Summary
Detta protokoll visar sekventiell immunofluorescens och immunohistokemi på kryosektioner från sebrafiskembryon från tidigt stadium, vilket möjliggör exakta samlokalisering analyser i specifika cellpopulationer.
Abstract
Undersökning av intercellulära interaktioner kräver ofta diskret märkning av specifika cellpopulationer och exakt protein lokalisering. Zebrafiskar embryo är ett utmärkt verktyg för att undersöka sådana interaktioner med en in vivo-modell. Helmonterade immunohistokemiska och immunofluorescensanalyser används ofta i Zebrafiskembryon för att bedöma proteinuttryck. Emellertid, det kan vara svårt att uppnå exakt kartläggning av co-lokaliserade proteiner i tredimensionellt utrymme. Dessutom kan vissa studier kräva användning av två antikroppar som inte är förenliga med samma teknik (t. ex. är antikropp 1 endast lämpad för immunohistokemi och antikropp 2 är endast lämplig för immunofluorescens). Syftet med den metod som beskrivs häri är att utföra sekventiell immunofluorescens och/eller immunohistokemi på enskilda kryosektioner som härrör från embryon från zebrafiskar i början av stadiet. Här beskriver vi användningen av sekventiella rundor av immunofluorescens, Imaging, immunohistokemi, avbildning för en enda kryosektion för att uppnå exakt identifiering av proteinuttryck på encellig nivå. Denna metod är lämplig för alla studier i tidig Stadium zebrafiskar embryon som kräver korrekt identifiering av flera protein mål i enskilda celler.
Introduction
Zebrafiskar är en extremt robust modellorganism som för närvarande används inom en mängd olika discipliner inom biomedicinsk forskning. I synnerhet, den snabba externa utvecklingen och translucens av zebrafiskar embryon ger ett utmärkt verktyg för in vivo studier. Häri beskriver vi en metod för sekventiell immunofluorescensanalys (IF) och immunohistokemiska (IHC) analyser av kryosektionerade Zebrafiskembryon. Denna roman förfarande använder sekventiell tillämpning av två antikroppar på en enda bild, vilket möjliggör korrekt identifiering av colokaliserade proteiner på cellnivå samtidigt bevara vävnad sektioner. Detta protokoll är särskilt användbart för studier med zebrafiskar-modellen, eftersom ett relativt litet antal antikroppar har validerats för användning i IF-och/eller IHC-tillämpningar i zebrafiskar jämfört med musmodeller.
Observation av intercellulära interaktioner är en viktig del i många studier, och kan ge viktiga insikter i molekylära mekanismer som fungerar på cellnivå som ligger bakom fenotyper på den organismers nivå. Dessutom kan proteinuttryck ge information om cellulär funktion, särskilt när man undersöker uttryck av flera proteiner samtidigt i cellen (samlokalisering). Även om hela Mount IHC och om används ofta tekniker för att analysera proteinuttryck i zebrafiskar embryon1,2,3,4,5, hela monteringsprocedurer kan problem för att uppnå exakta colocalization data. Enligt vår erfarenhet, det kan vara svårt att skilja mellan lager av vävnad och visualisera proteinuttryck på Single-cellnivå i hel-Mount prover. Bildhanteringsprogram kan i allmänhet inte skilja mellan ytfärgning och djupare färgning. Proteinuttryck som inte är ytnivå kan skymmas av tydligare uttryck på ytnivå, vilket leder till felaktigheter i kvantifieringen. Dessutom är de flesta traditionella zebrafiskar clearing metoder ganska giftiga6 och därmed mindre önskvärt för användning.
Antikroppsbaserad teknik, såsom IF och IHC, används ofta för att detektera proteinuttryck i sektionerat material, vilket förenklar identifieringen av diskreta cellpopulationer som uttrycker ett visst protein i komplexa vävnader. IHC används ofta för samlokalisering, oftast genom att använda två olika antikroppar konjugerade i olika värdarter och visualiseras med olika färgade kromogener4,7,8,9 , 10. men med hjälp av flera kromogener kan leda till ospecifik bakgrunds färgning eller inkompatibilitet av färger11,12.
Vi utvecklade ett nytt protokoll för detektion av flera proteiner genom sekventiell IF och IHC på kryosektionerade tidigt sebrafiskembryon. Kryosektionering är särskilt väl lämpad för känsliga vävnader såsom zebrafiskar embryon, och kryosektioner är överlägsna paraffin-inbäddade sektioner för fluorescens-baserade analyser13,14. Vi valde att optimera kombinerade om och IHC snarare än Dual-Color IF eller IHC, att kringgå problemet med antikropp inkompatibilitet för en enda assay typ. Dessa problem är särskilt relevanta för forskning som involverar zebrafisk på grund av det begränsade antalet kommersiellt tillgängliga antikroppar som validerats för användning i zebrafiskar. I själva verket visade en studie av fyra stora företag att kommersiellt tillgängliga antikroppar för användning i mus var ca 112 000 jämfört med ca 5 300 för användning i zebrafiskar15. Slutligen valde vi att utveckla ett protokoll som skulle kunna utföras på en enda kryosektion, vilket är viktigt när man arbetar med små eller begränsade vävnadsprover som erhålls från zebrafiskar embryon.
