Summary
Denne protokol demonstrerer sekventiel immunofluorescens og Immunhistokemi på kryosektioner fra tidlige stadier af zebrafiskembryoner, hvilket muliggør præcise samlokaliserings analyser i specifikke cellepopulationer.
Abstract
Undersøgelse af intercellulære interaktioner kræver ofte diskret mærkning af specifikke cellepopulationer og præcis protein lokalisering. Zebra embryo er et glimrende værktøj til at undersøge sådanne interaktioner med en in vivo model. Hele Mount immunohistokemiske og immunofluorescens assays anvendes hyppigt i Zebra embryoner til at vurdere protein ekspression. Det kan dog være svært at opnå nøjagtig kortlægning af co-lokaliserede proteiner i tre-dimensionelle rum. Desuden kan nogle undersøgelser kræve brug af to antistoffer, der ikke er kompatible med den samme teknik (f. eks. er antistof 1 kun egnet til immun histokemi, og antistof 2 er kun egnet til immunofluorescens). Formålet med den metode, der er beskrevet heri, er at udføre sekventiel immunofluorescens og/eller immun histokemi på individuelle kryosektioner afledt af tidlige stadier af Zebra embryoner. Her beskriver vi brugen af sekventielle runder af immunofluorescens, Imaging, immun histokemi, billeddannelse for en enkelt kryosektion for at opnå præcis identifikation af protein ekspression på enkelt celleniveau. Denne metode er velegnet til enhver undersøgelse i tidlige trin Zebra embryoner, der kræver nøjagtig identifikation af flere protein mål i individuelle celler.
Introduction
Zebra er en yderst robust model organisme, der i øjeblikket anvendes på tværs af en bred vifte af discipliner i biomedicinsk forskning. Især den hurtige eksterne udvikling og gennemskinnelighed af Zebra-embryoner er et glimrende værktøj til in vivo-undersøgelser. Heri beskrives en metode til sekventiel immunofluorescens (IF) og immunohistokemiske (IHC) analyser af kryosecerede Zebra-embryoner. Denne nye procedure bruger sekventiel anvendelse af to antistoffer på et enkelt dias, hvilket muliggør nøjagtig identifikation af colokaliserede proteiner på cellulært niveau, mens du bevarer vævs sektioner. Denne protokol er især nyttig i forbindelse med undersøgelser med Zebra-modellen, da et relativt lille antal antistoffer er blevet valideret til brug i IF-og/eller IHC-applikationer i Zebra sammenlignet med musemodeller.
Observation af intercellulære interaktioner er et væsentligt element i mange undersøgelser, og kan give vigtig indsigt i molekylære mekanismer, der fungerer på cellulært niveau, som ligger til grund for fænotyper på organismal niveau. Desuden kan protein ekspression give oplysninger om cellulær funktion, især når man undersøger ekspression af flere proteiner samtidigt i cellen (samlokalisering). Selv om hele Mount IHC og hvis er almindeligt anvendte teknikker til at analysere protein ekspression i Zebra embryoner1,2,3,4,5, hele Mount procedurer kan være problematisk for at opnå præcise samlokaliserings data. I vores erfaring kan det være svært at skelne mellem lag af væv og visualisere protein ekspression på enkelt celleniveau i hele Mount prøver. Imaging softwareprogrammer kan generelt ikke være i stand til at skelne mellem overfladefarvning versus dybere farvning. Protein udtryk uden for overflade niveau kan skjules af mere klart udtrykte overflade niveau udtryk, hvilket fører til unøjagtigheder i kvantificering. Desuden er de fleste traditionelle Zebra clearing metoder ganske giftige6 og dermed mindre ønskelig til brug.
Antistof-baserede teknikker, såsom IF og IHC, bruges ofte til at detektere protein ekspression i sektioneret materiale, hvilket forenkler identifikationen af diskrete cellepopulationer, der udtrykker et bestemt protein i komplekse væv. IHC anvendes almindeligvis til samlokalisering, oftest ved hjælp af to forskellige antistoffer, der er konjugeret i forskellige værtsarter og visualiseret med forskellige farvede kromogener4,7,8,9 , 10. men ved hjælp af flere kromogener kan føre til uspecifik baggrunds farvning eller uforenelighed af farver11,12.
Vi har udviklet en ny protokol til påvisning af flere proteiner ved sekventiel hvis og IHC på kryosecerede tidlige stadier af Zebra embryoner. Cryosectioning er særligt velegnet til sarte væv såsom Zebra embryoner, og kryosektioner er overlegne i paraffin-indlejrede sektioner for fluorescens-baserede assays13,14. Vi valgte at optimere kombineret hvis og IHC snarere end Dual-Color hvis eller IHC, at omgå problemet med antistof uforenelighed for en enkelt analysetype. Disse problemer er særligt relevante for forskning, der involverer Zebra på grund af det begrænsede antal kommercielt tilgængelige antistoffer, som er valideret til brug i Zebra. Faktisk viste en undersøgelse af fire store virksomheder, at kommercielt tilgængelige antistoffer til brug i mus var omkring 112.000 versus omkring 5.300 til brug i Zebra15. Endelig valgte vi at udvikle en protokol, der kunne udføres på en enkelt kryosektion, hvilket er vigtigt, når der arbejdes med små eller begrænsede vævsprøver, som stammer fra Zebra-embryoner.
