Summary
ここでは、短い所要時間、低コスト、高スループットの利点を有する、異性化症(PGT-A)の移植前遺伝子検査用半導体シーケンシング法を紹介する。
Abstract
染色体異性体は、胚発生停止、移植不全、または妊娠喪失につながる主な原因の1つであり、ヒト胚において十分に文書化されている。移植前遺伝子検査(PGT-A)は、胚の染色体異常を検出することによって生殖結果を有意に改善する遺伝子検査である。次世代シーケンシング(NGS)は、遺伝子解析のための高スループットと費用対効果の高いアプローチを提供し、PGT-Aの臨床的応用性を示しています。ここでは、胚における無気不変のスクリーニングのための迅速かつ低コストの半導体シーケンシングベースのNGS法を提示する。ワークフローの最初のステップは、生検胚標本の全ゲノム増幅(WGA)、続いてシーケンシングライブラリの構築、および半導体シーケンシングシステム上のシーケンシングです。一般に、PGT-A アプリケーションの場合、各チップに 24 個のサンプルをロードし、150 塩基対の平均読み取り長で 60-8000 万の読み取りを生成します。この方法は、テンプレートの増幅とシーケンシング ライブラリの強化を行うための洗練されたプロトコルを提供し、PGT-A検出を再現可能、高スループット、コスト効率、および時間節約にします。この半導体シーケンサーの稼働時間はわずか2~4時間で、サンプルの受け取りからレポートの発行までの所要時間を5日間に短縮します。これらすべての利点は、このアッセイを胚から染色体異性体を検出し、したがって、PGT-Aでの広い適用を容易にする理想的な方法を作る。
Introduction
補助生殖における転移のための正常な染色体コピー番号(ユーロイド)を持つ良好な生存胚を選択することは、妊娠の結果を改善するのに役立ちます。伝統的に、確立された形態グレーディングシステムは、その容易な可用性と非侵襲的な性質のために胚の評価のために広く使用されています。しかし、形態学的評価は、胚の質1および移植電位2に関する限られた情報しか提供できることが示されている。根本的な理由の一つは、胚の染色体組成を評価できないことである。
染色体異性体(染色体の異常コピー数)は、胚発生停止、移植不全または妊娠喪失につながる主な原因の一つである。無気腫の発生はヒト胚において十分に文書化されており、胚盤胞5では切断段階胚3、4および50%−60%で60%−70%を占めている。これは、ある程度、体外受精(IVF)治療の妊娠率の改善におけるボトルネックに寄与しており、これは約35%−40%6、7で維持されている。したがって、移植のためのユーロイド胚を選択することは、妊娠の結果を改善するために有益であると考えられている。この目的のために、移植前遺伝子検査(PGT-A)は、遺伝的アプローチを用いて胚の生存率を調べるためにさらに開発された。PGT-Aの重要な役割をサポートする無作為化対照試験およびコホート研究の数が増加している。PGT-Aの適用は流産率を減少させ、臨床妊娠率および移植率8、進行中の妊娠率および出生率9を増加させることを証明した。
歴史的に、PGT-Aには、その場所ハイブリダイゼーション(FISH)、比較ゲノムハイブリダイゼーション(CGH)、アレイ-CGH、単一ヌクレオチド多型(SNP)マイクロアレイなどの異なる方法が適用されてきました。これまでの研究では、FISHによる切断段階胚に対するPGT-Aは、59273array-CGHまたは59273array-CGHを用いた対応する胚盤胞の包括的な染色体スクリーニング(CCS)によって得られたものと一致しない結果を得るSNP-マイクロアレイ5927310.これらの不一致は、染色体モザイク、FISH技術アーティファクト、または開発11の間に染色体分離エラーの胚自己補正に起因しうる。アレイCGHやSNPマイクロアレイなどのアレイベースのPGT-Aに胚盤胞性栄養細胞(TE)生検を用いることは、胚10、12における染色体不均衡の同定に有効であると広く認識されている。近年、単細胞次世代シーケンシング(NGS)は、遺伝子解析のための高スループットと費用対効果の高いアプローチを提供し、PGT-A 13,14,15の臨床的応用性を示しています。現在利用可能な方法に代わる有望な方法です。
ここでは、ヒト胚における無気球体のスクリーニングのための高速、堅牢、低コストの半導体シーケンシングベースのNGS法を提示する。ワークフローの最初のステップは、生検胚標本の全ゲノム増幅(WGA)であり、単一細胞WGAキットを使用して、シーケンシングライブラリの構築、および半導体シーケンシングシステム上でのその後のシーケンシングを行います。
DNA鎖合成時に各デオキシリボヌクレオシド三リン酸から放出されるH+イオンを検出することにより、半導体元素によって捕捉された化学信号(pH変化)を転送し、デジタルデータを導くDNA配列情報にさらに解釈されます。高価な光学検出および複雑なシーケンシング反応のための条件を除去し、この簡単なシーケンシング化学は総試薬の費用を削減し、2-4時間16にシーケンシングの実行時間を短縮する。さらに重要なのは、製造元のパフォーマンス仕様に基づいて、半導体シーケンシングプラットフォームは、実行あたり最大15 GBのシーケンスデータ(ライブラリの品質に依存)を生成でき、他のシーケンサーよりも大幅に高い約 3−4 GBのデータ(2 x 75 bpの読み取り長)17を生成します。PGT-Aの臨床応用では、このプラットフォームは、最大8,000万回の読み取り17回、各サンプルの少なくとも100万回のユニークな読み取り値を生成するチップあたり24サンプルを達成することができます。読み取り深さは各サンプルが少なくとも0.05x全体のゲノムカバレッジを有することを保障できる。このプラットフォームの上記の利点は、理想的なスクリーニング方法を作り、したがって、PGT-A18でその広いアプリケーションを容易にします。
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Protocol
香港合同中国大学-新地域東部クラスター臨床研究倫理委員会(参考文献:2010.432)により倫理的承認を受けました。研究ライセンスは、香港の人間生殖技術評議会(番号R3004)によって承認されました。
1. 全ゲノム増幅
- 開始前に、磁気ビーズ(材料の表)の体積を確認して、各サンプルに135μL(20%の過剰)がないことを確認してください。磁気ビーズを室温(RT)で少なくとも30分間保ち、各サンプルに70%のエタノールの720 μL(20%の過剰)を準備します。105 °Cで加熱された蓋と熱サイクラー(材料のテーブル)を装備します。
注:新たに用意した70%エタノール(材料の表)は3日以内に使用する必要があります。 - サンプル調製
注:ルーチンの練習では、胚盤胞の5~10の栄養形成細胞は、実践ガイドライン19に従って生検される。- 単一の0.2 mLポリメラーゼ連鎖反応(PCR)チューブで1xリン酸緩衝生理食べ物(PBS)の2μLで生検を中断する。