Detta protokoll har utformats för att bedöma det proliferativa beteendet hos givar celler i 48 h postfertilisering chimär zebrafiskar embryon som genererades av blastula-till-blastula transplantation som beskrivs av carmany-rampey och Moens16. Donatorembryon injicerades vid encells-stadiet med ett fluorescensmärkt dextran-konjugat före transplantation av givar celler till mottagar embryon. Vi använde immunofluorescens för ser 10 fosforylerad histone H3 (pH3) för att detektera prolifererande celler följt av immunohistokemi för den märkta dextran för att upptäcka donator celler i chimär zebrafiskar embryon. Sekventiell detektering av pH3 och den märkta dextran inom en enda kryosektion möjligt för oss att identifiera och kvantifiera enskilda celler som uttryckte båda markörer.
Detta sekventiella IF/IHC protokoll för kryosektionerade zebrafisk kommer att ge ett användbart verktyg för zebrafiskar forskare som önskar en colocalization protokoll för proteinuttryck. De problem som detta protokoll utformades för att ta itu med, såsom små vävnadsprov och begränsad tillgång till antikroppar, är inte unika för zebrafiskar-modellen. Denna metod kan därför vara till nytta för alla forskare som önskar utföra sekventiell IF/IHC.
ETIK UTTALANDE:
Alla djurstudier godkändes av den institutionella djuromsorg och användning kommittén, North Carolina State University, Raleigh, North Carolina, USA.
Protocol
1. embryonal beredning
- Fix 48 h postfertilisering (HPF) chimär zebrafiskar embryon som genererats av blastula-till-blastula transplantation mellan AB vildtyp zebrafiskar embryon i 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) över natten med gungning vid 4 ° c. Utför två 5 min tvättar med gunga vid rumstemperatur med 500 μL 1x fosfatbuffrad saltlösning som innehåller 0,1% av en nonjontensid (1x PBSt; se material tabellen)
Anmärkning: PARAFORMALDEHYD är giftigt och cancerframkallande och måste kasseras på lämpligt sätt per institutionell föreskrift. Arbete med PARAFORMALDEHYD bör utföras i en kemisk huva, och lämplig personlig skyddsutrustning (handskar, labbrock och skyddsglasögon) ska alltid användas. - Dehydrera embryon genom att tvätta sekventiellt med 500 μL 30%, 50%, och 70% metanol (MeOH) utspädd med 1x PBSt för 10 min vardera vid rumstemperatur med gungning. Inkubera embryon i 500 μL 100% MeOH vid-20 ° c i minst 14 timmar.
Anmärkning: Metanol är giftigt och måste kasseras på lämpligt sätt enligt de institutionella föreskrifterna. Arbete med metanol bör utföras i en kemisk huva, och lämplig personlig skyddsutrustning (handskar, labbrock, och skyddsglasögon) bör alltid användas. - Rehydrate embryon genom tvättning sekventiellt med 500 μL av 70%, 50%, och 30% MeOH utspädd med 1x PBSt för 10 min vardera vid rumstemperatur med gungning. Utför två 5 min tvättar med 500 μL 1x PBSt vid rumstemperatur med gungande.
- Avlägsna 1x PBSt och inkubera i 500 μL 30% sackaros utspädd med avjoniserat vatten vid rumstemperatur med gunga tills embryona sjunker till botten av röret (ca 1 h). Ersätt sackaros med 500 μL 15% fiskgelatin/25% sackaros (15/25; Se material tabellen) och inkubera vid rumstemperatur med gungande över natten.
- Byt ut ungefär hälften av volymen av 15/25 med optimal skärtemperatur medium (OCT medium) och inkubera vid rumstemperatur med gunga tills embryona sjunker till botten av röret (ca 1 h).
- Ersätt ungefär hälften av volymen med OCT medium och inkubera vid rumstemperatur med gungande för 1 h. Upprepa detta steg en gång.
- Under inkubering steg med 15/25 och OCT medium, Invertera eller snärta röret som behövs för att kombinera dessa reagenser.
2. inbakning av embryon och beredning av Kryosektioner
- Överföra embryon till en plast mögel (se tabellen av material) med tång, minimera all överföring av 15/25-ULT blandningen. Fyll formen ungefär halvfull med OCT medium och försiktigt blanda embryon i OCT medium.
- Förbered märkta plast formar och överföra önskade embryon (vanligtvis 1 \ u20123 embryon) i den tomma, märkta plastformar, minimera överföring av OCT medium. När de önskade embryon är i plast mögel, försiktigt fylla med OCT medium till toppen av mögel.
- Använd tång eller 25 G nålar för att arrangera embryon till önskad orientering, med hjälp av en ljus stereomikroskop för visualisering (figur 1a, B).
- Frys de beredda formar på torris i en isolerad behållare med en metall plattform. Placera en isskopa eller skum kylare försiktigt över metall plattformen för att skapa en kall kammare (figur 1c, D)
-
Förbered 10 \ u201212 μm tjocka kryosektioner med en kryostatuppsättning vid-20 ° c.