Denne protokol blev designet til at vurdere den proliferativ opførsel af donorceller i 48 h efter befrugtning chimerisk Zebra embryoner, der blev genereret af blastula-til-blastula transplantation som beskrevet af carmany-rampey og MOENS16. Donor embryoner blev injiceret i en celle fase med en fluorescently mærket dextran konjugat før transplantation af donorceller til recipient embryoner. Vi brugte immunofluorescens til ser 10 fosforyleret histone H3 (pH3) til at detektere prolifererende celler efterfulgt af Immunhistokemi for den mærkede dextran til påvisning af donorceller i chimeriske Zebra embryoner. Sekventiel detektion af pH3 og den mærkede dextran inden for en enkelt cryosection gjorde os i stand til at identificere og kvantificere individuelle celler, der udtrykte begge markører.
Denne sekventielle IF/IHC-protokol for cryoseceret Zebra vil give et nyttigt værktøj for Zebra forskere, der ønsker en colokaliserings protokol for protein ekspression. De problemer, som denne protokol er designet til at løse, såsom småvævs prøver og begrænset antistof tilgængelighed, er ikke unikke for Zebra-modellen. Denne metode kan derfor være til nytte for enhver forsker, der ønsker at udføre sekventiel IF/IHC.
ETIK ERKLÆRING:
Alle dyreforsøg blev godkendt af det institutionelle udvalg for dyrepasning og-brug, North Carolina State University, Raleigh, North Carolina, USA.
Protocol
1. embryon præparat
- Fix 48 h efter befrugtning (HPF) kimerisk Zebra embryoner genereret af blastula-til-blastula transplantation mellem AB vild-type Zebra embryoner i 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) natten over med Rocking ved 4 °c. Udfør to 5 min vask med Rocking ved stuetemperatur med 500 μL 1x fosfat bufferet saltvand indeholdende 0,1% af et ikke-ionisk overfladeaktivt stof (1x PBSt; Se tabellen over materialer)
Bemærk: PARAFORMALDEHYD er giftigt og kræftfremkaldende og skal bortskaffes korrekt pr. institutionel lovgivning. Arbejde med PARAFORMALDEHYD skal udføres i en kemisk hætte, og passende personlige værnemidler (handsker, lab coat, og sikkerhedsbriller) bør altid anvendes. - Dehydrat embryoer ved at vaske sekventielt med 500 μL 30%, 50% og 70% methanol (MeOH) fortyndet med 1x PBSt i 10 min hver ved stuetemperatur med Rocking. Inkuber embryoner i 500 μL 100% MeOH ved-20 °C i mindst 14 timer.
Bemærk: Methanol er giftigt og skal bortskaffes korrekt pr. institutionel lovgivning. Arbejde med methanol skal udføres i en kemisk hætte, og passende personlige værnemidler (handsker, lab coat, og sikkerhedsbriller) bør altid anvendes. - Rehydrere embryoner ved at vaske sekventielt med 500 μL 70%, 50% og 30% MeOH fortyndet med 1x PBSt i 10 min hver ved stuetemperatur med Rocking. Udfør to 5 min vask med 500 μL 1x PBSt ved stuetemperatur med Rocking.
- 1x PBSt fjernes og inkubates i 500 μL 30% saccharose fortyndet med deioniseret vand ved stuetemperatur med gynge, indtil embryonerne synker til bunden af røret (ca. 1 time). Erstat saccharose med 500 μL af 15% fiskegelatine/25% saccharose (15/25; Se tabellen over materialer) og Inkuber ved stuetemperatur med Rocking natten over.
- Udskift ca. halvdelen af volumen 15/25 med optimalt skære temperatur medium (OLT-medium) og Inkuber ved stuetemperatur med Rocking, indtil embryonerne synker til bunden af røret (ca. 1 time).
- Udskift ca. halvdelen af volumenet med OLT-medium, og Inkuber ved stuetemperatur med Rocking i 1 time. Gentag dette trin én gang.
- Under inkubations trinene med 15/25 og OCT medium skal du invertere eller svirpe røret efter behov for at kombinere disse reagenser.
2. indarbejdelse af embryoner og klargøring af Kryosektioner
- Overfør embryoner til en plastik skimmel (Se tabellen over materialer) med pincet, hvilket minimerer enhver overførsel af 15/25-okt blandingen. Fyld formen omtrent halvt fyldt med OCT medium og bland forsigtigt embryonerne i OLT medium.
- Forbered mærkede plastik forme og overføre ønskede embryoner (normalt 1 \ u20123 embryoner) i den tomme, mærket plast forme, minimering overførsel af OLT medium. Når de ønskede embryoner er i plastik skimmel, forsigtigt fylde med OLT medium til toppen af formen.
- Brug pincet eller 25 G nåle til at arrangere embryoer i den ønskede retning ved hjælp af en lysstereomicroskop til visualisering (figur 1a, B).
- Fryse de forberedte støbeforme på tøris i en isoleret beholder med en metal platform. Anbring en isspand eller skum køler forsigtigt over metal platformen for at oprette et koldt kammer (figur 1c, D)
-
Forbered 10 \ u201212 μm tykke kryosektioner ved hjælp af en kryostat sat ved-20 °c.