- 簡単に液滴を収集するために3 sのためのミニ遠心分離機の管を回転させます。
- 細胞のリシスと抽出
- 細胞抽出バッファー(材料表)と抽出酵素希釈バッファー(材料の表)を氷、渦上で解凍し、使用前に3sのミニ遠心分離機で短時間スピンします。
- ステップ1.2.2から各チューブに3 μLの細胞抽出バッファーを追加します。
- 抽出酵素希釈バッファーと0.2 μL細胞抽出酵素(材料表)の4.8μLを加えて、各サンプルに5μL細胞リシスマスターミックスを調製します。ステップ1.3.2から各チューブによく混ぜてアリコートします。チューブを軽くひっくり返し、ミニ遠心分離機で3sの短時間スピンします。
注: マスターミックスを追加する際に、セルサンプルを含む液体にチップを触れないでください。 - 熱サイクラーのステップ1.3.3から熱サイクラーの管を熱蓋とインキュベートする。次の設定でプログラムを実行します:75 °Cで10分、95°Cで4分、4 °Cで保持します。
- プリアンプ化
- 氷、渦上の前増幅バッファー(材料の表)を解凍し、使用前に3sのミニ遠心分離機で短時間回転させます。
- 4.8 μLのプリアンプ化バッファーと0.2 μLのプリアンプ化酵素(材料表)を加えて、各サンプルに5μLのプリアンプ化マスターミックスを調製します。ステップ1.3.4から各チューブによく混ぜてアリコートします。チューブを軽くひっくり返し、ミニ遠心分離機で3sの短時間スピンします。
注: マスターミックスを追加する際に、DNAサンプルを含む液体にチップを触れないでください。 - 熱サイクラーでチューブを加熱した蓋でインキュベートします。流れる設定でプログラムを実行します:95 °Cで2分。12 サイクル 15 ° C, 15 °C で 50 s, 25 °C で 40 s, 35 ° C で 30 s, 40 s 65 °C で 40 s, 75 °C で 40 s;4 °Cで保持します。
- 増幅
- 氷、渦上の増幅バッファー(材料の表)を解凍し、使用前に3sのミニ遠心分離機で短時間スピンします。
- 増幅バッファーの25 μL、増幅酵素の0.8 μL(材料の表)、WGA(材料の表)のためのヌクレルフリー水の34.2 μLを加えることによって、各サンプルに60 μL増幅マスターミックスを調製します。ステップ1.4.3から各チューブによく混ぜてアリコートします。チューブを軽くひっくり返し、ミニ遠心分離機で3sの短時間スピンします。
- 熱サイクラーでチューブを加熱した蓋でインキュベートします。次の設定でプログラムを実行します: 95 °C で 2 分;95 °C で 15 s のための 14 サイクル, 65 °C で 1 分, 75 °C で 1 分;4 °Cで保持します。
- の精製WGA 製品
- 各 WGA 製品をステップ 1.5.3 から新しい 1.5 mL チューブに転送します。各チューブに112.5 μLの磁気ビーズを追加します。渦と5分間RTでインキュベートします。
注:使用前に磁気ビーズを完全に混ぜます。 - 上清が透明になるまで3分間、チューブを磁気スタンド(材料のテーブル)の上に置きます。ビーズを邪魔することなく、すべての上清を廃棄します。
- 各チューブに70%エタノールの300 μLを追加します。各チューブを180°回転させて、ビーズがエタノールを通り抜け、元の位置に戻るようにします。ビーズがビーズを邪魔することなく落ち着いた後、すべての上清を廃棄します。この手順を 1 回繰り返します。
メモ:チューブを水平に回転させながら、チューブを磁気スタンドに置いてください。 - 3 s. 残留上清が明確になるまで、チューブを磁気スタンドに置きます。ビーズを邪魔することなく、残留上清をすべて廃棄します。RTでビーズを約3分間乾燥させます。
- 磁気スタンドからチューブを取り外し、低トリスEDTA(TE)バッファー(材料表)の35μLを加えて乾燥ビーズを再懸濁させます。RTで5分間インキュベートします。
- 上清が透明になるまで、チューブを磁気スタンドに3分間置きます。ビーズを邪魔することなく、浸透したDNAを含むすべての上清を新しい1.5 mLチューブに移します。
- 各 WGA 製品をステップ 1.5.3 から新しい 1.5 mL チューブに転送します。各チューブに112.5 μLの磁気ビーズを追加します。渦と5分間RTでインキュベートします。
2. WGA製品の品質管理
- WGA製品の1μLを開始材料として使用して、製造元のマニュアルに従って、フッ素計アッセイ(材料の表)によってステップ1.6.6から各精製WGA製品を定量します。
注:WGA製品の受け入れ濃度は≥10 ng/μLです。このしきい値を下回る製品は、次の手順に進むことはお勧めしません。
3. WGA製品の断片化
- 開始前に、ドライブロックヒーターを37°Cに予熱します。各サンプルに対して6 μL(20%の過剰)0.5M EDTAを調調します。濃度に基づいて、ステップ1.6.6から新しい0.2 mL PCRチューブに各精製WGA製品からのDNAのアリコート300 ngを、各チューブにヌクレアーゼフリー水で16 μLに体積をもたらします。
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断片化
- dsDNA断片化反応バッファー(材料表)の2μLと2μLのdsDNA断片化酵素(材料表)を添加して、各試料に対して4 μL二本鎖DNA(dsDNA)断片化反応ミックスを調製する。ステップ3.1から各チューブによく混ぜてアリコートします。渦と3 s.のミニ遠心分離機で短時間スピンし、加熱された蓋を持つサーマルサイクラーで37°Cで25分間チューブをインキュベートします。
- 各チューブに直ちに0.5 M EDTAの5 μLを追加します。渦でよく混ぜ、3sのミニ遠心分離機で簡単に回転させます。
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精製と再サスペンション
- ステップ 3.2.2 から新しい 1.5 mL チューブに各製品を転送します。各チューブに37.5 μLの磁気ビーズを追加します。頂点で混合し、RTで5分間インキュベートします。
- ステップ 1.6.2 からステップ 1.6.4 まで説明されているように製品を浄化します。
- ステップ1.6.5および1.6.6に記載されているように、各精製製品を低TEバッファーの32 μLを追加して溶出します。
4. 図書館建設
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ブラント-endrペアリング、サイズの選択と精製
- 核リースフリー水の9.5 μL、5倍のエンド修復バッファーの10 μLを加えることによって、各サンプルに20 μLの鈍エンド修復ミックスを準備します(ステップ3.3.3から材料チューブの表。渦と3sのためのミニ遠心分離機で短時間回転します。