- Ställ in ett block i taget och Använd ULT medium för att frysa blocket på skivan/chucken med botten av blocket vänd mot bladet (figur 2A). Se till att blocket är helt fryst till skivan (ULT-mediet blir vitt) innan du påbörjar snittning (figur 2b).
- Placera kryosektioner på laddade glas rutschbanor (figur 2C, D) och lufttorka bilderna över natten vid rumstemperatur.
3. immunofluorescensteknik för pH3
- Utför tre 5 min tvättar av bilderna i 1x PBS i en lämplig behållare, till exempel en Coplin burk. Om vävnaderna inte följs på ett bra och lätt underlag, utför tvättar genom att lägga glidytorna på en plan yta och Pipettera försiktigt 500 μL 1x PBS på ytan. Häll av 1x PBS mellan tvätter genom att försiktigt tippa bilderna.
- Skissera sektionerna med en barriär penna eller vax penna för att hålla vätskan på bilderna (figur 3).
- Lägg glasen på en plan yta i en fuktig kammare och Pipettera 200 μL blockbuffert per sektion på diabilderna. Inkubera i blockbuffert i 2 timmar vid rumstemperatur eller över natten vid 4 ° c.
- Bered den primära antikropps spädningen (kanin anti-pH3 antikropp, 1:200; se tabell över material) i blockbuffert och blanda väl genom pipettering. Försiktigt spetsen på bilderna för att dränera blockbufferten, återgå till den fuktiga kammaren, och Pipettera 200 μL av primär antikropps lösning per sektion på glidbanorna. För den sekundära kontrollen, Pipettera 200 μL blockbuffert på lämpliga sektioner.
- Inkubera bilderna vid 4 ° c över natten i en fuktig kammare fylld med avjoniserat vatten. Täta kanterna på den fuktiga kammaren för att hjälpa till att bibehålla fukt.
- Utför tre 5 min tvättar av bilderna i 1x PBS i en lämplig behållare, till exempel en Coplin burk. Under tvätt stegen, Förbered den sekundära antikropps utspädning (anti-kanin fluorescerande sekundär antikropp konjugat, 1:2000, se tabell över material) i blockbuffert och blanda väl genom pipettering.
- Lägg glidbanorna på en plan yta i en fuktig kammare och Pipettera 200 μL sekundär antikropps lösning per sektion på diabilderna. Inkubera bilderna i sekundär antikropps lösning (er) i rumstemperatur, avskärmad från ljus, i 30 min.
- Utför tre 5 min tvättar av bilderna i 1x PBS i en lämplig behållare, såsom en Coplin burk, avskärmad från ljus. Förbered en nukleär Färgnings lösning (se material tabellen) under tvätt stegen.
- Placera glidbanorna på en plan yta och Pipettera 200 \ u2012500 μL (beroende på provets storlek) på den nukleära färgningslösningen på varje sektion. Inkubera glasen i den nukleära färgningslösningen i 10 minuter, avskärmad från ljus.
- Dränera bort den nukleära färgningslösningen och montera glidbanorna med icke-härdande fluorescerande monteringsmaterial och en glastäckslip. Behåll bilderna i mörker vid 4 ° c tills bildtagning utförs.
Anmärkning: De bästa resultaten erhålls när bilderna avbildas på samma dag eller nästa dag. - Efter om, visualisera och bild bilderna med en konfokalmikroskopi fluorescens Mikroskop och digitalkamera med 555 nm (röd) och 645 nm (långröd) utsläpp filter på 100x förstoring (10X okulär förstoring och 10X objektiv förstoring). Håll lasereffekten konsekvent i bildtagning.
- Efter avbildning, placera diabilderna i enskilda behållare med 1x PBS och förvara platt vid 4 ° c över natten för att förbereda täckslip avlägsnande. Vid placering av diabilder i 1x PBS, skaka försiktigt bilderna för att hjälpa till att avlägsna täckglas.
Anmärkning: Tryck inte ner täckslip eller försök att ta bort täckglan manuellt, eftersom detta kan äventyra kvaliteten på sektionerna. Täckglas måste avlägsnas horisontellt med minimal tvångs rörelse.
4. immunohistokemi för märkta dextran
- Efter täckglasen har avlägsnats, försiktigt överföra bilderna till nya 1x PBS i en lämplig behållare, till exempel en Coplin burk. Ta bort 1x PBS och utför tre 5 minuters inkuberingar av bilderna i 1x Tris-buffrad saltlösning med 0,1% av ett icke-joniskt ytaktivt ämne (1x TBSt) vid rumstemperatur.
- Bered 250 mL 3% väteperoxid (H2O2) utspädd i avjoniserat vatten i en behållare med lämplig storlek. Inkubera bilderna i 3% H2O2 lösning i rumstemperatur i 15 min.
Anmärkning: Väteperoxid är frätande och måste kasseras på lämpligt sätt enligt de institutionella föreskrifterna. Lämplig personlig skyddsutrustning (handskar, labbrock och skyddsglasögon) ska alltid användas. - Skölj bilderna snabbt med avjoniserat vatten. Utför tre 5 min tvättar av bilderna i 1x TBSt. torka försiktigt området runt vävnads sektionerna och placera bilderna plant i en fuktig kammare. Beskriva vävnads sektionerna med en barriär penna eller vax penna för att hålla vätskan på sektionerna om det behövs.
