Summary
פרוטוקול זה ממחיש החיסונית רציפים של האנטי ואימונוהיסטוכימיה על קריודורים מן השלב המוקדם של העוברים ומאפשרים לניתוחי לוקליזציה מדויקים באוכלוסיות תאים ספציפיות.
Abstract
חקירת אינטראקציות בין-סלולריות דורשת לעתים קרובות תיוג בדיד של אוכלוסיות תאים ספציפיות ולוקליזציה של חלבונים מדויקים. העובר הדג הוא כלי מצוין לבדיקת אינטראקציות כאלה עם מודל vivo. כל הר אימונוהיסטוככימיים ואימונוכימיקלים מיושם לעתים קרובות בעוברי דגים דג זברה להעריך את הביטוי חלבון. עם זאת, זה יכול להיות קשה להשיג מיפוי מדויק של חלבונים שיתוף מקומי במרחב תלת מימדי. בנוסף, מחקרים מסוימים עשויים לדרוש שימוש בשני נוגדנים שאינם תואמים לאותה טכניקה (למשל, נוגדן 1 מתאים רק לאימונוהיסטוכימיה ונוגדן 2 מתאים רק לimmunofluorescence). מטרת השיטה המתוארת בזאת היא לבצע מרפאוולוגיה רציפה ו/או אימונוהיסטוכימיה על חלקי קריוקיים שמקורם בשלב מוקדם של עוברי דגים. כאן אנו מתארים את השימוש של סיבובים רציפים של immunofluorescence הדמיה, אימונוהיסטוכימיה, הדמיה עבור הקפאה בודד על מנת להשיג זיהוי מדויק של ביטוי חלבון ברמת תא בודד. מתודולוגיה זו מתאימה לכל מחקר בשלב מוקדם של עוברי דגים שדורשים זיהוי מדויק של מטרות חלבון מרובות בתאים בודדים.
Introduction
הדג הוא אורגניזם מודל חסון מאוד, המשמש כיום לאורך מגוון רחב של דיסציפלינות במחקר ביו-רפואי. בפרט, פיתוח חיצוני מהיר ו הרי של עוברי דגים לספק כלי מצוין עבור במחקרים vivo. להלן, אנו מתארים שיטה לניתוח האימונוכימיקלים הרציפים (IF) ו אימונוהיסטוכימיה (IHC) ניתוחים של עוברי הדגים בהקפאה. הליך זה משתמש ביישום רציף של שני נוגדנים בשקופית אחת, ומאפשר זיהוי מדויק של חלבונים מותאמים לשפות אחרות ברמה התאית תוך שימור מקטעי רקמות. פרוטוקול זה שימושי במיוחד עבור מחקרים עם מודל דג זברה, מאז מספר קטן יחסית של נוגדנים אומתו לשימוש ביישומים IF ו/או ihc בדגים בהשוואה לדגמי העכבר.
התבוננות באינטראקציות בין-סלולריות היא מרכיב חיוני במחקרים רבים, והיא עשויה לספק תובנות מפתח למנגנונים מולקולריים הפועלים במישור הסלולר הפנוטיפים ברמה הארגונית. בנוסף, ביטוי החלבון יכול לספק מידע על הפונקציה התאית, במיוחד כאשר בוחן ביטוי של מספר חלבונים בו בתוך התא (לוקליזציה משותפת). למרות מלאה-הר ihc ואם הם בשימוש נפוץ טכניקות לניתוח ביטוי חלבון ב-דג זברה עוברי1,2,3,4,5, הליכי הר שלם יכול להיות בעייתי להשגת נתונים מדויקים ללוקליזציה. בניסיון שלנו, זה יכול להיות קשה להבדיל בין שכבות של רקמה לבין הביטוי חלבון ביטוי ברמה תא יחיד בתוך כל המינים. תוכנות לדימות יכולות בדרך כלל להיות מסוגלים להבדיל בין צביעת פני שטח לעומת כתמים עמוקים יותר. ביטויים של חלבון ברמה שאינה מפני השטח יכולים להיות מטושטשים על-ידי ביטוי ברמה גבוהה יותר של משטח בוהק, המוביל אי-דיוקים בקוונפיקציה. בנוסף, שיטות הניקוי המסורתי ביותר של הדגים הם רעילים למדי6 ולכן פחות רצוי לשימוש.
טכניקות מבוססות נוגדן, כגון IF ו-IHC, משמשות לעתים קרובות כדי לזהות ביטוי חלבונים בחומר מנות, מפשט את הזיהוי של אוכלוסיות תאים דיסקרטית המבטאים חלבון מסוים בתוך רקמות מורכבות. Ihc משמשת בדרך כלל ללוקליזציה, לעתים קרובות באמצעות שני נוגדנים שונים מצוכרים במינים מארחים שונים ודמיינו עם כרומוגנים בצבעים שונים4,7,8,9 , 10. עם זאת, שימוש במספר כרומוגנס יכול להוביל לצביעת רקע לא ספציפי או אי-תאימות של צבעים11,12.
פיתחנו פרוטוקול הרומן לגילוי של חלבונים מרובים על ידי רציף IF ו-ihc על מנות בשלב מוקדם של עוברי דג דג זברה. קריוסיסירהמתאימה במיוחד לרקמות העדינות כגון עוברי הדגים והקריוקטרונים מעולים לחלקים משובצים בפרפין בעלי מראה מבוסס-פלואורסצנטית13,14. בחרנו למטב את IF ו-IHC משולבים במקום אם או IHC בצבעים כפולים, כדי לעקוף את בעיית חוסר התאימות של הנוגדנים לסוג של שיטת התאמה בודדת. בעיות אלה רלוונטיות במיוחד עבור מחקר מעורבים דגים עקב מספר מוגבל של נוגדנים זמינים מסחרית כי הם מאומתים לשימוש ב-דג זברה. למעשה, מחקר של ארבע חברות גדולות הראו כי נוגדנים זמינים מסחרית לשימוש בעכבר היה על 112,000 לעומת כ 5,300 לשימוש ב-דג זברה15. בסופו של דבר, בחרנו לפתח פרוטוקול שניתן לבצע על הקפאה אחת, שהיא חיונית כשעובדים עם דגימות רקמות קטנות או מוגבלות כגון המתקבלים מעוברי הדגים.