- ステップ4.1.1から各チューブに50 μLの磁気ビーズを追加します。渦と5分間RTでインキュベートします。
注:使用前に磁気ビーズを完全に混ぜます。 - 上清が透明になるまで、各チューブを磁気スタンドに3分間置きます。すべての上清を新しい1.5 mLチューブに移し、それぞれに25μLの磁気ビーズを加えます。転移した上清でチューブを渦にし、RTで5分間インキュベートします。
- ステップ 1.6.2 からステップ 1.6.4 まで説明されているように、インキュベートされたチューブ内の製品を浄化します。
- ステップ1.6.5および1.6.6に記載されているように、各精製製品を低TEバッファーの32 μLを追加して溶出します。
注: これは安全なストップ ポイントです。この工程からの精製されたDNAは、24時間以下で4°Cで安定しています。
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アダプターlイゲーションとp排尿
- 10 μL の核リースフリー水、10x リガーゼ バッファーの 5 μL(材料表)、P1 アダプター (材料の表)、および 1 μL の DNA リガーゼ (材料表) を加えて、各サンプルに 17 μL アダプターライゲーション ミックスを準備します。5sの渦でよく混ぜ、15sのミニ遠心分離機でスピンし、ステップ4.1.5から各チューブにアリコート。
- サンプルシート(補足ファイル:アダプターライゲーション用サンプルシート)に従って、ステップ4.2.1から各チューブにアダプタ(材料表)の1 μLを追加します。渦と短時間3秒のミニ遠心分離機でスピンし、RT(20−25°C)でチューブを20分間インキュベートします。
- ステップ4.2.2から各チューブに75 μLの磁気ビーズを追加します。頂点で混合し、RTで5分間インキュベートします。次に、ステップ 1.6.2 からステップ 1.6.4 まで説明されているように製品を精製します。
- ステップ1.6.5および1.6.6で説明されているように、各精製製品を15 μLの低TEバッファーを追加して溶出します。浸透したDNAを含むすべての上清を新しい0.2 mL 8チューブストリップに移します。
注: これは安全なストップ ポイントです。この工程からの精製されたDNAは、24時間以下で4°Cで安定しています。
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増幅・精製
- スーパーミックス(材料表)の47.5μLとプライマーミックス(材料の表)の2.5 μLを加えることによって、各サンプルに50 μL増幅マスターミックスを準備します。渦でよく混ぜ、ミニ遠心分離機で簡単にスピンし、ステップ4.2.4から0.2 mL 8チューブストリップにアリコート。
- 30 s用のストリップを渦にし、3 s.熱サイクラーのストリップを加熱された蓋でインキュベートするミニ遠心分離機で短時間回転させます。次の設定でプログラムを実行します: 72 °C で 20 分;95 °Cで5分;95 °C で 15 s の 10 サイクル、 62 °C で 15 s、70 °C で 1 分;70 °Cで5分;4 °Cで保持します。
- ステップ 4.3.2 から新しい 1.5 mL チューブに各製品を転送します。各チューブに97.5 μLの磁気ビーズを追加します。渦で混ぜ、RTで5分間インキュベートします。
- ステップ 1.6.2 からステップ 1.6.4 まで説明されているように製品を浄化します。
- ステップ1.6.5および1.6.6に記載されているように、各精製製品を25 μLの低TEバッファーを追加して溶出します。
5. DNAライブラリーの品質管理と希釈
- 製造元のマニュアルに従って、2 μLのDNAライブラリーを開始材料として使用して、フッ素計アッセイによってステップ4.3.5から各調製DNAライブラリーを定量します。
- DNAライブラリーの受け入れられた濃度は≥0.5 ng/μLであり、陽性対照(材料表)の濃度は≤15 ng/μLである。陽性制御の濃度が15 ng/μLからあまりにも多く変化する場合は、濃度が15ng/μLに近づくまで正対照の定量を繰り返します。ライブラリの濃度が 0.5 ng/μL 未満の場合は、断片化から再開します (セクション 3)。
注: DNA ライブラリーを定量する前に、正のコントロールの濃度が受け入れられた値に達していることを確認してください。 - ヌクレアーゼフリー水を加えて各図書館を100pmolに希釈します。ヌクレアーゼフリー水のn μLに1 μLのライブラリーを追加します。以下の式を使用してnを計算します。
ここでQは、フッ素計アッセイによって測定された各ライブラリーの濃度であり、Cは、蛍光計アッセイによって測定された陽性対照の濃度である。
6. シーケンス
- 開始前に、各サンプルに対して1M NaOHの48 μL(20%の過剰)と1つのヌクレルスフリー1.5 mLチューブを調製します。マスターミックスPCRバッファ(材料表)(体積2000μL)をRTで解凍し、球粒子(材料の表)をRTに持ち込みます。
- ライブラリ プーリング
- 渦はステップ5.3から各希釈されたライブラリを、毎回3sのミニ遠心分離機で4倍に簡単に回転させます。各ライブラリの5 μLを取り、ヌクレアーゼフリーの1.5 mLチューブにプールします。混合ライブラリを渦にし、3sのミニ遠心分離機で簡単に回転します。
- エマルジョンシステムを用したエマルジョンPCR
- 2つの新しい回収管(材料の表)に壊れる解決の150 μLを加える。新しいリカバリチューブ、リカバリルータ、増幅プレートを取り付けます。
- オイルボトル(材料のテーブル)を3回反転して混ぜます。オイルと回収液(材料の表)の両方が少なくとも2/3がいっぱいであることを確認します。
- 30sのマスターミックスPCRバッファを渦にし、3 s.Vortex球粒子と混合ライブラリをステップ6.2.1から1分間、ミニ遠心分離機で短時間スピンし、3sのミニ遠心分離機で短時間スピンします。
- 2400 μL のライゲーションミックスを、ステップ 6.3.3 から 172 μL、混合ライブラリーの 8 μL をステップ 6.3.3、酵素ミックスの 120 μL(材料の表)、および 2000 μL マスターミックス PCR バッファーを含むチューブに 100 μL の球体粒子を加えて調製します。
- ピペットを 800 μL に設定し、ステップ 6.3.4 からリゲーション ミックスをサンプル ポートを介して反応フィルター (材料の表)にロードします。1000Pピペットを使用して、反応フィルターに200μLの反応油を追加します。
- プログラムプロトン:イオンPI Hi-Q OT2 200キットを選択し、[アシスト]ボタンを選択して、モニタの指示に従ってデバイスが正しく設定されていることを確認します。次に、[次へ]をクリックしてプログラムを開始します。
