning-bufferen til et nyt 1,5 ml rør. Bland ved pipettering op og ned. Indlæs 65 μL af denne blandede opløsning i chip indlæsningen godt. Pipetten langsomt for at undgå skumdannelse.
    12. Hold chippen væk fra lys og Inkuber ved RT i 5 min.
    13. Efter inkubationen skal du straks indlæse chippen på sequenceren og klikke på Start sekvensering Kør på skærmen for at starte sekvensering.
      Bemærk: sekvensering af RAW-data og kvalitetskontrol filer uploades automatisk til virksomheden til dataanalyse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

På baggrund af denne ændrede protokol blev halvleder sekvensering for første gang anvendt til PGT-A. Vi testede på biopsier fra både kavaler-scenen blastomeres og blastocyst-Stage embryoner. Det foreslås, at de biopsierede celler gennemgår WGA så hurtigt som muligt for at forhindre enhver forringelse af DNA. En tidligere undersøgelse sammenlignede ydeevnen af forskellige WGA-metoder og indikerede, at den metode, vi beskrev her, havde den bedste ensartethed ved placerings størrelsen på 100 KB20. I betragtning af ydeevnen af både ensartethed og median absolutte parvis forskel (MAPD)21, denne WGA metode blev valgt til PGT-A ved hjælp af halvleder sequencer. Gennem en retrospektiv statistisk analyse af 186 spaltning og 1135 blastocyst Stage-embryoner bemærkede vi, at WGA-succesraterne var 95,4% i blastomerkerneoverførsel-prøver og 96,9% i blastocyst-prøver (figur 1). Rensnings trinnet før Biblioteks konstruktionen som en størrelses udvælgelsesprocedure var afgørende for sekvensering af kvaliteten ved at opfange store DNA-fragmenter. Desuden, det lettet input mængden af 300 ng til bibliotek byggeri. Den enzymatiske fragmentering metode aktiveret en effektiv klipning af WGA produkter i ca. 160 BP.

Data analyse blev udført ved hjælp af euklidisk distance og cirkulære binære segmentering (EDCBS) analyse system. In-House validering blev udført for at evaluere robustheden af denne bioinformatiske algoritme. Vi etablerede en referencedatabase eksklusiv for PGT-A gennem sekventering 379 WGA-produkter fra 66 cellelinjer med kendte karyotyper ved at analysere en placerings størrelse på 100 KB. Fra denne database blev et referenceområde afgrænset som tærsklen for CNV-kald (copy Number variant), og 10 MB blev angivet som cutoff for registrerings niveauet. Både følsomhed og specificitet nåede over 99% ved denne tærskel (tabel 1). I ansøgningen om PGT-A på embryo biopsier, vinduesstørrelsen blev sat til 400 KB med en glidende vindue tilgang til at nå nok læser. Kvalitetskontrol (QC) af hver prøve blev bestemt af unikke læsninger, MAPD og standardafvigelse af kopi nummer variant (CNV ∙ SD). Prøve ud over et af de tre indekser blev defineret som QC fiasko (figur 2c). Fortolkningen af kromosom scatter plots (figur 2a,B, D) blev udført af kvalificerede genetikere efter en arbejdsgang ved at SAMMENLIGNE den identificerede cnv med DECHIFRERE, DGV eller Clingen-databaser. Individuelle uoverensstemmelser blev kontrolleret af en ekspert kurator procedure. Kromosomale abnormaliteter blev grupperet i aneuploidi og mosaisme i blastocyst prøver. Et eksemplarnummer gevinst eller-tab inden for intervallet 30% − 70% blev klassificeret som havende mosaik kromosomal sammensætning; ellers ville resultatet blive fortolket som enten euploidy eller aneuploidy. I denne undersøgelse var euploidraterne 45,2% i blastomeres og 52,3% i blastocysts, hvilket gentog sig til publicerede data22,23.

