Summary
我们采用硅橡胶 (PDMS) 制造高通量牵引力测定。这种新颖的测定适用于研究各种生物和生物医学过程和疾病中细胞收缩性的物理变化。通过测量上皮到中位过渡期间收缩性增加的TGF-α依赖性增加,我们证明了这种方法的效用。
Abstract
细胞收缩性在生物学的各个方面都是必不可少的,推动过程从运动和分裂,到组织收缩和机械稳定性,并代表多细胞动物生命的核心元素。在附着细胞中,在细胞在其基质上施加的牵引力中可以看到肌苷收缩。细胞收缩性调节的调节出现在无数的疾病中,使得收缩性成为使用生物物理学作为指标的各种诊断方法中一个有希望的目标。此外,新的治疗策略可以基于纠正细胞收缩性的明显故障。然而,这些应用需要直接量化这些力量。
我们开发了基于硅弹性体牵引力显微镜 (TFM) 的并行多井格式。我们使用硅橡胶,特别是聚二甲基硅氧烷(PDMS),而不是常用的水凝胶聚丙烯酰胺(PAA),使我们能够制造具有不确定保质期的坚固和惰性基材,无需专门的储存条件。与基于柱-PDMS的方法在GPa范围内具有模量不同,此处使用的PDMS非常符合,范围从大约0.4 kPa到100 kPa不等。我们通过将这些大型单片基板在空间上划分为生物化学独立井,为 TFM 创建高通量平台,创建一个多井平台,用于牵引力筛选,与现有的多井系统兼容。
在本手稿中,我们使用此多井牵引力系统来检查到中端过渡 (EMT);我们诱导NMuMG细胞中的EMT,将它们暴露到TGF-β,并量化EMT期间的生物物理变化。我们测量收缩性作为TGF-α暴露的浓度和持续时间的函数。我们在这里的发现证明了并行TFM在疾病生物物理学中的效用。
Introduction
Acto-myosin收缩性是活性细胞力学的基本要素,影响细胞行为从运动和增殖到干细胞分化。在组织中,收缩性驱动从胚胎生成中的极性分离到气道收缩和心脏活动的活动。关键的是,要产生紧张,细胞必须首先粘附在细胞外环境中。这样,这种收缩性就在其周围环境中产生牵引力。牵引力显微镜(TFM)以多种形式出现,作为在不同条件下量化不同细胞的这些力的一种方式。
TFM 领域具有非凡的创新和应用广度,其结果为生物学中包含力学和物理力的新视角铺平了道路。从起皱硅胶基板1开始,研究人员应用了各种技术来测量细胞牵引力。这些方法不断改进,现已达到几微米2的分辨率水平。然而,出现了一个主要问题,那就是难以利用现有的硅胶制造适当低的月面基板。为了规避这一问题,聚丙烯酰胺被采用作为替代品,因为易于在1-20 kPa3的量下创建基板。我们最近在TFM4中实现了非常合规的有机硅,使我们能够制造与聚丙烯酰胺相同的莫杜拉利范围,但具有惰性和强健硅胶的优点。
TFM 方法使有价值的美查诺生物发现得以实现,然而,一个长期存在的缺点是它们的复杂性,通常将其使用限制在工程或物理科学学科的研究人员。这在很大程度上是由于量化收缩性所需的详细校准和具有挑战性的计算。另一个重大挑战是,TFM方法基本上低通量,因此不适合同时研究许多不同的条件或人群。这带来了一个瓶颈,阻碍了TFM从专业生物物理学机构转移到更广泛的生物和药理学应用。
我们最近开发了一种多孔格式的TFM板,使研究人员能够并行化其TFM测量,从而更快地量化收缩性指标,同时探索不同化合物的影响,同时使用更少的试剂4.该方法在各种的美形生物学研究中具有广泛的效用,从评估化合物对细胞活动的影响,到量化分化或疾病的收缩变化。
生物医学研究的一个领域,将大大受益于TFM是研究物理线索如何影响癌细胞的恶性表型。转移,导致90%的癌症相关死亡,其特点是癌细胞离开其原来的肿瘤部位和殖民一个次要部位。细胞要通过组织迁移,进出血管系统,必须从根本上改变其形状,以挤压这些物理屏障,同时产生巨大的力量,沿着细胞外基质拉路或在其他细胞间移动细胞。这些力通过焦点附着力2、3将物质传递到基材上,并可通过TFM进行量化。虽然癌症在生物化学上是异常多样化的,已知突变和蛋白质变化的种类不断扩大,但观察到一些常见的物理变化;在各种癌症中,包括乳腺癌、前列腺癌和肺癌,转移性细胞已被证明能发挥非转移性细胞6、7、8的牵引力2-3倍。这些结果表明,转移性进展与细胞施加的牵引力之间可能存在很强的相关性;然而,合同性的详细时间相关变化很难研究。
上皮到间质过渡(EMT)是一个过程,细胞减少粘附和紧密结介细胞-细胞粘附,变得更加迁移和侵入。除了包括伤口愈合和发育过程在内的生理功能外,EMT 也是转移过程中利用的过程,使其成为研究这一过程的有用模型系统。使用TGF-α,我们可以诱导小鼠乳腺上皮细胞(NMuMG)9中的EMT直接量化这种转化过程中的物理变化,并描述TGF-α对EMT和细胞收缩性的时间和剂量依赖性效应。在本文中,我们通过测量诱导EMT期间契约性的变化来演示此方法的效用。
