Summary
Этот протокол представляет метод для децеллюляризации и последующего гидрогеля формирования murine молочных жировых прокладок после облучения ex vivo.
Abstract
Радиация – это терапия для пациентов с тройным отрицательным раком молочной железы. Влияние излучения на внеклеточную матрицу (ЭКМ) здоровой ткани молочной железы и ее роль в локальном рецидиве на первичном участке опухоли неизвестны. Здесь мы представляем метод децеллюляризации, лиофилизации и изготовления гидрогелей ECM, полученных из murine mammary жировых прокладок. Представлены результаты по эффективности процесса децеллюляризации, оценены реологические параметры. GFP- и люциферазы помечены раковых клеток молочной железы инкапсулированных в гидрогелях продемонстрировали увеличение пролиферации в облученных гидрогелей. Наконец, фаллоидный конъюгированный окрашивание было использовано для визуализации цитоскелетной организации инкапсулированных опухолевых клеток. Наша цель состоит в том, чтобы представить метод для изготовления гидрогелей для исследования in vitro, которые имитируют среду ткани молочной железы in vivo и ее реакцию на радиацию для изучения поведения опухолевых клеток.
Introduction
Рак характеризуется избыточным пролиферацией клеток, которые могут избежать апоптоза, а также метастазировать в отдаленные места1. Рак молочной железы является одной из наиболее распространенных форм среди женщин в США, по оценкам, 266000 новых случаев и 40000 смертей в 2018году 2. Особенно агрессивным и трудным для лечения подтипа является тройной отрицательный рак молочной железы (TNBC), который не хватает рецепторов эстрогена (ER), рецептор прогестерона (PR), и человека эпидермального фактора роста (HER2). Лучевая терапия обычно используется при раке молочной железы для устранения остаточных опухолевых клеток после lumpectomy, но более 13% пациентов TNBC по-прежнему испытывают рецидив на первичном сайте опухоли3.
Известно, что лучевая терапия эффективна в смягчении метастазирования и рецидивов, поскольку сочетание лампэктомии и радиации приводит к такому же долгосрочному выживанию, как мастэктомия4. Тем не менее, недавно было показано, что лучевая терапия связана с местным рецидивом первичного участка опухоли в условиях иммунокомпромисса5,6. Также хорошо известно, что излучение изменяет внеклеточную матрицу (ЭКМ) нормальной ткани, вызывая фиброз7. Поэтому важно понимать роль вызванных радиацией изменений ЭКМ в диктовке поведения опухолевых клеток.
Децеллюляризованные ткани были использованы вкачестве моделей in vitro для изучения болезни 8,9. Эти децеллюлярные ткани сохраняют состав ECM и резюмируют комплекс in vivo ECM. Эта децеллюляризованная ткань ECM может быть дополнительно обработана и переварена, чтобы сформировать восстановленные гидрогели ECM, которые могут быть использованы для изучения роста клеток и функции10,11. Например, инъекционные гидрогели, полученные из децеллюлярного липоаспиратии человека и из ткани миокарда, служили неинвазивными методами тканевой инженерии, а гидрогель, полученный из ткани свиного легкого, использовался в качестве метода тестирования in vitro мезенхимальных стволовых клеток вложения и жизнеспособности12,13,14. Влияние нормального повреждения тканей радиации на свойства ECM, однако, не было исследовано.
Гидрогели, полученные из ECM, обладают наибольшим потенциалом для изучения in vitro явлений in vivo. Было изучено несколько других материалов, в том числе коллаген, фибрин и матригель, но трудно синтетически резюмировать состав ECM13. Преимущество использования Гидрогелей, полученных из ECM, заключается в том, что ECM содержит необходимые белки и факторы роста для конкретной ткани14,15. Облучение нормальной ткани во время lumpectomy вызывает значительные изменения в ECM, и ECM полученных гидрогелей могут быть использованы для изучения этого эффекта в пробирке. Этот метод может привести к более сложным и более точным в пробирке модели болезни.
В этом исследовании, мы подвергли murine молочных жировых прокладок (MFPs) радиации ex vivo. MFPs были decellularized и сделаны в раствор pre-геля. Гидрогели были сформированы со встроенными 4T1 клетки, линии murine TNBC ячейки. Были изучены реологические свойства гидрогеля, а также оценена динамика опухолевых клеток в гидрогелях. Гидрогели, изготовленные из облученных MFPs, усиливали пролиферацию опухолевых клеток. Будущие исследования будут включать другие типы клеток для изучения клеточных взаимодействий в контексте рецидива рака после терапии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Исследования на животных проводились в соответствии с институциональными руководящими принципами и протоколами, утвержденными Комитетом по институциональному уходу и использованию животных Университета Вандербильта.
1. Подготовка и ex vivo облучение MFPs
- Пожертвование агимических ну/ну мышей (8-10 недель) с использованием CO2 удушья с последующим вывихом шейки матки.
- Очистите кожу с помощью 70% этанола.
- Сбор молочных жировых прокладок (MFPs) из жертвенных мышей с помощью предварительно стерилизованных ножниц и щипцы в 15 мл конической трубки, содержащей полный RPMI сми (RPMI дополнен 1% пенициллин-стрептомицин и 10% плода крупного рогатого скота сыворотки) (см. таблицу материалов ).