פרוטוקול זה תוכנן כדי להעריך את ההתנהגות ההתרבות של תאי התורם ב 48 h אחרי הפריה שלאחר ההפריה העוברי דגים שנוצרו על ידי השתלת blastula-to-blastula כפי שמתואר על ידי Carmany ראמאלפי ו Moens16. עוברי תורם הוזרק על הבמה תא אחד עם המשלים תוספי בתווית לפני השתלת תאים תורמים לעוברי הנמען. השתמשנו באימונוכימיה עבור Ser 10 זרחניים histone H3 (pH3) כדי לזהות תאים מתרבים ואחריו אימונוהיסטוכימיה על התווית תוספי לזהות תאים תורמים בצ העוברים עוברי דגים. זיהוי סדרתי של pH3 ו תוספי בתווית בתוך מדור הקפאה אחד איפשר לנו לזהות ולכמת תאים בודדים הביעו שני סמנים.
פרוטוקול IF/ihc זה רציף עבור דג ההקפאה יספק כלי שימושי עבור חוקרים דג זברה המבקשים פרוטוקול לוקליזציה עבור ביטוי חלבון. הבעיות שפרוטוקול זה נועד לטפל בהן, כגון דגימות של רקמה קטנה וזמינות מוגבלת של נוגדנים, אינן ייחודיות לדגם דג זברה. לפיכך, ייתכן ששיטה זו תהיה שימוש עבור כל חוקר שרוצה לבצע את הפעולות הרציפות IF/IHC.
הצהרת אתיקה:
כל מחקרים בעלי חיים אושרו על ידי הוועדה טיפול בעלי חיים מוסדיים והשתמש, צפון קרוליינה סטייט, ראלי, צפון קרוליינה, ארצות הברית.
Protocol
1. הכנה לעובר
- תקן 48 h לאחר הפריה (hpf) כצ העוברים עוברי דגים שנוצרו על ידי השתלת blastula-to-blastula בין AB בר-סוג של העוברים בתוך 4% פאראפורמלדהיד (בהרוק) לילה עם נדנדה ב 4 ° c. לבצע שני 5 דקות שוטף עם נדנדה בטמפרטורת החדר באמצעות 500 μL של מלוחים 1x פוספט מחסן המכיל 0.1% של חומר מתכלה לא יונית (1x PBSt; לראות את הטבלה של חומרים)
הערה: פאראפורמלדהיד הוא רעיל ומסרטן, וחייב להיות מסולק כראוי מתקנות מוסדיים. יש לבצע עבודה עם פאראפורמלדהיד במכסה כימי, ולהשתמש בציוד הגנה אישי מתאים (כפפות, חלוק מעבדה ומשקפי בטיחות). - עוברים מייבשים על ידי שטיפת ברצף עם 500 μL של 30%, 50%, ו 70% מתנול (MeOH) מדולל עם 1x PBSt עבור 10 דקות כל אחד בטמפרטורת החדר עם נדנדה. העוברים דגירה ב 500 μL של 100% MeOH ב-20 ° c עבור לפחות 14 h.
הערה: מתנול הוא רעיל צריך להיות מסולק כראוי על פי תקנות מוסדיים. יש לבצע את העבודה עם מתנול במכסה כימי, ולהשתמש בציוד הגנה אישי מתאים (כפפות, חלוק מעבדה ומשקפי בטיחות). - מייבשים עוברים מחדש על ידי שטיפת ברצף עם 500 μL של 70%, 50%, ו 30% MeOH מדולל עם 1x PBSt עבור 10 דקות כל אחד בטמפרטורת החדר עם נדנדה. בצע שני 5 דקות שוטף עם 500 μL של 1x PBSt בטמפרטורת החדר עם נדנדה.
- הסר את ה-1x PBSt ו-דגירה ב 500 μL של 30% סוכרוז מדולל במים מאוהים בטמפרטורת החדר עם הנדנדה עד העוברים כיור לתחתית הצינור (כ 1 h). החלפת סוכרוז עם 500 μL של 15% דג ג'לטין/25% סוכות (15/25; לראות את הטבלה של חומרים) ו דגירה בטמפרטורת החדר עם נדנדה בלילה.
- החלף כמחצית מכמות הנפח של 15/25 עם הטמפרטורה האופטימלית בינונית (OCT) והדגירה בטמפרטורת החדר עם הנדנדה עד שהעוברים מטביעים את תחתית הצינור (כ 1 h).
- החלף כמחצית של עוצמת הקול עם מדיום OCT ו-דגירה בטמפרטורת החדר עם נדנדה עבור 1 h.. חזור על שלב זה פעם אחת
- במהלך שלבי דגירה עם 15/25 ו-OCT בינוני, להפוך או קפיצי את הצינור לפי הצורך כדי לשלב אלה ריאגנטים.
2. הטמעת העובר והכנת הקריודורים
- להעביר עוברים לתבנית פלסטיק (לראות את הטבלה של חומרים) עם מלקחיים, למזער כל העברה של התערובת 15/25-OCT. למלא את העובש בערך חצי מלא עם מדיום OCT בעדינות לערבב את העוברים במדיום OCT.
- הכנת בתבניות פלסטיק התווית והעברת העוברים הרצויים (בדרך כלל 1 \ u20123 עוברים) לתוך הריק, בתבניות פלסטיק מתויג, מזעור לשאת את מדיום OCT. לאחר העוברים הרצויים הם בתבנית פלסטיק, מילוי בעדינות עם מדיום OCT לחלק העליון של העובש.
- השתמש מלקחיים או 25 גרם מחטים כדי לארגן עוברים לכיוון הרצוי, באמצעות אור stereomicroscope להדמיה (איור 1A, B).