- Applicera en klar att använda 2,5% serum blockerande lösning försedd med en sekundär antikropp märkning Kit (se tabellen av material) droppvis till varje sektion. Inkubera glasen i en fuktig kammare i rumstemperatur i 20 minuter.
- Bered den primära antikroppen utspädd i antikropps spädningsmedel (kanin anti-märkt dextran, 1:7500; se tabell över material) och blanda genom skonsam pipettering. Försiktigt spetsen på bilderna för att dränera blockbufferten, torka området runt sektionerna, och placera bilderna platt i en fuktig kammare.
- Tvätta inte innan den primära antikroppslösningen appliceras. Pipettera över 200 μL primär antikropps lösning per sektion på glidbanorna och inkubera i en fuktig kammare vid 4 ° c över natten. För den sekundära kontrollen, Pipettera 200 μL antikropps spädningsmedel på lämpliga sektioner.
- Försiktigt spetsen på bilderna för att dränera den primära antikropp lösningen och placera i 1x TBSt i en lämplig behållare, såsom en Coplin burk. Utför två 5 min tvättar av rutschkanorna i 1x TBSt. torka området runt sektionerna och placera plant i en fuktig kammare.
- Använd en färdig bakgrundsreducerande blockeringsreagens (se tabellen med material) droppvis till varje sektion. Inkubera glasen i en fuktig kammare i rumstemperatur i 20 minuter.
- Försiktigt spetsen på bilderna för att dränera blockbufferten, torka försiktigt området runt sektionerna, och placera bilderna platt i en fuktig kammare. Tvätta inte innan du applicerar den sekundära antikroppslösningen.
- Applicera en sekundär antikropps lösning (anti-kanin pepparrot peroxidas (HRP) polymer sekundär antikropp; se tabellen med material) till varje avsnitt droppvis och inkubera i en fuktig kammare vid rumstemperatur i 30 min.
- Försiktigt spetsen på bilderna för att dränera den sekundära antikroppen lösning och placera i 1x TBSt i en lämplig behållare, såsom en Coplin burk. Utför två 5 min tvättar av rutschkanorna i 1x TBSt.
- Bered HRP-kromogent substrat omedelbart före användning enligt tillverkarens protokoll (se material tabellen).
- Torka området runt sektionerna, placera glidbanorna på en plan yta och applicera 200 μL av HRP-kromogent substrat i varje sektion. Inkubera i rumstemperatur i 3 minuter, starta en timer när underlaget har applicerats på den första bilden (figur 4).
- Dränera av substratlösningen och skölj glasen kort i en Coplin burk som innehåller 1x PBS. Placera bilderna i avjoniserat vatten i en lämplig behållare, såsom en Coplin burk, och utföra två 5 min tvättar i avjoniserat vatten med mild agitation.
- Motfärga glasen genom att placera dem i hematoxylin färgning lösning för upp till 30 s.
Anmärkning: Hematoxylin är giftigt och måste bortskaffas per institutionella förordningar. Lämplig personlig skyddsutrustning (handskar, labbrock och skyddsglasögon) ska alltid användas. - Placera bilderna i avjoniserat vatten i en lämplig behållare, till exempel en Coplin burk, och utföra tre 5 min tvättar i avjoniserat vatten. Överför bilderna till en behållare som innehåller Scotts kranvatten (se material tabellen) och inkubera i 1 min.
- Placera bilderna i avjoniserat vatten i en lämplig behållare, till exempel en Coplin burk, och utföra tre 5 min tvättar i avjoniserat vatten.
- Torka av glasen genom en serie etanol (EtOH) kvaliteter (utspädd i avjoniserat vatten) och xylen i en kemisk huva. Utför en 2 min inkubation i 70% EtOH, två 1 min inkuberingar i 95% EtOH, två 1 min inkubering i 100% EtOH, och tre 1 min inkuberingar i xylen. Ta bort glasen från xylen och placera en täckglas medan den är våt med ett toluenbaserat monteringsmedium i en kemisk huva.
Anmärkning: Xylen och toluen är giftiga och brandfarliga och måste kasseras på lämpligt sätt per institutionell föreskrift. Arbete med xylen och toluen ska utföras i en kemisk huva, och lämplig personlig skyddsutrustning (handskar, labbrock och skyddsglasögon) ska alltid användas. - Efter IHC, visualisera och bild bilderna med ett sammansatt ljusmikroskop och digitalkamera på 100x förstoring (10X okulär förstoring och 10X objektiv förstoring). (Figur 5).