Figure 1
Figur 1: demografiske statistikker over 1321 embryo-biopsier testet ved denne metode. A) Data fra 186-spaltningen af embryoer. B) Data fra 1135 blastocyst-stadie embryoner. WGA succesrater er over 95% i begge typer af enheder. Antallet af fejl i sekvensering af kvalitetskontrol er 3,4% i Cleavage-Stage-gruppen og kun 1,9% i blastocyst-stadie gruppen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: repræsentative resultater af PGT-en klinisk anvendelse af embryo til de 23 par kromosomer. Repræsentative resultater afa) euploidy B) aneuploidi (SEQ [GRCh37] (2) X3, (21) X3) (C) sekventering QC mislykket prøve på grund af cnv ∙ SD ved 0,6571 (accept ≤ 0,4); D) fjernelse af segmental mosaik (55%) på 4p 16,3 p 15.1 (29,50 MB). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

CNV-tærskelværdi
(-0,23, 0,20) (-0,32, 0,26) (-0,41, 0,32) (-0,51, 0,37) (-0,62, 0,43) (-0,73, 0,48)
Følsomhed 100,00% 100,00% 100,00% 100,00% 98,30% 96,02%
Specificitet 72,41% 81,03% 91,38% 99,10% 99,54% 100,00%

Tabel 1: følsomhed og specificitet mellem forskellige log R nøgletal af halvleder sequenceren. I alt 240 prøver med kendte euploid karyotype resultater blev testet ved denne metode og ringede til forskellige log R-nøgletal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Forskellig fra andre sekventering kemi, den sequencer beskrevet her bruger halvleder til påvisning af nukleotider. Chippen i sig selv er en elektronisk anordning, der detekterer hydrogen ioner ved polymerase-drevet base inkorporering17, som muliggør 2-4 h sekventering tid af Proton programmet. Desuden chippen er en strips med mikrobrønde chip, der tillader lokalisering af et mål molekyle, som er forskellig fra flowcelle sekvensering kemi af andre sequencer udbydere. Denne protokol er en modificeret protokol, der er optimeret til anvendelse af PGT-A. Optimeringen omfatter fragmentering af forstærket DNA ved den enzymatiske metode i stedet for sonikering for at reducere risikoen for kontaminering samt størrelses valget og PCR-systemet for bedre ydeevne med lavere omkostninger. Derudover brugte vi i den kliniske indstilling en valideret in-House pipeline til variant kald.

Der er kritiske skridt at være opmærksom på i løbet af praksis. Ethanol til rensning skal være frisk tilberedt før forsøget, da en høj koncentration af ethanol ville forårsage utilstrækkelig vask af forurenet DNA, mens en lav koncentration ville medføre tab af Target DNA. Fluorometeret skal kalibreres af den positive kontrol med en kendt koncentration for at sikre nøjagtigheden. Desuden er en passende indlæsning af skabelonen afgørende for sekvensering. Bobler af den rigtige størrelse hjælper med at skubbe skabelon kuglen til at falde i mikrobrønde, men for store bobler kan forårsage utilstrækkelig belastning. Brugere kan ændre antallet af prøver (ikke nødvendigvis 24), der skal sorteres for hver kørsel. Der er 96 indekser designet til denne chip. Men sekventering læse dybden vil falde med stigende prøver pr. chip. Et af de mest almindeligt forekommende problemer er lav Biblioteks koncentration, som kan tilskrives en DNA-udgang med lav eller dårlig kvalitet fra rensning på grund af residualethanol eller magnetiske perler eller krakning af perler som tidligere nævnt. En suboptimal DNA-udgang kan også skyldes lav effektivitet af PCR, som kan korrigeres ved forsigtig forberedelse af masterblandingen med nøjagtige prøve indgange og temperaturkontrol af de termiske cyclere. Til sekvensering af QC-mislykkede prøver, såsom dem med høj CNV ∙ SD-værdier (figur 2c), anbefales det at køreprøverne på en bioanalysator til størrelses fordelings analyse.