- Облучать образцы до 20 Ги с помощью источника цезия.
- Принесите облученных MFPs и полный RPMI средств массовой информации в кабинет ею биобезопасности. Средства массовой информации будут зависеть от клеточной линии, которая будет выращена в конечном гидрогеле. Заполните 6 см или 10 см блюд с достаточным количеством носителей для погружения MFPs. Для 6 см блюдите 8 мл медийных средств, а для 10 см блюдите 20 мл носителей.
- Инкубировать в инкубаторе CO2 в течение двух дней. Продолжительность пребывания в инкубаторе может быть скорректирована.
- Промыть ткани в фосфат-буферизированных солей (PBS), пятно избыток влаги, и место MFPs в 15 мл конических труб для хранения при -80 градусов по Цельсию до децеллюляризации. Этот шаг замораживания помогает этапу децеллюляризации, и образец должен быть заморожен, даже если следующие шаги в противном случае готовы.
2. Децеллюляризация (адаптирована из ссылок12,16,17)
ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура была адаптирована из ранее опубликованных методов, ориентированных на жировой децеллюляризации, которая включала натрия дезоксихолат ионного моющего средства, а не сульфат натрия додецикл для удаления ДНК эффективно12,16 , 17.
- На 1день, удалить замороженные MFPs от -80 градусов по Цельсию и оттепели при комнатной температуре.
- После того, как оттаяли, сухие MFPs кратко на деликатной задачей протрите. Взвешивание MFPs с использованием аналитической шкалы.
- Используя пару щипцы с ножницами или скальпелем, разделите ткань на 3 мм х 3 мм х 3 мм образцы для изучения нетронутых ECM и оставшейся ткани для производства гидрогеля.
ПРИМЕЧАНИЕ: Количество образцов зависит от количества методов тестирования, например, приведена ниже коллекция двух образцов: один для встраивания парафина (шаг 2.5) и один для замораживания криостатной встраивающей среды, при желании (см. таблицу материалов и шаг 2.6). - Взвесьте ткани. При встраивании в парафин для секции, продолжайте шаг 2.5. При замораживании криостата встраивания среды для секции, продолжайте шаг 2.6.
- В химическом капюшоне, погрузить ткани в 10% нейтральный буферный формалин (NBF) (см. Таблица материалов) для 24 ч при 4 C. Вымойте 3 раза в PBS в течение 5 минут каждый. Погрузите ткань в 30% сахарозу в 48 ч при 4 градусах Цельсия.
- Взвесьте ткани теперь, когда этот кусок был удален. Продолжайте шаг 2.6.
- В химическом капюшоне поместите кусочки MFP в маркированную кассету, приготовленную криостатом встраивающей среду. Добавить больше криостата встраивания среды для покрытия ткани.
- Поместите кассету в стакан с 2-метилбутаном (см. таблицуматериалов), который предварительно охлаждается жидким азотом. Стакан должен иметь достаточно 2-метилбутан, чтобы покрыть дно, но не достаточно, чтобы погрузить кассету, потому что криостат встраивая среду не должны касаться 2-метилбутан. Пусть кассета сидеть в 2-метилбутана до криостата встраивания среды замерзает и становится непрозрачным.
- Оберните кассету (ы) в фольгу, этикетку, и оставить на -80 градусов по Цельсию до тех пор, пока используется для секции.
ПРИМЕЧАНИЕ: Ткани, помещенные сразу в криостат встраивающую среду, были разделены на 5 мкм, в то время как ткани, инкубированные в сахарозе, были разделены на 30 мкм, чтобы сохранить морфологию адипоцитов.
- Используйте щипки для ручного массажа оставшейся ткани.
ПРИМЕЧАНИЕ: Ткань штук также могут быть помещены в 10% NBF для 24-48 ч, промыть в PBS, и оставили в 70% этанола до встраивания в парафин. После встраивания, 5 мкм разделы могут быть использованы для гематоксилина и эозина (H и E) окрашивания (см. раздел 7 ниже). - Поместите MFPs в 6 см блюд с 5 мл 0,02% трипсин / 0,05% EDTA раствор. Инкубировать при 37 градусах по Цельсию на 1 ч. Спрей и протрите посуду 70% этанола перед помещением в инкубатор.
- Используйте 0,7 мм ситечки для мытья MFPs с деионированной (DI) воды, обливая водой ткани в три раза. Используйте щипцы для ручного массажа ткани между смыками.
- Кратко высушить ткань на деликатной задаче протрите и взвесить. Поместите ткани в предварительно автоклавированный стакан, содержащий соответствующий размер перемешать бар. Обложка тканей с 60 мл 3% т-octylphenoxypolyethoxyethanol (см. Таблица материалов) на 1 г ткани и перемешать в течение 1 ч при комнатной температуре. Используйте минимум 20 мл.
- Сбросьте ткани и содержимое в ситечко. Промыть стакан с помощью воды DI и налить на ткани. Повторите еще два раза. Используйте щипцы для ручного массажа ткани между полосками.