- הקפא את התבניות המוכנות על קרח יבש במיכל מבודד עם פלטפורמת מתכת. מניחים דלי קרח או מצנן קצף בעדינות מעל פלטפורמת המתכת כדי ליצור תא קר (איור 1C, D)
-
הכן 10 \ u201212 יקרומטר בהקפאה עבה באמצעות מערכת קריוסטט ב-20 ° c.
- הגדר בלוק אחד בכל פעם והשתמש במדיום OCT כדי להקפיא את הבלוק על הדיסק/צ'אק עם תחתית הבלוק הפונה לכיוון הלהב (איור 2 א). ודא שהבלוק מוקפא לחלוטין לדיסק (המדיום של OCT יהפוך לבן) לפני התחלת החסימה (איור 2B).
- מניחים את ההקפאה על שקופיות הזכוכית הטעונות (איור 2C, D) ומייבשים את השקופיות ללילה בטמפרטורת החדר.
3. אימונולווקורנציה עבור pH3
- בצע שלוש שטיפות של 5 דקות מהשקופיות ב-1x PBS במיכל המתאים, כגון צנצנת Coplin. אם הרקמות אינן מדבקה היטב לשקופית, בצע שוטף על-ידי הנחת שקופיות על משטח שטוח ובעדינות ליטוף 500 μL של 1x PBS על פני השטח. שופכים את 1x PBS בין שוטף על ידי מפנה בעדינות את השקופיות.
- התווה את המקטעים עם עט מחסום או עיפרון שעווה כדי לשמור על הנוזלים בשקופיות (איור 3).
- הנח את השקופיות על משטח שטוח בתא לח ופיפטה 200 μL של מאגר בלוקים למקטע על השקופיות. מודטה במאגר בלוק עבור 2 h בטמפרטורת החדר או לילה ב -4 ° c.
- להכין את דילול הנוגדן העיקרי (הארנב anti-pH3 הנוגדן, 1:200; ראה טבלה של חומרים) במאגר לחסום ולערבב היטב על ידי ליטוף. הקצה בעדינות את השקופיות כדי לנקז את מאגר החסימות, לחזור לחדר הלח והפיפטה 200 μL של פתרון הנוגדן העיקרי לכל מקטע אל השקופיות. עבור שליטה משנית בלבד, פיפטה 200 μL של בלוק מאגר על הסעיפים המתאימים.
- הסרת השקופיות ב -4 ° c לילה בחדר לח מלא במים מפוחים. סגרו את קצות התא הלח כדי לסייע בשמירה על הלחות.
- בצע שלוש שטיפות של 5 דקות מהשקופיות ב-1x PBS במיכל המתאים, כגון צנצנת Coplin. במהלך שטיפת הצעדים, להכין את דילול הנוגדן המשני (אנטי הארנב פלורסנט משנית המשלים, 1:2000; ראה טבלה של חומרים) בבלוק לחסום ומערבבים היטב על ידי ליטוף.
- הנח את השקופיות על משטח שטוח בתא לח ופיפטה 200 μL של פתרון נוגדן משני לכל מקטע אל השקופיות. מודיית את השקופיות בפתרון נוגדן משני בטמפרטורת החדר, מוגן מפני אור, עבור 30 דקות.
- בצע שלוש שטיפות של 5 דקות של השקופיות ב-1x PBS במיכל המתאים, כגון צנצנת Coplin, מוגן מפני אור. במהלך השטיפה, הכינו פתרון לצביעת הגרעין (ראו את טבלת החומרים).
- מניחים את השקופיות על משטח שטוח ופיפטה 200 \ u2012500 μL (בהתאם לגודל המדגם) של פתרון הצביעת הגרעיני על כל מקטע. מודיית את השקופיות בתמיסה מכתים גרעינית עבור 10 דקות, מוגן מפני אור.
- לנקז את הפתרון מכתים גרעינית ולטעון את השקופיות עם מדיה לא הקשחת פלורסנט הרכבה ושמיכות זכוכית. שמרו על השקופיות בחשכה ב-4 ° צ' עד לביצוע ההדמיה.
הערה: התוצאות הטובות ביותר יתקבלו כאשר השקופיות מתמונות באותו יום או ביום שלמחרת. - בעקבות IF, להמחיש ולדמות את השקופיות עם מיקרוסקופ מיקוד ומצלמה דיגיטלית באמצעות 555 ננומטר (אדום) ו 645 ננומטר (האדום הרחוק) מסנני פליטה 100x (הגדלה עינית 10x ו 10x ההגדלה היעד). שמור על עוצמת הלייזר עקבית במהלך ההדמיה.
- לאחר הדמיה, למקם את השקופיות במכולות בודדות של 1x PBS ולאחסן שטוח 4 ° c ללילה כדי להתכונן להסרת שמיכות. כשממקמים את השקופיות ב-1x PBS, בעדינות משקופיות את השקופיות כדי לסייע בהסרת הכיסויים.
הערה: אל תלחץ על שמיכות או לנסות להסיר את שמיכות באופן ידני, כמו זה יכול להתפשר על איכות של סעיפים. יש להסיר את הכיסויים אופקית עם תנועה נכפית מינימלית.
4. אימונוהיסטוכימיה על תווית דקטרן
- לאחר הסרת הכיסויים, העבר בעדינות את השקופיות לתוך ה-PBS 1x החדש במיכל המתאים, כגון צנצנת Coplin. להסיר את ה-1x PBS ולבצע שלושה 5 דקות incubations של השקופיות ב-1x טריס מלוחים באגירה עם 0.1% של סטנט לא יוני (1x TBSt) בטמפרטורת החדר.
- הכן 250 mL של 3% חמצן מימן (H2O2) מדולל במים מוכי המהול במיכל בגודל הראוי. מודיית את השקופיות ב 3% H 2O 2 פתרון בטמפרטורת החדר עבור 15 דקות.