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Protocol
注:以下协议将指导研究人员制造和使用图1所示的多井TFM盘。
1. PDMS硅胶基板的制备
- 基于两个市售套件的复合混合物制备 PDMS 硅橡胶混合物。
- 将 PDMS 套件的 A 部分和 B 部分(例如 GEL-8100,参见材料表)以 1:1 的重量比添加到 50 mL 管中。
注:混合物在旋转器上混合,速度足够慢,混合物在旋转过程中来回流动,以确保完全混合。 - 为基材所需的模量添加所需的固化剂。
注:添加到混合物中的固化剂量取决于基材所需的模量,通常范围为0.1%至1.8%。有关特定交联剂浓度和所得的调制利的指南,请参阅表 1和图3。 - 在旋转器上混合配方 30-45 分钟;确保旋转足够慢,以便彻底混合。
- 将 PDMS 套件的 A 部分和 B 部分(例如 GEL-8100,参见材料表)以 1:1 的重量比添加到 50 mL 管中。
- 底层:在玻璃玻片上涂覆 PDMS 基板
- 将图 2所示的定制夹头放在旋转涂层上。用乙醇或异丙醇清洁玻璃,用无绒擦拭擦干。将玻璃滑块放在夹头中,打开真空,将滑轨保持到位。
- 在距离边缘约 1 厘米的边上涂抹未固化的 PDMS,然后朝中心工作。应用足够的 (3-4 mL) PDMS,以确保覆盖整个表面。
注:为确保 PDMS 均匀地分布在玻璃表面,移液器尖端可能有助于将 PDMS 混合物从中心扩散到边缘。 - 使用以下协议在旋转涂层上使用 PDMS 混合物旋转玻璃。
- 要将未固化的 PDMS 铺在幻灯片上,以 50 rpm/s 的速度从 0 转速加速到 200 rpm;保持 200 rpm 1 分钟。
- 要达到 100 μm 厚的 PDMS 层,以 50 rpm/s 加速至 300 rpm,并在 300 rpm 下保持 1 分钟。除了 100 μm 之外,不同的所需厚度需要特定的速度值。
- 要拆卸,请以 50 rpm/s 的速度减速至 0 rpm。禁用真空并拆下涂层滑块,注意不要接触涂层表面。
注: 包含加速和减速步骤以确保平滑的连续表面非常重要。
注意:为确保样品不会飞离夹头,应使用定制的支架来握住滑轨,而不是仅仅依靠真空和现有的平夹头。图2给出了此支架的详细信息和规格。
- 将旋转涂层样品置于制造商推荐温度(100 °C)2小时。
注:放置样品的烤箱表面应为固体(即,而不是电线架)和水平表面,以确保样品的均匀加热和厚度。陶瓷或钢板是理想的表面。
- 顶部珠层
- 以适当的比例将珠溶液添加到剩余的 PDMS 混合物中。
注:此比率取决于库存珠溶液的浓度和样品上所需的珠密度。典型的最终值为 9.2 x 1011珠/mL 和 0.05-0.2 珠/μm2,并且珠子的过量通常比数量不足更可取。 - 将珠子溶液与未固化的 PDMS 混合。这可以通过将管子放在旋转器上大约 30 分钟、涡旋 1-2 分钟或声波 30 分钟来实现。这些方法可以组合。
注:在我们的应用中,我们发现声波能有效分解珠料,旋转在混合中是有效的。合成的受信珠可以聚合在存储中。在使用之前,它们可能重新悬浮在己化和声波中。如果存在大量大的聚合体,则可以通过 5 μm 注射器过滤器过滤珠悬浮液。此过滤步骤是可选的;它有助于用单分散的珠子涂覆样品,但过滤器中可能会丢失相当一部分珠子。 - 从烤箱中拿出幻灯片,让温度冷却,然后放在旋转涂层上。
- 将 3-4 mL 的珠子和未固化的 PDMS 混合物添加到涂层样品表面。
注:由于己带,添加的珠子的混合物粘性较低。确保不要接触基板表面,因为它可能会损坏已经涂覆的 PDMS 基板。此外,珠混合物最初可能不会湿表面;注意混合物不会立即从固化的 PDMS 表面流出。 - 使用以下协议旋转示例。
- 要扩散珠子和未固化的 PDMS 混合物,以 100 rpm/s 的速度从 0 转速加速到 500 rpm;保持 500 rpm 1 分钟。
- 要实现薄层珠嵌入的 PDMS (±1 μm),以 200 rpm/s 的速度从 500 rpm 加速到 5000 rpm;保持 5000 rpm 10 s。
- 要拆卸,请以 100 rpm/s 的速度减速至 0 rpm。禁用真空并拆下涂层滑块,注意不要接触涂层表面。
- 将旋转涂层样品置于 100°C 的烤箱中,等待 1 小时。
注:温度超过100°C或持续时间超过1小时可以减少珠光。确保烤箱温度设置为 100°C 且不升高。 - 可以在此处暂停该协议。要存放样品,请覆盖表面以避免灰尘和光线照射。确保没有接触表面。样品在室温下无限期地稳定。
- 以适当的比例将珠溶液添加到剩余的 PDMS 混合物中。
- 组装板
- 将 PDMS 弹性体套件的 A 部分(基体)和 B 部分(固化剂,例如 Sylgard)以 10:1 的重量比添加到 50 mL 管中。