- Indstil en blok ad gangen og brug OCT medium til at fryse blokken på disken/Chuck med bunden af blokken vendt mod klingen (figur 2a). Sørg for, at blokken er helt frosset til disken (OLT-mediet bliver hvidt), før du begynder at skære (figur 2b).
- Placer kryosektioner på opladede glas rutsjebaner (figur 2c, D),og lufttørre gliderne natten over ved stuetemperatur.
3. immunofluorescens for pH3
- Udfør tre 5 min. skylning af gliderne i 1x PBS i en passende beholder, såsom en Coplin-krukke. Hvis vævet ikke er godt overholdt på diaset, skal du udføre skylning ved at lægge slides på en flad overflade og forsigtigt pipettere 500 μL 1x PBS på overfladen. Hæld 1x PBS mellem skyller ved forsigtigt at vippe slides.
- Skitsere afsnittene med en barriere pen eller voks blyant for at holde væsken på slidene (figur 3).
- Læg slidene på en flad overflade i et fugtigt kammer, og afpipettér 200 μL blok buffer pr. sektion på diasene. Inkuber i blok buffer i 2 timer ved stuetemperatur eller natten over ved 4 °C.
- Forbered den primære antistof fortynding (kanin anti-pH3 antistof, 1:200; Se tabel over materialer) i blok buffer og bland godt ved pipettering. Tip forsigtigt diasene for at tømme blok bufferen, vende tilbage til det fugtige kammer og afpipettere 200 μL primær antistof opløsning pr. sektion på slidene. For den sekundære kontrol, pipette 200 μL blok buffer på de relevante sektioner.
- Der inkubates ved 4 °C natten over i et fugtigt kammer fyldt med deioniseret vand. Forsegl kanterne af det fugtige kammer for at hjælpe med at bevare fugt.
- Udfør tre 5 min. skylning af gliderne i 1x PBS i en passende beholder, såsom en Coplin-krukke. Under vask trin, forberede den sekundære antistof fortynding (anti-kanin fluorescerende sekundær antistof konjugat, 1:2000; Se tabel over materialer) i blok buffer og bland godt ved pipettering.
- Læg gliderne på en flad overflade i et fugtigt kammer, og afpipettér 200 μL sekundær antistof opløsning pr. sektion på slidene. Inkubaterne i sekundære antistof opløsning (er) ved stuetemperatur, afskærmet mod lys, i 30 minutter.
- Udfør tre 5 min skylning af diasene i 1x PBS i en passende beholder, såsom en Coplin krukke, afskærmet mod lys. Under vask trin, forberede en nuklear farvning løsning (Se tabellen over materialer).
- Placer slidene på en flad overflade, og afpipettér 200 \ u2012500 μL (afhængigt af prøvens størrelse) af den nukleare farvningsopløsning på hver sektion. Inkuber diasene i den nukleare farvningsopløsning i 10 minutter, afskærmet fra lys.
- Tøm den nukleare farvningsopløsning, og monter gliderne med ikke-hærde fluorescerende monterings medier og en glas dækseddel. Bevar slidene i mørke ved 4 °C, indtil der udføres billeddannelse.
Bemærk: De bedste resultater opnås, når diasene er afbildet samme dag eller næste dag. - Efter hvis, visualisere og billede slides med en confokal fluorescens mikroskop og digital kamera ved hjælp af 555 nm (rød) og 645 nm (far-rød) emission filtre ved 100x forstørrelse (10x okulær forstørrelse og 10x objektivforstørrelse). Hold laser strømmen konsistent i hele billeddannelse.
- Efter billeddannelse skal du placere diasene i individuelle beholdere med 1x PBS og opbevare dem fladt ved 4 °c natten over for at forberede dækglas-fjernelse. Når du placerer diasene i 1x PBS, skal du forsigtigt agitere for at hjælpe med at fjerne dæksedlen.
Bemærk: Du må ikke trykke ned på dæksedlen eller forsøge at fjerne dæksedlen manuelt, da dette kan kompromittere kvaliteten af sektionerne. Dæksedlerne skal fjernes horisontalt med minimal tvungen bevægelse.
4. Immunhistokemi for mærket dextran
- Når dæksedlerne er fjernet, skal du forsigtigt overføre diasene til nye 1x PBS i en passende beholder, f. eks. Fjern 1x PBS og Udfør tre 5 min inkubationer af diasene i 1x Tris-bufferet saltvand med 0,1% af et ikke-ionisk overfladeaktivt stof (1x TBSt) ved stuetemperatur.
- Forbered 250 mL 3% hydrogenperoxid (H2O2) fortyndet i deioniseret vand i en passende størrelse beholder. De slides i 3% H2O2 opløsning ved stuetemperatur i 15 min.
Bemærk: Hydrogenperoxid er ætsende og skal bortskaffes korrekt pr. institutionel lovgivning. Der bør altid anvendes passende personlige værnemidler (handsker, laboratorie beklædning og sikkerhedsbriller). - Skyl hurtigt gliderne med deioniseret vand. Udfør tre 5 min. vask af diasene i 1x TBSt. Tør forsigtigt området omkring vævs sektionerne, og Placer gliderne fladt i et fugtigt kammer. Skitsere vævs sektioner med en barriere pen eller voks blyant for at holde væske på sektionerne, hvis det er nødvendigt.