- 自動エンリッチメントシステムによるエンリッチメント
- エマルジョン PCR プログラムが完了したら、[次へ]をクリックし、[最終スピン]をクリックして 10 分間スピンします。[ふたを開く]をクリックした後、2 つの回復チューブを取り出します。
- 各チューブに100μLが残るまで、2本の回収管から上清を廃棄し、それに応じてラベルを付けます。溶液をよく混ぜ、新しい1.5 mLチューブに移します。
- 各回収管に200μLのヌクレアーゼフリー水を加え、ピペで数回上下に洗浄し、ステップ6.4.2で1.5 mLチューブにすべての溶液を移します。洗浄手順を1回繰り返します。
- 回収管の1つに200μLのヌクレアーゼフリー水を加え、上下に数回ピペッティングして洗浄します。すべての溶液を他の回収管に移し、ピペを数回上下に動かして洗います。次に、ステップ6.4.3からすべての溶液を同じ1.5 mLチューブに移します。渦は1.5 mLチューブを30s、遠心分離機は15,500 x gで8分間です。
注: このステップのエマルジョン PCR 製品の最終的な総体積は、約 1200 μL である必要があります。 - チューブ内の上清を廃棄し、エマルジョンPCR製品の20 μLを保持します。チューブに80 μLの再懸濁液(材料の表)を追加します。上下にピペッティングしてミックスします。
- ポリエチレングリコールソルビタン単一ラウレート溶液(材料表)の280 μLと1M NaOHの40 μLを加えて、各チップに対して320μLの溶融溶液を調製します。
注:1 M NaOHは4°Cで保存するか、または新鮮に調製する必要があります。使用前の渦。 - 30s用のC1ビーズ(材料の表)を含むチューブを渦。新しい1.5 mLチューブにC1ビーズの100 μLを取ります。1.5 mLチューブを磁気スタンドの上に2分間置き、ビーズを邪魔することなくビーズが落ち着いた後にすべての上清を捨てます。
- ステップ6.4.7からチューブに洗浄液C1(材料のテーブル)の1mLを追加します。30 s. RTで2分間磁気スタンドにチューブを置きます。ビーズ捕捉液(材料の表)の130 μLを追加してビーズを再懸濁します。
-
エンリッチメントシステム(ES)セットアップ
- ステップ6.4.5からサンプル(100 μLエマルションPCR産物)、ステップ6.4.8から洗浄ビーズ(130 μL)、ES洗浄液(300μL)(材料の表)、ステップ6.4.6からメルトオフ溶液(300 μL)を8チューブストリップにロードします。レイアウトの順序は、サンプル(チューブ1)、洗浄ビーズ(チューブ2)、ES洗浄液(チューブ3、4、5)、および溶融溶液(チューブ7)です。チューブ6と8は空にしておきます。
- ステップ 6.4.9.1 の 8 チューブ ストリップを ES に配置します。ピペットチップと新しい0.2 mLチューブを取り付け、プログラムを開始します。
注: ピペッティングが正常に動作することを確認します。
- 濃縮が完了したら、球の粒子を洗浄します。
- ステップ6.4.9.2から0.2 mLチューブを15,500 x gで5分間遠心分離します。上清を廃棄し、濃縮物の10μLを保ちます。管に200 μLのヌクレルスフリー水を加えます。渦で混ぜる。
- 遠心分離管から15,500 x gで5分間。上清を廃棄し、濃縮物の10μLを保ちます。90 μL のヌクレアーゼフリー水をチューブに加えます。渦で混ぜる。
- テンプレートの準備
- 正のコントロールを渦にし、短時間スピンします。100 μL テンプレート(ステップ 6.4.10.2 からの濃縮製品)に 5 μL の正のコントロールを追加します。渦と遠心分離機 15,500 x gで 5 分.上清を捨て、テンプレートの10 μLを保持します。
- ステップ6.5.1から20 μLのシーケンシングプライマー(材料表)と15μLのアニーリングバッファー(材料表)をテンプレートチューブに追加します。チューブを渦にし、3sのミニ遠心分離機で短時間回転させます。
- 熱サイクラーのステップ6.5.2から熱サイクラーの管を熱蓋とインキュベートする。次の設定でプログラムを実行します:95°Cで2分、37°Cで2分、4 °Cで保持します。
- ステップ6.5.3からチューブに10 μLのローディングバッファ(材料の表)を追加します。上下にピペッティングしてミックスします。
- シーケンサーの初期化
- 窒素ガスのタンク圧力(総圧力≥500 psi、出力圧力≥10 psi、最適な20-30 psi)を確認してください。C1およびC2チューブ(材料の表)にトップアップ100 mL脱イオン水(18.2 MΩ)を、シーケンサー上の対応するC1およびC2位置に取り付けます。
- W1(1M NaOHの32 μL)およびW3(W3バッファー[材料の表])の40-50 mL)溶液を準備します。1920 mLの脱イオン水(18.2MΩ)、W2バッファー(材料表)のボトル1本、1M NaOHの8−12 μLを加えてW2溶液を調べ、4~8回反転して混合します。
注:水質は地質学的に異なるため、必要に応じて1M NaOHの体積を調整してください。W2の開始pHは5.9−6.1で、調整後の最適範囲は7.4−7.6です。新しい試薬チューブを交換して取り付け、最近使用したチップを洗浄に使用します。 - シーケンシングサプリメントキット(材料の表)から4つの新しい空のチューブを準備します。4 つのチューブに dGTP、dCTP、dATP、および dTTP というラベルを付け、対応するチューブに 70 μL の dGTP、dCTP、または dTTP (材料の表)を追加します (つまり、dGTP などの標識のあるチューブに 70 μL dGTP)。使用前にチューブを渦にします。シーケンサー(材料の表)に指定された対応する位置にチューブを取り付けます。
- チップウォッシュ
- チップの積み込み井戸に100μLのイソプロパノールを注入して、チップ(材料のテーブル)を1回洗います。追い出された液体を反対側の井戸から取り除きます。
- チップの積み込み井戸に100μLのヌクレルスフリー水を注入して、チップを2回洗浄します。追い出された液体を反対側の井戸から取り除きます。
- 0.1 M NaOHの100 μLをチップの積み込み井戸に注入して、チップを1回洗います。追い出された液体を反対側の井戸から取り除きます。RTで1分間インキュベートします。
- チップの積み込み井戸に100μLのヌクレルスフリー水を注入して、チップを一度洗います。追い出された液体を反対側の井戸から取り除きます。
- チップの積み込み井戸に100μLのイソプロパノールを注入してチップを2回洗浄します。追い出された液体を反対側の井戸から取り除きます。チップに窒素を吹き付け、乾燥させます。光から遠ざけてください。
- サンプルの読み込みとシーケンス