Representative Results
Vi utvecklade detta protokoll för att identifiera och analysera proteinuttryck i enskilda givar celler i 48 h postfertilisering chimär zebrafiskar embryon som genererats av blastula-till-blastula transplantation mellan AB vildtyp zebrafiskar embryon. Framgångsrik analys av proteinuttryck vid en cellnivå krävs beredning av kryosektioner med lämpligt inriktade embryon (figur 1 och figur 2) och noggrann, SEKVENTIELL applicering av IF-och IHC-tekniker på dessa kryosektioner (figur 3 och figur 4). Användning av specifika antikroppar för att samtidigt detektera prolifererande celler (anti-pH3, figur 5a, B) och givar celler (anti-märkt dextran, figur 5D) kan användas för att identifiera och kvantifiera givar celler som aktivt sprider sig ( Figur 5E). Det är viktigt att generera högkvalitativa bilder efter både om (figur 2A, B) och IHC (figur 2D) för att korrekt identifiera enskilda celler. Ett bildanalysprogram bör användas för att utföra bild överlagring (figur 5E). Beroende på vilket bildanalysprogram som används kan det vara möjligt att utföra automatiserade inventeringar av märkta celler om kvantifieringen önskas.
Figur 1: Beredning av frysta Oct-block. (A) 50x mikroskopisk syn på embryon i ULT i en kryogen mögel beredd för frysning. Röd pil indikerar chef för zebrafiskar embryo position mot bottenytan av mögel; svart pil indikerar att svansen pekar uppåt mot användaren. B) plastformar med embryon och ULT placerade på kyld metall plattform. Cskum isskopa placerad över plastformar för att skapa frys kammare. D) ULT blir vitt från transparent när blocket är helt fryst. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Kryosnittning av frysta Oct-block. Atillämpning av färskt ULT på kryostatskiva och placering av fryst block på Oct, roterat 180 ° från frysnings riktningen av blocket. (B) sidovy av block fryst till snittnings skiva. (C) vy av snittnings block med rullplåt i läge. D) hämtning av sektioner med hjälp av en laddad bild från kryostats metall plattform. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Vy över preparerade sektioner efter placering på en bild. Pilen indikerar hydrofoba barriär, och prickad linje avgränsat zonen som innehåller sektioner inom barriär omkrets. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: förberedelse för kromogent substrat applicering under IHC. Bilden placeras på en plan yta täckt med plastfolie för att möjliggöra en enhetlig tillämpning av kromogena substrat samtidigt som den innehåller alla spill av farligt material. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Representativ IF och IHC märkning av kryosektionerade 48 HPF chimär zebrafiskar embryon som genererats av blastula-till-blastula transplantation mellan AB vildtyp zebrafiskar embryon. (A) om du ska upptäcka ser 10 fosforylerad histone H3 (anti-pH3, 1:200) uttryck i 48 HPF chimär zebrafiskar embryo. Röd = pH3-positiva celler; blå = kärnor. Gula pilar indikerar exempel på positiva celler. (B) subtraktion av den blå nukleära fläcken i den digitala bilden (imagej programvara) förbättrar visualisering av pH3-positiva celler för kvantifiering och bild overlay. C) negativ kontroll (endast sekundär antikropp) för IF-analys i kryosektionerad 48 HPF chimär zebrafiskar embryo. Skalstapeln motsvarar 50 μm (gäller alla paneler). (D) IHC att detektera märkt dextran (anti-märkt dextran, 1:7500) i chimär 48 HPF zebrafiskar embryo som genereras av blastula-till-blastula transplantation mellan AB vildtyp zebrafiskar embryon. Donatorembryon injicerades med ett fluorescensmärkt dextran-konjugat i encellsledet före användning för transplantation av blastula-till-blastula. Rött indikerar celler märkta med ett dextran-konjugat; blått indikerar atomkärnor. Gula pilar indikerar exempel på positiva celler. (E) överlagring av panel B (om för pH3) och panel C (IHC för märkt dextran) som visar samlokalisering av pH3-uttryck och dextran-märkning i enskilda celler. Gula pilar indikerar exempel på dubbel positiva celler. F) negativ kontroll (endast sekundär antikropp) för IHC-analys i kryosektionerad 48 HPF chimär zebrafiskar embryo. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Vi har presenterat en ny metod för kombinerad immunofluorescens och immunohistokemi som utgör ett viktigt steg framåt i utförandet av samlokalisering experiment på kryosektionerade zebrafiskar embryon. Det finns en kritisk brist på befintliga samlokalisering protokoll som är optimerade för användning med små embryon och kryosektionerat material17,18, som båda är annars vanligen används i molekylära studier14. Befintliga colocalization protokoll fokuserar främst på samtidig visualisering av två fluoroforer17,18. Även om dessa protokoll kan fungera bra, är deras användbarhet begränsad av tillgången på antikroppar som (i) kan användas i zebrafiskar och (II) är förenliga med IF.
Vi anser att användning av kryosektionering för zebrafiskar embryon ger en betydande fördel i form av konserverad vävnadmorfologi. Eftersom IHC är vanligare utförs på paraffin sektioner än kryosektioner7,8, ytterligare utforskning av cryosection-baserade IHC metoder för detektion av proteinuttryck är motiverad. Användning av hela Mount om är en vanlig metod för att visualisera uttrycks nivåer i zebrafiskar embryon, och är mer allmänt beskrivs i litteraturen än om att använda kryosektioner1,2,3,4, 19. Dock har hela monterings protokoll begränsningar, inklusive bristen på exakt lokalisering av proteiner uttryckta i djupa vävnader och potentialen för ytnivå uttryck för att dölja proteinuttryck i djupare vävnader. Vi har genomgående observerat utmärkt underhåll av cellulär morfologi efter cryopreservation, snittning, och sekventiella om och IHC. För program som kräver exakt lokalisering av proteinuttryck på encellig nivå, finns det en betydande fördel för avsnitt-baserade förfaranden som vi har beskrivit i detta protokoll. Harts inbäddning ger ett alternativ för att utföra IF eller IHC analyser på sektioner från tidigt stadium zebrafiskar embryon20. Harts sektioner ger överlägsen bevarande av vävnadmorfologi jämfört med kryosektioner, och relativt tunnare vävnad sektioner kan förberedas. Emellertid, tillverkare rekommenderar generellt inte användning av harts sektioner för Immuno-baserade analyser, eftersom vissa komponenter i hartser inte kan avlägsnas från avsnitten och kan maskera antikroppar bindningsställen21.
Även om hela protokollet är viktigt för korrekt och framgångsrik analys av uttrycksmönster, är några specifika steg avgörande för experimentell framgång. Det första kritiska steget är hanteringen av embryon under inbäddning i13oktober,14. Det kan vara svårt att orientera varje embryo i samma tvärgående plan så att snitt skärs från ungefär samma område för alla embryon. Vi har funnit att använda små gauge nålar för att utföra små, avsiktliga rörelser genom trögflytande OCT medium för embryonal orientering är överlägsen med hjälp av pinps, som är för stora och förskjuter för mycket OCT medium. Ett andra kritiskt steg inträffar under snittning av frysta block, eftersom det kan vara svårt att få högkvalitativa sektioner som innehåller önskad vävnad (er) utan betydande utbildning och erfarenhet. Vi rekommenderar därför användning av testprover tills tekniken behärskas. Ett tredje kritiskt steg är täckslip avlägsnande, som har potential att störa eller remsor av vävnadsprover. Vi har funnit att en kombination av mild agitation för att lossa täckglas och långsam borttagning av bilden från PBS-behållaren är den mest effektiva metoden för att ta bort täcklappar. En mild och stadig hand är bäst; forskare kan finna att vissa Trial and error är nödvändigt att lära sig att ta bort täckglas effektivt.
Ytterligare viktiga steg i protokollet inkluderar antikropps optimering (primära och sekundära antikroppar för både IF och IHC-analyser) och exponering av diabilder till det kromogena substratet och motfläcken. Grundlig forskning om primär antikroppselektivitet och målkoncentration är nödvändig. Generellt är det bäst att samla in tillräckligt med icke-dyrbara prover för minst två separata experiment för IF och IHC som kommer att utföras för att optimera primära antikropps koncentrationer innan du påbörjar kombinationen om/IHC. Inklusive en känd positiv och negativ kontroll för varje primär antikropp är viktigt i varje experiment för att säkerställa att både IF och IHC analyser fungerar på lämpligt sätt. Justeringar av sekundär antikroppskoncentration kan också behövas. Optimering av exponeringen av Vävnadsdelar till kromogent substrat och motfärgning för IHC-analysen krävs, eftersom tillverkarens riktlinjer ofta beskriver ett brett spektrum av möjliga exponeringstider. Inte alla kromogener kan vara förenliga med motfläckar och endogena vävnad pigmentering, kräver noggrann planering med avseende på kromogen urval.
Det finns många potentiella ändringar som kan tillämpas på det beskrivna protokollet, och vi har framgångsrikt utfört detta protokoll med andra kombinationer av antikroppar som inte kunde båda användas för IF. Som nämnt ovan, kromogena ämnen har distinkt kompatibilitet med specifika motfläckar. Vi har funnit att dessa komponenter är lätt modifierbara i protokollet. Dessutom är parametrarna för antikropps inkubation ganska flexibla, och kan ökas eller minskas beroende på önskad Färgnings intensitet. Inbäddnings processen kan också ändras. Medan vi har fokuserat på tvärgående sektioner, kan embryon lätt orienteras i någon riktning för att ta itu med särskilda vävnader av intresse. Slutligen finns det flera möjliga paus punkter i det här protokollet. Dehydratiserade embryon kan lagras i 100% MeOH vid-20 ° c i några månader; frysta block kan förvaras vid-80 ° c i upp till tre månader; och förberedda diabilder kan förvaras vid-80 ° c i upp till nio månader i en bildruta.
På grund av den relativa komplexiteten i detta kombinerade IF/IHC-protokoll finns det flera möjliga källor till variation eller fel som kan kräva felsökning, alltifrån vävnads kvalitet till forskar erfarenhet till provhantering. De flesta av de kritiska stegen som beskrivs ovan anses vara kritiska eftersom de antingen kräver optimering på individuell användarnivå eller att de kräver särskild fingerfärdighet, skicklighet och erfarenhet. Vi har dock funnit att ospecifik bakgrunds färgning och låg signalintensitet är de mest betydelsefulla frågor som kräver optimering. Som med alla IF eller IHC protokoll, ta itu med dessa frågor kan vara tidskrävande och arbetsintensiva, och kan förvärras med denna metod eftersom de två teknikerna kombineras. Av denna anledning rekommenderar vi starkt att optimera om och IHC separat innan du fortsätter med det kombinerade protokollet.
Även om vi förutspår att denna metod kommer att vara användbar för ett brett spektrum av experiment, det finns potentiella begränsningar. Lyckad prestanda för denna procedur är beroende av att bibehålla intakt vävnadsprover genom två sekventiella experiment som innehåller många tvättsteg. Av denna anledning, eventuella problem som uppstår vid snittning eller vävnads hantering, inklusive användning av äldre bilder som kan ha försämrad kvalitet, kommer att avsevärt begränsa forskarnas förmåga att utföra detta protokoll framgångsrikt. Även om diabilder kan potentiellt lagras vid-80 ° c i upp till nio månader, vävnad följsamhet till bilder minskar med tiden och vi hade den bästa framgången med bilder som används inom en månad av förberedelser eller helst, nästa dag. En andra begränsning är den lilla fotavtryck av zebrafiskar embryon. Även om vi har funnit detta experiment för att vara användbar för att visualisera proteiner som är relativt rikligt uttrycks i tidigt skede embryon, proteiner som uttrycks inkonsekvent eller på låga nivåer kan vara mycket svårt att fånga i ett avsnitt. Slutligen, eftersom protokollet använder 10 \ u201212 μm kryosektioner, är det bäst lämpad för utvärdering av proteinuttryck i större strukturer, såsom kärnor, snarare än mindre sub-cellulära komponenter.
Sammanfattningsvis kommer vårt kombinerade IF/IHC-protokoll att vara fördelaktigt för en mängd olika studier på embryon från zebrafiskar på tidigt stadium, och utgör en viktig innovation i exakt analys av proteinuttryck i sådana prover. Vår metod, som visas framgångsrikt i figur 5, kommer att göra det möjligt för forskare att bevara den känsliga morfologin hos embryon av sebrafisk i tidig fas i kryosektioner medan de arbetar med det något begränsade utbudet av för närvarande tillgängliga primära antikroppar som är validerats för användning i IF eller IHC hos denna art. Detta protokoll kommer sannolikt att vara användbart för studier på andra arter av fisk och grodddjur (t. ex. Medaka och Xenopus spp.), som hämmas av liknande begränsningar av tillgängligheten till antikroppar och kan tillämpas för traditionella däggdjurs modeller som Väl.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av NIH Grant 5K01OD021419-02 och NC State University College of Veterinary Medicine.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15/25 | N/A | N/A | 15% fish gelatin/25% sucrose w/v, made in dH2O |
| Alexa 555 secondary antibody | Invitrogen | A21429 | used at 1:2,000 dilution in block buffer for IF |
| Antibody Diluent | Dako | S3022 | |
| Background Buster | Innovex | NB306 | |
| block buffer (IF) | N/A | N/A | 5% normal goat serum, 0.1% Triton X-100 in 1x PBS |
| cellSens imaging software | Olympus | cellSens | imaging software used with compound light microscope |
| chimeric zebrafish embryos | N/A | N/A | AB wild-type chimera zebrafish embryos analyzed at 48 hpf |
| Compound light microscope | Olympus | BX51 | used with digital camera and cellSens imaging software for image capture after IHC |
| Confocal fluorescence microscope | Leica | DM 2500 | used with digital camera and Leica Application Suite Advanced Fluorescence imaging software for image capture after IF |
| Disposable plastic molds, 15 mm x 15 mm x 5 mm | Ted Pella | 27147-2 | |
| Digital camera, light microscope | Olympus | DP27 | |
| Digital camera, fluorescence microscope | Leica | TCS SPE | |
| Ethanol | Koptec | V1001 | |
| Fish gelatin | Sigma | G7041 | |
| Glass slides | Fisher | 12-550-15 | |
| Hydrogen peroxide, 30% | Fisher | H325-100 | |
| ImmPRESS HRP Polymer detection kit | Vector | MP-7401 | anti-rabbit secondary antibody, HRP polymer |
| Leica Application Suite Advanced Fluorescence imaging software | Leica | LAS AF 2.3.6 | imaging software used with confocal fluorescence microscope |
| Methanol | Fisher | A452-4 | |
| Modified Meyer's Hematoxylin | Thermo | 72804 | |
| Normal Goat Serum | MP Biomedical | 191356 | |
| OCT medium | Tissue-Tek/Fisher | 4583/4585 | |
| anti-Oregon Green antibody | Molecular Probes/Life Technologies | A889 | used at 1:7500 dilution for IHC |
| Oregon Green Dextran | Invitrogen | P7171 | used at 2.5% in 0.2 M KCl |
| Paraformaldehyde, 4% | Acros Organics | 416780030 | made in lab in 1x PBS |
| Permount | Fisher | SP15 | |
| 1x phosphate-buffered saline | made in lab | N/A | 50 mL 10x PBS, up to 500 mL volume with dH2O |
| 10x phoshpate-buffered saline | made in lab | N/A | use Cold Spring Harbor protocol |
| 1x PBSt | made in lab | N/A | 50 mL 10x PBS, 1 mL 10% Tween 20, up to 500 mL volume with dH2O |
| anti-Ser10 phosphorylated Histone H3 antibody | Santa Cruz | sc-8656-R | used at 1:500 dilution for IF |
| Scott's Tap Water | Electron Microscopy Sciences | 26070-06 | have used other brands successfully in addition to EMS |
| Sucrose | Amresco | 335 | |
| Tween-20 | Fisher | BP337 | |
| TO-PRO3 | Invitrogen | T3605 | used at 1:1,000 in 1x PBS for IF |
| 1x Tris-buffered saline | made in lab | N/A | 50 mL 10x TBS, up to 500 mL volume with dH2O |
| 10x Tris-buffered saline | made in lab | N/A | 85 g NaCl, 61 g Tris base, up to 1 L volume with dH2O |
| 1x TBSt | made in lab | N/A | 50 mL 10x TBS, 1 mL 10% Tween 20, up to 500 mL volume with dH2O |
| Triton X-100 | Acros Organics | 327371000 | |
| Vectashield | Vector | H-1000 | non-hardening mounting media |
| Vector NovaRed substrate | Vector | SK-4800 | HRP substrate |
| Xylene | Fisher | X3P-1GAL |
References
- Whole-mount IHC protocol for zebrafish embryos [Internet]. GeneTex. , Irvine. Available from: http://www.genetex.com/uploaddata/Protocol/Document/IHC-WM.pdf (2013).
- Inoue, D., Wittbrodt, J. One for all--a highly efficient and versatile method for fluorescent immunostaining in fish embryos. PLoS One. 6 (5), (2011).
- Kogata, N., Howard, B. A. A whole-mount immunofluorescence protocol for three-dimensional imaging of the embryonic mammary primordium. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 18 (2), 227-231 (2013).
- Santos, D., Monteiro, S., Luzio, A. General Whole-Mount Immunohistochemistry of Zebrafish (Danio rerio) Embryos and Larvae Protocol. Methods in Molecular Biology. 1797, 365-371 (2018).
- Shive, H. R., West, R. R., Embree, L. J., Sexton, J. M., Hickstein, D. D. Expression of KRASG12V in Zebrafish Gills Induces Hyperplasia and CXCL8-Associated Inflammation. Zebrafish. 12 (3), 221-229 (2015).
- Karlsson, J., von Hofsten, J., Olsson, P. E. Generating transparent zebrafish: a refined method to improve detection of gene expression during embryonic development. Marine Biotechnology (NY). 3 (6), 522-527 (2001).
- Macdonald, R. Zebrafish Immunohistochemistry. Molecular Methods in Developmental Biology. Guille, M. , 127th ed, Humana Press. New York. 77-88 (1999).
- Santos, C., Pinto, M. L. Immunohistochemical Assessment as a Tool for Investigating Developmental Toxicity in Zebrafish (Danio rerio). Methods in Molecular Biology. 1797, 461-476 (2018).
- Shive, H. R., West, R. R., Embree, L. J., Azuma, M., Sood, R., Liu, P., et al. brca2 in zebrafish ovarian development, spermatogenesis, and tumorigenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (45), 19350-19355 (2010).
- Shive, H. R., West, R. R., Embree, L. J., Golden, C. D., Hickstein, D. D. BRCA2 and TP53 collaborate in tumorigenesis in zebrafish. PLoS One. 9 (1), (2014).
- van der Loos, C. M. Multiple Immunoenzyme Staining: Methods and Visualizations for the Observation With Spectral Imaging. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (4), 313-328 (2008).
- van der Loos, C. M. Immunoenzyme Multiple Staining Methods. , Bios Scientific Publishers. New York. (1999).
- OCT Embedding For Cryostat Sectioning Of Embryos or Larvae [Internet]. The Zebrafish Book, 5th edition. , University of Oregon Press. Available from: https://wiki.zfin.org/display/prot/OCT+Embedding+For+Cryostat+Sectioning+Of+Embryos+Or+Larvae (2007).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Preparation of Cells and Tissues for Fluorescence Microscopy. Basic Methods in Microscopy. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. Spector and Goldman, editors (2006).
- Torres, E. The Lack of Commercial Antibodies for Model Organisms (and How You Can Deal with It) [Internet]. BenchSci Blog. , Available from: https://blog.benchsci.com/the-lack-of-commercial-antibodies-for-model-organisms-and-how-you-can-deal-with-it (2018).
- Carmany-Rampey, A., Moens, C. B.
- Da’as, S. I., Balci, T. B., Berman, J. N. Mast cell development and function in the zebrafish. Methods in Molecular Biology. 1220, 29-57 (2015).
- Quan, F. B., et al. Comparative distribution and in vitro activities of the urotensin II-related peptides URP1 and URP2 in zebrafish: evidence for their colocalization in spinal cerebrospinal fluid-contacting neurons. PLoS One. 10 (3), (2015).
- Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 4th ed, University of Oregon Press. Eugene. (2000).
- Sullivan-Brown, J., Bisher, M. E., Burdine, R. D. Embedding, serial sectioning and staining of zebrafish embryos using JB-4 resin. Nature Protocols. 6 (1), 46-55 (2011).
- JB-4 Embedding Kit. [Internet]. Polysciences, Inc. , Available from: http://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/histology-microscopy/plastic-embedding-media-kits/jb-4-sup-r-sup-embedding-kits-reagents/jb-4supsup-embedding-kit/ (2018).