- Anvend en klar-til-brug 2,5% serum blokerende opløsning, der leveres med et sekundært antistof mærknings sæt (Se tabellen over materialer) dråbevis til hver sektion. Der inkubates i et fugtigt kammer ved stuetemperatur i 20 minutter.
- Forbered det primære antistof fortyndet i antistof fortyndingsmiddel (kanin-anti-mærket dextran, 1:7500; Se tabellen over materialer) og bland med blid pipettering. Tip forsigtigt diasene til at dræne blok bufferen, tør området omkring sektionerne, og Placer gliderne fladt i et fugtigt kammer.
- Må ikke vaskes, før den primære antistof opløsning anvendes. Der afpipetteres 200 μL primær antistof opløsning pr. sektion på slidene, og der inkubateres i et fugtigt kammer ved 4 °C natten over. For sekundær kontrol afpipetteres 200 μL antistof-fortyndingsmiddel på de relevante sektioner.
- Tip forsigtigt diasene for at tømme den primære antistof opløsning og anbringe den i 1x TBSt i en passende beholder, f. eks. Udfør to 5 min. vask af diasene i 1x TBSt. tør området omkring afsnittene og Placer fladt i et fugtigt kammer.
- Anvend en klar-til-brug baggrunds reducerende blokerende reagens (Se tabellen over materialer) dråbevis til hver sektion. Der inkubates i et fugtigt kammer ved stuetemperatur i 20 minutter.
- Tip forsigtigt diasene for at dræne blok bufferen, tør forsigtigt området omkring sektionerne, og Placer gliderne fladt i et fugtigt kammer. Må ikke vaskes, før den sekundære antistof opløsning anvendes.
- Anvende en klar-til-brug sekundær antistof opløsning (anti-kanin peberrod peroxidase (HRP) polymer sekundært antistof; Se tabellen over materialer) til hver sektion dråbevis og inkuberes i et fugtigt kammer ved stuetemperatur i 30 min.
- Tip forsigtigt diasene for at tømme den sekundære antistof opløsning og anbringe den i 1x TBSt i en passende beholder, f. eks. Udfør to 5 min. skyller af diasene i 1x TBSt.
- Forbered det kromogene substrat HRP umiddelbart før brug i henhold til producentens protokol (Se tabellen over materialer).
- Tør området omkring afsnittene, Placer slidene på en flad overflade, og Anvend 200 μl af HRP kromogene substrat til hver sektion. Inkuber ved stuetemperatur i 3 minutter, start en timer, når substratet er blevet påført på det første dias (figur 4).
- Dræn substratopløsningen, og skyl gliderne kortvarigt i en Coplin-krukke med 1x PBS. Placer gliderne i deioniseret vand i en passende beholder, såsom en Coplin krukke, og udfør to 5 min vask i deioniseret vand med blid agitation.
- Counterstain lysbilleder ved at placere dem i hematoxylinlegemer farvningsopløsning for op til 30 s.
Bemærk: Hematoxylin er giftigt og skal bortskaffes pr. institutionel lovgivning. Der bør altid anvendes passende personlige værnemidler (handsker, laboratorie beklædning og sikkerhedsbriller). - Placer gliderne i deioniseret vand i en passende beholder, såsom en Coplin krukke, og Udfør tre 5 min vask i deioniseret vand. Overfør diasene til en container, der indeholder Scotts ledningsvand (Se tabellen over materialer), og Inkuber i 1 min.
- Placer gliderne i deioniseret vand i en passende beholder, såsom en Coplin krukke, og Udfør tre 5 min vask i deioniseret vand.
- Dehydrat gliderne gennem en række ethanol (EtOH) kvaliteter (fortyndet i deioniseret vand) og xylen i en kemisk hætte. Udføre en 2 min inkubation i 70% EtOH, to 1 min inkubationer i 95% EtOH, to 1 min inkubationer i 100% EtOH, og tre 1 min inkubationer i xylen. Fjern slidene fra xylen, og Placer en dækseddel, mens den er våd med et toluen-baseret monterings medium i en kemisk hætte.
Bemærk: Xylen og toluen er giftige og brandfarlige og skal bortskaffes på passende måde pr. institutionel lovgivning. Arbejde med xylen og toluen skal udføres i en kemisk hætte, og passende personlige værnemidler (handsker, lab coat, og sikkerhedsbriller) bør altid anvendes. - Efter IHC, visualisere og billede slides med en sammensat lys mikroskop og digital kamera ved 100x forstørrelse (10x okulær forstørrelse og 10x objektivforstørrelse). (Figur 5).