En af begrænsningerne ved denne metode er dens højere falske single-nucleotid Calling rate i forhold til andre platforme. Fejlfrekvensen er 1% sammenlignet med kun 0,1% Indel falsk positiv rate af andre sequencere17. Dette er dog ikke en afgørende faktor for CNV-kald eller PGT-A-analyse. Sammenlignet med andre platforme minimerer anvendelsen af emulsions systemet operative uoverensstemmelser og pipetteringsfejl, hvilket øger Biblioteks kvaliteten. Dette er en betydelig fordel ved vores metode sammenlignet med andre platforme, fordi dsDNA-koncentrationen er meget lav, og der kræves en nøjagtig kvantificering for følgende Biblioteks gruppering. Vores metode introducerede kalibrering af fluorometer kvantificering ved hjælp af en standard positiv kontrol for at kontrollere detekterings fejl.

Som en høj gennemløbs platform med kort behandlingstid er halvleder sequenceren ideel til PGT-A og kan anvendes bredt på IVF-patienter med PGT-en klinisk indikation såsom avanceret mødres alder24. Deleye et al. gennemførte parallel sekvensering af humane blastocyster for at sammenligne halvleder sequenceren med andre sequencere25. Desuden har dette PGT-A-sæt fået den "særlige godkendelsesprocedure på innovativt medicinsk udstyr" fra China Food and Drug Administration og har været klinisk anvendt til tusinder af embryoner. Med hensyn til omkostninger, prisen på denne platform er halvdelen af prisen pr Giga baser i forhold til en anden almindeligt anvendte platform i PGT-et marked. De trophectoderm celler kan pålideligt repræsentere den genetiske forfatning af embryonet26. Denne metode kan potentielt udvikles til PGT for monogene/enkelt gensygdomme (PGT-M) som Treff et al. har påvist27. I deres model, de lettet 300 MB til 1 GB gennemløb på PGT-M af 16 embryo biopsier og sammenlignede resultaterne med to konventionelle PGT-M metoder. Ved at opfange og indlæse 16 prøver, nåede deres metode mindst 100x læse dybden af den målrettede region og resulterede i 100% pålidelighed og reproducerbarhed27. Den gennemstrømning af halvleder sequencer ved vores protokol kan nå 15 GB, og der er 96 stregkoder designet; Derfor, hvis anvendes til målrettede PGT-M, et betydeligt antal af embryo biopsier kan sorteres af en chip på en høj læse dybde.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Denne undersøgelse blev støttet af den generelle forskningsfond (ref nr. 14162417) fra Hong Kong, National Natural Science Foundation i Kina (ref No. 81860272), den store forsknings plan for provins videnskab og teknologi Foundation i Guangxi (ref nr. AB16380219), og China postdoc Science Foundation Grant (ref nr. 2018M630993) fra Kina.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PCR tubes, 0.2 mL Axygen PCR-02D-C
UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 ThermoFisher 15575020
PBS, pH 7.4, Ca2+ and Mg2+ free ThermoFisher 10010023
1.0 M NaOH (1.0N) solution SIGMA-ALDRICH S2567 For Melt-off solution. Molecular grade
Eppendorf LoBind Tubes, 1.5 mL Fisher Scientific 13-698-791
Ion Plus Fragment Library Kit ThermoFisher 4471252
ELGA PURELAB Flex 3 Water Purification System or
Equivalent 18 MΩ water system		 ThermoFisher 4474524
Ion Plus Fragment Library Kit ThermoFisher 4471252
PicoPLEX WGA Amplification buffer Rubicon Genomics R30050 This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03.
PicoPLEX WGA Amplification enzyme Rubicon Genomics R30050 This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03.
Ion OneTouch Amplification Plate In kit: Ion OneTouch 2 Supplies (Part No. A26367). Extended kit component in Sheet 5
Ion PI Annealing Buffer
MyOne Beads Capture Solution
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument Agilent G2939AA
Ion OneTouch Breaking Solution (black cap) In kit: Ion PI Hi?Q OT2 Solutions 200 (Part No. A26429). Extended kit component in Sheet 5
Dynabeads MyOne Streptavidin C1 ThermoFisher 65001
PicoPLEX WGA Cell extraction buffer Rubicon Genomics R30050 This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-00.