- ステップ6.5.4から55 μLサンプルを上下にピペッティングして混合し、チップのローディングウェルにサンプルをロードします。
注:ピペット先端と0.2 mL PCRチューブは、このステップで使用してください。 - チップをチップミニ遠心分離機(材料のテーブル)に置きます。
- アニーリングバッファとフラッシング溶液用に2つの新しい1.5 mLチューブを準備します。500 μL のアニールバッファーと 500 μL のヌクレアーゼフリー水を加えて、50% のアニーリング バッファーを準備します。アニールバッファーの500 μLと100%2-プロパノールの500 μLを加えてフラッシング溶液を調製します。
- 2つの新しい1.5 mLチューブを準備し、50%のアニーリングバッファーの49 μLと1 μLの発泡液(材料のテーブル)を両方のチューブに混合して発泡混合物を調作します。
- ピペットを100 μLに設定し、ステップ6.8.4から2つのチューブのいずれかから発泡混合物に空気をピペットで泡を作ります。120 μLの気泡を作り、目立つ目に見える気泡が見えなくなるまでピペッティングを続けます。120 μL の気泡を積み込みによく積み込みます。
注: 目に見える気泡がないことを確認します。それ以外の場合は、最初からやり直してください。 - 過度の排出された液体をステップ6.8.5からピペッティングによってよくローディングに移します。気泡をピペットにしないでください。チップミニ遠心分離機で30s用のチップを遠心分離します。
- ステップ6.8.4から発泡混合物を含む第2のチューブを使用して、ステップ6.8.5を繰り返します。
- ステップ6.8.1に保持された0.2 mLチューブに50%のアニーリングバッファの55 μLを追加します。ステップ 6.8.1 のキープピペットチップを使用して、上下にピペットを使用します。55 μLのアニーリングバッファーをすべて積み込みによくロードします。指定されたチップミニ遠心分離機上の30s用チップを遠心分離します。
- 100 μLの洗い流し溶液をチップローディングに十分にロードし、排出された液体をよく出口から廃棄します。この読み込み手順を 1 回繰り返します。
注:チップに気泡がある場合は、大きな気泡によって小さな気泡を排出し、溶液をフラッシュしてフラッシュします。これは、フラッシング溶液の100 μLをピペッティングし、フラッシュ溶液の下に5 μLの空気を残すことによって達成することができます。したがって、105 μLをチップにピペッティングすると、空気が小さな気泡を排出できる大きな気泡を形成し、次のフラッシング溶液によって大きな気泡を排出することができます。 - 50%アニーリングバッファの100 μLをチップローディングウェルにロードします。この読み込み手順を合計 3 回繰り返します。
- 50%のアニーリングバッファーの60 μLにシーケンシング酵素の6 μLを新しい1.5 mLチューブに加えます。上下にピペッティングしてミックスします。この混合溶液の65 μLをチップローディングウェルにロードします。発泡を避けるためにゆっくりとピペット。
- チップを光から遠ざけ、RTで5分間インキュベートします。
- インキュベーションの後、すぐにシーケンサーにチップをロードし、画面上のシーケンス実行を開始をクリックしてシーケンスを開始します。
注:生データと品質管理ファイルの順序付けは、データ分析のために自動的に会社にアップロードされます。
- ステップ6.5.4から55 μLサンプルを上下にピペッティングして混合し、チップのローディングウェルにサンプルをロードします。
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Representative Results
この改変プロトコルに基づき、半導体シーケンシングプラットフォームは初めてPGT-Aに適用されました。切断段階の胚盤胞と胚盤胞期胚の両方からの生検について試験した。生検細胞は、DNAの分解を防ぐために、できるだけ早くWGAを受けることが示唆される。以前の研究では、異なるWGAメソッドの性能を比較し、ここで説明した方法は、100 KB20のビンサイズで最高の均一性を持っていることを示しました。均一性と中央値絶対対方向差(MAPD)21の両方の性能を考慮して、このWGA法は半導体シーケンサーを用いてPGT-Aに選択した。186の切断段階と1135個の胚盤胞期胚に関する遡及的統計分析を通して、WGAの成功率は胚盤胞サンプルで95.4%、胚盤胞サンプルで96.9%であったことが分かった(図1)。サイズ選択手順としてのライブラリ構築前の精製工程は、大きなDNA断片を捕捉して品質をシーケンシングするために重要でした。さらに、ライブラリ構築のための300 ngの入力量を容易にしました。酵素フラグメンテーション法により、WGA製品の効率的なせん断を約160bpに可能にしました。
データ分析は、ユークリッド距離および円形バイナリセグメンテーション(EDCBS)解析システムを用いて行った。このバイオインフォマティクスアルゴリズムの堅牢性を評価するために社内検証を行った。既知の核型を持つ66本の細胞株から379 WGA製品をシーケンシングし、100KBのビンサイズを解析することで、PGT-A専用のリファレンスデータベースを確立しました。このデータベースから、参照範囲はコピー番号バリアント (CNV) 呼び出しのしきい値として記述され、検出レベルのカットオフとして 10 MB が設定されました。感度と特異性の両方がこのしきい値で 99% を超えました (表1)。胚生検に関するPGT-Aのアプリケーションでは、ウィンドウサイズは400 KBに設定され、十分な読み取りに到達するためのスライディングウィンドウアプローチが付着した。各サンプルの品質管理(QC)は、一意の読み取り、MAPDおよびコピー番号バリアント(CNV∙SD)の標準偏差によって決定された。3 つのインデックスのいずれかを超えるサンプルは、QC 障害として定義されました (図 2C)。染色体散乱プロットの解釈(図2A、B、D)は、同定されたCNVをDECIPHER、DGV、またはClinGenデータベースと比較することにより、ワークフローに従って有資格遺伝学者によって行われた。個々の不一致は、専門家のキュレーション手順によって制御されました。染色体異常は、胚盤胞サンプルにおいて異性化症およびモザイク化にグループ化した。30%−70%の範囲内のコピー数の損益は、モザイク染色体組成物を運ぶと分類された。それ以外の場合、結果は、euploidy または異性異常のいずれかとして解釈されます。本研究では、ユープロイド率は胚盤で45.2%、胚盤胞で52.3%であったが、これは公表されたデータ22,23に反響した。