Representative Results
Vi udviklede denne protokol for at identificere og analysere protein ekspression i individuelle donorceller i 48 h efter befrugtning chimerisk Zebra embryoner, der blev genereret af blastula-til-blastula transplantation mellem AB vild-type Zebra embryoner. En vellykket analyse af protein ekspression på det ene celleniveau krævede forberedelse af kryosektioner med passende orienterede embryoner (figur 1 og figur 2) og omhyggelig, sekventiel anvendelse af IF og IHC-teknikker til disse kryosektioner (figur 3 og figur 4). Anvendelse af specifikke antistoffer til samtidig påvisning af prolifererende celler (anti-pH3, figur 5a, B) og donorceller (anti-mærket dextran, figur 5D) kan bruges til at identificere og kvantificere donorceller, der aktivt prolifererer ( Figur 5E). Det er vigtigt at generere billeder af høj kvalitet efter begge hvis (figur 2a, B) og IHC (figur 2D) for præcist at identificere individuelle celler. Et billedanalyse program skal bruges til at udføre billed overlay (figur 5E). Afhængigt af det anvendte billedanalyse program kan det være muligt at udføre automatiserede optællinger af mærkede celler, hvis kvantificeringen ønskes.
Figur 1: Forberedelse af frosne OLT blokke. A) 50x mikroskopisk syn af embryoner i OLT i en kryogen støbeform, der er tilberedt til frysning. Rød pil indikerer leder af Zebra embryo position mod den nederste overflade af formen; sort pil indikerer, at halen peger opad mod brugeren. B) plast forme med embryoner og OLT placeret på kølet metal platform. (C) skum isspand placeret over plast forme til at skabe frysende kammer. (D) Oct bliver hvidt fra transparent, når blokken er helt frosset. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Cryosectioning af frosne OLT blokke. (A), anvendelse af fersk OLT på kryostat skive og placering af frosne blok på okt, roteret 180 ° fra frysepunktet af blokken. B) side visning af blok frosset til skæreskive. C) visning af skære blokken med rulle pladen i position. (D) pick-up af sektioner ved hjælp af en opladet slide fra metal platform af cryostat. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Visning af forberedte sektioner efter placering på et dias. Pil indikerer hydrofobe barriere, og punkteret linje afgrænse zonen, der indeholder sektioner inden barriere omkreds. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: klargøring til kromogen substrat applikation under IHC. Sliden anbringes på en flad overflade, der er dækket med plastfolie, for at muliggøre ensartet anvendelse af det kromogene substrat, samtidig med at det indeholder spild af farligt materiale. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Repræsentativ hvis og IHC mærkning af cryosekeret 48 HPF kimerisk Zebra embryoner genereret af blastula-til-blastula transplantation mellem AB vild-type Zebra embryoner. (A) Hvis der detekterer ser 10 fosforyleres histone H3 (anti-pH3, 1:200) ekspression i 48 HPF kimerisk Zebra embryo. Rød = pH3-positive celler; blå = kerner. Gule pile indikerer eksempler på positive celler. (B) subtraktion af den blå nukleare plet i det digitale billede (ImageJ software) forbedrer visualisering af pH3-positive celler til kvantificering og billed overlay. C) negativ kontrol (kun sekundært antistof) for IF-assay i cryoseceret 48 HPF kimerisk Zebra embryo. Scale bar repræsenterer 50 μm (gælder for alle paneler). D) IHC til påvisning af mærket dextran (anti-mærket dextran, 1:7500) i kimerisk 48 HPF Zebra embryo genereret ved blastula-til-blastula transplantation mellem AB vild-type Zebra embryoner. Donor embryoner blev injiceret med en fluorescentlig mærket dextran konjugat i en celle fase før brug til transplantation af blastula-til-blastula. Rød indikerer celler mærket med en dextran konjugat; blå indikerer kerner. Gule pile indikerer eksempler på positive celler. (E) overlay af panel B (IF for pH3) og panel C (IHC for mærket dextran) viser samlokalisering af pH3 udtryk og dextran mærkning i individuelle celler. Gule pile indikerer eksempler på dobbelt positive celler. F) negativ kontrol (kun sekundært antistof) for IHC-assay i cryosekeret 48 HPF kimerisk Zebra embryo. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Vi har præsenteret en ny metode til kombineret immunofluorescens og immun histokemi, som er et vigtigt skridt fremad i gennemførelse af samlokaliserings eksperimenter på kryosecerede Zebra-embryoner. Der er en kritisk mangel på eksisterende samlokaliserings protokoller, der er optimeret til brug med små embryoner og kryoseceret materiale17,18, som begge ellers er almindeligt anvendt i molekylære undersøgelser14. Eksisterende samlokaliserings protokoller fokuserer primært på simultan visualisering af to fluorophorer17,18. Mens disse protokoller kan fungere godt, er deres anvendelighed begrænset af tilgængeligheden af antistoffer, at (i) kan anvendes i Zebra og (II) er forenelige med IF.