PicoPLEX WGA Cell extraction enzyme Rubicon Genomics R30050 This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03.
Ion PI Chip Kit v3 ThermoFisher A26771
Ion Chip Minifuge, 230 V ThermoFisher 4479673
Ion PI dATP ThermoFisher A26772
Ion PI dCTP ThermoFisher A26772
Ion PI dGTP ThermoFisher A26772
Ion Plus Fragment Library Kit ThermoFisher 4471252
Ion Plus Fragment Library Kit ThermoFisher 4471252
ThermoQ–Temperature Dry Bath TAMAR HB-T2-A
NEBNext dsDNA Fragmentase New England Biolabs M0348L
NEBNext dsDNA Fragmentase New England Biolabs M0348L
Ion PI dTTP ThermoFisher A26772
Ion OneTouch 2 Instrument ThermoFisher INS1005527 ThermoFisher Catalog number: 4474778.
Ion Plus Fragment Library Kit ThermoFisher 4471252
Ion One Touch ES ThermoFisher 8441-22 ThermoFisher Catalog number: 4469495. Extended kit component in Sheet 5
Ethanol SIGMA-ALDRICH 51976 This can be replaced by any brand's molecular grade absolute ethanol.
PicoPLEX WGA Extraction enzyme dilution buffer Rubicon Genomics R30050 This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-01.
PicoPLEX WGA Extraction enzyme dilution buffer Rubicon Genomics R30050 This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-02.
Qubit 3.0 Fluorometer ThermoFisher Q33216 This model has been replaced by Qubit 4 Fluorometer, Catalog number: Q33226.
Qubit ds DNA HS Assay kit ThermoFisher M2002-02
Qubit Assay Tubes ThermoFisher Q32856
Ion PI Foaming Solution ThermoFisher A26772
Index for barcoding of libraries BaseCare this is a in-house prepared index. Users can buy commercial product from ThermoFisher Ion Xpress Barcode Adapters Kits (Cat. No. 4474517)
Ion PI Loading Buffer ThermoFisher A26772
Solid(TM) Buffer Kit-1X Low TE Buffer ThermoFisher 4389764
Agencour AMPure XP Kit Beckman Coulter A63880
DynaMag-2 magnet (magnetic rack) ThermoFisher 12321D
Ion PI Master Mix PCR buffer
Sorvall Legend Micro 17 Microcentrifuge Micro 17 75002430
Ion Plus Fragment Library Kit ThermoFisher 4471252
Nuclease-free water ThermoFisher AM9922 This can be replaced by other brand.
PicoPLEX WGA Nuclease-free water Rubicon Genomics R30050 This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03.
Ion OneTouch Oil bottle Ion PI Hi?Q OT2 Solutions 200 (Part No. A26429). Extended kit component in Sheet 5
Ion Plus Fragment Library Kit ThermoFisher 4471252 Extended kit component in Sheet 3
double-strand DNA standard This is a in-house prepared DNA standard for calibration of Qubit before quantification of library.
PicoPLEX WGA Preamplification buffer Rubicon Genomics R30050 This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03.
PicoPLEX WGA Preamplification enzyme Rubicon Genomics R30050 This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03.
Library Amplification Primer Mix ThermoFisher 4471252 Extended kit component in Sheet 3
Ion OneTouch Reaction Filter Extended kit component in Sheet 5
Recovery Router Extended kit component in Sheet 5
Recovery Tubes Extended kit component in Sheet 5
ISP Resuspension Solution
Ion Proton ThermoFisher DA8600 This model is imported by Da An Gene Co.,LTD. of Sun Yat-Sen University from ThermoFisher and has been certified by China Food and Drug Administration for clinical application. The catalog number in ThermoFisher is 4476610.
Ion PI Hi?Q Sequencing Polymerase ThermoFisher A26772
Ion PI Sequencing Primer
server for sequencer Lenovo T260
Ion PI Sphere Particles
Platinum PCR SuperMix High Fidelity ThermoFisher 4471252
Nalgene 25mm Syringe Filters ThermoFisher 724-2045 Pore size: 0.45μm. Specifically for aqueous fluids.
Ion PI Hi?Q W2 Solution ThermoFisher A26772
Ion PI 1X W3 Solution ThermoFisher A26772
Ion OneTouch Wash Solution C1
The Ion PGM Hi?Q View Sequencing Kit ThermoFisher A30044 Extended kit component in Sheet 2
Ion Plus Fragment Library Kit ThermoFisher 4471252 Extended kit component in Sheet 3
Ion PI Hi-Q Sequencing 200 Kit (1 sequencing run per initialization) ThermoFisher A26772 Extended kit component in Sheet 4
Ion PI Hi?Q OT2 200 Kit ThermoFisher A26434 Extended kit component in Sheet 5