הערה: מי חמצן מימן הוא מאכל וחייב להיות מסולק כראוי על פי תקנות מוסדיים. יש להשתמש תמיד בציוד הגנה אישי מתאים (כפפות, מעיל מעבדה ומשקפי בטיחות). - שטוף במהירות את השקופיות עם מים מפוהים. לבצע שלושה 5 דקות שוטף של השקופיות ב-1x TBSt. בזהירות לייבש את האזור סביב משטחי הרקמה ולהניח את השקופיות שטוח בתא לח. מתווה את חתכי הרקמה בעט מחסום או עיפרון שעווה כדי לשמור על הנוזלים בסעיפים במידת הצורך.
- החל מוכנים לשימוש 2.5% סרום החסימה שסופקו עם ערכת הנוגדן משני תיוג (לראות את הטבלה של חומרים) dropwise לכל מקטע. מודאת השקופיות בתא לח בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות.
- להכין את הנוגדן העיקרי מדולל בנוגדן מדלל (ארנב אנטי מתויג dextran, 1:7500; לראות את הטבלה של חומרים) ולערבב על ידי ליטוף עדין. עצה עדינה של השקופיות כדי לנקז את מאגר החסימות, לייבש את האזור סביב המקטעים ולמקם את השקופיות בחדר לח.
- אין לשטוף לפני החלת הפתרון העיקרי נוגדן. פיפטה 200 μL של פתרון הנוגדן העיקרי לכל מקטע אל השקופיות ומודקות בתא לח ב -4 ° c בלילה. עבור שליטה משנית בלבד, פיפטה 200 μL של נוגדנים מדלל על הסעיפים המתאימים.
- עצה בעדינות את השקופיות כדי לנקז את פתרון הנוגדן העיקרי ולמקם ב-1x TBSt במיכל המתאים, כגון צנצנת Coplin. בצע שתי שטיפות של 5 דקות של השקופיות ב-1x TBSt. ייבוש האזור סביב המקטעים והמקום שטוח בחדר לח.
- החל מגיב מוכן לשימוש להפחתת הרקע לחסימה (עיין בטבלת החומרים) הנפתחת לכל מקטע. מודאת השקופיות בתא לח בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות.
- עצה עדינה של השקופיות כדי לנקז את מאגר החסימות, לייבש בזהירות את האזור מסביב למקטעים, ולמקם את השקופיות בחדר לח. אין לשטוף לפני החלת הפתרון נוגדן משני.
- החל מוכן לשימוש בפתרון נוגדן משני (האנטי ארנבת peroxidase (HRP) נוגדן משני פולימר; לראות את הטבלה של חומרים) על כל מקטע dropwise ו-דגירה בתא לח בטמפרטורת החדר עבור 30 דקות.
- עצה בעדינות את השקופיות כדי לנקז את פתרון הנוגדן המשני ולמקם ב-1x TBSt במיכל המתאים, כגון צנצנת Coplin. בצע שתי שטיפות של 5 דקות מהשקופיות ב-1x TBSt.
- הכינו את המצע המכרומוגני HRP מיד לפני השימוש בהתאם לפרוטוקול היצרן (עיין בטבלת החומרים).
- נגב את האזור סביב המקטעים, הצב את השקופיות על משטח שטוח, והחל 200 μL של המצע הרומוגניים של HRP לכל מקטע. דגירה בטמפרטורת החדר עבור 3 דקות, הפעלת טיימר כאשר המצע הוחל על השקופית הראשונה (איור 4).
- לנקז את פתרון המצע ולשטוף את השקופיות בקצרה בצנצנת Coplin המכילה 1x PBS. הניחו את השקפים במים מפוהים במיכל מתאים, כגון צנצנת קופלין, ובצעו שני 5 דקות של שטיפת מים מלוחים בעצבנות עדינה.
- מנגד את השקופיות על ידי הצבת אותם במטאוקסילין מכתים את הפתרון של עד 30 s.
הערה: המטאוקסילין רעיל וחייב להיות. מסולק מתקנות מוסדיים יש להשתמש תמיד בציוד הגנה אישי מתאים (כפפות, מעיל מעבדה ומשקפי בטיחות). - מניחים את השקופיות במים מפוהים במיכל מתאים, כגון צנצנת קופלין, ומבצעות שלוש שטיפות של 5 דקות במים מלוחים. העבר את השקופיות למיכל המכיל את מי הברז של סקוט (ראה את הטבלה של חומרים) ו הדגירה עבור 1 דקות.
- מניחים את השקופיות במים מפוהים במיכל מתאים, כגון צנצנת קופלין, ומבצעות שלוש שטיפות של 5 דקות במים מלוחים.
- מייבשים את השקופיות באמצעות סדרת כיתות אתנול (אטואה) (מדולל במים מפוהים) וקסילן במכסה כימי. בצעו אחת 2 דקות דגירה ב 70% אטוח, שני 1 דקות incubations ב 95% אטוח, שני 1 דקות incubations ב 100% אטוח, ו 3 1 דקות incubations בתוך קסילן. הסר את השקופיות מ-קסילן והמקום שמיכות בזמן רטוב עם מדיום הרכבה toluene מבוסס במכסה כימי.
הערה: קסילן וטולואן רעילים ודליקים וחייבים להיפטר כיאות מתקנות מוסדית. יש לבצע את העבודה עם קסילן וטולואן במכסה כימי, ולהשתמש בציוד הגנה אישי מתאים (כפפות, מעיל מעבדה ומשקפי בטיחות). - בעקבות IHC, המחש והתמונה את השקופיות עם מיקרוסקופ אור מורכב ומצלמה דיגיטלית בהגדלה של 100x (הגדלה בעינית 10x והגדלה אובייקטיבית של 10 x). (איור 5).