Vi mener, at brugen af kryosectioning til Zebra embryoner giver en betydelig fordel i form af konserveret vævs morfologi. Da IHC er mere almindeligt forekommende på paraffin sektioner end kryosektioner7,8, er yderligere udforskning af cryosection-baserede IHC-metoder til påvisning af protein ekspression berettiget. Brugen af hele Mount hvis er en almindelig metode til visualisering af udtryks niveauer i Zebra-embryoner og er mere almindeligt beskrevet i litteraturen, end hvis der anvendes kryosektioner1,2,3,4, 19. Men hele Mount protokoller har begrænsninger, herunder manglen på nøjagtig lokalisering af proteiner udtrykt i dybe væv og potentialet for overflade niveau udtryk til at sløre protein ekspression i dybere væv. Vi har konsekvent observeret fremragende vedligeholdelse af cellulære morfologi efter Kryopreservation, skæring, og sekventiel hvis og IHC. For applikationer, der kræver præcis lokalisering af protein ekspression på enkelt celleniveau, er der en betydelig fordel ved sektions baserede procedurer, som vi har beskrevet i denne protokol. Harpiks indlejring giver en alternativ mulighed for at udføre, hvis eller IHC assays på sektioner fra tidlige Stage Zebra embryoner20. Harpiks sektioner giver overlegen bevarelse af vævs morfologi sammenlignet med kryosektioner, og relativt tyndere vævs sektioner kan forberedes. Fabrikanterne anbefaler dog generelt ikke anvendelse af harpiks sektioner til immuno-baserede assays, da nogle af komponenterne i harpiksen ikke kan fjernes fra sektionerne og kan maskere antistof bindingssteder21.
Mens hele protokollen er afgørende for en nøjagtig og vellykket analyse af udtryks mønstre, er et par specifikke skridt afgørende for eksperimentel succes. Det første kritiske skridt er håndteringen af embryoner under indlejring i okt13,14. Det kan være udfordrende at orientere hvert embryo i samme tværplan, således at sektioner skæres fra omtrent samme område for alle embryoner. Vi har konstateret, at brugen af små måler nåle til at udføre små, bevidste bevægelser gennem det viskøse OLT-medium til embryo orientering er bedre end at bruge pincet, som er for store og fortrænger for meget OLT-medium. Et andet kritisk trin opstår under skæring af frosne blokke, da det kan være svært at opnå høj kvalitet sektioner, der indeholder den ønskede væv (r) uden væsentlig uddannelse og erfaring. Vi anbefaler derfor brug af testprøver, indtil teknikken er behersket. Et tredje kritisk skridt er Cover slip fjernelse, som har potentiale til at forstyrre eller fratage vævsprøver. Vi har fundet ud af, at en kombination af blid agitation for at løsne dæksedlen og den langsomme fjernelse af sliden fra PBS-beholderen er den mest effektive metode til at fjerne dæksedler. En blid og rolig hånd er bedst; forskere kan finde, at nogle forsøg og fejl er nødvendig for at lære at fjerne coverglider effektivt.
Yderligere vigtige skridt i protokollen omfatter antistof optimering (primære og sekundære antistoffer for både hvis og IHC assays) og eksponering af dias til kromogen substrat og kontra plet. Grundig forskning vedrørende primært antistof specificitet og målkoncentration er afgørende; generelt er det bedst at indsamle tilstrækkelige ikke-værdifulde prøver til mindst to separate eksperimenter for IF og IHC, der vil blive udført for at optimere primære antistofkoncentrationer, før de påbegynder IF/IHC-kombinationen. Herunder en kendt positiv og negativ kontrol for hvert primært antistof er afgørende i hvert eksperiment for at sikre, at både hvis og IHC assays klarer sig korrekt. Det kan også være nødvendigt at justere sekundær antistofkoncentration. Det er nødvendigt at optimere eksponeringen af vævs sektioner til det kromogene substrat og kontra pletten til IHC-analysen, da producentens retningslinjer ofte beskriver en lang række mulige eksponeringstider. Ikke alle kromogener kan være kompatible med kontra pletter og endogene vævs pigmentering, hvilket kræver omhyggelig planlægning med hensyn til kromogen udvælgelse.
Der er talrige potentielle modifikationer, der kan anvendes på den beskrevne protokol, og vi har med succes udført denne protokol med andre kombinationer af antistoffer, der ikke begge kunne bruges til hvis. Som nævnt ovenfor har kromogene stoffer en tydelig forenelighed med specifikke kontra pletter. Vi har konstateret, at disse komponenter er let modificerbare i protokollen. Derudover er parametrene for antistof inkubation ret fleksible og kan øges eller mindskes afhængigt af den ønskede farvnings intensitet. Integreringsprocessen kan også ændres. Mens vi har fokuseret på tværgående sektioner, kan embryoner nemt være orienteret i enhver retning for at løse bestemte væv af interesse. Endelig er der flere mulige pausepunkter i denne protokol. Dehydrerede embryoner kan opbevares i 100% MeOH ved-20 °C i et par måneder; frosne blokke kan opbevares ved-80 °C i op til tre måneder; og forberedte slides kan opbevares ved-80 °C i op til ni måneder i en slide boks.
På grund af den relative kompleksitet af denne kombinerede IF/IHC protokol, der er flere mulige kilder til variation eller fejl, der kan kræve fejlfinding, lige fra vævs kvalitet til forsker erfaring til at prøvehåndtering. De fleste af de kritiske trin, der er beskrevet ovenfor, betragtes som kritiske, fordi de enten kræver optimering på det individuelle brugerniveau, eller de kræver særlig fingerfærdighed, dygtighed og erfaring. Men vi har konstateret, at uspecifik baggrunds farvning og lav signalintensitet er de mest betydningsfulde problemer, der kræver optimering. Som med enhver hvis eller IHC protokol, behandle disse spørgsmål kan være tidskrævende og arbejdskrævende, og kan forværres med denne metode, da de to teknikker kombineres. Af denne grund anbefaler vi stærkt optimering af hvis og IHC separat, før du fortsætter med den kombinerede protokol.