- 在旋转器上混合混合物 30-45 分钟。
注:对于一个板,将 5 mL 的底座与 0.5 mL 的固化剂混合。可添加高达 1 mL 的己化,以降低混合物的粘度。 - 将混合物涂抹在分压器底部,然后将混合物铺开。
注:分隔器应倒置放置。 - 将基板倒置放在分隔板上。
- 将样品倒置在 65°C 的烤箱中 2 小时。
- 从烤箱中取出样品,用 70% 乙醇或异丙醇清洁玻璃底部,以清除任何 PDMS 残留物。
注: 可以在此处暂停该协议。要存储样品,请盖在基板上盖,并将设备包裹在铝箔中,以避免暴露在光线下。样品在室温下无限期地稳定。此方法中使用的分频器采用 96 井格式;但是,研究人员可能采用其他格式(384 孔、2 孔、4 孔、8 孔等),具体取决于所需的实验设置和划分结构的可用性。可能需要一些进一步的优化。
2. 表面功能化
- 将 80 μL 的 Sulfo-SANPAH 等分液溶解在 40 mL 的 0.1 M HEPES 缓冲液 (pH 7-9) 中。
注:通过在2 mL无菌二甲基亚硫酸盐(DMSO)中溶解100毫克硫磺-SANPAH粉末,制备硫磺-SANPAH等分物。通过在450 mL的无菌去离子水中稀释 50 mL 的 HEPES 缓冲液,并通过 0.22 μm 孔隙过滤器进行过滤,制备 0.1 M HEPES 缓冲液。 - 在 96 孔板的每个孔中加入 200 μL 的稀释硫磺-SANPAH 溶液。
- 以适当的距离和持续时间将板暴露在紫外线(300-460nm)光下。
注:紫外线照射后,溶液的颜色应较暗。紫外线照射距离和持续时间取决于紫外线灯的功率。在我们的应用中,我们在 5 厘米的距离内曝光 10-15 分钟。 - 从井中取出 Sulfo-SANPAH 溶液,并在每口井中加入 200 μL 的 5 μg/mL 纤维素溶液。
注:研究人员指定的蛋白质可用于表面涂层。一些常用的蛋白质是胶原蛋白、纤维蛋白和拉米宁。我们发现 Sulfo-SANPAH 是最有效的方法,有时在 PDMS 中采用等离子清洁时,由于产生二氧化硅层并明显损坏表面,因此不鼓励进行等离子体清洁。 - 在4°C下孵育板过夜。
注:根据用于涂层的蛋白质,可以采用不同的孵育方法。 - 去除纤维内丁溶液,用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗净每口井两次。
- 在样品上盖上盖子。
- 在每个井中加入 200 μL 的 PBS。
注: 可以在此处暂停该协议。纤维素涂层样品可在4°C下储存长达2周。
3. 紫外线灭菌
- 在生物安全柜的紫外线下对样品进行消毒30分钟。
注: 较长的紫外线照射时间可能会对珠光产生负面影响。所有后续步骤必须在无菌条件下执行。
4. 细胞培养
- 从每个井中取出PBS,并将悬浮在培养培养的200μL细胞添加到每个井中。
- 以所需的细胞密度为细胞板。细胞密度取决于所需的实验。对于单细胞研究,细胞应至少相距50μm,成像窗口边缘附近的细胞不应包含在TFM测量中。对于单层细胞,成像窗口应覆盖一个细胞的汇合层的观察场。
- 通过补充DMEM5%FBS、10 mM HEPES、10μg/mL胰岛素、1%青霉素-链霉素、1mM L-谷氨酰胺和0.5μg/mL氨基林B,为NMuMG细胞制备完整的生长培养基。
- 通过在酸化水中重组(130 mL的去离子水中2.5 ml的冰川醋酸)至10mg/mL的浓度,制备胰岛素。将库存溶液储存在 4°C。等待溶液清除,然后过滤0.22 μm孔隙。
- TGF-+添加
- 要制备TGF-β库存,在10mM柠檬酸(pH 3.0)的100μL中溶解2μgTGF-α,用0.22μm孔隙过滤灭菌。将管子和等分涡涡到所需体积中。将等分存储在-80°C。
- 将1.5μL的TGF-α库存溶液加入10 mL的完整细胞培养基,以构成细胞培养基,最终TGF-+浓度为3纳克/mL。
注:要制造10 mM pH 3.0柠檬酸,请稀释水中的酸,并通过添加HCl将pHH调整至3.0。
5. 数据采集
- 对于每个位置,获取至少一个受托粒子和细胞的图像。聚焦在珠子层上。
注:像素大小应根据所使用的受托粒子大小和图像处理方法进行优化。在此应用程序中,作者使用 10x 0.4 NA 目标,以 1024 x 1024 分辨率以 455 nm/像素获取图像。通常,保持每珠子至少 1-5 像素的分辨率会很有帮助;在这里,珠子是多分散的,其个体尺寸为300-500纳米。对于用于 TFM 计算的图像,荧光受信珠必须聚焦,这一点至关重要。珠子的焦点和成像质量应优先于细胞本身成像。不同通道之间不应有串扰,尤其是非来自磁珠成像光谱中的受信珠的任何荧光。 - 记录完所有感兴趣位置后,在每个井中添加分离溶液,以获取受信粒子的无力参考图像。
- 要制备细胞分离溶液,混合含有2%TritonX-100、50 mM阿齐德钠和500 mM氢氧化钾的水溶液。
注:以上是作为有效分离解决方案的示例提供的。研究人员可自行决定使用不同的分离解决方案来分离基底表面的细胞。
- 要制备细胞分离溶液,混合含有2%TritonX-100、50 mM阿齐德钠和500 mM氢氧化钾的水溶液。
6. 图像分析
- 根据需要执行适当的图像分析。
注:分析软件是在内部开发的。图像分析可通过在线提供的定制软件进行。
7. 珠子合成
注:以下协议基于Klein等人10所述的合成方法。
- 在烟气罩下,用水冷反流冷凝器准备三颈烧瓶。
注意:在通风良好的化学烟气罩中设置合成。 - 在烧瓶中加入 0.5 mL 的 PDMS 稳定剂和荧光剂。
- 用氮气入口针和出口针为一个颈部配备橡胶隔膜,并为另一个颈部配备橡胶隔膜,用于添加注射器试剂。
- 在250 mL中加入100 mL的无水和己酸,并加入一个小的磁搅拌棒。
- 将烧瓶置于矿物油浴75°C,用氮气清洗1小时。
- 在25 mL圆形底瓶中加入6 mL甲基丙烯酸酯。
- 在圆底烧瓶中加入 0.100 g 的 2,2'-非松石(AIBN),用氮气清洗混合物 1 小时。
注:在使用前通过预包装柱冲洗甲基丙烯酸酯以去除抑制剂。在三颈烧瓶中加入甲基丙烯酸酯和AIBN混合物。 - 溶液最初变得浑浊,变成乳状。在溶液变浑浊后,让反应运行3小时。
- 3小时后,将烧瓶放入冰水浴中。
- 用粗滤纸真空过滤溶液。
- 将滤液离心,并重新悬浮己己的颗粒。
注: 要添加的己带体积取决于珠溶液的所需浓度。声波促进珠子颗粒在己化溶液中的重新分散。作者产生的珠子的多分散直径约为300-500nm。由于使用交叉相关模式跟踪来确定位移,因此不需要单分散珠子。
8. 汇变学测量协议
注:并非每个研究人员或实验都需要使用环变学,但需要量化 PDMS 新配方的调节剂。在此协议中,我们使用剪切变频计来测量交联器、频率和应变对 PDMS 样品的调节力的影响。根据可用的工具和专业知识,也可以使用许多其他机械分析方法进行测量。此外,使用该协议的研究人员可以选择使用表1、图3和图4中所示的已发布的moduli。
- 使用直径为 25 mm 的平行板几何形状的 rheo 计。可能使用其他几何形状。
- 初始化系统并校准设备和测量系统(平行板,d = 25 mm)。测量零间隙后,开始加载 PDMS 样品。
- 一旦PDMS弹性体和交联剂被混合,将混合物移至流变仪底板上。
- 向下移动主轴以完全接触 PDMS 样品的顶部。
- 小心地从底板上修剪负载的样品过量。
- 在应变扫描测试中,对具有不同交联密度的每个组合物施加增加应变,以确保聚合物结构在所有剪切测量过程中保持线性粘弹性。
注:与细胞研究相关的应变值通常在0.1-10%的范围内。我们发现 PDMS 是线性的,高达大约 100% 应变。 - 在频率为 1 Hz 和振荡剪切应变 0.5% 的 100°C 下进行时间扫描测试中测量 PDMS 网络的动态剪切存储模量 (G') 和损耗模量 (G+)。
- 要确定最终 PDMS 网络的粘度和时间依赖性,请应用频率范围为 0.1-100 Hz 的频率扫描测试,振荡剪切应变为 0.5%。
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Representative Results
在添加TGF-β之前,细胞的汇合单层具有类似形状的圆石,并且紧密包装。在TGF-β治疗时,细胞在形态学上变得更长,扩大细胞面积,获得更中位表型。利用用软PDMS弹性体制造的多井装置,研究了细胞在总共17个不同条件下的物理特性。细胞用四种不同的TGF-+浓度(0.5,1,2和4纳克/mL)和4个不同的孵育时间(12,24,48,96小时)进行治疗,这些结果在图5中总结。使用TGF-α处理的电池比没有TGF-α的培养细胞施加更大的牵引应力和应变能量。用TGF-α孵育96小时的电池表现出最大的牵引应力和应变能量。当TGF-β浓度较高时,细胞施加较大的应力和应变能量。在较长的孵育时间,牵引力和应变能量的差异更为明显。
基材表面需要光滑均匀地涂覆配体,如纤维蛋白或胶原蛋白。划伤表面和/或配体涂层不均匀可能导致电池附着不当,导致牵引力测量不准确。图 6显示了由于基板表面不均匀而导致的局部牵引应力。
图 1:多孔板制造概述。(A) 定制切割玻璃滑梯是起点.(B) 玻璃滑块涂有厚(±100 μm PDMS 层)。(C) 一层受信珠(以绿色显示)然后在前一层顶部的 ±1 μm 厚层中旋转涂层。(D) 多井分压器被小心地放置在受托珠层的顶部。(E) 完整的多孔板已组装完毕,可供使用或储存。请点击此处查看此图的较大版本。
图 2:为旋转涂层定制夹头。为了防止底部玻璃(PDMS 涂层)从标准旋板夹头飞离,将定制支架放在夹头上。(A) 旋转外套夹头的定制支架.(B) 所有尺寸的支架的工程图纸。请点击此处查看此图的较大版本。
图 3:基板刚度随交联物浓度变化(wt%)的变化。PDMS 混合物按所述制备,附加交联百分比增加弹性模量,直到最大 100 kPa,重量为 1.8 (wt%)交联器。作为指南,作为交联器函数的模量是线性拟合的,研究人员可以使用它在这个范围内的特定所需模量来配制自己的混合物。请点击此处查看此图的较大版本。
图 4:在100°C温度下含有0、0.15、0.36和1wt%的交联剂的PDMS弹性体的横变体。三角形符号表示损耗模量 (G')),方形符号表示存储模量 (G')。(A) 在凝胶化期间,振荡时间扫描频率为 1 Hz,剪切应变为 0.5%。(B) 在剪切应变为 0.5% 时 PDMS 网络的振荡频率扫描。(C) 以 1 Hz 的频率对 PDMS 网络进行应变扫描。所有数据点均以三元数采集。请点击此处查看此图的较大版本。
图 5: 使用多井格式的牵引应力装置的代表性结果。在多井装置中培养不同条件下的单层细胞,以测量收缩性和应变能量。(A) 不同TGF-β浓度的牵引应力与增加TGF-+孵育时间的图表。牵引应力随着TGF-+浓度和孵育时间的增加而增加。所有数据在控制方面具有统计显著性(即无 TGF-+),但以下数据除外:12 小时 - 0.5 纳克、12 小时 - 1 纳克、48 小时 - 1 纳克。(B) 不同TGF-β浓度增加TGF-+孵育时间的应变能量图。应变能量随着TGF-+浓度和孵育时间的增加而增加。样本大小范围从 n = 7 到 n = 15。所有数据在统计上对控制(即无TGF-α)具有统计学意义,但以下数据除外:12小时- 0.5 ng,12 h - 1 ng,24 h - 0.5 ng,24 h - 1 ng,48 h - 1 ng。统计显著性是使用Kruskal Wallis测试确定的,该测试不假定为正态分布。请点击此处查看此图的较大版本。
图 6:代表结果来自次优(A、B)和令人满意的(C、D)实验。(A) 基板表面的反射图像.不需要的污染物(可能包括灰尘或纤维)或材料缺陷(如划痕)存在于基材表面。(B)细胞收缩力的应力图:由于表面不均匀,在物体周围观察到不规则和不准确的牵引应力。(C)基板表面的反射图像。看不到明显的污染物。(D)细胞收缩性应力图:无工件不连续可见。请点击此处查看此图的较大版本。
| 交联器浓度(wt%) | G' (Pa) | 标准偏差 | E (kPa) | 标准偏差 |
| 0 | 0.135 | 0.014 | 0.405 | 0.043 |
| 0.15 | 1 | 0.1 | 3 | 0.35 |
| 0.36 | 4.027 | 0.245 | 12.081 | 0.73 |
| 0.75 | 16.01 | 0.49 | 48.03 | 1.2 |
| 1 | 18.44 | 0.989 | 55.32 | 1.94 |
| 1.5 | 27.638 | 0.93 | 82.91 | 1.64 |
| 1.8 | 33.986 | 0.88 | 101.94 | 1.088 |
| 2 | 33.36 | 0.67 | 100.08 | 1.1 |
表 1:基板刚度随交联物浓度变化(wt%)的变化。通过改变额外的交联剂浓度,可制造所需的 Young 的调制液的 PDMS 基板。用变速计测量PDMS剪切月数,确定杨的月数。对于每个数据点,进行了3次独立准备,给出了标准偏差。
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Discussion
为了这种方法的成功,拥有一个厚度稳定约100μm的均匀涂层样品至关重要。应仔细选择模量,以检查感兴趣的生物系统的物理意义。在制造顶层时,应优化基准荧光粒子的浓度,以便准确分析位移和牵引应力。分析孤立的单个细胞需要比测量连体单层更密集的信任层。此外,基板表面应具有胶原蛋白、纤维蛋白和层宁等粘附分子的稳定和均匀涂层,以确保细胞正确附着在基板表面。安装多井分压器时必须特别注意;应放置它而不滑动,以防止密封 PDMS 胶水涂抹在培养表面上,外边缘必须与玻璃尺寸小心对齐,以防止边界井上出现任何泄漏。
为了防止油井泄漏,需要向井分线器应用足够量的 PDMS 胶水,以将其固定到位。然而,使用过量将覆盖细胞培养表面。
在旋转涂层过程中,需要添加足够的 PDMS 量。固化时,烤箱和机架需要水平。PDMS 不足或未平整的烤箱可能导致 PDMS 厚度不均匀。
珠密度需要优化以进行正确的分析。当珠子密度不足时,需要增加PDMS混合物中珠子的浓度。此外,需要为旋转涂层添加足够数量的混合物。为确保受信珠颗粒发出正确的荧光信号,应仔细监测固化情况。比本协议规定的时间长和温度高可能会降低荧光。样品表面的蛋白质涂层不当可能导致细胞粘附不良。为了防止这种情况,需要清洁表面,并检查试剂(如 Sulfo-SANPAH 和配体)的过期情况。紫外线照射时间和强度应优化。免疫荧光或其他荧光蛋白结构可以进行测试,以确保均匀的配体涂层。
采用这种方法和PDMS配方的装置仅适用于杨的月法范围从0.4 kPa到100 kPa的基板。其他moduli可能可以使用替代配方,但是,目前的范围跨越大量的生理相关值。虽然此方法专门用于多井制造,但它也可用于准备单个幻灯片或其他幻灯片几何形状,在这些情况下,可能需要进一步的用户故障排除。在本实施例中,采用相对厚的(1毫米)玻璃滑动,排除了倒置显微镜上常见的高数值孔径(NA)物。虽然使用较薄的玻璃构建这些多井 TFM 盘在技术上是可行的,但这些在加工和装配中的脆弱性可能会导致较高的破损率,并可能与高通量方法相反。此外,对于器件的更广泛应用,还可以进一步研究表面涂层。
利用多井格式,高通量实验是可能的。多井格式使我们能够在一个培养皿中结合不同浓度和不同孵育时间,通过TGF-+处理在EMT期间检查NMuMG细胞的物理变化。使用水凝胶(如聚丙烯酰胺凝胶)制造牵引应力装置有几个限制。水凝胶的主要成分是水,对盐浓度(渗透性)、温度、湿度和pH变化很敏感。这些特性的变化都可能导致材料的机械性能发生变化,在使用样品和解释结果时需要格外小心。此外,有水,水凝胶更容易感染,需要额外的照顾。与水性水凝胶相比,硅基PDMS是稳定和惰性的。一旦制造,它可以无限期地存储在室温下,无需任何特殊的处理或储存条件。
PDMS 的不透水性使我们能够制造单片基板,确保所有井的基材厚度和成分真正相同,同时允许在介质中应用独特的生物化学,或将不同的细胞应用于每个嗯水凝胶表面允许扩散因子渗透和通过它,因此有必要将水凝胶添加到井中,否则将水凝胶分区,以防止交叉污染。
这种方法使研究人员能够以高通量的方式研究细胞收缩性,这是细胞生物学的一个基本和无处不在的方面,从而实现更高效和可重复的数据采集。这有助于将牵引力显微镜转化为收缩力筛选,使研究人员能够真正将收缩性作为细胞活性或化合物功效的指标。作为一种方法论,这在生物物理和生物医学科学中有着广泛的应用,从了解细胞的物理特性,到针对标准化细胞类型进行药物化合物的定性和测试,或者可能高度专业化个性化药物的单个细胞。
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Disclosures
AJE 和 RK 对活细胞技术公司感兴趣,该公司制造本文中描述的材料。
Acknowledgments
作者感谢汤姆·科德格、迈克尔·兰德里和克里斯托弗·巴雷特在珠子合成方面给予的帮助。A.J.E. 承认自然科学和工程研究理事会赠款 RGPIN/05843-2014 和 EQPEQ/472339-2015,加拿大卫生研究院赠款 143327 号,加拿大癌症协会赠款号 703930 和加拿大创新基金会项目#32749。克里希南承认国家卫生研究院的拨款R21HL123522 和 R01HL136209。H.Y.得到了魁北克圣贝奇基金会和魁北克自然与技术基金会的支持。作者感谢JohananIdicula在视频和手稿方面给予的帮助,并感谢何子新协助制作视频。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plate | |||
| GEL-8100 | Nusil Technology | GEL-8100 | High Purity Dielectric, Soft Silicone Gel kit |
| Dow Corning Sylgard 184 Silicone Encapsulant Clear 0.5 kg Kit | Ellsworth Adhesives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | curing agent |
| Custom Cut Glass | Hausser Scientific Company | 109.6mm± x 72.8mm± x 1mm thickness | |
| Target 2TM Nylon Syringe Filter | ThermoFisher Scientific | F2513-4 | |
| 96-well Stripwell Egg Crate Strip Holder | Corning | 2572 | |
| Polystyrene Universal Microplate Lid With Corner Notch | Corning | 3099 | |
| Ethyl alcohol | Greenfield Global | P016EA95 | 0.95 |
| 2-Propanol | Sigma-Aldrich | 190764 | ACS reagent, ≥99.5% |
| Surface Coating | |||
| Sulfo-SANPAH Crosslinker | Proteochem | c1111-100mg | |
| Fibronectin bovine plasma | Sigma-Aldrich | F1141-1MG | solution, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
| PBS, 1X | Wisent | 319-005-CL | pH 7.4, without calcium and magnesium |
| DMSO | Sigma-Aldrich | 472301 | |
| Cell Culture | |||
| DMEM, 1X | Wisent | 319-005-CL | 4.5g/L glucose, with L-glutamine, sodium pyruvate and phenol red |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Wisent | 080-150 | Premium Quality, Endotoxin <1, Hemoglobin <25 |
| HEPES | Wisent | 330-050-EL | 1M, free acid |
| Human Insulin Recombinant | Wisent | 511-016-CM | USP grade |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Wisent | 450-201-EL | 100 X, sterile filtered for cell culture |
| L-Glutamine solution | Wisent | 609-065-EL | 200mM solution, sterile filtered for cell culture |
| Amphotericine B | Wisent | 450-105-QL | 250μg/ml, sterile filtered for cell culture |
| Recombinant Human TGF-β1 | Peprotech | 100-21 | HEK293 Derived |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | 537020 | Glacial, ≥99.85% |
| Cictric acid | Sigma-Aldrich | 251275 | ACS reagent, ≥99.5% |
| NMuMG | ATCC | CRL-1636 | Mouse Mammary Gland Cell Line |
| Sodium azide | Fisher Schientific | AC190385000 | 99%, extra pure, ACROS Organics |
| Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221473 | ACS reagent, ≥85%, pellets |
| TritonX-100 | Sigma-Aldrich | X100 | laboratory grade |
| Bead Synthesis | |||
| 1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI) | Sigma-Aldrich | 468495-100MG | 97% |
| Methyl methacrylate | Sigma-Aldrich | M55909-500ML | contains ≤30 ppm MEHQ as inhibitor, 99% |
| Inhibitor Remover | Sigma-Aldrich | 306312-1EA | Prepacked column for removing hydroquinone and monomethyl ether hydroquinone |