Representative Results
פיתחנו את הפרוטוקול כדי לזהות ולנתח חלבון ביטוי בתאי תורמים בודדים 48 h לאחר הפריה כימראריק דג זברה העוברים שנוצרו על ידי השתלת blastula-to-blastula בין מסוג AB פראי בצורת דג זברה. ניתוח מוצלח של ביטוי חלבון ברמה תא אחד נדרש הכנה של קריודורים עם עוברים מונחה כראוי (איור 1 ואיור 2) וזהיר, יישום רציף של שיטות IF ו-ihc אלה הקפאה מקטעים (איור 3 ואיור 4). שימוש בנוגדנים ספציפיים כדי לזהות בו תאים מתרבים (anti-pH3, איור 5A, B) ותאים תורמים (האנטי מתויג Dextran, איור 5a) ניתן להשתמש כדי לזהות ולכמת תאים תורמים כי הם באופן פעיל מתרבים ( איור 5E). חיוני ליצור תמונות באיכות גבוהה לאחר הן IF (איור 2A, B) ו-Ihc (איור 2a) כדי לזהות במדויק תאים בודדים. יש להשתמש בתוכנית ניתוח תמונה כדי לבצע כיסוי תמונה (איור 5E). בהתאם לתוכנית ניתוח התמונה בשימוש, ייתכן שניתן יהיה לבצע ספירות אוטומטיות של תאים המסומנים בתווית צריך להיות הצורך בקוונפיקציה.
איור 1: הכנת גושי OCT קפואים. (A) 50x תצוגה מיקרוסקופית של עוברים ב OCT בתבנית קריוגניים מוכן להקפאה. החץ האדום מצביע על ראש של מיקום העובר של דג של דג זברה נגד המשטח התחתון של העובש; חץ שחור מציין את הזנב מצביע לעבר המשתמש. (ב) תבניות פלסטיק עם עוברים ו-OCT הונחו על פלטפורמת מתכת מקורר. (ג) קצף קרח דלי הניח על צורות פלסטיק כדי ליצור תא קפוא. (ד) OCT הופך לבן משקוף לאחר שהבלוק קפוא לחלוטין. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: קריוסקר של גושי OCT קפואים. (א), יישום של OCT טרי על דיסק קריוסטט ומיקום של בלוק קפוא על אוקטובר, סובב 180 ° מכיוון ההקפאה של הבלוק. (ב) השקפה צדדית של הבלוק מוקפא כדי לחסום את הדיסק. (ג) מבט לחסום את החסימה עם צלחת הגליל בעמדה. (ד) איסוף סעיפים באמצעות שקופית טעונה מפלטפורמת המתכת של הקריוסטט. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: תצוגה של מקטעים מוכנים לאחר מיקום בשקופית. החץ מצביע על מחסום הידרופובי, וקו מנוקד מסמן את האזור המכיל סעיפים בתוך המתחם המכשול. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: הכנה ליישום המצע כרומוגניים במהלך IHC. השקופית מונחת על משטח שטוח המכוסה בניילון, כדי לאפשר יישום אחיד של המצע כרומוגניים, תוך שהיא מכילה כל התעלה של חומר מסוכן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: נציג IF ו-IHC התיוג של הקריוסינות 48 hpf כצ העוברים עוברי דגים שנוצרו על ידי השתלת blastula-to-blastula בין AB מסוג פראי בצורת העוברי דג. (א) אם לזהות Ser 10 זרחניים Histone H3 (אנטי pH3, 1:200) ביטוי 48 hpf העובר דג. אדום = pH3 תאים חיוביים; כחול = גרעינים. חיצים צהובים מציינים דוגמאות של תאים חיוביים. (ב) חיסור של הכתם הגרעיני הכחול בתמונה הדיגיטלית (התוכנה imagej) מגביר ויזואליזציה של תאים pH3-חיוביים לכימות וכיסוי תמונה. (ג) שליטה שלילית (נוגדן משני בלבד) עבור שיטת IF בהקפאה 48 hpf כלאריק דג זברה העובר. סרגל קנה מידה מייצג 50 יקרומטר (ישים לכל החלוניות). (ד) ihc כדי לזהות תוספי מתויג (האנטי מתויג תוספי, 1:7500) בצ 48 hpf דג זברה העובר שנוצר על ידי השתלת blastula-to-blastula בין מסוג AB פראי-בצורת דג זברה. עוברי תורם הוזרק עם המשלים תוספי בתווית בשלב אחד לפני השימוש עבור השתלת blastula-to-blastula. אדום מציין את התאים המסומנים באמצעות המשלים של תוספי; כחול מציין גרעינים. חיצים צהובים מציינים דוגמאות של תאים חיוביים. (E) כיסוי של לוח B (IF עבור pH3) ו-לוח C (ihc לתווית תוספי) המראה לוקליזציה של pH3 ביטוי ותיוג תוספי בתאים בודדים. חיצים צהובים מציינים דוגמאות של תאים כפולים חיוביים. (ו) שליטה שלילית (נוגדן משני בלבד) עבור שיטת ihc בהקפאה 48 hpf כימראריק דג זברה העובר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Discussion
הצגנו שיטה הרומן לשילוב immunofluorescence ואימונוהיסטוכימיה המייצגת צעד חשוב קדימה בביצוע ניסויים בלוקליזציה של העברת דגים בהקפאה. יש חוסר קריטי של פרוטוקולים קיימים לוקליזציה האופטימיזציה לשימוש עם עוברים קטנים וחומרים קריוסמנות17,18, שניהם בשימוש נפוץ במחקרים מולקולריים14. פרוטוקולי לוקליזציה קיימים מתמקדים בעיקר בהדמיה בו של שני fluorophores17,18. בעוד פרוטוקולים אלה יכולים לפעול היטב, התועלת שלהם מוגבלת על ידי זמינות של נוגדנים כי (אני) ניתן להשתמש ב-דג זברה ו (ii) תואמים IF.