Selv om vi forudser, at denne metode vil være nyttig for en bred vifte af eksperimenter, der er potentielle begrænsninger. Vellykket udførelse af denne procedure er afhængig af at opretholde intakt vævsprøver gennem to sekventielle eksperimenter, der omfatter talrige vask trin. Af denne grund vil eventuelle problemer, der opstår under skæring eller vævs håndtering, herunder brug af ældre dias, der kan have forringet kvalitet, betydeligt begrænse forskernes evne til at udføre denne protokol med succes. Selvom slides potentielt kan opbevares ved-80 °C i op til ni måneder, falder vævs tilslutningen til dias over tid, og vi havde den bedste succes med slides, der bruges inden for en måned efter forberedelse eller ideelt, den næste dag. En anden begrænsning er den lille fodaftryk af Zebra embryoner. Mens vi har fundet dette eksperiment til at være nyttigt i visualisering af proteiner, der er relativt rigeligt udtrykt i tidlige stadier embryoner, proteiner, der udtrykkes inkonsekvent eller ved lave niveauer kan være meget vanskeligt at fange i en sektion. Endelig, da protokollen bruger 10 \ u201212 μm kryosektioner, er det bedst egnet til evaluering af protein ekspression i større strukturer, såsom kerner, snarere end mindre sub-cellulære komponenter.
Sammenfattende vil vores kombinerede IF/IHC-protokol være fordelagtig for en lang række undersøgelser i tidlige stadier af Zebra-embryoner og udgør en vigtig nyskabelse i præcis analyse af protein ekspression i sådanne prøver. Vores metode, der vises med succes i figur 5, vil give forskerne mulighed for at bevare den delikate morfologi af tidlige stadier af Zebra embryoner i kryosektioner, mens de arbejder med det noget begrænsede udvalg af aktuelt tilgængelige primære antistoffer, der er godkendt til brug i IF eller IHC i denne art. Denne protokol vil sandsynligvis være nyttig i forbindelse med undersøgelser af andre fisk og amfibie arter (f. eks. Medaka og xenopus spp.), som hæmmes af lignende begrænsninger af antistof tilgængeligheden, og kan være gældende for traditionelle pattedyr modeller som Godt.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af NIH Grant 5K01OD021419-02 og NC State University College of Veterinary Medicine.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15/25 | N/A | N/A | 15% fish gelatin/25% sucrose w/v, made in dH2O |
| Alexa 555 secondary antibody | Invitrogen | A21429 | used at 1:2,000 dilution in block buffer for IF |
| Antibody Diluent | Dako | S3022 | |
| Background Buster | Innovex | NB306 | |
| block buffer (IF) | N/A | N/A | 5% normal goat serum, 0.1% Triton X-100 in 1x PBS |
| cellSens imaging software | Olympus | cellSens | imaging software used with compound light microscope |
| chimeric zebrafish embryos | N/A | N/A | AB wild-type chimera zebrafish embryos analyzed at 48 hpf |
| Compound light microscope | Olympus | BX51 | used with digital camera and cellSens imaging software for image capture after IHC |
| Confocal fluorescence microscope | Leica | DM 2500 | used with digital camera and Leica Application Suite Advanced Fluorescence imaging software for image capture after IF |
| Disposable plastic molds, 15 mm x 15 mm x 5 mm | Ted Pella | 27147-2 | |
| Digital camera, light microscope | Olympus | DP27 | |
| Digital camera, fluorescence microscope | Leica | TCS SPE | |
| Ethanol | Koptec | V1001 | |
| Fish gelatin | Sigma | G7041 | |
| Glass slides | Fisher | 12-550-15 | |
| Hydrogen peroxide, 30% | Fisher | H325-100 | |
| ImmPRESS HRP Polymer detection kit | Vector | MP-7401 | anti-rabbit secondary antibody, HRP polymer |
| Leica Application Suite Advanced Fluorescence imaging software | Leica | LAS AF 2.3.6 | imaging software used with confocal fluorescence microscope |
| Methanol | Fisher | A452-4 | |
| Modified Meyer's Hematoxylin | Thermo | 72804 | |
| Normal Goat Serum | MP Biomedical | 191356 | |
| OCT medium | Tissue-Tek/Fisher | 4583/4585 | |
| anti-Oregon Green antibody | Molecular Probes/Life Technologies | A889 | used at 1:7500 dilution for IHC |
| Oregon Green Dextran | Invitrogen | P7171 | used at 2.5% in 0.2 M KCl |
| Paraformaldehyde, 4% | Acros Organics | 416780030 | made in lab in 1x PBS |
| Permount | Fisher | SP15 | |
| 1x phosphate-buffered saline | made in lab | N/A | 50 mL 10x PBS, up to 500 mL volume with dH2O |
| 10x phoshpate-buffered saline | made in lab | N/A | use Cold Spring Harbor protocol |
| 1x PBSt | made in lab | N/A | 50 mL 10x PBS, 1 mL 10% Tween 20, up to 500 mL volume with dH2O |
| anti-Ser10 phosphorylated Histone H3 antibody | Santa Cruz | sc-8656-R | used at 1:500 dilution for IF |
| Scott's Tap Water | Electron Microscopy Sciences | 26070-06 | have used other brands successfully in addition to EMS |
| Sucrose | Amresco | 335 | |
| Tween-20 | Fisher | BP337 | |
| TO-PRO3 | Invitrogen | T3605 | used at 1:1,000 in 1x PBS for IF |
| 1x Tris-buffered saline | made in lab | N/A | 50 mL 10x TBS, up to 500 mL volume with dH2O |
| 10x Tris-buffered saline | made in lab | N/A | 85 g NaCl, 61 g Tris base, up to 1 L volume with dH2O |
| 1x TBSt | made in lab | N/A | 50 mL 10x TBS, 1 mL 10% Tween 20, up to 500 mL volume with dH2O |
| Triton X-100 | Acros Organics | 327371000 | |
| Vectashield | Vector | H-1000 | non-hardening mounting media |
| Vector NovaRed substrate | Vector | SK-4800 | HRP substrate |
| Xylene | Fisher | X3P-1GAL |
References
- Whole-mount IHC protocol for zebrafish embryos [Internet]. GeneTex. , Irvine. Available from: http://www.genetex.com/uploaddata/Protocol/Document/IHC-WM.pdf (2013).