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Balaban, B., Urman, B. Effect of oocyte morphology on embryo development and implantation. Reproductive BioMedicine Online. 12 (5), 608-615 (2006).
  2. Capalbo, A., et al. Correlation between standard blastocyst morphology, euploidy and implantation: An observational study in two centers involving 956 screened blastocysts. Human Reproduction. 29 (6), 1173-1181 (2014).
  3. Magli, M. C., Gianaroli, L., Ferraretti, A. P. Chromosomal abnormalities in embryos. Molecular and Cellular Endocrinology. 183, 29-34 (2001).
  4. Trussler, J. L., Pickering, S. J., Ogilvie, C. M. Investigation of chromosomal imbalance in human embryos using comparative genomic hybridization. Reproductive BioMedicine Online. 8 (6), 701-711 (2004).
  5. Fragouli, E., et al. Cytogenetic analysis of human blastocysts with the use of FISH, CGH and aCGH: Scientific data and technical evaluation. Human Reproduction. 26 (2), 480-490 (2011).
  6. Calhaz-Jorge, C., et al. Assisted reproductive technology in Europe, 2013: Results generated from European registers by ESHRE. Human Reproduction. 32 (10), 1957-1973 (2017).
  7. Dyer, S., et al. International committee for monitoring assisted reproductive technologies world report: Assisted reproductive technology 2008, 2009 and 2010. Human Reproduction. 31 (7), 1588-1609 (2008).
  8. Dahdouh, E. M., Balayla, J., García-Velasco, J. A. Comprehensive chromosome screening improves embryo selection: A meta-analysis. Fertility and Sterility. 104 (6), 1503-1512 (2015).
  9. Chen, M., Wei, S., Hu, J., Quan, S. Can Comprehensive Chromosome Screening Technology Improve IVF/ICSI Outcomes? A Meta-Analysis. PloS One. 10 (10), e0140779 (2015).
  10. Northrop, L. E., Treff, N. R., Levy, B., Scott, J. T. SNP microarray-based 24 chromosome aneuploidy screening demonstrates that cleavage-stage FISH poorly predicts aneuploidy in embryos that develop to morphologically normal blastocysts. Molecular Human Reproduction. 16 (8), 590-600 (2010).
  11. Barbash-Hazan, S., et al. Preimplantation aneuploid embryos undergo self-correction in correlation with their developmental potential. Fertility and Sterility. 92 (3), 890-896 (2009).
  12. Fragouli, E., et al. Comprehensive cytogenetic analysis of the human blastocyst stage. Fertility and Sterility. 90 (11), S36 (2008).
  13. Fiorentino, F., et al. Development and validation of a next-generation sequencing-based protocol for 24-chromosome aneuploidy screening of embryos. Fertility and Sterility. 101 (5), 1375-1382 (2014).
  14. Fiorentino, F., et al. Application of next-generation sequencing technology for comprehensive aneuploidy screening of blastocysts in clinical preimplantation genetic screening cycles. Human Reproduction. 29 (12), 2802-2813 (2014).
  15. Wells, D., et al. Clinical utilisation of a rapid low-pass whole genome sequencing technique for the diagnosis of aneuploidy in human embryos prior to implantation. Journal of Medical Genetics. 51 (8), 553-562 (2014).