| Methacryloxylpropyl Terminated Polydimethylsiloxane | Gelest | DMS-R31 (25,000g/mol) | Polydimethylsiloxane stabilizer, 25,000g/mol, 1,000 cSt |
| 2,2′-Azobis(2-methylpropionitrile) (AIBN) | Sigma-Aldrich | 441090-25G | 98% |
| Hexane | Sigma-Aldrich | 296090-2L | anhydrous, 95% |
| Hexane, mixture of isomers | Sigma-Aldrich | 227064-1L | anhydrous, ≥99% |
| Whatman qualitative filter paper, Grade 1 | Sigma-Aldrich | WHA1001055 | circles, diam. 55 mm, |
| Equipment | |||
| Laurell WS-650Mz-23NPPB | Laurell Technologies | ||
| UVP Handheld UV Lamp Model UVGL-58 | VWR | 21474-622 | |
| Rheometer | Anton Paar | MCR 302 WESP |
References
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- Oliver, T., Dembo, M., Jacobson, K.
- Dembo, M., Wang, Y. L. Stresses at the Cell-to-Substrate Interface during Locomotion of Fibroblasts. Biophysical Journal. 76 (4), 2307-2316 (1999).
- Yoshie, H., Koushki, N., et al. Traction Force Screening Enabled by Compliant PDMS Elastomers. Biophysical Journal. 114 (9), 2194-2199 (2018).
- Park, C. Y., Zhou, E. H., et al. High-throughput screening for modulators of cellular contractile force. Integrative biology quantitative biosciences from nano to macro. 7 (10), 1318-1324 (2015).
- Kraning-Rush, C. M., Califano, J. P., Reinhart-King, C. A. Cellular traction stresses increase with increasing metastatic potential. PLoS ONE. 7 (2), e32572 (2012).
- Agus, D. B., et al. Physical Sciences - Oncology Centers Network. A physical sciences network characterization of non-tumorigenic and metastatic cells. Scientific Reports. 3 (1), 1449 (2013).
- Guo, M., Ehrlicher, A. J., et al. Probing the Stochastic, Motor-Driven Properties of the Cytoplasm Using Force Spectrum Microscopy. Cell. 158 (4), 822-832 (2014).
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- Klein, S. M., Manoharan, V. N., Pine, D. J., Lange, F. F. Preparation of monodisperse PMMA microspheres in nonpolar solvents by dispersion polymerization with a macromonomeric stabilizer. Colloid & Polymer Science. 282 (1), 7-13 (2003).