- Кратко высушить ткань на деликатной задаче протрите и взвесить. Поместите ткани и перемешать баров обратно в те же клюв, и накрыть 60 мл 4% дезоксихолевой кислоты на 1 г ткани. Перемешать в течение 1 ч при комнатной температуре. Используйте минимум 20 мл.
- Сбросьте ткани и содержимое в сетч-ситечко. Промыть стакан с помощью воды DI и налить на ткани. Повторите еще два раза. Используйте щипцы для ручного массажа ткани между полосками.
- Кратко высушить ткань на деликатной задаче протрите и взвесить.
- Поместите ткани в тот же стакан со свежей водой DI, дополненной 1% пенициллина-стрептомицина. Обложка плотно с парафина пленки. Оставьте на ночь при 4 градусах Цельсия.
- Вымойте ситечко и клюв для использования на следующий день.
- На 2-й деньслейте содержимое стакана в ситечко. Кратко высушить ткань на деликатной задаче протрите и взвесить.
- Поместите MFPs в том же стакане с соответствующим размером перемешать бар. Накрыть 60 мл 4% этанола/0,1% раствора перацетической кислоты на 1 г ткани. Используйте минимум 20 мл. Перемешать в течение 2 ч при комнатной температуре.
- Сбросьте ткань и содержимое в 0,7 мм ситечко. Используйте щипки для ручного массажа ткани. Поместите содержимое обратно в стакан. Вымойте ткань, покрыв ее 60 мл 1x PBS на 1 г ткани. Используйте минимум 20 мл. Перемешать в течение 15 минут при комнатной температуре. Повторите один раз.
- Сбросьте ткань и содержимое в 0,7 мм ситечко. Используйте щипки для ручного массажа ткани. Поместите содержимое обратно в стакан. Вымойте ткань, покрыв ее 60 мл DI воды на 1 г ткани. Используйте минимум 20 мл. Перемешать в течение 15 минут при комнатной температуре. Повторите один раз.
- Кратко высушить ткань на деликатной задаче протрите и взвесить. Сбросьте ткани и содержимое в ситечко. Используйте щипки для ручного массажа ткани.
- Поместите содержимое обратно в стакан. Закройте ткани 60 мл 100% n-пропанола на 1 г ткани. Используйте минимум 20 мл. Перемешать в течение 1 ч при комнатной температуре.
- Кратко высушить ткань на деликатной задаче протрите и взвесить. Сбросьте ткань и содержимое в 0,7 мм ситечко. Используйте щипки для ручного массажа ткани.
- Поместите содержимое обратно в стакан. Вымойте ткань, покрыв ее 60 мл воды DI на 1 г ткани. Используйте минимум 20 мл. Перемешать в течение 15 минут при комнатной температуре. Повторите три раза.
- Сбросьте ткани и содержимое в ситечко. Повторите шаги 2.3-2.6 для сбора кусочков ткани для инкубации сахарозы и замораживания в криостатвной среде встраивания.
- Кратко высушить ткань на деликатной задаче протрите и взвесить. Поместите в прописную трубку 15 мл. Заморозить при -80 градусов на ночь.
3. Лиофилизация
- Снимите трубки 15 мл с -80 градусов по Цельсию и поместите на сухой лед. Держите образцы замороженными на сухом льду до тех пор, пока на лиофилизатор.
- Снимите колпачки. Используйте резинку, чтобы прикрепить деликатную задачу протрите к верхней части, чтобы покрыть отверстие. Положите образцы на лиофилизатор, по крайней мере 2 дней.
- Удалите образцы из лиофилизатора и поместите трубки на сухой лед. Удалите деликатные салфетки задачи весят каждый образец на аналитической шкале. Прикрепите колпачки и поместите на -80 градусов на ночь.
4. Мельница
- Заполните неглубокий контейнер жидким азотом. Удалите образцы из морозильной камеры -80 градусов. Взвесьте каждый лиофилизированный MFP.
- Поместите один образец в ступку. Используйте криогенную перчатку, чтобы держать раствор в жидком азоте.
- Используйте пестик, прикрепленный к ручной дрели, чтобы сделать образец. Мельница в 1 мин интервалы, чтобы проверить прогресс и удалить перчатку руку из жидкого азота. Мельница не менее 5 мин.
- Повторите для всех образцов. Спрей и протрите раствор и пестик с этанолом между каждым образцом.
- Храните порошкообразные образцы в 15 мл труб октядрий при -80 градусах Цельсия до готовности к использованию.
ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы могут быть использованы немедленно или храниться на ночь.
5. Формирование гидрогеля
- При хранении при температуре -80 градусов на ночь, снимите и оттаивните при комнатной температуре. При оттаивании, рассчитать необходимый вес пепсина (см. Таблица материалов) и объем соляной кислоты (HCl), необходимых для каждого образца, что приводит к решению с 1% w/v образец порошка и 0,1% w/v пепсина в 0.01 M HCl. Добавить пепсин в HCl форме пепсин-HCl раствор.
- Добавьте образец порошка и пепсина-HCl раствора в трубку 15 мл. Добавить небольшой бар перемешать, и перемешать в течение 48 ч.