אנו חשים כי שימוש בהקפאה עבור עוברי דגים מספק יתרון משמעותי במונחים של מורפולוגיה רקמות שנשמרו. כמו ihc הוא נפוץ יותר בשימוש על סעיפים פרפין מאשר קריוסעיפים7,8, חקירה נוספת של שיטות ihc מבוססות של קריוסעיף לאיתור של ביטוי חלבון מוצדקת. השימוש בהר כולו אם הוא שיטה נפוצה להמחיש רמות הביטוי בעוברי הדגים דג זברה, והוא מתואר באופן נפוץ יותר בספרות מאשר אם באמצעות קריוסעיפים1,2,3,4, . בן 19 עם זאת, לפרוטוקולי הטעינה השלמה יש מגבלות, כולל היעדר לוקליזציה מדויקת של חלבונים המתבטאת ברקמות עמוקות והפוטנציאל לביטוי ברמת המשטח לביטוי חלבון עלום ברקמות עמוקות יותר. בעקביות הבחנו תחזוקה מצוינת של מורפולוגיה תאית בעקבות הקפאה, הקפאת, ורציפים IF ו-IHC. עבור יישומים הדורשים לוקליזציה מדויקת של ביטוי החלבון ברמת התא הבודד, יש יתרון משמעותי בהליכים מבוססי המקטעים כפי שתיארנו בפרוטוקול זה. הטבעה שרף מספק אפשרות חלופית עבור ביצוע IF או ihc בחני בסעיפים משלב מוקדם של העוברים השלבים20. מקטעי שרף לספק שימור מעולה של מורפולוגיה רקמות לעומת קריודורים, ומקטעי רקמות דקים יחסית יכול להיות מוכן. עם זאת, היצרנים בדרך כלל לא ממליצים על השימוש בסעיפים שרף עבור מבוסס על מבוססי-אימונואומר, כמו מרכיבים מסוימים של שרפים לא ניתן להסיר מן הסעיפים ועשויים מסכה לאתר כריכת נוגדנים21.
בעוד הפרוטוקול כולו חיוני לניתוח מדויק ומוצלח של דפוסי הביטוי, כמה צעדים ספציפיים הם קריטיים להצלחה ניסויית. הצעד הקריטי הראשון הוא טיפול של עוברים במהלך הטבעה באוקטובר13,14. זה יכול להיות מאתגר לכוון כל העובר במישור הרוחבי אותו, כך סעיפים הם חותכים בערך באותו אזור עבור כל העוברים. מצאנו כי באמצעות מחטים מד קטן לבצע תנועות קטנות, מכוון דרך מדיום OCT צמיג עבור כיוון העובר הוא מעולה לשימוש מלקחיים, שהם גדולים מדי ולתפוס יותר מדי OCT בינונית. צעד קריטי שני מתרחש במהלך הירידה של בלוקים קפואים, כפי שהוא יכול להיות קשה להשיג מקטעים באיכות גבוהה המכילים את הרקמה הרצויה (ים) ללא הכשרה משמעותית וניסיון. לפיכך, אנו ממליצים על שימוש בדגימות מבחנים עד לשליטה בטכניקה. צעד קריטי שלישי הוא coverslip הסרת, אשר יש את הפוטנציאל להפריע או להסיר דגימות רקמה. מצאנו כי שילוב של עצבנות עדינה כדי לשחרר את שמיכות והסרה איטית של השקופית מן המכל PBS היא הגישה היעילה ביותר עבור הסרת coverslip. יד עדינה ויציבה היא הטובה ביותר; החוקרים עשויים לגלות כי כמה ניסוי וטעייה יש צורך ללמוד כיצד להסיר שמיכות ביעילות.
שלבים חשובים נוספים בפרוטוקול כוללים אופטימיזציה של נוגדן (נוגדנים ראשוניים ומשניים עבור IF ו-IHC assays) וחשיפה של שקופיות למצע כרומוגניים וכתמי נגד. מחקר מעמיק לגבי ספציפיות הנוגדן העיקרי ריכוז היעד הוא חיוני; בדרך כלל, עדיף לאסוף דגימות לא יקרות מספיק עבור לפחות שני ניסויים נפרדים עבור IF ו-IHC שיבוצעו כדי לייעל ריכוזי הנוגדן העיקרי לפני תחילת השילוב IF/IHC. כולל שליטה חיובית ושלילית ידועה עבור כל נוגדן ראשוני הוא חיוני בכל ניסוי כדי להבטיח כי הן IF ו-ihc בחני מופיעים כראוי. התאמות ריכוז נוגדן משני עשוי להיות גם הכרחי. אופטימיזציה של חשיפה של מקטעי רקמות למצע כרומוגניים וכתמים לצורך שיטת IHC נדרשת, מאחר שהנחיות היצרן מתארות לעתים קרובות מגוון רחב של זמני חשיפה אפשריים. לא כל כרומוגנס יכול להיות תואם כתמי נגד ופיגמנטציה רקמה אנדוגניים, המחייב תכנון קפדני לגבי בחירת כרומוגן.
קיימים שינויים פוטנציאליים רבים שניתן להחילם על הפרוטוקול המתואר, וביצעת בהצלחה פרוטוקול זה עם צירופים אחרים של נוגדנים שלא ניתן היה להשתמש בהם עבור IF. כאמור, לחומרים כרומוגניים יש תאימות ברורה לכתמי-נגד ספציפיים. גילינו כי מרכיבים אלה ניתן לשינוי בקלות בפרוטוקול. בנוסף, הפרמטרים של דגירה הנוגדן הם גמישים למדי, וניתן להגדיל או להקטין בהתאם לעוצמת הצביעה הרצויה. ניתן גם לשנות את תהליך ההטבעה. למרות שאנו מתמקדים במקטעים רוחבי, העוברים יכולים בקלות להיות מכוונים לכל כיוון כדי לטפל ברקמות מסוימות של עניין. לבסוף, קיימות מספר נקודות השהיה אפשריות בפרוטוקול זה. עוברים יבשים ניתן לאחסן 100% MeOH ב-20 ° c במשך כמה חודשים; בלוקים קפואים ניתן לאחסן ב-80 ° צ' עד שלושה חודשים; וניתן לאחסן שקופיות מוכנות ב-80 ° c עד תשעה חודשים בתיבת שקופיות.