図1:この方法で試験した1321個の胚生検の人口統計。(A) 186個の切断段階胚からのデータ。(B) 1135胚盤胞期胚からのデータ。WGAの成功率は両方のタイプの標本の95%以上である。シーケンシング品質管理の失敗率は、切断段階群では3.4%、胚盤胞期群では1.9%に過ぎません。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:23対染色体に対する胚のPGT-A臨床応用の代表的な結果。(A)ユープロイディの代表的な結果;(B) 異性愛者 (seq[GRCh37] (2)x3, (21)x3);(C) 0.6571 (受け入れ ≤ 0.4) CNV∙SD によるQCのシーケンシングに失敗したサンプル。(D) セグメントモザイク削除 (55%)4p16.3p15.1(29.50 MB)の。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| CNV しきい値 | ||||||
| (-0.23, 0.20) | (-0.32, 0.26) | (-0.41, 0.32) | (-0.51, 0.37) | (-0.62, 0.43) | (-0.73, 0.48) | |
| 感度 | 100.00% | 100.00% | 100.00% | 100.00% | 98.30% | 96.02% |
| 特異 性 | 72.41% | 81.03% | 91.38% | 99.10% | 99.54% | 100.00% |
表1:半導体シーケンサーによる異なるLog R比間の感度と特異性。既知のユーロイド核型結果を持つ合計240個のサンプルをこの方法で試験し、異なるLog R比で呼び出した。
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Discussion
他のシーケンシング化学品とは異なり、ここで説明するシーケンサーは、ヌクレオチドの検出に半導体を使用します。チップ自体は、ポリメラーゼ駆動ベース組み込み17により水素イオンを検出する電子デバイスであり、プロトンプログラムの2〜4時間シーケンシング時間を可能にする。また、このチップは、他のシーケンサープロバイダーによるフローセルシーケンシング化学とは異なる1つの標的分子の局在化を可能にするマイクロウェルチップです。このプロトコルは、PGT-Aの適用に最適化された改変プロトコルです。最適化には、汚染の可能性を減らすために超音波処理の代わりに酵素法による増幅DNAの断片化が含まれており、サイズ選択とPCRシステムは、より低コストでより良いパフォーマンスを実現します。さらに、臨床設定では、バリアント呼び出しに検証済みの社内パイプラインを使用しました。
演習中に注意する必要がある重要な手順があります。精製用エタノールは、高濃度のエタノールが汚染されたDNAの洗浄不足を引き起こし、低濃度では標的DNAの損失を引き起こすため、実験前に新たに準備する必要があります。フッ素計は、精度を確保するために、既知の濃度で正の制御によって校正する必要があります。また、シーケンスにはテンプレートの適切な読み込みが重要です。適切なサイズの気泡は、テンプレートの球をマイクロウェルに落とすのに役立ちますが、大きすぎると不十分な荷重が発生する可能性があります。ユーザーは、実行ごとにシーケンスするサンプルの数 (必ずしも 24 個) を変更できます。このチップ用に設計された 96 のインデックスがあります。しかし、読み取り深度のシーケンスは、チップあたりのサンプル数を増やすと減少します。最も一般的な問題の1つは、残留エタノールまたは磁気ビーズによる精製による低品質または品質の低いDNA出力、または前述のビーズの割れ値に起因する可能性のある低いライブラリー濃度です。最適でないDNA出力は、正確なサンプル入力とサーマルサイクラーの温度チェックでマスターミックスを慎重に調製することで補正できるPCRの低効率から生じる場合もあります。CNV∙SD値(図2C)の高いサンプルなど、QC失敗したサンプルをシーケンシングする場合は、サイズ分布解析用のバイオアナライザでサンプルを実行することをお勧めします。
この方法の制限の1つは、他のプラットフォームと比較して、その高い偽単一ヌクレオチド呼び出し率です。誤差率は、他のシーケンサー17による誤検知率のわずか0.1%に比べて1%である。ただし、これは CNV 呼び出しまたは PGT-A 分析の決定要因ではありません。他のプラットフォームと比較して、エマルジョンシステムの適用は、操作上の不一致とピペッティングエラーを最小限に抑え、ライブラリの品質を向上させます。dsDNA濃度が非常に低く、以下のライブラリプールには正確な定量が必要なため、これは他のプラットフォームと比較して当社の方法の重要な利点です。我々の方法は、検出誤差を制御するための標準的な陽性制御を用いて、蛍光計定量の較正を導入した。
短いターンアラウンド時間の高いスループットプラットホームとして、半導体シーケンサーはPGT-Aにとって理想的であり、高度な母性年齢24のようなPGT-A臨床徴候を有するIVF患者に広く適用することができる。Deleyeらは、他のシーケンサー25と半導体シーケンサーの性能を比較するために、ヒト胚盤胞の並列シーケンシングを行った。さらに、このPGT-Aキットは、中国食品医薬品局から「革新的な医療機器に関する特別な承認手続き」を取得し、何千もの胚に臨床的に使用されています。コストの面では、このプラットフォームの価格は、PGT-A市場で一般的に使用される別のプラットフォームと比較して、ギガベースあたりの価格の半分です。対流細胞は、胚26の遺伝的体質を確実に表すことができる。この方法は、Treffらが27を実証したように、単原性/単一遺伝子疾患(PGT-M)に対してPGT用に開発される可能性がある。モデルでは、16個の胚生検のPGT-Mで300MBから1GBのスループットを促進し、その結果を従来の2つのPGT-M法と比較した。16サンプルを捕捉してロードすることにより、その方法は対象領域の少なくとも100倍の読み取り深さに達し、100%の信頼性と再現性27をもたらした。当社のプロトコルによる半導体シーケンサーのスループットは15 GBに達し、96のバーコードが設計されています。したがって、標的PGT-Mに適用された場合、かなりの数の胚生検を高い読み取り深さで1つのチップで配列することができる。
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Disclosures
著者は何も開示していない。
Acknowledgments
この研究は、広西省科学技術財団の主要研究計画である中国国家自然科学財団(Ref No.81860272)である香港の一般研究基金(Ref No.14162417)の支援を受けた。AB16380219)、および中国から中国ポストドクター科学財団助成金(Ref No. 2018M630993)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PCR tubes, 0.2 mL | Axygen | PCR-02D-C | |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | ThermoFisher | 15575020 | |