- Поместите трубки на лед в течение 5 мин. Рассчитайте необходимый объем 10x PBS, необходимый для каждого образца, что приводит к раствору с концентрацией 1x PBS. Добавьте соответствующий объем 10x PBS к каждой трубке.
- Добавьте 10% v/v 0.1 M NaOH к каждому решению для достижения pH 7.4. Используйте бумагу pH для проверки индивидуально.
ПРИМЕЧАНИЕ: Гель раствор может храниться при 4 градусах По Цельсию в течение одной недели.
6. Инкапсуляция клеток в гидрогелях
- Использование gFP- и люциферазы помечены клетки
- Используя раствор геля pH 7.4, resuspend pelleted GFP- и luciferase-маркированные 4T1 клетки к концентрации 500,000 или 1,000,000 клеток/мл раствора геля. Добавьте 16 зл гель-клеточного раствора к каждому колодцу 16-колодца камерного слайда. Инкубировать в течение 30 мин при 37 градусах Цельсия.
- Добавьте 100 зл и полного носителя RPMI к каждому колодцу. Продолжить инкубацию в течение 48 ч при 37 градусах Цельсия. Клетки с маркировкой GFP и люциферазы могут быть визуализированы с помощью флуоресценции в 0 часов, 24 часа и 48 часов после гелирования.
ПРИМЕЧАНИЕ: Пролиферация клеток может быть измерена для GFP- и luciferase-маркированных 4T1 клеток, используемых здесь путем добавления (S)-4,5-Dihydro-2-(6-гидрокси-2-бензотиазолил)-4-thiazolecarboxylic кислоты калийной соли (см. Таблица материалов) в колодцы в течение 10 мин и выполнение биолюминесценционной визуализации с использованием биолюминесценционной системы визуализации (см. Таблицаматериалов). После биолюминесценции цитоскелет может быть визуализирован (см. раздел 10).
- Использование немаркированных ячеек
- Используя раствор геля pH 7.4, resuspend pelleted немаркированные 4T1 клетки к концентрации 500,000 или 1,000,000 клеток/мл раствора геля. Добавьте 16 зл гель-клеточного раствора к каждому колодцу 16-колодца камерной горки и 96-колодской пластине. Инкубировать в течение 30 мин при 37 градусах Цельсия.
- Добавьте 100 л носителей к каждому колодцу. Продолжить инкубацию в течение 48 ч при 37 градусах Цельсия.
ПРИМЕЧАНИЕ: жизнеспособность клеток может быть измерена (см. раздел 11). 16-колодец камеры слайд может быть использован для визуализации, и 96-коловидной пластины могут быть использованы для количественной оценки.
7. H и E окрашивания
- Для формилина фиксированной, парафина встроенных тканей, погружения слайды, содержащие 5 мкм разделов дважды в 100% ксилена (5-10 мин) для де-парафинизации. Регидратировать путем погружения в 100%, 95%, 85%, и 70% этанола в течение 5 мин каждый следуют DI воды в течение 5 мин. Продолжайте шаг 7,6.
- Для замороженных секций ткани, возьмите разделы сразу из морозильной камеры и погрузите их в 10% NBF в течение 10 мин. Вымойте в 1x PBS три раза в течение 5 мин каждый. Промыть в воде в течение 5 мин.
- Пятно ядер с гематаклином в течение 3 мин. Промыть в проточной водопроводной воде.
- Дифференцировать путем погружения 1-2 раза в 0,3% кислотного алкоголя (0,3% HCl в 70% этанола). Промыть в проточной водопроводной воде в течение 5 мин.
- Добавить bluing агент для 30 s. Промыть в проточной водопроводной воды в течение 5 мин. Погрузить в 95% этанола в течение 30 с.
- Инкубировать эозином на 90 с при комнатной температуре. Обезвоживание в 3 изменениях 100% этанола по 5 мин каждый.
- Погрузите дважды в 100% ксилена в течение 5 мин каждый. Добавьте дистирол-пластик-ксилен (DPX0 монтажа носителя на слайд и добавить coverslip. Пусть это вылечить на ночь до изображения.
8. 1-(4-(Xylylazo)xylyl-azo)-2-нафтальное окрашивание
- Приготовьте раствор 1-(4-(Xylylazo)xylyl-azo-2-нафталь.
- Добавьте в стакан с 100 мл пропилена гликоля 0,5 г 1-(4-(Xylylazo)xylyl-azo-2-нафтальпол порошок. Нагрейте до 95-100 градусов по Цельсию, помешивая не менее 30 мин. Предотвратить температуру от превышения 100 градусов по Цельсию.
- Снимите стакан с огня и дайте немного остыть. Налейте раствор через качественную фильтровальную бумагу 4-го класса, чтобы удалить все остаточные частицы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор может храниться при комнатной температуре и должен быть отфильтрован через фильтр шприца 0,45 мкм непосредственно перед окрашиванием.
- Пятно замороженных тканей разделов.
- Удалите слайды из морозильной камеры -80 градусов и высушите воздух в течение 30 мин. Предварительно охладить 10% NBF при -20 градусов по Цельсию в течение 30 минут в банке Коплина. Исправьте горки при комнатной температуре в течение 10 мин. Вымойте в воде DI 3 раза в течение 5 минут каждый.