בשל המורכבות היחסית של פרוטוקול IF/IHC המשולב, קיימים מקורות אפשריים מרובים של וריאציה או שגיאה העשויים לדרוש פתרון בעיות, החל מאיכות הרקמה ועד לניסיון החוקר לטיפול במדגם. רוב השלבים הקריטיים המתוארים לעיל נחשבים לקריטיים כיוון שהם דורשים אופטימיזציה ברמת המשתמש הבודדת או שהם דורשים מיומנות, מיומנות וניסיון מסוימים. עם זאת, גילינו כי מכתים רקע לא ספציפי ועוצמת אות נמוכה הם הנושאים המשמעותיים ביותר הדורשים אופטימיזציה. כמו בכל פרוטוקול IF או IHC, הטיפול בבעיות אלה עשוי לגזול זמן רב ולעבוד באופן אינטנסיבי, וניתן לשלבו עם שיטה זו מאחר ששתי הטכניקות משולבות. מסיבה זו, אנו ממליצים מאוד למטב את IF ו-IHC בנפרד לפני שממשיכים עם הפרוטוקול המשולב.
בעוד אנו מנבא כי שיטה זו תהיה שימושית עבור מגוון רחב של ניסויים, יש מגבלות פוטנציאליות. ביצוע מוצלח של הליך זה תלוי בשמירה על דגימות רקמה שלמות באמצעות שני ניסויים רציפים הכוללים מספר שטיפת שלבים. מסיבה זו, כל בעיה שתיווצר במהלך הטיפול בבעיות או ברקמה, לרבות שקופיות ישנות יותר שעלולות לרדת באיכות, תגביל באופן משמעותי את יכולתם של החוקרים לבצע בהצלחה פרוטוקול זה. למרות שניתן לאחסן שקופיות ב-80 ° צ' עד תשעה חודשים, הדבקות ברקמות מירידה במשך הזמן והייתה לנו את ההצלחה הטובה ביותר עם שקופיות המשמשות בתוך חודש של הכנה או באופן אידיאלי, למחרת. הגבלה שנייה היא טביעת הרגל הקטנה של עוברי הדגים. למרות שמצאנו את הניסוי הזה כדי להיות שימושי להמחיש חלבונים כי הם בשפע יחסית העוברים בשלב מוקדם, חלבונים כי הם ביטוי בלתי עקבי או ברמות נמוכות עלול להיות קשה מאוד ללכוד בסעיף. בסופו של דבר, מאז הפרוטוקול משתמש 10 \ u201212 יקרומטר שכדורים, הוא מתאים ביותר להערכה של ביטוי חלבון במבנים גדולים יותר, כגון גרעינים, במקום רכיבים תת-סלולריים קטנים יותר.
לסיכום, פרוטוקול IF/IHC המשולב שלנו יהיה יתרון עבור מגוון רחב של מחקרים בשלב מוקדם של עוברי דגים, והוא מייצג חדשנות חשובה בניתוח ביטוי חלבונים מדויקים בדגימות כאלה. השיטה שלנו, המוצגת בהצלחה באיור 5, תאפשר לחוקרים לשמר את המבנה העדין של עוברי בשלב מוקדם של העוברים בהקפאה בתוך העבודה עם מגוון מוגבל במקצת של נוגדנים העיקרי זמין כעת, כי הם אומת לשימוש ב-IF או IHC במין זה. פרוטוקול זה עשוי להיות שימושי עבור מחקרים של דגים אחרים ומינים אמפיחיים (למשל, מאקה ו xenopus spp.), אשר הוגבלו על ידי מגבלות דומות לזמינות הנוגדן, והיא עשויה להיות ישימה עבור דגמי יונקים מסורתיים כ ובכן.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
עבודה זו נתמכת על ידי NIH המענק 5K01OD021419-02 ו-NC סטייט המכללה לרפואה וטרינרית.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15/25 | N/A | N/A | 15% fish gelatin/25% sucrose w/v, made in dH2O |
| Alexa 555 secondary antibody | Invitrogen | A21429 | used at 1:2,000 dilution in block buffer for IF |
| Antibody Diluent | Dako | S3022 | |
| Background Buster | Innovex | NB306 | |
| block buffer (IF) | N/A | N/A | 5% normal goat serum, 0.1% Triton X-100 in 1x PBS |
| cellSens imaging software | Olympus | cellSens | imaging software used with compound light microscope |
| chimeric zebrafish embryos | N/A | N/A | AB wild-type chimera zebrafish embryos analyzed at 48 hpf |
| Compound light microscope | Olympus | BX51 | used with digital camera and cellSens imaging software for image capture after IHC |
| Confocal fluorescence microscope | Leica | DM 2500 | used with digital camera and Leica Application Suite Advanced Fluorescence imaging software for image capture after IF |
| Disposable plastic molds, 15 mm x 15 mm x 5 mm | Ted Pella | 27147-2 | |
| Digital camera, light microscope | Olympus | DP27 | |
| Digital camera, fluorescence microscope | Leica | TCS SPE | |
| Ethanol | Koptec | V1001 | |
| Fish gelatin | Sigma | G7041 | |
| Glass slides | Fisher | 12-550-15 | |
| Hydrogen peroxide, 30% | Fisher | H325-100 | |
| ImmPRESS HRP Polymer detection kit | Vector | MP-7401 | anti-rabbit secondary antibody, HRP polymer |
| Leica Application Suite Advanced Fluorescence imaging software | Leica | LAS AF 2.3.6 | imaging software used with confocal fluorescence microscope |
| Methanol | Fisher | A452-4 | |
| Modified Meyer's Hematoxylin | Thermo | 72804 | |
| Normal Goat Serum | MP Biomedical | 191356 | |
| OCT medium | Tissue-Tek/Fisher | 4583/4585 | |
| anti-Oregon Green antibody | Molecular Probes/Life Technologies | A889 | used at 1:7500 dilution for IHC |
| Oregon Green Dextran | Invitrogen | P7171 | used at 2.5% in 0.2 M KCl |
| Paraformaldehyde, 4% | Acros Organics | 416780030 | made in lab in 1x PBS |
| Permount | Fisher | SP15 | |
| 1x phosphate-buffered saline | made in lab | N/A | 50 mL 10x PBS, up to 500 mL volume with dH2O |
| 10x phoshpate-buffered saline | made in lab | N/A | use Cold Spring Harbor protocol |
| 1x PBSt | made in lab | N/A | 50 mL 10x PBS, 1 mL 10% Tween 20, up to 500 mL volume with dH2O |
| anti-Ser10 phosphorylated Histone H3 antibody | Santa Cruz | sc-8656-R | used at 1:500 dilution for IF |