- Inoue, D., Wittbrodt, J. One for all--a highly efficient and versatile method for fluorescent immunostaining in fish embryos. PLoS One. 6 (5), (2011).
- Kogata, N., Howard, B. A. A whole-mount immunofluorescence protocol for three-dimensional imaging of the embryonic mammary primordium. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 18 (2), 227-231 (2013).
- Santos, D., Monteiro, S., Luzio, A. General Whole-Mount Immunohistochemistry of Zebrafish (Danio rerio) Embryos and Larvae Protocol. Methods in Molecular Biology. 1797, 365-371 (2018).
- Shive, H. R., West, R. R., Embree, L. J., Sexton, J. M., Hickstein, D. D. Expression of KRASG12V in Zebrafish Gills Induces Hyperplasia and CXCL8-Associated Inflammation. Zebrafish. 12 (3), 221-229 (2015).
- Karlsson, J., von Hofsten, J., Olsson, P. E. Generating transparent zebrafish: a refined method to improve detection of gene expression during embryonic development. Marine Biotechnology (NY). 3 (6), 522-527 (2001).
- Macdonald, R. Zebrafish Immunohistochemistry. Molecular Methods in Developmental Biology. Guille, M. , 127th ed, Humana Press. New York. 77-88 (1999).
- Santos, C., Pinto, M. L. Immunohistochemical Assessment as a Tool for Investigating Developmental Toxicity in Zebrafish (Danio rerio). Methods in Molecular Biology. 1797, 461-476 (2018).
- Shive, H. R., West, R. R., Embree, L. J., Azuma, M., Sood, R., Liu, P., et al. brca2 in zebrafish ovarian development, spermatogenesis, and tumorigenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (45), 19350-19355 (2010).
- Shive, H. R., West, R. R., Embree, L. J., Golden, C. D., Hickstein, D. D. BRCA2 and TP53 collaborate in tumorigenesis in zebrafish. PLoS One. 9 (1), (2014).
- van der Loos, C. M. Multiple Immunoenzyme Staining: Methods and Visualizations for the Observation With Spectral Imaging. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (4), 313-328 (2008).
- van der Loos, C. M. Immunoenzyme Multiple Staining Methods. , Bios Scientific Publishers. New York. (1999).
- OCT Embedding For Cryostat Sectioning Of Embryos or Larvae [Internet]. The Zebrafish Book, 5th edition. , University of Oregon Press. Available from: https://wiki.zfin.org/display/prot/OCT+Embedding+For+Cryostat+Sectioning+Of+Embryos+Or+Larvae (2007).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Preparation of Cells and Tissues for Fluorescence Microscopy. Basic Methods in Microscopy. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. Spector and Goldman, editors (2006).
- Torres, E. The Lack of Commercial Antibodies for Model Organisms (and How You Can Deal with It) [Internet]. BenchSci Blog. , Available from: https://blog.benchsci.com/the-lack-of-commercial-antibodies-for-model-organisms-and-how-you-can-deal-with-it (2018).
- Carmany-Rampey, A., Moens, C. B.
- Da’as, S. I., Balci, T. B., Berman, J. N. Mast cell development and function in the zebrafish. Methods in Molecular Biology. 1220, 29-57 (2015).
- Quan, F. B., et al. Comparative distribution and in vitro activities of the urotensin II-related peptides URP1 and URP2 in zebrafish: evidence for their colocalization in spinal cerebrospinal fluid-contacting neurons. PLoS One. 10 (3), (2015).
- Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 4th ed, University of Oregon Press. Eugene. (2000).
- Sullivan-Brown, J., Bisher, M. E., Burdine, R. D. Embedding, serial sectioning and staining of zebrafish embryos using JB-4 resin. Nature Protocols. 6 (1), 46-55 (2011).
- JB-4 Embedding Kit. [Internet]. Polysciences, Inc. , Available from: http://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/histology-microscopy/plastic-embedding-media-kits/jb-4-sup-r-sup-embedding-kits-reagents/jb-4supsup-embedding-kit/ (2018).