| PBS, pH 7.4, Ca2+ and Mg2+ free | ThermoFisher | 10010023 | |
| 1.0 M NaOH (1.0N) solution | SIGMA-ALDRICH | S2567 | For Melt-off solution. Molecular grade |
| Eppendorf LoBind Tubes, 1.5 mL | Fisher Scientific | 13-698-791 | |
| Ion Plus Fragment Library Kit | ThermoFisher | 4471252 | |
| ELGA PURELAB Flex 3 Water Purification System or Equivalent 18 MΩ water system |
ThermoFisher | 4474524 | |
| Ion Plus Fragment Library Kit | ThermoFisher | 4471252 | |
| PicoPLEX WGA Amplification buffer | Rubicon Genomics | R30050 | This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03. |
| PicoPLEX WGA Amplification enzyme | Rubicon Genomics | R30050 | This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03. |
| Ion OneTouch Amplification Plate | In kit: Ion OneTouch 2 Supplies (Part No. A26367). Extended kit component in Sheet 5 | ||
| Ion PI Annealing Buffer | |||
| MyOne Beads Capture Solution | |||
| Agilent 2100 Bioanalyzer instrument | Agilent | G2939AA | |
| Ion OneTouch Breaking Solution (black cap) | In kit: Ion PI Hi?Q OT2 Solutions 200 (Part No. A26429). Extended kit component in Sheet 5 | ||
| Dynabeads MyOne Streptavidin C1 | ThermoFisher | 65001 | |
| PicoPLEX WGA Cell extraction buffer | Rubicon Genomics | R30050 | This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-00. |
| PicoPLEX WGA Cell extraction enzyme | Rubicon Genomics | R30050 | This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03. |
| Ion PI Chip Kit v3 | ThermoFisher | A26771 | |
| Ion Chip Minifuge, 230 V | ThermoFisher | 4479673 | |
| Ion PI dATP | ThermoFisher | A26772 | |
| Ion PI dCTP | ThermoFisher | A26772 | |
| Ion PI dGTP | ThermoFisher | A26772 | |
| Ion Plus Fragment Library Kit | ThermoFisher | 4471252 | |
| Ion Plus Fragment Library Kit | ThermoFisher | 4471252 | |
| ThermoQ–Temperature Dry Bath | TAMAR | HB-T2-A | |
| NEBNext dsDNA Fragmentase | New England Biolabs | M0348L | |
| NEBNext dsDNA Fragmentase | New England Biolabs | M0348L | |
| Ion PI dTTP | ThermoFisher | A26772 | |
| Ion OneTouch 2 Instrument | ThermoFisher | INS1005527 | ThermoFisher Catalog number: 4474778. |
| Ion Plus Fragment Library Kit | ThermoFisher | 4471252 | |
| Ion One Touch ES | ThermoFisher | 8441-22 | ThermoFisher Catalog number: 4469495. Extended kit component in Sheet 5 |
| Ethanol | SIGMA-ALDRICH | 51976 | This can be replaced by any brand's molecular grade absolute ethanol. |
| PicoPLEX WGA Extraction enzyme dilution buffer | Rubicon Genomics | R30050 | This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-01. |
| PicoPLEX WGA Extraction enzyme dilution buffer | Rubicon Genomics | R30050 | This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-02. |
| Qubit 3.0 Fluorometer | ThermoFisher | Q33216 | This model has been replaced by Qubit 4 Fluorometer, Catalog number: Q33226. |
| Qubit ds DNA HS Assay kit | ThermoFisher | M2002-02 | |
| Qubit Assay Tubes | ThermoFisher | Q32856 | |