- Удалите избыток воды, используя деликатную задачу протрите перед погружением в пропиленгликоль 2 раза в течение 5 минут каждый. Удалите слайды из пропилена гликоль. Не смягчить.
- Поместите слайды в шприц фильтрованного масла Red O окрашивающий раствор для 3 ч при комнатной температуре.
- Дифференцируйте, размещая слайды в 85% пропилена гликоль в течение 5 мин. Промыть образцы в PBS дважды в течение 5 минут каждый.
- Образцы пятен с гематоксилин на 30 с. Вымойте в проточной водопроводной воде в течение 5 мин, а затем поместите горки в воду DI.
- Маунт образцы с использованием водного на основе монтажа среды и позволяют средствам массовой информации высохнуть на ночь перед изображением.
9. Реология
- Принесите предгелевые растворы от шага 5.4 до реометра на льду.
- Прикрепите 25-мм руку и пластину к реометру. Откройте программное обеспечение для реологии на компьютере, подключенном к реометру.
- Выполните вращательное отображение и определите нулевой разрыв. Поднимите руку, когда полный.
- Пипетка 500 л предварительного геля на тарелке. Опустите руку до тех пор, пока раствор предварительного геля полностью не занимает зазор между пластиной и рукой. Будьте консервативны, потому что опуская руку мимо этой точки приведет к предварительного гель решение разлива из стороны.
- Выполните частотный развертки на предварительно гель раствор от 0,1 до 100 Гц после того, как он остался на 37 градусов по Цельсию в течение 30 минут.
- Поднимите руку реометра, когда это будет завершено. Протрите жидкость с деликатной задачей протрите. Промыть с DI воды и протрите с деликатной задачей протрите. Повторите шаги 9.4-9.6 с дополнительными образцами.
10. Фаллоидин конъюгированное окрашивание F-актина
- Принесите фаллоидный конъюгировать раствор до комнатной температуры. Кратко центрифуги на низкой скорости до открытия. Aliquot достаточное решение для ассоциации, а остальное хранить при -20 градусах Цельсия.
- Разбавить 1000x фаллоидин конъюгированного стокового раствора к 1x рабочему раствору, добавив 1 раствор запаса qL до 1 мл 1x PBS и 1% бычьего сывороточных альбумина (BSA). Это делает достаточно для 10 скважин (100 л/колой).
ПРИМЕЧАНИЕ: Можно использовать простой 1x PBS, но 1x PBS и BSA предпочтительнее, чтобы предотвратить фаллоидный конъюгировать от прилипания к трубе. Не храните это решение после ассоциат. 1 к Л синего флуоресцентного красителя (см. таблицуматериалов) рабочий раствор может быть добавлен к пятнам для ядер. Рабочий раствор можно сделать путем смешивания 1 л из 20 мм синего флуоресцентного красителя с 11,3 л 1х1x PBS. - Аспирные носители из скважин (шаг 6.1). Промыть скважины с 1x PBS.
- Добавить 10% NBF. Инкубировать скважины с 10% NBF в течение 20 минут при комнатной температуре. Удалить супернатант. Вымойте 3 раза с PBS в течение 5 минут каждый раз.
- Добавить 0,1% т- Octylphenoxypolyethoxyethanol в PBS в течение 5 мин. Аспир и промыть 3 раза с PBS в течение 5 минут каждый раз.
- Добавьте 100 л рабочего раствора от шага 10.2 к каждому колодцу. Инкубировать 1 ч при комнатной температуре. Аспир и мыть 3 раза с PBS в течение 5 минут каждый раз. Оставьте в PBS при 4 градусах По Цельсия.
- Аспирируйте и убирайте колодцы из прокладки на камерной горке. Используйте игольчатый нос пинцет, чтобы удалить прокладку со слайда. Маунт и coverslip образцы с использованием aqueous основе монтажа среды. Разрешить вылечить (5 мин).
- Наблюдайте клетки под флуоресцентным микроскопом при возбуждении/выбросе 590/618 нм.
11. Перетаскание жизнеспособности
- Промыть клетки с PBS Dulbecco (DPBS). Добавьте 100 кЛ DPBS, содержащий 1 мкм кальций AM и 2 мкм этидия омидимера к каждой скважине. Инкубировать в течение 30 минут при комнатной температуре.
- Изображение 16-колодец камеры слайд флуоресценции микроскопии. Кальцин ацетоксиметил (calcein AM) можно наблюдать при возбуждении/выбросах 494/517 нм. Эхидий гомодимер можно наблюдать при возбуждении/выбросах 528/645 нм.
- Прочитайте 96-ну хорошую пластину на считывателе пластин, используя те же длины волн в шаге 11.2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
MFPs были decellularized после облучения с помощью процедуры, показанной на рисунке 1A. MFPs pre-decellularization (Рисунок 1B) и post-decellularization (рисунок 1C) показаны. Децеллюляризация была подтверждена с использованием гематоксилина и эозина (H и E) окрашивания, и 1-(No 4-(Xylylazo)xylyl'azo)-2-нафтоль окрашивания был использован для оценки содержания липидов (Рисунок 2). Реологические свойства гидрогелей ECM также оценивались на уровне 37 градусов по Цельсию(рисунок3). Модули хранения были выше, чем способ потери для всех условий, демонстрируя стабильное образование гидрогеля.
GFP- и люциферазы помечены 4T1 клетки карциномы молочной железы были инкапсулированы в гидрогелях. Пролиферация клеток была исследована флуоресценционной микроскопией, измерениями биолюминесценции и жизнеспособностью окрашивания 48 ч после инкапсуляции(рисунок 4). Облученные гидрогели показали растущую тенденцию к пролиферации опухолевых клеток. Фаллоидин конъюгировать был использован для визуализации F-актина в инкапсулированных клетках(Рисунок 5). Этот метод может быть использован для изучения морфологии клеток и цитоскелетных свойств.
Рисунок 1: Экспериментальный рабочий процесс. (A) Схема образования гидрогеля. Цифровые изображения камеры были приняты MFPs до (B) и пост-децеллюляризации (C ). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Подтверждение децеллюляризации и делипидации в MFPs. Гематоксилин и эозин окрашивания (H и E) неиррадиациированных MFPs встроенных в парафина и разделены на 5 мкм (A) был по сравнению с MFPs замороженных в криостат встраивания среды (5 мкм разделов) до (B) и после деклеточной (C), инкубированные с сахарозой до замораживания в криостат встраивания среды и разделены на 30 мкм (D). 1-(No 4-(Xylylazo)xylyl'azo)-2-нафталь окрашиваемость была сделана, чтобы визуализировать удержание липидов в MFPs замороженных в криостат встраивания среды (5 мкм разделы) до (E) и после децеллюляризации (F) и инкубируется с сахарозой до замораживания в криостат встраивания средних и секционированныхна 30 мкм разделов (G ). Шкала баров представляют 50 мкм. Децеллизация децеллюляризации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Подтверждение образования гидрогеля. Реология была использована для определения хранения ипотери модуля управления (A ) и облученных (B) предгель решение из MFPs при 37 градусов по Цельсию и 0,5% штамма. Ошибки бары показывают стандартное отклонение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Пролиферация опухолевых клеток в облученных гидрогелях ECM. 4T1 пролиферации клеток 48 ч после прививки показано с предварительного геля, полученных из контроля (A) и облученных (B) MFPs. (C) Биолюминесценция сигнал из 4T1 клеток, встроенных в контроль и облученных гидрогелей. Calcein AM окрашенных живых клеток и этидия омодимер окрашенных мертвых клеток были оценены в контроле (D) и облученных (E) гидрогели, и жить / мертвый соотношение было количественно (F). Шкала баров представляют 200 мкм. Ошибки баров показывают стандартную ошибку. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5: Цитоскелетные свойства гидрогелей ECM. Клетки внутри (A) контроль и (B) облученные гидрогели ECM окрашены фаллоидина конъюгированных визуализировать F-актин (красный) и синий флуоресцентный краситель для визуализации ядер (синий) в облученных MFPs. Шкала бар представляет 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
| Вес ткани (g) | Управления (0 Gy) |
Облученных (20 Gy) |
| Первоначальный вес MFP | 0,461 | 0,457 |
| Вес MFP после удаления гистологии образца | 0,423 | 0,416 |
| Вес MFP после децеллюляризации | 0,025 | 0,025 |
| Децеллюлярный вес MFP после удаления гистологии образца | 0,015 | 0,016 |
Таблица 1: Вес ткани до и после децеллюляризации. Репрезентативные весы тканей для каждого состояния измерялись до и после децеллюляризации MFP.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот метод гидрогеля во многом зависит от количества стартовой ткани. M'urine MFPs малы, и процесс децеллюляризации приводит к значительному сокращению материала(Таблица 1). Процесс может быть повторен с более MFPs увеличить конечную доходность. Мельница является еще одним важным шагом, который может привести к потере материала. Другие показали успех с криогенной мельницы, но этот протокол основан на фрезерования через портативный раствор и электрическую дрель с пестиком вложения8,17. Преимущество этого имеет более низкие капитальные затраты и минимизацию материальных потерь, но может привести к изменчивости конечного продукта.
Задача для подтверждения децеллюляризации и делипидации в замораживании жировой ткани в криостат встраивания среды. На рисунке 2A показаны H и E окрашивание неизлученного MFP, встроенного и разделенного в парафине. Различные ядра видны по краям жировые клетки вблизи соединений с другими клетками, а морфология адипоцитов в хорошем состоянии. Рисунок 2B ,C,E,F показать MFPs подготовлены путем встраивания и замораживания MFPs в криостат встраивания средних и секции 5 мкм ломтиками. Этот процесс был не в состоянии сохранить адипоцита морфологии и формы. Тем не менее, децеллюляризация была подтверждена через потерю ядер и других следов ДНК(Рисунок 2C), и делипидация была визуализирована с потерей нейтрального липидового содержания окрашивания (рисунок2F). Морфология адипоцитов поддерживалась путем инкубации MFPs в сахарозе, встраивании и замораживании в криостатвной среде встраивания, и секционирование 30 мкм ломтиками (Рисунок 2D, G). В то время как визуализация H и E окрашивания было трудно с этим методом(Рисунок 2D), 1 -(4-(Xylylazo)xylyl'azo)-2-нафталь окрашивая подтвердил сохранение морфологии адипоцитов (Рисунок2G).
Мы разработали модель гидрогеля in vitro, которая может имитировать микросреду in vivo нормальной ткани и ее реакцию на радиационное повреждение. Гидрогели ECM были изготовлены в аналогичных исследованиях, но влияние радиационного поврежденияна поведение опухолевых клеток не было оценено 9,12,16,17,18. Мы ожидаем, что облучение MFPs изменит ECM ремоделирования и состав, и эти композиционные изменения будут характерны в будущих исследованиях. Мы наблюдали растущую тенденцию в пролиферации 4T1 клеток в облученных гидрогелях ECM, используя как биолюминесценцию изображения и жизнеспособность окрашивания (Рисунок 4). Кроме того, мы использовали фаллоидный конъюгировать для окрашивания F-актина нити в инкапсулированных опухолевых клеток и обнаружили качественное увеличение в атин выравнивания и удлинения опухолевых клеток в облученных гидрогелях ECM, что свидетельствует об увеличении силы адгезии и инвазивной емкости(рисунок 5)19,20. Будущие эксперименты будут изучать изменения в динамике координационной адгезии и протеазе-опосредовано ремоделирования для оценки миграции клеток и вторжения.
Этот метод был разработан с использованием линии клеток Murine TNBC, но этот метод может быть использован в качестве платформы для оценки пролиферации и инвазивности других типов клеток. Будущие исследования могут включать иммунные клетки для определения их роли в ответ на радиацию, а также другие формы повреждения тканей (например, хирургическое вмешательство). Хотя это исследование оценило гидрогели ECM от MFPs облученных ex vivo, дополнительные исследования будут изучать виво излучение MFPs для оценки влияния физиологической радиационной реакции и проникновения иммунных клеток на характеристики ECM. Мы создали метод изготовления гидрогелей ECM из мыши MFPs для изучения влияния нормального излучения тканей на поведение опухолевых клеток, и этот метод может быть распространен на ткани человека для более релевантной модели гидрогеля. В целом, изучение нормального повреждения тканей с помощью гидрогелей ECM может привести к пониманию роли изменений ECM после лучевой терапии в локальном рецидиве.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы благодарят д-р Лаура Л. Бронсарт для предоставления GFP- и luciferase-4T1 клетки, д-р Эдвард Л. Лагори за советом по 1 -(No 4-(Xylylazo)xylyl'azo)-2-нафталь окрашивания, д-р Крейг Л. Дюваль для IVIS и лиофилизатор использования, и д-р Скотт Гюль Использовать. Это исследование было финансово поддержано грантом NIH #R00CA201304.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Neutral Buffered Formalin, Cube with Spigot | VWR | 16004-128 | - |
| 2-methylbutane | Alfa Aesar | 19387 | - |
| AR 2000ex Rheometer | TA Instruments | 10D4335 | rheometer |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A1933-25G | - |
| calcein acetoxymethyl (calcein AM) | Molecular Probes, Inc. | C1430 | - |
| D-Luciferin Firefly, potassium salt | Biosynth Chemistry & Biology | L-8820 | (S)-4,5-Dihydro-2-(6-hydroxy-2-benzothiazolyl)-4-thiazolecarboxylic acid potassium salt |
| DPX Mountant for Histology | Sigma-Aldrich | 06522-500ML | - |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline | Gibco | 14040133 | - |
| Eosin-Y with Phloxine | Richard-Allan Scientific | 71304 | eosin |
| ethidium homodimer | Molecular Probes, Inc. | E1169 | ethidium homodimer-1 (EthD-1) |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F0926-500ML | - |
| Fisher Healthcare Tissue-Plus O.C.T. Compound | Fisher Scientific | 23-730-571 | cryostat embedding medium |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | aqueous based mounting medium |
| FreeZone 4.5 | Labconco | 7751020 | lyophilizer |
| Hoechst 33342 Solution (20 mM) | Thermo Scientific | 62249 | blue fluorescent dye |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148-500ML | - |
| IVIS Lumina III | PerkinElmer | CLS136334 | bioluminescence imaging system |
| Kimtech Science Kimwipes | Kimberly Clark | delicate task wipes | |
| n-Propanol (Peroxide-Free/Sequencing), Fisher BioReagents | Fisher Scientific | BP1130-500 | - |
| Oil Red O | Sigma-Aldrich | O0625-25G | 1-([4-(Xylylazo)xylyl]azo)-2-naphthol |
| OPS Diagnostics CryoGrinder | OPS Diagnostics, LLC | CG-08-02 | - |
| PBS (10X), pH 7.4 | Quality Biological, Inc. | 119-069-151 | Phosphate-buffered saline |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | - |
| Pepsin from porcine gastric mucosa | Sigma-Aldrich | P6887-5G | pepsin |
| Peracetic acid | Sigma-Aldrich | 77240-100ML | - |
| Phalloidin-iFluor 594 Reagent (ab176757) | abcam | ab176757 | phalloidin conjugate |
| Propylene glycol | Sigma-Aldrich | W294004-1KG-K | - |
| Richard-Allan Scientific Signature Series Bluing Reagent | Richard-Allan Scientific | 7301L | bluing agent |
| Richard-Allan Scientific Signature Series Hematoxylin 7211 | Richard-Allan Scientific | 7211 | - |
| RPMI Medium 1640 | Gibco | 11875-093 | - |
| Sodium deoxycholate, 98% | Frontier Scientific | JK559522 | deoxycholic acid |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S5016 | - |
| Triton x-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | t-Octylphenoxypolyethoxyethanol |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200-056 | - |
| Whatman qualitative filter paper, Grade 4 | Whatman | 1004-110 | grade 4 qualitative filter paper |
| Xylenes (Certified ACS), Fisher Chemical | Fisher Scientific | X5-4 | - |
References
- Hanahan, D., Weinberg, R. A.