| Scott's Tap Water | Electron Microscopy Sciences | 26070-06 | have used other brands successfully in addition to EMS |
| Sucrose | Amresco | 335 | |
| Tween-20 | Fisher | BP337 | |
| TO-PRO3 | Invitrogen | T3605 | used at 1:1,000 in 1x PBS for IF |
| 1x Tris-buffered saline | made in lab | N/A | 50 mL 10x TBS, up to 500 mL volume with dH2O |
| 10x Tris-buffered saline | made in lab | N/A | 85 g NaCl, 61 g Tris base, up to 1 L volume with dH2O |
| 1x TBSt | made in lab | N/A | 50 mL 10x TBS, 1 mL 10% Tween 20, up to 500 mL volume with dH2O |
| Triton X-100 | Acros Organics | 327371000 | |
| Vectashield | Vector | H-1000 | non-hardening mounting media |
| Vector NovaRed substrate | Vector | SK-4800 | HRP substrate |
| Xylene | Fisher | X3P-1GAL |
References
- Whole-mount IHC protocol for zebrafish embryos [Internet]. GeneTex. , Irvine. Available from: http://www.genetex.com/uploaddata/Protocol/Document/IHC-WM.pdf (2013).
- Inoue, D., Wittbrodt, J. One for all--a highly efficient and versatile method for fluorescent immunostaining in fish embryos. PLoS One. 6 (5), (2011).
- Kogata, N., Howard, B. A. A whole-mount immunofluorescence protocol for three-dimensional imaging of the embryonic mammary primordium. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 18 (2), 227-231 (2013).
- Santos, D., Monteiro, S., Luzio, A. General Whole-Mount Immunohistochemistry of Zebrafish (Danio rerio) Embryos and Larvae Protocol. Methods in Molecular Biology. 1797, 365-371 (2018).
- Shive, H. R., West, R. R., Embree, L. J., Sexton, J. M., Hickstein, D. D. Expression of KRASG12V in Zebrafish Gills Induces Hyperplasia and CXCL8-Associated Inflammation. Zebrafish. 12 (3), 221-229 (2015).
- Karlsson, J., von Hofsten, J., Olsson, P. E. Generating transparent zebrafish: a refined method to improve detection of gene expression during embryonic development. Marine Biotechnology (NY). 3 (6), 522-527 (2001).
- Macdonald, R. Zebrafish Immunohistochemistry. Molecular Methods in Developmental Biology. Guille, M. , 127th ed, Humana Press. New York. 77-88 (1999).
- Santos, C., Pinto, M. L. Immunohistochemical Assessment as a Tool for Investigating Developmental Toxicity in Zebrafish (Danio rerio). Methods in Molecular Biology. 1797, 461-476 (2018).
- Shive, H. R., West, R. R., Embree, L. J., Azuma, M., Sood, R., Liu, P., et al. brca2 in zebrafish ovarian development, spermatogenesis, and tumorigenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (45), 19350-19355 (2010).
- Shive, H. R., West, R. R., Embree, L. J., Golden, C. D., Hickstein, D. D. BRCA2 and TP53 collaborate in tumorigenesis in zebrafish. PLoS One. 9 (1), (2014).
- van der Loos, C. M. Multiple Immunoenzyme Staining: Methods and Visualizations for the Observation With Spectral Imaging. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (4), 313-328 (2008).
- van der Loos, C. M. Immunoenzyme Multiple Staining Methods. , Bios Scientific Publishers. New York. (1999).
- OCT Embedding For Cryostat Sectioning Of Embryos or Larvae [Internet]. The Zebrafish Book, 5th edition. , University of Oregon Press. Available from: https://wiki.zfin.org/display/prot/OCT+Embedding+For+Cryostat+Sectioning+Of+Embryos+Or+Larvae (2007).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Preparation of Cells and Tissues for Fluorescence Microscopy. Basic Methods in Microscopy. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. Spector and Goldman, editors (2006).
- Torres, E. The Lack of Commercial Antibodies for Model Organisms (and How You Can Deal with It) [Internet]. BenchSci Blog. , Available from: https://blog.benchsci.com/the-lack-of-commercial-antibodies-for-model-organisms-and-how-you-can-deal-with-it (2018).
- Carmany-Rampey, A., Moens, C. B.
- Da’as, S. I., Balci, T. B., Berman, J. N. Mast cell development and function in the zebrafish. Methods in Molecular Biology. 1220, 29-57 (2015).
- Quan, F. B., et al. Comparative distribution and in vitro activities of the urotensin II-related peptides URP1 and URP2 in zebrafish: evidence for their colocalization in spinal cerebrospinal fluid-contacting neurons. PLoS One. 10 (3), (2015).
- Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 4th ed, University of Oregon Press. Eugene. (2000).
- Sullivan-Brown, J., Bisher, M. E., Burdine, R. D. Embedding, serial sectioning and staining of zebrafish embryos using JB-4 resin. Nature Protocols. 6 (1), 46-55 (2011).
- JB-4 Embedding Kit. [Internet]. Polysciences, Inc. , Available from: http://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/histology-microscopy/plastic-embedding-media-kits/jb-4-sup-r-sup-embedding-kits-reagents/jb-4supsup-embedding-kit/ (2018).