  16. Quail, M. A., et al. A tale of three next generation sequencingplatforms: comparison of Ion Torrent, PacificBiosciences and Illumina MiSeq sequencers. BMC Genomics. 13 (1), 1-13 (2012).
  17. Goodwin, S., McPherson, J. D., McCombie, W. R. Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies. Nature Reviews Genetics. 17 (6), 333-351 (2016).
  18. Bono, S., et al. Validation of a semiconductor next-generation sequencing-based protocol for preimplantation genetic diagnosis of reciprocal translocations. Prenatal Diagnosis. 35 (10), 938-944 (2015).
  19. Harton, G. L., et al. ESHRE PGD Consortium/Embryology Special Interest Groupbest practice guidelines for polar body and embryo biopsy for preimplantation genetic diagnosis/screening (PGD/PGS). Human Reproduction. 26 (1), 41-46 (2011).
  20. Liu, W. Q., et al. The performance of MALBAC and MDA methods in the identification of concurrent mutations and aneuploidy screening to diagnose beta-thalassaemia disorders at the single- and multiple-cell levels. Journal of Clinical Laboratory Analysis. 32 (2), 1-8 (2018).
  21. Zhang, X., et al. The comparison of the performance of four whole genome amplification kits on ion proton platform in copy number variation detection. Bioscience Reports. 37 (4), BSR20170252 (2017).
  22. Munné, S., Grifo, J., Wells, D. Mosaicism: “survival of the fittest” versus “no embryo left behind”. Fertility and Sterility. 105 (5), 1146-1149 (2016).
  23. Del Carmen Nogales, M., et al. Type of chromosome abnormality affects embryo morphology dynamics. Fertility and Sterility. 107 (1), 229-235 (2017).
  24. Harton, G. L., et al. ESHRE PGD consortium best practice guidelines for amplification-based PGD. Human Reproduction. 26 (1), 33-40 (2011).
  25. Deleye, L., et al. Shallow whole genome sequencing is well suited for the detection of chromosomal aberrations in human blastocysts. Fertility and Sterility. 104 (5), 1276-1285 (2015).
  26. Bielanska, M., Tan, S. L., Ao, A. Chromosomal mosaicism throughout human preimplantation development in vitro: incidence, type, and relevance to embryo outcome. Human Reproduction. 17 (2), Oxford, England. 413-419 (2002).
  27. Treff, N. R., et al. Evaluation of targeted next-generation sequencing-based preimplantation genetic diagnosis of monogenic disease. Fertility and Sterility. 99 (5), 1377-1384 (2013).

Tags

Genetik næste generations sekventering halvleder sekvensering biblioteks konstruktion præimplantations genetisk testning for aneuploidi (PGT-A) hel genom amplifikation (WGA) blastocyst
Halvleder sekvensering for præimplantations genetisk testning for Aneuploidy
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gui, B., Zhang, Y., Liang, B., Kwok, … More

Gui, B., Zhang, Y., Liang, B., Kwok, Y. K. Y., Lui, W. T., Yeung, Q. S. Y., Kong, L., Xuan, L., Chung, J. P. W., Choy, K. W. Semiconductor Sequencing for Preimplantation Genetic Testing for Aneuploidy. J. Vis. Exp. (150), e59273, doi:10.3791/59273 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter