使用PDMS的高通量牵引力显微技术揭示转化生长因子-β对上皮-间质转化的剂量依赖性效应

摘要

我们介绍一种使用硅橡胶（PDMS）制备的高通量牵引力检测方法。该新型检测方法适用于研究细胞收缩力在多种生物学、生物医学过程及疾病中的物理变化。我们通过检测上皮-间质转化过程中TGF-β依赖性的收缩力增强，展示了该方法的应用价值。

摘要

细胞收缩力在生物学的诸多方面至关重要，驱动着从运动、分裂到组织收缩和机械稳定性的各种过程，是多细胞动物生命的核心要素之一。在贴壁细胞中，肌动球蛋白收缩表现为细胞对其基质施加的牵引力。细胞收缩力的失调出现在多种病理状态中，使得收缩力成为利用生物物理指标进行诊断的有前景靶点。此外，新的治疗策略可基于纠正细胞收缩力的明显功能障碍而建立。这些应用， 然而，需要对这些力进行直接量化。

我们开发了基于硅胶弹性体的并行多孔板格式牵引力显微镜技术（TFM）。与常用的水凝胶聚丙烯酰胺（PAA）不同，我们采用硅橡胶材料，特别是聚二甲基硅氧烷（PDMS），从而制备出稳定且惰性的基底，其储存期无限，无需特殊储存条件。与基于微柱PDMS、模量处于GPa范围的方法不同，此处使用的PDMS具有高度顺应性，模量范围约为0.4 kPa至100 kPa。我们通过在空间上将这些大尺寸整体基底划分为生化上相互独立的孔，构建了一个高通量TFM平台，形成一种可与现有多种多孔板系统兼容的多孔板牵引力筛选平台。

在本论文中，我们利用这种多孔牵引力系统研究上皮细胞向间充质细胞的转变（EMT）；通过将 NMuMG 细胞暴露于 TGF-β 以诱导 EMT，并量化 EMT 过程中的生物物理变化。我们测量了细胞收缩力随 TGF-β 处理浓度和时间的变化。我们的研究结果展示了并行化牵引力显微技术在疾病生物物理学研究中的应用价值。

引言

肌动蛋白-肌球蛋白收缩力是细胞主动力学的核心要素，影响着细胞从运动、增殖到干细胞分化的多种行为。在组织中，收缩力驱动了从胚胎发育过程中的极性分离，到气道收缩以及心脏活动等多种生理过程。关键的是，细胞要产生张力，必须首先黏附于其细胞外环境。通过这种黏附，细胞的收缩力会对其周围环境产生牵引力。牵引力显微镜技术（Traction Force Microscopy, TFM）已发展出多种形式，成为在不同条件下定量测量各类细胞产生牵引力的重要方法。

牵引力显微技术（TFM）领域在创新和应用方面取得了广泛进展，其成果为生物学研究开辟了融入力学和物理力作用的新视角。从早期使用产生皱褶的硅胶基底¹开始，研究人员已采用多种技术来测量细胞牵引力。这些方法不断得到改进，目前分辨率已达到数微米级别²。然而，一个主要问题逐渐显现，即使用现有的硅胶材料难以制备出具有合适低模量的基底。为解决这一问题，聚丙烯酰胺被引入作为替代材料，因其易于制备模量在1–20 kPa范围内的基底³。我们近期在TFM中采用了高度顺应性的硅胶材料⁴，使我们能够实现与聚丙烯酰胺相当的模量范围，同时兼具硅胶材料惰性强、机械稳定性好的优势。

TFM 方法已实现了重要的力学生物学发现，然而其复....

方案

注意：以下方案将指导研究人员制备和使用如图1所示的多孔牵引力显微镜（TFM）培养皿。

1. PDMS硅胶基底的制备

1. 基于两种市售试剂盒的复合混合物制备聚二甲基硅氧烷（PDMS）硅橡胶混合液。
   1. 将PDMS试剂盒的A组分和B组分（例如GEL-8100，参见材料表）按1:1的质量比加入50 mL离心管中。
      注：混合过程在旋转混合仪上进行，转速应足够慢，使混合液在旋转过程中能够来回流动，以确保充分混合。
   2. 根据所需基底模量，加入适量的固化剂。
      注：加入混合液中的固化剂量取决于所需基底的模量，通常范围为0.1%至1.8%。具体交联剂浓度与所得模量的对应关系可参考表1和图3。
   3. 在旋转混合仪上混合配方30–45分钟；确保转速足够慢，以实现充分混合。
2. 底层：在载玻片上涂覆PDMS基底
   1. 将图2所示的自制卡盘放置于匀胶机上。用乙醇或异丙醇清洁载玻片，并用无尘布擦干。将载玻片放入卡盘中，并开启真空以固定载玻片。
   2. 在距离边缘约1 cm处施加未固....

结果

在添加TGF-β之前，汇合的单层细胞呈鹅卵石样形态，排列紧密。经TGF-β处理后，细胞形态变得更加细长，细胞面积增大，并获得更明显的间充质样表型。利用由柔软PDMS弹性体制造的多孔装置，研究了共17种不同条件下细胞的物理特性。细胞分别接受四种不同浓度的TGF-β（0.5、1、2和4 ng/mL）以及四种不同孵育时间（12、24、48、96 h）处理，结果总结于图5中。经TGF-β处理的细胞所产生的牵引应力和应变能均大于未添加TGF-β培养的细胞。孵育96小时的TGF-β处理组细胞表现出最大的牵引应力和应变能。随着TGF-β浓度的升高，细胞施加的应力和应变能也随之增大。在较长的孵育时间下，牵引力和应变能的差异更为显著。

基底表面必须光滑，并均匀涂覆配体（如纤连蛋白或胶原蛋白）。表面划痕和/或配体涂层不均匀可能导致细胞贴附异常，从而造成牵引力测量不准确。图.......

讨论

该方法成功的关键在于制备出厚度均匀且恒定的样品，厚度约为 100 µm。应谨慎选择模量，以准确考察目标生物系统的物理意义。在制备顶层时，应优化示踪荧光微粒的浓度，以实现对位移和牵引力应力的精确分析。分析单个孤立细胞时，所需的示踪层密度高于测量汇合单层细胞时的需求。此外，基底表面应稳定且均匀地包被黏附分子（如胶原蛋白、纤连蛋白和层粘连蛋白），以确保细胞能够正常附着于基底表面。安装多孔分隔器时需格外小心，应避免滑动放置，以防密封用的 PDMS 胶被涂抹到培养表面；同时，其外边缘必须与玻璃尺寸精确对齐，以防止边缘孔位发生泄漏。

为防止小室发生泄漏，需在小室分隔处涂抹适量的PDMS胶以固定其位置。但若使用过量，则会覆盖细胞培养表面。

在旋涂过程中需要加入足量的PDMS。固化时，烘箱和支架必须保持水平。PDMS不足或烘箱不水平可能导致PDMS厚度不均。

微珠密度需要优化以确保准确分析。当微珠密度不足时，需增加微珠在基准PDMS混合物中的浓度。此外，还需加入足量的混合物用于旋涂。为确.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
平板
GEL-8100	Nusil Technology	GEL-8100	高纯度介电性软硅胶凝胶套件
Dow Corning Sylgard 184 硅胶封装剂透明 0.5 kg 套件	Ellsworth Adhesives	184 SIL ELAST KIT 0.5KG	固化剂
定制切割玻璃	Hausser Scientific Company		109.6 mm± × 72.8 mm± × 1 mm 厚度
Target 2TM 尼龙注射器滤器	ThermoFisher Scientific	F2513-4
96 孔条板蛋格式条带支架	Corning	2572
带角切口的聚苯乙烯通用微孔板盖	Corning	3099
乙醇	Greenfield Global	P016EA95	0.95
2-丙醇	Sigma-Aldrich	190764	ACS 试剂，≥99.5%
表面涂层
Sulfo-SANPAH 交联剂	Proteochem	c1111-100mg
牛血浆纤连蛋白	Sigma-Aldrich	F1141-1MG	溶液，经无菌过滤，BioReagent，适用于细胞培养
PBS，1×	Wisent	319-005-CL	pH 7.4，不含钙和镁
DMSO	Sigma-Aldrich	472301
细胞培养
DMEM，1×	Wisent	319-005-CL	含 4.5 g/L 葡萄糖、L-谷氨酰胺、丙酮酸钠和酚红
FBS（胎牛血清）	Wisent	080-150	优质，内毒素  <1，血红蛋白 <25
HEPES	Wisent	330-050-EL	1 M，游离酸
重组人胰岛素	Wisent	511-016-CM	USP 级
青霉素-链霉素溶液	Wisent	450-201-EL	100×，经无菌过滤，适用于细胞培养
L-谷氨酰胺溶液	Wisent	609-065-EL	200 mM 溶液，经无菌过滤，适用于细胞培养
两性霉素 B	Wisent	450-105-QL	250μg/mL，经无菌过滤，适用于细胞培养
重组人 TGF-β1	Peprotech	100-21	HEK293 表达来源
乙酸	Sigma-Aldrich	537020	冰醋酸，≥99.85%
柠檬酸	Sigma-Aldrich	251275	ACS 试剂，≥99.5%
NMuMG	ATCC	CRL-1636	小鼠乳腺细胞系
叠氮化钠	Fisher Scientific	AC190385000	99%，超纯，ACROS Organics
氢氧化钾	Sigma-Aldrich	221473	ACS 试剂，≥85%，颗粒状
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100	实验室级
微珠合成
1,1′-二十八烷基-3,3,3′,3′-四甲基吲哚羰花青高氯酸盐（DiI）	Sigma-Aldrich	468495-100MG	97%
甲基丙烯酸甲酯	Sigma-Aldrich	M55909-500ML	含 ≤30 ppm MEHQ 作为抑制剂，99%
抑制剂去除柱	Sigma-Aldrich	306312-1EA	预装柱，用于去除氢醌和单甲醚氢醌
甲基丙烯酰氧基丙基封端聚二甲基硅氧烷	Gelest	DMS-R31 (25,000 g/mol)	聚二甲基硅氧烷稳定剂，25,000 g/mol，1,000 cSt
2,2′-偶氮双(2-甲基丙腈)（AIBN）	Sigma-Aldrich	441090-25G	98%
正己烷	Sigma-Aldrich	296090-2L	无水，95%
己烷，异构体混合物	Sigma-Aldrich	227064-1L	无水，≥99%
Whatman 定性滤纸，1 号	Sigma-Aldrich	WHA1001055	圆形，直径 55 mm
设备
Laurell WS-650Mz-23NPPB	Laurell Technologies
UVP 手持式紫外灯 UVGL-58 型	VWR	21474-622
流变仪	Anton Paar	MCR 302 WESP