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A.
- Lowery, A. J., Kell, M. R., Glynn, R. W., Kerin, M. J., Sweeney, K. J. Locoregional recurrence after breast cancer surgery: a systematic review by receptor phenotype. Breast Cancer Research and Treatment. 133 (3), 831-841 (2012).
- Miller, K. D., et al. Cancer treatment and survivorship statistics, 2016. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 66 (4), 271-289 (2016).
- Vilalta, M., Rafat, M., Giaccia, A. J., Graves, E. E. Recruitment of Circulating Breast Cancer Cells Is Stimulated by Radiotherapy. Cell Reports. 8 (2), 402-409 (2014).
- Rafat, M., Aguilera, T. A., Vilalta, M., Bronsart, L. L., Soto, L. A., von Eyben, R., Golla, M. A., Ahrari, Y., Melemenidis, S., Afghahi, A., Jenkins, M. J., Kurian, A. W., Horst, K. C., Giaccia, A. J., Graves, E. E. Macrophages Promote Circulating Tumor Cell-Mediated Local Recurrence Following Radiation Therapy in Immunosuppressed Patients. Cancer Res. 75 (15), 4241-4252 (2018).
- Haubner, F., Ohmann, E., Pohl, F., Strutz, J., Gassner, H. G. Wound healing after radiation therapy: Review of the literature. Radiation Oncology. 7 (1), 1-9 (2012).
- Beachley, V. Z., et al. Tissue matrix arrays for high throughput screening and systems analysis of cell function. Nature Methods. 12 (12), 1197-1204 (2015).
- Tian, X., et al. Organ-specific metastases obtained by culturing colorectal cancer cells on tissue-specific decellularized scaffolds. Nature Biomedical Engineering. 2 (6), 443-452 (2018).
- Saldin, L. T., Cramer, M. C., Velankar, S. S., White, L. J., Badylak, S. F. Extracellular matrix hydrogels from decellularized tissues: Structure and function. Acta Biomaterialia. 49, 1-15 (2017).
- Hinderer, S., Layland, S. L., Schenke-Layland, K. ECM and ECM-like materials — Biomaterials for applications in regenerative medicine and cancer therapy. Advanced Drug Delivery Reviews. 97, 260-269 (2016).
- Young, D. A., Ibrahim, D. O., Hu, D., Christman, K. L. Injectable hydrogel scaffold from decellularized human lipoaspirate. Acta Biomaterialia. 7 (3), 1040-1049 (2011).
- Singelyn, J. M., Christman, K. L., Littlefield, R. B., Schup-Magoffin, P. J., DeQuach, J. A., Seif-Naraghi, S. B. Naturally derived myocardial matrix as an injectable scaffold for cardiac tissue engineering. Biomaterials. 30 (29), 5409-5416 (2009).
- Pouliot, R. A., et al. Development and characterization of a naturally derived lung extracellular matrix hydrogel. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 104 (8), 1922-1935 (2016).
- Bonvillain, R. W., et al. A Nonhuman Primate Model of Lung Regeneration: Detergent-Mediated Decellularization and Initial In Vitro Recellularization with Mesenchymal Stem Cells. Tissue Engineering Part A. 18 (23-24), 2437-2452 (2012).
- Brown, B. N., et al. Comparison of Three Methods for the Derivation of a Biologic Scaffold Composed of Adipose Tissue Extracellular Matrix. Tissue Engineering Part C: Methods. 17 (4), 411-421 (2011).
- Link, P. A., Pouliot, R. A., Mikhaiel, N. S., Young, B. M., Heise, R. L. Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture. Journal of Visualized Experiments. (119), 1-9 (2017).
- Massensini, A. R., et al. Concentration-dependent rheological properties of ECM hydrogel for intracerebral delivery to a stroke cavity. Acta Biomaterialia. 27, 116-130 (2015).
- Mierke, C. T., Frey, B., Fellner, M., Herrmann, M., Fabry, B. Integrin 5 1 facilitates cancer cell invasion through enhanced contractile forces. Journal of Cell Science. 124 (3), 369-383 (2011).
- Ahmadzadeh, H., et al. Modeling the two-way feedback between contractility and matrix realignment reveals a nonlinear mode of cancer cell invasion. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (9), E1617-E1626 (2017).