| Ion PI Foaming Solution | ThermoFisher | A26772 | |
| Index for barcoding of libraries | BaseCare | this is a in-house prepared index. Users can buy commercial product from ThermoFisher Ion Xpress Barcode Adapters Kits (Cat. No. 4474517) | |
| Ion PI Loading Buffer | ThermoFisher | A26772 | |
| Solid(TM) Buffer Kit-1X Low TE Buffer | ThermoFisher | 4389764 | |
| Agencour AMPure XP Kit | Beckman Coulter | A63880 | |
| DynaMag-2 magnet (magnetic rack) | ThermoFisher | 12321D | |
| Ion PI Master Mix PCR buffer | |||
| Sorvall Legend Micro 17 Microcentrifuge | Micro 17 | 75002430 | |
| Ion Plus Fragment Library Kit | ThermoFisher | 4471252 | |
| Nuclease-free water | ThermoFisher | AM9922 | This can be replaced by other brand. |
| PicoPLEX WGA Nuclease-free water | Rubicon Genomics | R30050 | This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03. |
| Ion OneTouch Oil bottle | Ion PI Hi?Q OT2 Solutions 200 (Part No. A26429). Extended kit component in Sheet 5 | ||
| Ion Plus Fragment Library Kit | ThermoFisher | 4471252 | Extended kit component in Sheet 3 |
| double-strand DNA standard | This is a in-house prepared DNA standard for calibration of Qubit before quantification of library. | ||
| PicoPLEX WGA Preamplification buffer | Rubicon Genomics | R30050 | This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03. |
| PicoPLEX WGA Preamplification enzyme | Rubicon Genomics | R30050 | This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03. |
| Library Amplification Primer Mix | ThermoFisher | 4471252 | Extended kit component in Sheet 3 |
| Ion OneTouch Reaction Filter | Extended kit component in Sheet 5 | ||
| Recovery Router | Extended kit component in Sheet 5 | ||
| Recovery Tubes | Extended kit component in Sheet 5 | ||
| ISP Resuspension Solution | |||
| Ion Proton | ThermoFisher | DA8600 | This model is imported by Da An Gene Co.,LTD. of Sun Yat-Sen University from ThermoFisher and has been certified by China Food and Drug Administration for clinical application. The catalog number in ThermoFisher is 4476610. |
| Ion PI Hi?Q Sequencing Polymerase | ThermoFisher | A26772 | |
| Ion PI Sequencing Primer | |||
| server for sequencer | Lenovo | T260 | |
| Ion PI Sphere Particles | |||
| Platinum PCR SuperMix High Fidelity | ThermoFisher | 4471252 | |
| Nalgene 25mm Syringe Filters | ThermoFisher | 724-2045 | Pore size: 0.45μm. Specifically for aqueous fluids. |
| Ion PI Hi?Q W2 Solution | ThermoFisher | A26772 | |
| Ion PI 1X W3 Solution | ThermoFisher | A26772 | |
| Ion OneTouch Wash Solution C1 | |||
| The Ion PGM Hi?Q View Sequencing Kit | ThermoFisher | A30044 | Extended kit component in Sheet 2 |
| Ion Plus Fragment Library Kit | ThermoFisher | 4471252 | Extended kit component in Sheet 3 |
| Ion PI Hi-Q Sequencing 200 Kit (1 sequencing run per initialization) | ThermoFisher | A26772 | Extended kit component in Sheet 4 |
| Ion PI Hi?Q OT2 200 Kit | ThermoFisher | A26434 | Extended kit component in Sheet 5 |
References
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